KR20000057316A - 항원-특이적 면역글로불린 지 검출방법 - Google Patents

항원-특이적 면역글로불린 지 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2 이상의 상이한 수용체 R1와 R2(R2의 주성분이 단량체 형태인 결합 파트너이다), 및 경우에 따라 부가적인 수용체들과 항온배양시키므로써 체액중 M 계열의 면역글로불린의 존재하에서 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 방법, 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출용 시약, 뿐만 아니라 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출을 위한 단량체 형태의 결합 파트너의 용도에 관한 것이다.

Description

항원-특이적 면역글로불린 지 검출방법{ANTIGEN-SPECIFIC IgG DETECTION}
외래 물질의 도입에 반응하여, 포유류의 면역계는 면역글로불린이라 불리는 항체를 생성한다. 그들은 항원이라 칭하는 외래 물질에 대항하여 방어작용을 한다. 면역글로불린은 5 개의 상이한 종류로 분류될 수 있다. 이는 M, G, A, E 및 D 종의 면역글로불린으로 구별된다. 상기 5 면역글로불린 종류 각각은 μ, γ, α, ε 및 δ 사슬로 칭하는 중쇄(heavy chain) 의 조성이 상이하다.
각 면역글로불린 종류는 유기체내에서 상이한 기능을 갖는다. M 계열의 면역글로불린은 항원과 처음 접촉하여 일차 면역을 나타낸다. 그러나, 상기 면역글로불린의 농도는 감염이 진행됨에 따라 급속하게 감소한다. G 계열의 면역글로불린은 일차 면역후 처음에는 천천히 형성되다가, 동일한 항원으로 이차 감염되는 경우에 대량으로 발생한다. A 계열의 면역글로불린은 유기체의 점막 표면상에서 발견되고 거기에서 방어 작용들을 담당한다. E 계열의 면역글로불린은 주로 알레르기 반응을 담당한다. D 계열의 면역글로불린의 정확한 기능은 지금까지 밝혀지지 않았다.
각각의 면역글로불린 종류는 혈액중에 매우 상이한 농도로 발생한다. 그러므로, G 계열의 면역글로불린(IgG)은, 8 내지 18 mg/ml 의 혈청 함량에 해당하는 정상적인 사람 혈청중 약 75 % 를 차지하는 주된 종류이다. 가장 빈번하게 발생하는 이차 면역글로불린은 평균 혈청 농도가 0.9 내지 4.5 mg/ml인 IgA 이다. M 계열 면역글로불린은 0.6 내지 2.8 mg/ml 의 농도로 존재하고, D 계열의 면역글로불린은 0.003 내지 0.4 mg/ml 의 농도로 존재한다. IgE 항체의 비율은 혈청중 0.02 내지 0.05 ㎍/ml 의 농도로만 발생되어 가장 낮다.
많은 질병들의 차별적인 진단을 위해서 특정 항원에 특이적인 하나 이상의 매우 특정한 면역글로불린 계열의 항체를 검출하는 것이 중요하다. 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염의 만족할 만한 진단은 종류-특이적 항체 시험에 의해서 또는 임의 면역글로불린 종류의 존재를 배제하므로써만 (예컨데, IgG 및 IgA 항체는 검출되나 IgM 항체는 미검출) 이루어질 수 있다. 이는 새로운 또는 급성 감염과 초기에 발생되는 감염 사이의 구별을 위해서 뿐 아니라 감염 경로의 임상학적 모니터를 위해서 특히 중요하다. 항체의 종류-특이적 검출은 HIV, A형 간염, B형 간염, 톡소플라스마증, 풍진 및 클라미디아 감염에 특히 중요하다. 특정 항원에 특이적인 항체의 종류-특이적 검출은 항체 보호의 적정값의 결정 및 면역화의 성공을 조사하는데 또한 필요하다. 그러므로, 진단적 관점에서는, IgG 및 IgA 항체와 같은 감염의 비급성 상태의 항체를 특히 검출하는 것이 매우 주목된다.
항원에 특이적인 특정 종류의 항체를 검출하기 위한 각종 방법들이 당 분야의 보고서에 기재되어 있다. 그러므로, 특정 종류의 항원-특이적 항체는 흔히 특정 항원으로 도포된 고체상에 특이적 항체가 결합하므로써 측정된다. 고체상에 현재 결합되어있는 항원 특이적 면역글로불린 (Ig) 은 특정 종류의 사람 Ig 에 대해 특이적인 항체가 검출될 Ig 분자에 결합하므로써 검출된다. 사람 Ig 에 대한 항체를 표지시키므로써 검출을 수행한다. 그러나, 상기 시험 방법은 모든 비특이적이고 결합되지 않은 Ig 를 사람 Ig 에 대한 종류-특이적 표지된 항체로 반응시키기 전에 세척하여 제거하여야만 가능하다. 그러므로, 자동화 시스템을 위해 자주 요구되는 1-단계 시험 방법은 불가능하다.
US 특허 제 4,292,403 호에 기재된 방법에 따르면, 특정 면역글로불린 계열의 항원-특이적 항체는 검출될 시료 항체가 결합되어 있는 고체상위에 종류-특이적 항체를 고정시킨 다음, 특이적 항원을 첨가하고, 결합되어져 있는 항원이 항원에 특이적인 더 표지된 항체에 결합하므로써 검출된다. 그러나, 상기 방법의 단점은 검출될 모든 계열의 항체들이 종류-특이적 고정 항체에 결합되어야만 한다는 것이다. 시료 항체는 항원-특이적으로 결합되지 않는다. 이는 항원-특이적 항체에 대한 결합부위가 결합되지 않은 상태로 충분하지 않을 수 있기 때문에 시험의 민감성을 손상시킬수도 있다. 수회의 세척 단계가 또한 상기 시험 방법에 필요하다. 상기 방법은 1-단계 시험 방법으로는 가능하지 않다.
1-단계 시험으로의 항체 검출은 일명 브릿지 시험(Bridge test)에 의해 수행될 수 있다. 브릿지 시험의 개요는 EP-A-0 280 211 에 기재되어 있다. 상기 방법에 있어서, 검출될 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 수용체가 예를 들어 항원과 같이 고체상에 결합되어 있다. 검출될 항체는 고체상-결합 항원에 결합한다. 또한, 보다 특이적 항원도 표지된 시험 혼합물중에 존재한다. 항체는 표식에 의해 검출된다. 상기 시험에서, 특정 종류의 항체만이 아니라 모든 항원-특이적 항체들이 검출된다.
EP-A-0 307 149 및 US 특허 5,254,458 에서, 브릿지 시험 원리를 기초로하는 방법들이 항원에 특이적인 항체들을 검출하기 위해 개시되어 있다. 상기 경우에 있어서, 항원의 임의 에피토프로 부터 유래된 재조합 생성된 펩티드는 검출될 항체와 결합되는데 사용된다. 펩티드를 고체상에 고정시킨다. 시료 항체를 상기 펩티드에 결합시킨다. 추가로 표지된 펩티드를 검출을 위해 시료 항체에 결합시킨다. 재조합 펩티드는 시험의 특이성을 증가시키기 위해서 상이한 유기체내에서 발현된다. 또한 상기 방법에서 모든 종류의 항체들이 펩티드에 결합한다. 예를 들어, IgG 와 IgM 항체를 식별하는 것은 불가능하다.
EP-A-0 386 713 에는 일정 분량의 시료 및 표지된 HIV 항원과 각각 접촉되는 2 개의 고체 캐리어상에 상이한 HIV 항원을 고정화시키고 이러한 두 캐리어를 사용하여 HIV 에 대한 항체를 검출하는 것으로, 항체의 존재가 1 회 이상의 시험에서 양성 반응에 의해 검출되는 방법이 기재되어 있다. 재조합 생성된 폴리펩티드는 HIV 항원으로 개시되었다. 웨스턴 블롯을 기초로 하는 방법이 EP-A-0 627 625 에 개시되어 있는데, 이는 또한 HIV 항체가 재조합 단백질 또는 합성 펩티드에 의해 검출될 수 있다는 것이다. 그러나, 상기 양 방법들은 항원-특이적 항체의 종류-특이적 검출을 수행치 못한다.
선행 방법들로는 특정 면역글로불린 종류의 항원-특이적 항체가 1-단계 방법으로 검출될 수 없다. 표지된 항원과 고체상에 결합될 수 있는 항원이 사용되는 브릿지 시험 발상을 기초로 하는 당분야에서 공지된 면역학적 검출 방법은 실제로 1-단계 시험일 수 있다. 그러나, 지금까지는 이러한 간단한 원리를 이용하여 IgG 및 IgM 계열의 항체를 함께 검출하는 것만이 가능하였다.
그러므로, 본 발명의 목적은 특정 항원에 대한 비-급성 감염의 항체, 예를 들어, 특히 IgG 계열의 항체를 검출하는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 동시에, 본 방법은 동일한 특이성의 IgM 항체는 검출되지 않도록 해야한다. 본 발명은 바람직하게는 자동화된 시스템에 유리하게 사용될 수 있도록 1-단계 시험 원리로 구성되어야 한다.
본 발명은 시료를 2 이상의 상이한 수용체 R1및 R2(상기 두 수용체들은 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, R1은 고체상에 결합되어 있거나 결합될 수 있고, R2는 표식을 수반한다)와 항온배양시키고, 액체상으로 부터 고체상을 분리하여 표식 (검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단량체 형태의 결합 파트너와 표식의 콘쥬게이트가 R2로 사용된다)을 측정하므로써, 체액내 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 IgM 계열의 면역글로불린의 존재하에서 IgG 계열의 면역글로불린의 특이적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 시료를 2 이상의 상이한 수용체 R1및 R2와 항온배양시키므로써 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 본 발명에 따른 방법에 의해 수행되는데, 상기 두 수용체는 항체에 특이적으로 결합될 수 있으며, R1은 고체상에 결합되어 있거나 또는 결합될 수 있고, R2는 표식을 수반하는데 이는 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단량체 형태인 결합 파트너와 표식의 콘쥬게이트가 R2로 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 동일한 항원-특이성의 IgM 계열의 항체들이 존재하는 시료중에서 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출할 수 있다.
검출될 IgG 항체와 동일한 특이성을 가진 시료중에 존재하는 IgA, IgD 및 IgE 항체들은 IgG 항체들 보다 훨씬 더 낮은 농도로 발생한다. 특히 IgD 및 IgE 계열는 검출 방법중에 그들의 반응성이 측정된 결과를 변화시키지 않거나 거의 변화시키지 않도록 하는 IgG 농도 이하인 정도의 농도로 존재한다. IgA 항체들은 총 IgG 함량의 약 10 % 에 해당하는 농도로 존재한다. 그러므로, IgA 항체도 아마 본 방법으로 측정될 것이다. 본 방법의 주요 목적은 비-급성 감염의 항체들을 검출하는 것이므로, 비-급성 감염의 IgG 및 IgA 항체 모두를 공동 검출하는 것은 정밀하지는 않다. IgG 항체는 비-급성 감염에 있어서 주요 면역글로불린 종류이므로, IgG 검출이라는 용어가 하기에 사용된다. 급성 감염에서 다량으로만 발생하는 동일한 항원 특이성의 IgM 항체가 검출되어서는 안된다는 것이 중요하다.
놀랍게도, 이중-항원 시험 원리를 기초로 하는 브릿지 시험에서 단량체 형태인 결합 파트너의 본 발명에 따른 용도는 특정 항원에 대해 특이성을 나타내는 IgG 계열의 항체만을 오로지 검출시킬는 것으로 판명되었다. 동일한 시료중에 존재하는 동일한 특이성의 IgM 계열의 항체는 놀랍게도 단량체 펩티드와 반응하지 않거나 무시할 정도로 약하게 반응하므로 IgG 검출을 방해하지 않는다. 용어 "무시할 만큼 약한" 은 IgM 항체의 항원 결합 부위가 단량체 형태인 결합 파트너에 의해 검출가능할 정도로 결합되지 않는다는 것을 의미한다. 이는 아마도 개별적인 분자의 형태로 존재하는 IgG 항체와 비교하여 단량체형 에피토프에 대해 5량체인 IgM 항체의 매우 낮은 친화성때문이다.
그러므로, IgM 항체를 분리하기 위한 연속적인 시험 공정은 상기 항체가 방해가 되지 않는 본 발명에 따른 방법에 있어서는 절대적으로 필요한 것은 아니다. 그러므로, 본 방법 특유의 장점은 시험 공정의 간편성이다.
시험 시약들이 액상으로 존재하는 일명 습식 시험과는 별개로, 단백질 또는 항체의 검출에 적합한 모든 표준 건식 시험 형식이 또한 사용될 수 있다. 상기 건식 시험 또는 예를 들어 EP-A-0 186 799 에 기재된 시험 스트립에서, 시험 성분들이 캐리어에 도포된다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법이 시험 스트립 형식으로 수행된다면 세척단계는 필요없다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 습식 시험으로 수행된다.
모든 수용체들과 시료를 함께 항온배양시켜 상기 방법을 1 단계로 수행하는 것이 가능하다. 이는 경우에 따라 항온배양후 단 1 회의 세척 단계를 필요로 한다.
통상적으로 2 개의 상이한 수용체 R1및 R2는 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 사용된다. 습식 시험이 사용된다면, 수용체 R2는 액상으로 존재한다. R1은 액상으로 존재하거나 또는 이미 고체상에 결합되어 있다. R1및 R2가 액상으로 존재하는 경우에는, 그들은 동일한 농도가 바람직하다. R1:R2의 농도비는 0.5:1.0 내지 1.0:5.0 이 매우 적합한 것으로 증명되었다. 최적 농도비는 당 분야의 숙련자에 의해서 용이하게 시험될 수 있다.
고체상에 결합할 수 있으나 고체상에 아직 결합하지 않은 수용체가 R1으로 사용된다면, 시료를 수용체 R1및 R2와 항온배양시킨다. 상기 공정에서, 시료 항체는 R1및 R2에 결합한다. 상기 항온배양은 고체상의 존재하에서 수행될 수 있다. 고체상-R1-시료-항체-R2로 이루어진 복합체가 상기 공정에서 형성된다.
다음으로, 고체상을 액상과 분리하고, 고체상은 경우에 따라 세척되며, R2의 표식을 측정한다. 표식은 대체적으로 고체상에서 측정되지만 액상에서도 측정될 수 있다.
시료와 R1및 R2와의 항온배양이 고체상의 부재하에서 수행된다면, 이에 따라 시험 혼합물 전체는 다음 단계로 고체상과 접촉해야만 하고, 세척은 선택적으로 수행되며 표식을 측정한다.
수용체 R1이 이미 고체상-결합 형태인 경우에는, 시료 및 수용체 R2를 고체상-결합 수용체 R1에 첨가하여 함께 항온배양시킨다. 그 이상의 공정은 상기 기술된 방법에 해당한다.
그러나, 본 발명에 따른 방법이 여러 단계들로 수행되는 것도 가능하다. 이러한 경우에, 우선적으로 시료와 수용체 R1및 R2를 항온배양시키는 것이 편리하다. 형성되는 R1, R2및 검출될 항체의 복합체를 이어서 다른 수용체들과 항온배양시키므로써 이는 여러 단계들로 수행될 수 있다. 그 이상의 공정은 앞서 기재된 방법에 해당한다.
수용체 R2는 단량체 형태인 결합 파트너와 표식의 콘쥬게이트이다. 본 발명에 따른 단량체 형태의 결합 파트너는 정확하게 1 개의 에피토프 영역 또는 검출될 항체에 대한, 예를 들어, 검출될 IgG 항체와 면역학적으로 특이적 반응하는 구조인, 단 하나의 결합부위만을 함유한다. 결합 파트너의 단량체형 구조는 검출될 항원-특이적 IgG 항체만이 단량체 형태인 결합 파트너에 결합하고 동일한 특이성의 IgM 항체를 방해하지 않도록 하는 것이 중요하다.
에피토프 영역은 예를 들어 항원 또는 항-인자형 항체로 부터 유래될 수 있다. 에피토프 영역은, 단량체 형태인 결합 파트너의 경우에 있어서는, 또한 당 및/또는 지질 구조 또는 펩티드, 지질 및/또는 당 성분들의 조합된 구조로 부터 유래될 수 있다. 검출될 IgG 계열의 항체가 동일한 특이성의 IgM 항체의 존재하에서 특이적으로 결합하는 결합부위를 갖는 에피토프 영역이 유래될 수 있는 모든 구조가 사용될 수 있다. 예를 들어, 단량체 형태로 사용되는 결합 파트너에 대한 결합부위로서 유일한 필요조건은 IgG 에 결합하는 특이적인 능력이 보유되어야 한다는 것이다. 이러한 조건은 또한 당 또는 지질 구조가 결합부위내에 존재하는 경우에도 적용된다.
본 발명에 따르면, 검출될 IgG 항체가 특이적으로 결합되는 결합부위와 나란히 위치하거나 또는 겹치는 단량체 형태인 결합 파트너를 사용하는 것도 가능하다. 그러므로, 또한 결합부위가 검출될 에피토프와 겹치는 교차-반응 IgG 항체를 검출하는 것도 가능하다. 그러므로, 단량체 형태인 결합 파트너의 혼합물이 항원-특이적 IgG 항체를 검출하기 위해 사용되는 것이 바람직하다.
펩티드는 바람직하게는 단량체 형태인 결합 파트너로 사용된다. 분석물질이 단백질인 경우에, 결합부위는 펩티드인 것으로 이해되며, 그의 서열은 단백질 항원이 단백질 서열의 일부이고 이러한 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체가 생성되는데, 본 발명의 경우에 있어서는 IgG 항체이다. 또한, 상기 펩티드에 대해서 결합부위는 또한 앞서 언급된 펩티드와 검출될 IgG 항체에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성이 본질적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 펩티드는 바람직하게는 개별적인 아미노산 잔기들을 치환, 결손 또는 삽입시키므로서 상기 언급된 펩티드로 부터 유래될 수 있다.
검출될 IgG 계열 항체가 동일한 특이성의 IgM 항체의 존재하에서 조차 특이적으로 결합하는 결합부위를 갖는 모든 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용된 펩티드에 대한 결합부위로서 단지 필요한 것은 IgG 에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있어야 한다는 것이다. 결합부위는 서열이 단백질 항원(분석물질)의 단백질 서열의 일부인 펩티드이며, 여기에 특이적으로 결합하는 상기 단백질에 대한 항체가 본 발명에 있어서는 IgG 항체인 것으로 이해된다. 또한, 상기 펩티드에 대해서, 결합부위는 또한 앞서 언급된 펩티드와 검출될 IgG 항체에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성이 본질적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 펩티드는 바람직하게는 개별적인 아미노산 잔기들을 치환, 결손 또는 삽입시키므로서 상기 언급된 펩티드로 부터 유래될 수 있다.
특이적 결합부위에 상응하는 본 발명에 따른 펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산이 화학반응에 의해 유도체화된 펩티드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 펩티드 유도체의 예는 특히 골격 또는/및 반응성 아미노산 부반응기, 예를 들어, 유리 아미노기, 유리 카르복실기 또는/및 유리 히드록실기가 유도체화된 상기 분자이다. 아미노기 유도체의 구체적인 예는 술포아미드 또는 카르복사미드, 티오우레탄 유도체 및 암모늄염, 예를 들어 히드로클로라이드이다. 카르복실기 유도체는 염, 에스테르 및 아미드이다. 히드록실기 유도체의 예는 O-아실 또는 O-알킬 유도체이다. 펩티드는 바람직하게는 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법들에 따라서 화학적 합성에 의해 생성되며 이를 특별히 여기에서 설명할 필요는 없다. 원칙적으로 펩티드는 또한 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 그런, 더 긴 폴리펩티드가 흔히 이량체화 또는 다량체화되는 경향이 있으므로 펩티드는 단량체 성질을 유지하기 위해서 화학적 합성에 의해 생성되는 것이 바람직하다.
또한 용어 펩티드 유도체는 또한 하나 이상의 아미노산이 천연 발생 또는 비-천연 발생된 20 개의 "표준"아미노산의 아미노산 상동체로 대체된 펩티드를 포함한다. 상기 상동체의 예는 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘, 호모세린, 오르니틴, β-알라닌 및 4-아미노부티르산이다. 펩티드 유도체는 그들이 유래되는 펩티드와 검출될 IgG 항체에 대한 결합 특이성 또는/및 친화성이 본질적으로 동등해야만 한다.
특이적 결합부위에 상응하는 본 발명에 따른 펩티드는 또한 상기 언급된 펩티드 또는 펩티드 유도체와 검출될 IgG 항체에 대한 결합 특이성 또는/및 친화성이 본질적으로 동등한, 하기에서 펩티드-유사체라 불리는 펩티드-유사물질로 언급된다. 펩티드-유사체는 검출될 항체와의 상호작용 면에서 펩티드를 대체할 수 있고 특히 프로테이나제 및 펩티다제에 대해 천연 펩티드 보다 더 높은 안정성을 가질 수 있는 화합물이다. 펩티드-유사체의 제조방법은 문헌 [Giannis 및 Kolter, "Angew. Chem." 105 (1993), 1303-1326 및 Lee et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010] 에 기재되어 있다.
결합부위의 길이, 예컨데 본 발명의 단량성 펩티드의 길이는 대체적으로 4 개 이상의 아미노산이다. 길이는 바람직하게는 4 내지 20 개, 6 내지 15 개의 아미노산, 또는 특히 바람직하게는 9 내지 12 개의 아미노산이다. 펩티드-유사체 또는 펩티드 유도체의 경우에 있어서, 분자의 크기에 있어서 유사길이가 필요하다.
단량체 형태의 결합 파트너로서 본 발명에 따른 단량체형 펩티드는 검출될 IgG 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 함유한다. 그러나, 더 이상 특이적 에피토프에 상응하지 않는 그 이상의 플랭킹 펩티드 서열이 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 존재할 수 있다. 더욱이, 펩티드가 당 분야의 숙련자에게는 친숙한 스페이서기를 제공하는 것도 가능하다. 단지 필요한 것은 단량체 형태의 결합 파트너로서 펩티드가 실제 단량체로서 존재하고 검출될 IgG 항체와의 결합능을 보유한다는 것이다.
수용체 R2의 또 다른 성분은 표식이다. 직접적으로 검출가능한 물질로는 예를 들어 화학발광, 형광 또는 방사성 물질 또는 금속 졸, 라텍스 또는 골드입자가 표식으로 바람직하게 사용된다. 효소 또는 또 다른 생물학적 물질은 예를 들어 합텐과 같은 표식으로 바람직하다. 디곡시제닌이 합텐중 특히 바람직한 표식이다. 표지 방법들은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으므로 여기에서 더 설명할 필요는 없다. 표식은 화학발광, 형광 또는 방사성 물질 또는 금속 졸, 라텍스 또는 골드입자를 측정하거나 또는 효소에 의해 전환되는 물질을 측정하므로써 이미 공지된 방법으로 직접 검출된다.
표식은 또한 간접적으로 검출될 수 있다. 이러한 경우에 수용체 자체가 시그날-생성기와 차례로 연결되는 또 다른 수용체가 디곡시제닌과 같은 합텐인 R2의 표식에 특이적으로 결합한다. 시그날-생성기, 예를 들어, 화학발광, 형광 또는 방사성 물질 또는 효소 또는 골드입자는 당 분야의 숙련자에게 친숙한 방법에 의해서 검출된다. 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 R2의 표식에 특이적으로 결합하는 또 다른 수용체로서 사용될 수 있다. 표식의 상기 간접적 검출이 사용된다면 이어서 R2표식은 바람직하게는 디곡시제닌 또는 또 다른 합텐이고, 검출은 디곡시제닌 또는 합텐에 대해 생성된 퍼옥시다제와 커플된 항체를 통해 수행된다.
수용체 R1의 주성분은 검출될 IgG 항체에 특이적 결합할 수 있는 결합 파트너이다. 수용체 R1은 고체상에 직접 결합되어 있거나 또는 고체상에 결합할 수 있다. 수용체 R2에서와 같은 단량체 형태의 결합 파트너는 검출될 IgG 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너로서 사용될 수 있다. 그러나, 단량체 형태로 존재하지 않는 결합 파트너를 사용하는 것도 가능한데, 즉, 결합 파트너가 하나 이상의 에피토프 또는 결합부위를 가질 수 있다. 검출될 IgG 항체에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 능력을 보유하는 것이 중요하다. 그러나, 단량체 형태의 결합 파트너 및 특히 바람직한 펩티드는 또한 수용체 R1으로 사용된다. R1에 함유된 펩티드는 R2에 대한 펩티드와 동일한 방법에 의해 생성될 수 있다.
수용체 R1및 R2에 함유된 항체-특이적 결합 파트너 또는 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있으나, 둘 모두 검출될 IgG 항체에 동시에 결합할 수 있어야 한다.
R1은 또한 고체상에 직접 결합될 수 있다. 고체상에 R1의 직접 결합은 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해서 수행된다. R1은 또한 특이적 결합 시스템에 의해서 고체상에 간접적으로 결합될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, R1은 상기 설명된 펩티드 및 특이적 결합 시스템의 반응 파트너로 이루어진 콘쥬게이트이다. 특이적 결합 시스템은 이 경우에 있어서 함께 특이적으로 반응할 수 있는 2 개의 파트너로서 이해된다. 이러한 경우에 있어서, 결합능은 면역학적 반응 또한 또 다른 특이적 반응을 기초로 할 수 있다. 비오틴 및 아비딘의 조합 또는 비오틴 및 스트렙트아비딘의 조합이 특이적 결합 시스템으로 바람직하게 사용된다. 또 다른 바람직한 조합은 비오틴과 항-비오틴, 합텐과 항-합텐, 항체의 Fc 단편과 Fc 단편에 대한 항체, 또는 카르보히드레이트와 렉틴이다. 상기 특이적으로 결합가능한 쌍의 반응 파트너중 하나는 그러므로 수용체 R 을 형성하는 콘쥬게이트의 한 부분인 것이다.
특이적 결합 시스템의 다른 반응 파트너는 고체상에 존재한다. 특이적 반응 시스템의 다른 반응 파트너는 당 분야의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법에 의해서 불용성 캐리어 물질에 결합될 수 있다. 상기 경우에 공유결합 뿐 아니라 흡착결합이 적합하다. 특히 적합한 고체상은 폴리스티렌으로 제조된 시험관 또는 미소적정 플레이트 또는 유사한 플라스틱으로, 그의 내부표면은 특이적 결합 시스템의 반응 파트너로 도포되어 있다. 라텍스 입자, 분자체 물질, 유리 비드, 플라스틱 튜브 등과 같은 입자성 물질인 또한 적합할 수 있으며 특히 바람직하다. 종이와 같은 다공층 캐리어가 또한 캐리어로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예로는, 단량체 형태의 결합 파트너와 특이적 결합 시스템의 반응 파트너로 구성된 콘쥬게이트가 R1으로 사용된다. 상기 바람직한 구현예에는, 수용체 R1및 R2뿐 아니라 검출될 IgG 항체를 함유하는 시료를 함께 배양한다. 상기 방법에서 수용체 R1및 R2의 펩티드 성분은 검출될 IgG 항체와 특이적으로 반응한다. R1, 시료 항체 및 R2로 구성된 상기 복합체는 R1의 성분인 특이적 반응 시스템의 반응 파트너에 의해서 특이적 반응 시스템의 다른 반응 파트너로 도포된 고체상에 결합한다. 결과적으로, R1, 시료 항체 및 R2로 구성된 복합체 전체는 고체상에 결합한다. 고체상을 액체상과 분리하고 경우에 따라 고체상을 세척한 후, R2의 표식은 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해서 검출된다. 상기 시험 방법은 동일한 특이성의 IgM 항체의 존재하에서 IgG 항체가 특이적으로 검출될 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 방법은 또 다른 바람직한 구현예로는, 수용체 R1및 R2에 더하여 부가적인 수용체가 사용된다. 이러한 시험 방법에서, 단량체 형태의 결합 파트너와 예컨데 비오틴과 같은 특이적 결합 시스템의 반응 파트너로 구성된 콘쥬게이트가 R1으로 사용된다. 이를 위해서, 수용체 R1및 R2뿐 아니라 검출될 IgG 항체를 함유하는 시료를 함께 항온배양시킨다. 이러한 방법에 있어서, 수용체 R1및 R2의 펩티드 성분들은 검출될 IgG 항체와 특이적으로 반응한다. 특이적 반응 시스템의 다른 반응 파트너 (예를 들어, 스트렙트아비딘)로 도포된 고체상으로의 결합은 R1의 성분인 특이적 결합 시스템의 반응 파트너에 의해서 수행된다. 결과적으로, R1, 시료 항체 및 R2로 구성된 복합체 전체는 고체상에 결합한다. 고체상을 액체상과 분리하고 경우에 따라 고체상을 세척한 후, 고체상에 결합된 복합체를 R2의 표식을 특이적으로 인식하는 부가적인 수용체와 항온배양시킨다. 또 다른 수용체는 효소와 같은 시스날-생성기와 연결된다. 부가적인 선택적 세척 단계후, 시료 항체는 효소에 의해 전환되는 물질에 의한, 시그날-생성기를 통해 검출된다. 이러한 시험 방법이 사용된다면, 디곡시제닌이 R2표식으로 바람직하게 사용된다. 이러한 경우에 있어서 부가적인 수용체는 디곡시제닌에 대한 항체 또는 항체 단편 및 퍼옥시다제 효소로 이루어진다. 이러한 시험 방법에 있어서, R1및 R2와 부가적인 수용체의 시료와의 항온배양은 또한 동시에 수행될 수 있다.
상기 시험 방법은 또한 자동화 시스템에 사용되기에 매우 적합하지만 2 회 또는 수회의 세척 단계들이 필요하다. 상기 시험 방법의 주요 장점은, 예를 들어 gp41, p17 등에 대한 HIV 항체와 같은 여러 항원-특이적 항체를 검출하고자 하는 경우에 명백해질 것이다. 이러한 경우에 있어서, 부가적인 수용체가 R2표식을 특이적으로 인식하기 때문에 부가적인 수용체가 보편적인 표식으로 사용된다.
당 분야의 숙련자에세 공지된 모든 생물학적 액체는 시료로 사용될 수 있다. 혈액, 혈청, 혈장, 오줌, 침 등과 같은 체액이 시료로서 바람직하게 사용된다.
상기 시료에 더불어, 고체상 및 상기 언급된 수용체, 완충액, 염, 세제, BSA 와 같은 단백질 첨가제와 같이 사용시 필요로 될 수 있는 다른 첨가제들이 시험 혼합물에 존재할 수 있다. 필수적인 첨가제는 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있거나 또는 숙련자에 의해 간단한 방법으로 결정될 수 있다.
IgM 항체 또는 류마티드성 인자들이 항원-특이적 IgG 검출을 방해하지 않도록 하기 위해서, 경우에 따라 방해 감소를 위해 추가적인 측정이 필요할 수 있다. 이는 EP-B-0 341 439 에 개시된 연구에서와 같이 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE) 또는 β-메르캅토에탄올과 같은 환원성 물질의 사용을 들 수 있다. 또한, 항-Fd 항체가 류마티드성 인자들에 의한 방해를 제거하기 위해서 경우에 따라 사용될 수 있다. 이러한 고안은 WO 96/14338 에 개시되어 있다. 방해를 감소시키기 위한 다양한 측정들이 개별적으로 또는 임의 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 완충액, 염, 세제 등과 같은 면역검정을 위한 통상적인 시험 첨가제와 더불어, 단량체 형태의 결합 파트너와 표식으로 구성되며 검출될 항체에 결합할 수 있는 수용체 R2를 함유하는 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출용 시약에 관한 것이다.
본 발명의 주제는 또한 면역검정을 위한 통상적인 시험 첨가제와 더불어, 검출될 항체에 결합할 수 있는 두개의 수용체 R1및 R2(R1은 고체상에 결합할 수 있고 R2는 표식을 수반하는데 수용체 R2의 주성분이 단량체 형태의 결합 파트너이다)를 함유하는 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출용 시약에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 주제는 또한 면역검정을 위한 통상적인 시험 첨가제와 더불어, 검출될 항체에 결합할 수 있는 두개의 수용체 R1및 R2(R1은 고체상에 결합할 수 있고 R2는 표식을 수반하는데 상기 두 수용체의 주성분이 단량체 형태의 결합 파트너이다)를 함유하는 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출용 시약에 관한 것이다.
또한 본 발명의 주제는 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 단량체 형태인 결합 파트너의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다.
실시예 1. 단량체형 및 다량체형 에피토프를 사용하는 경우 〈HIV 2〉MABs (IgG 및 IgM) 와의 반응성
시험 방법의기재:
비오틴-표지 및 디곡시제닌-표지된 단량체형 (시험 A) 또는 다량체형 (시험 B) 항원 (HIV 2) 을 시료항체 및 스트렙트아비딘-도포된 고체상과 반응시킨다 (25 ℃ 또는 37 ℃에서 약 60 내지 180 분 항온배양, 본 실시예에서는 120 분, 25 ℃). 세척 단계후, 벽에 결합된 면역 복합체를 항-디곡시제닌-퍼옥시다제 콘쥬게이트와 반응시킨다 (25 ℃ 또는 37 ℃ 에서 약 30 내지 120 분 항온배양, 본 실시예에서는 60 분 25 ℃). 또 한번의 세척 단계후, 퍼옥시다제 콘쥬게이트-표지된 면역 복합체를 기질 반응에 의해 검출한다 (25 ℃ 에서 60 분 콘쥬게이트 항온배양). 일반적으로, 콘쥬게이트 항온배양은 25 ℃ 또는 37 ℃ 에서 약 30 내지 120 분간 수행될 수 있다.
반응 단계들(기질 반응 제외)은 약 0.05 내지 0.4 % 세제 (본 시험에서는 0.2 % 폴리도카놀) 및 약 0.5 % 단백질/단백질 유도체 첨가제 (본 시험에서는 락트알부민 및 BSA 에서 유래된 펩톤)를 함유하는 트리스/HCl 완충액 (pH 7.5, 50 내지 150 mM, 본 실시예에서는 100 mM)중에서 수행된다.
이 경우에 있어서, 시료 항체는 항-HIV 네가티브 사람 혈청중에 약 2 - 20 ㎍/ml 로 희석된 HIV 2 에피토프에 대한 모노클론성 쥐 항체(IgM 및 IgG)이다.
시험 A 및 B 의 시험 결과 비교 : mA 에서의 흡광도
시료 시험 A(단량체형 에피토프) 측정 시험 B(다량체형 에피토프) 측정
MAB〈HIV2〉IgG20.3.1 2764 양성 2800 양성
MAB〈HIV2〉IgG23.5.3 9999 양성 3974 양성
MAB〈HIV2〉IgM2.6.6 6 음성 3271 양성
MAB〈HIV2〉IgM2.11.7 6 음성 4250 양성
MAB〈HIV2〉IgM2.22.8 6 음성 6442 양성
단량체 형태인 HIV2-특이적 결합 파트너의 사용은 HIV2 에 대한 IgG 항체의 특이적 검출을 가능케 한다. 동일한 항원 특이성의 IgM 계열의 항체는 인식되지 않는다 (시험 A).
다량체 형태인 HIV2-특이적 결합 파트너가 사용되는 경우, IgG 와 IgM 를 식별하는 것은 불가능하다 (시험 B).
실시예 2. 침팬지의 HIV2 혈청변환의 혈청 항체와의 반응성
실시예 1 과 실험 방법 동일.
시험 A 및 B 대한 침팬지 혈청전환의 시험 결과 : mA 에서의 흡광도
감염후 순차적인 혈청시료 시험 A(단량체형 에피토프) 측정 시험 B(다량체형 에피토프) 측정
(감염후) 0 주상태: 항체 없음 6 음성 98 음성
(감염후) 1 주상태: 항체 없음 7 음성 89 음성
(감염후) 3 주상태: IgM 항체 6 음성 673 양성
(감염후) 7 주상태: IgM 및 IgG 항체 250 경계선 589 양성
(감염후) 10 주상태: IgG 항체 8767 양성 6845 양성
단량체 형태인 결합 파트너의 사용은 HIV2-감염후 혈청전환이 검출될 수 있도록 한다. 시험 A 의 잇점은 특히 감염후 3 주에 분명해진다: IgM 항체만이 존재하고 이는 단량체 형태인 결합 파트너에 의해 검출되지 않는다. IgG 항체 출현후 시험 A 만이 양성 시그날을 나타낸다. 다량체형 에피토프를 사용하는 시험 B 는 동일한 특이성의 IgG 와 IgM 를 식별할 수 없다.
실시예 3. 환자의 HIV1 혈청변환의 혈청 항체와의 반응성
항원이 HIV 1 인 것을 제외하고, 실시예 1 과 실험 방법 동일.
시험 A 및 B 대한 HIV1 혈청전환의 시험 결과 : mA 에서의 흡광도
1차 검사후 순차적인 혈청시료 시험 A(단량체형 에피토프) 측정 시험 B(다량체형 에피토프) 측정
0 일상태: 항체 없음 30 음성 89 음성
14 일상태: 항체 없음 28 음성 78 음성
26 일상태: IgG 항체 35 음성 9999 양성
35 일상태: IgM 및 IgG 항체 250 경계선 9999 양성
40 일상태: IgM 및 IgG 항체 589 양성 9151 양성
시험 A 는 HIV1(실시예 2 에서의 HIV2 와 유사) 감염인 경우에서 또한 IgG 항체의 검출을 용이하게 한다.
실시예 4. 단량체형 에피토프를 함유하는 펩티드를 가진 풍진에 대한 IgG 의 검출
시험 방법의 기재:
풍진-특이적 IgG 는 단량체 형태인 본 발명에 따른 결합 파트너에 의해 Elecsys 2010 기기 (상품명; Boehringer Mannheim GmbH, Germany) 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 검출된다. 하기 시약들이 사용된다 :
시약 R1 : 비오티닐화된 풍진 E1 항원의 시클릭 펩티드.
트리스 완충액, pH 7.5, 0.2 % Myrij, 0.2 % BSA, 0.1 % R-IgG
시약 R1 : 루테닐화된 풍진 E1 항원의 시클릭 펩티드.
트리스 완충액, pH 7.5, 0.2 % Myrij, 0.2 % BSA, 0.1 % R-IgG
사람 혈청 시료가 시료로 사용된다.
시험은 하기 단계들로 수행된다:
1. 30 ㎕ 시료 + 65 ㎕ R1+ 65 ㎕ R2
2. 37 ℃ 에서 9 분간 항온배양
3. 40 ㎕ SA-도포된 자기 비이드의 첨가
4. 37 ℃ 에서 9 분간 항온배양
5. 검출 반응: 전기-화학발광 시그날 측정
결과
시료 특성 횟수 IU/ml
No. 1 IgM 음성, IgG 음성 1359 0.5
No. 3 IgM 음성, IgG 음성 1370 0.5
No. 8 IgM 음성, IgG 음성 1338 0.5
No. 1.3 IgM 양성, IgG 음성 929 0.1
No. 1.4 IgM 양성, IgG 음성 981 0.2
No. 255 IgM 음성, IgG 양성 11256 83
No. 272 IgM 음성, IgG 양성 26254 192
No. 278 IgM 음성, IgG 양성 4453 32
No. 283 IgM 음성, IgG 양성 49328 363
항원-특이적 IgG 를 함유하는 시료만이 양성으로 인식된다. 항원-특이적 IgM 만을 함유하는 시료 (No. 1.3 및 1.4) 는 본 발명에 있어서 양성으로 인식되지 않는다.

Claims (9)

  1. 시료를 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2 이상의 상이한 수용체 R1및 R2(R1은 고체상에 결합되어 있거나 또는 고체상에 결합할 수 있고, R2는 표식을 수반하는데, 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 단량체 형태인 결합 파트너와 표식의 콘쥬게이트가 R2로 사용된다)와 항온배양시키므로써 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, R1의 주성분이 단량체 형태의 결합 파트너인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 비오틴/아비딘; 비오틴/스트렙트아비딘; 비오틴/항-비오틴; 합텐/항-합텐; 항체의 Fc 단편/Fc 단편에 대한 항체; 카르보히드레이트/렉틴이 R1을 고체상에 결합시키기 위한 특이적 결합 시스템으로 사용되는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 R2가 화학발광, 형광 또는 방사성 물질, 효소 또는 생물학적 분자로 표지되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 R1및 R2와 동시에 항온배양되는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 혼합물을 수용체 R2의 표식에 특이적으로 결합하는 부가적인 수용체(부가적인 수용체는 R2의 표식에 특이적인 수용체와 표식의 콘쥬게이트이다)와 항온배양한 다음, 표식을 측정하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 R1에서의 단량체 형태인 결합 파트너의 양이 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 R2에서의 단량체 형태인 결합 파트너의 양과 동일하거나 그 이상인 방법.
  8. 면역검정을 위한 통상적인 시험 첨가제와 더불어, 단량체 형태의 결합 파트너와 표식으로 구성된 검출될 항체에 결합할 수 있는 수용체 R2를 함유하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에서 청구된 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체의 검출용 시약.
  9. 면역글로불린 G 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 단량체 형태의 결합 파트너의 용도.
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