ES2248357T3 - Composicion de antigeno mosaico de vhc. - Google Patents
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Abstract
Una composición peptídica que comprende dos o más péptidos diferentes que son reconocidos por anticuerpos contranti-VHC, caracterizada porque cada péptido: consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por MSTNPKPQRKTKRNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6); está acoplado covalentemente en N terminal o C terminal a un componente transportador; y tiene una proporción entre péptido y masa de transportador comprendida en el intervalo de 0, 5 a 8, 0.
Description
Composición de antígeno mosaico de VHC.
La invención proporciona una composición de
antígenos mosaico altamente inmunorreactiva que contiene una
pluralidad de péptidos antigénicos diferentes codificados a partir
de la región central del genoma del virus de la hepatitis C (VHC)
con el fin de detectar anticuerpos contra VHC. También se
proporcionan un procedimiento de diagnóstico in vitro para
detectar anticuerpos contranti-VHC en una muestra de
prueba y un kit de prueba de diagnóstico que utilizan la composición
de antígenos mosaico como un inmunorreactivo.
El virus de la hepatitis C (VHC) es la causa
principal de enfermedad hepática en todo el mundo. Hasta el 85% de
los infectados con VHC se convierten en portadores crónicos, lo que
puede conducir a trastornos fisiológicos como cirrosis
(cicatrización del tejido hepático), insuficiencia hepática y cáncer
de hígado.
En 1998, la Organización Mundial de la Salud
(OMS) estimó que el 3% de la población mundial había sido infectado
por VHC, lo que significa que en todo el mundo hay más de 170
millones de portadores crónicos de VHC.
El VHC crónico es la causa principal de
trasplantes de hígado. Es también una causa importante de cáncer de
hígado en muchas áreas del mundo. El VHC crónico aparece a menudo
sin síntomas y la mayoría de estos infectados puede permanecer
ignorante de su infección durante años. Pueden pasar 20 años o más
para que se manifiesten los síntomas en personas que contraen
enfermedad hepática crónica. Por esta razón, el VHC se denomina
epidemia silenciosa.
El VHC se transmite principalmente a través de
sangre infectada. Puede transmitirse también a través de contacto
sexual y verticalmente de madres infectadas a sus hijos recién
nacidos.
El VHC se descubrió a finales de la década de
1970 como agente etiológico de la hepatitis C. El VHC es un virus de
ARN perteneciente a la familia Flaviviridae. Sin embargo, hasta 1989
no pudo disponerse de una prueba de anticuerpos específicos del
virus, permitiendo así las pruebas rutinarias.
En la actualidad no existe vacuna para el VHC. En
los últimos años han aparecido opciones de tratamiento prometedoras
para la hepatitis C. Sin embargo, como la hepatitis C crónica es a
menudo silenciosa, normalmente se descubre sólo mediante pruebas
clínicas rutinarias.
Una prueba serológica de VHC sencilla y rápida
podría mejorar la detección selectiva y los servicios de
diagnóstico, y es una alternativa atractiva en numerosos centros que
pueden tener recursos e instalaciones limitados. Según el informe
del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades de los
Estados Unidos, las pruebas rápidas o de punto de cuidado permiten
también a los proveedores sanitarios suministrar en cuestión de
minutos a los pacientes los resultados de las pruebas en el momento
de la prueba, aumentando así potencialmente la eficacia global de
los programas de asesoramiento y detección selectiva. Como la
prevención es un aspecto importante del control pandémico, el acceso
fiable a procedimientos de diagnóstico adecuados es un requisito
esencial para la protección de la salud pública. Sin embargo, los
procedimientos tradicionales actualmente disponibles para el
diagnóstico de la infección por VHC tienen varios
inconvenientes.
Existen esencialmente tres estrategias bien
definidas que se utilizan en la actualidad en el diagnóstico de
infección por VHC que se basan en si el analito objeto es: (a) ácido
nucleico viral, (b) antígenos virales o (c) un anticuerpo específico
para los antígenos virales. Dependiendo de las circunstancias
particulares y del tipo de información buscado, un ensayo usado con
el fin de detectar infección por VHC puede incorporar uno cualquiera
de estos tres procedimientos, o una combinación de los mismos.
Aunque la detección positiva de ácido nucleico
viral es el indicador principal de la presencia del virus, existen
ciertos inconvenientes que se atribuyen al uso de este tipo de
enfoque. Por ejemplo, los ensayos que permiten la detección de ácido
nucleico viral (ARN) son, en general, significativamente más
complejos y requieren más tiempo que la mayoría de los ensayos para
la detección de antígenos virales y anticuerpos
contranti-VHC. En general, los ensayos de detección
de ácidos nucleicos implican procedimientos complejos como técnicas
de transcriptasa inversa-reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR), separación por electroforesis
de fragmentos de ácidos nucleicos y análisis de transferencia
Northern. Por tanto, la complejidad de este enfoque asociada con la
necesidad de equipos de laboratorio sofisticados y un alto nivel de
conocimientos y experiencia técnica compromete su aplicación en un
centro clínico. Además, este tipo de ensayo de diagnóstico será
eficaz únicamente para obtener un resultado preciso si el nivel o la
concentración de ácido nucleico viral en una muestra es
suficientemente alto para que pueda detectarse adecuadamente. De
este modo, la aplicación de este procedimiento particular se
restringe a menudo a una muestra biológica de prueba de un tejido
apropiado (por ejemplo, biopsia de hígado) en el que el ácido
nucleico viral estará presente probablemente en un nivel muy alto,
imponiendo así ciertas limitaciones a los tipos de muestras
biológicas que son adecuados para proporcionar un diagnóstico
preciso.
Cuando se determinan antígenos virales como
analito objeto, el ensayo inmunológico se diseña generalmente de tal
forma que se usen uno o más anticuerpos monoclonales o policlonales
específicos de los antígenos virales como reactivos de detección y/o
captura. El formato más común de este ensayo es el formato
inmunométrico, también denominado formato de doble determinante o
formato de sándwich de anticuerpo doble. En este tipo de ensayo, el
antígeno viral (o antígeno bacteriano) que ha de detectarse se pone
normalmente en contacto con un anticuerpo monoclonal específico que
a menudo se inmoviliza en un soporte sólido (es decir, anticuerpo de
captura). Después de la incubación con una muestra biológica de la
que se sospecha que contiene el antígeno, el anticuerpo monoclonal
inmovilizado se une selectivamente al antígeno. Después de una etapa
de lavado, la muestra se incuba a continuación con un anticuerpo
marcado (es decir, anticuerpo sonda o de detección), lo que hace que
el antígeno quede atrapado entre el anticuerpo de captura y el
anticuerpo sonda. Sin embargo, un inconveniente conocido en el uso
de este procedimiento se encuentra cuando se intenta generar
anticuerpos que pueden reconocer el antígeno con alta afinidad y
especificidad. Además, los anticuerpos deben poseer la capacidad de
reconocer igualmente las formas variantes de ocurrencia natural del
antígeno. Este aspecto es particularmente relevante en el caso de
antígenos virales y bacterianos que muestran un alto grado de
diversidad de secuencia entre las diferentes cepas.
Un enfoque alternativo para diagnosticar una
enfermedad infecciosa consiste en detectar el anticuerpo específico
de los agentes infecciosos. En la mayoría de las enfermedades
infecciosas (bacterianas y virales), se produce una respuesta a
anticuerpos significativa por parte del sistema inmunológico del
huésped. Como la presencia de anticuerpos específicos para un agente
infeccioso es indicativa de una infección en curso, la detección de
anticuerpos específicos es un enfoque muy atractivo en el
diagnóstico de estados de enfermedad infecciosa. A este respecto,
los anticuerpos diana proporcionan un medio más práctico y fiable de
detección de enfermedades infecciosas virales en comparación con
antígenos, dado que en muchos casos los antígenos no se encuentran
normalmente en concentraciones adecuadas para la detección en
líquidos biológicos (por ejemplo, sangre y orina).
El formato de prueba usado más comúnmente para
detección de anticuerpos es el ensayo de captura de anticuerpos.
Según este formato, el o los antígenos correspondientes al agente
infeccioso se inmovilizan en una fase sólida y se ponen en contacto
con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos
específicos para los agentes infecciosos. Después de un tiempo de
incubación adecuado que permita la formación de un complejo
inmunitario (es decir, complejo
anticuerpo-antígeno), los anticuerpos específicos de
los agentes infecciosos se unen al o a los antígenos inmovilizados
(es decir, reactivos de captura). Con posterioridad a la fase de
incubación, los complejos inmunitarios pueden detectarse usando
procedimientos inmunoquímicos estándar. Una ventaja importante
proporcionada por este formato de prueba es que en la mayoría de los
estados de enfermedades infecciosas pueden encontrarse altas
valoraciones de anticuerpos en la circulación sanguínea y, en
consecuencia, permiten el desarrollo de procedimientos altamente
sensibles para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. En
consecuencia, se realiza sistemáticamente la detección selectiva
serológica y el diagnóstico de hepatitis C para la detección de
anticuerpos frente a VHC en suero o
plasma.
plasma.
El formato de ensayo usado más comúnmente para
detectar anti-VHC es ELISA (ensayo de inmunosorbente
unido a enzima). Se ha conseguido una mejora progresiva en la
sensibilidad de pruebas de anticuerpos contranti-VHC
a través de tres generaciones de ensayos ELISA de detección
selectiva incorporando diferentes configuraciones o tipos de
inmunorreactivos (antígenos) de captura como proteínas virales
recombinantes o mezclas de polipéptidos sintéticos que corresponden
a diversas regiones de la poliproteína de VHC.
Las proteínas recombinantes o péptidos sintéticos
empleados como inmunorreactivos de captura para la detección de
anticuerpos de VHC contienen secuencias obtenidas de regiones
altamente conservadas de las proteínas no estructurales del virus
(por ejemplo, NS3, NS4 y NS5) y las proteínas estructurales
(proteínas de núcleo y de envoltura). La selección de las secuencias
de antígeno recombinante y antígeno de péptidos sintéticos se basa
en la posición de los determinantes antigénicos principales
(epítopos) de la poliproteína de VHC. Si un ensayo emplea antígenos
de proteínas recombinantes o antígenos de péptidos sintéticos, ambas
formas de antígenos deben contener la mayoría de los determinantes
antigénicos de la poliproteína de VHC para mostrar la especificidad
y sensibilidad requeridas para conseguir un rendimiento adecuado
para el diagnóstico de VHC. Normalmente, los inmunoensayos diseñados
para detectar anticuerpos específicos para la poliproteína de VHC
usan una combinación de péptidos sintéticos como inmunorreactivos de
captura, o una o más proteínas de antígenos recombinantes que pueden
contener todos los sitios antigénicos principales en una larga
cadena de polipéptidos contiguos. Esto se debe normalmente a que un
péptido sintético contiene sólo un determinante antigénico y, en
general, existe más de un determinante antigénico para una molécula
de proteína, por ejemplo, una poliproteína de VHC.
Por ejemplo, el documento
EP-0.489.968-A1 desvela el uso de
combinaciones de péptidos obtenidos de VHC para detectar anticuerpos
de VHC en sueros, usando un inmunoensayo ELISA. Se usa también un
enfoque similar en Jackson y col. (J. Med. Virol. [1997]
51:67-79), en el que se usan muestras homogéneas de
péptidos de VHC acoplados a albúmina de suero bovino (BSA) para
detectar anticuerpos de VHC en suero. Sin embargo, estos ensayos
tienen sensibilidad y selectividad relativamente bajas, y requieren
cantidades importantes de tiempo y experiencia para llegar al
resultado deseado.
Al uso de proteínas de antígenos recombinantes se
asocian numerosos inconvenientes. En primer lugar, la conformación
tridimensional de la cadena de polipéptidos resultante de
plegamiento aberrante puede producir secuestro de epítopos de la
superficie de la proteína. De este modo, la eficacia para
proporcionar un grado razonable de unión a un anticuerpo puede
reducirse o suprimirse, comprometiendo la sensibilidad y
especificidad como inmunorreactivo. Además, el plegamiento aberrante
de la cadena de polipéptidos puede producir epítopos estructurales
no presentes en los antígenos nativos que probablemente promoverán
reactividades cruzadas y unión no específica con otros anticuerpos,
produciendo potencialmente reacciones de falso positivo. En segundo
lugar, otros inconvenientes que se encuentran comúnmente durante la
producción a mayor escala de proteínas recombinantes y que
representan serias limitaciones en lo que respecta a su uso son:
expresión de bajo nivel del antígeno recombinante; inestabilidad del
sistema de expresión; degradación debida a proteólisis; baja
solubilidad de los antígenos recombinantes en soluciones acuosas
debido a una propensión a agregación; y baja recuperación durante
las etapas de proceso y purificación. En consecuencia, el desarrollo
de pruebas de diagnóstico fiables y altamente específicas para
infección por VHC ha sido problemático con el uso de los
procedimientos disponibles en la actualidad.
Así, aunque los procedimientos actuales se han
demostrado útiles para la determinación de infección por VHC,
persiste una necesidad de un ensayo de diagnóstico que incorpore el
uso de un inmunorreactivo que evite los inconvenientes aparentes
descritos anteriormente y, al mismo tiempo, proporcione una prueba
analítica específica y altamente sensible.
Según la presente invención, se proporciona una
composición de antígenos mosaico de VHC que, cuando se utiliza como
inmunorreactivo en un ensayo de detección selectiva de VHC,
proporciona una prueba precisa y altamente sensible para la
detección in vitro de anticuerpos contra VHC en suero,
plasma o sangre completa humana y que comprende dos o más péptidos
diferentes, caracterizado porque cada péptido: consiste en una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por
MSTNPKPQRKTKRNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2),
GQIVGGVYLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4),
ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6);
está acoplado covalentemente en N-terminal o
C-terminal a un componente transportador; y tiene
una proporción entre péptido y masa de transportador comprendida en
el intervalo de 0,5 a 8,0. La composición de antígenos mosaico está
pensada para su uso en pruebas de diagnóstico clínico en las que se
detecte selectivamente a los donantes de sangre u otros individuos
para determinar si están o no infectados con VHC.
Las proteínas de fusión recombinantes y los
polipéptidos de cadena larga que comprenden una porción o regiones
completas del genoma de VHC poseen ciertos inconvenientes en
relación con su desarrollo y utilización en ensayos de diagnóstico.
A pesar de los importantes avances técnicos realizados en el ámbito
de la expresión y purificación recombinante, su aplicación como
inmunorreactivos para pruebas de diagnóstico sigue adoleciendo de
importantes inconvenientes debido a las cuestiones técnicas
mencionadas anteriormente. Como se ha expuesto previamente,
proteínas de fusión recombinantes sufren problemas asociados a
procedimientos complicados de proceso y purificación, a su
susceptibilidad a proteólisis y degradación, a la baja solubilidad
en soluciones acuosas y al potencial de generar reactividades de
falso positivo; lo último procede de la formación de sitios de
epítopos interreactivos basados en homologías estructurales entre la
proteína de fusión y antígenos no relacionados. Además, dado que las
proteínas de fusión recombinantes son difíciles de purificar y
procesar, existe un riesgo potencial de contaminación por proteínas
extrañas obtenidas de las células del huésped usadas en el sistema
de expresión.
La producción de péptidos a través de síntesis
química usando procedimientos automatizados supera algunos de los
problemas identificados con el uso de medios recombinantes de ADN.
Sin embargo, cuando la longitud del péptido es mayor que cuarenta o
cincuenta restos de aminoácidos en longitud, aproximadamente, se
hace cada vez más difícil producir un producto de alta integridad
con resultados consistentes. En consecuencia, la síntesis química y
purificación de polipéptidos de cadena relativamente larga puede
conducir a menudo a errores de secuencia sustanciales que pueden
comprometer gravemente el rendimiento del diagnóstico. Además, una
mayor longitud de péptidos se asocia con un bajo rendimiento de
producción, altos costes de producción y características físicas que
pueden promover plegamiento aberrante, conduciendo así a baja
solubilidad.
El diseño y producción de péptidos sintéticos con
secuencias de aminoácidos mucho más cortas supera los inconvenientes
descritos anteriormente para polipéptidos de cadena larga y
proteínas de fusión recombinantes, pero dependiendo del sitio de la
molécula, pueden no ser suficientemente inmunorreactivos para fines
de diagnóstico. Esto se debe a que, aunque la secuencia puede
contener un sitio epitópico, un péptido de cadena corta puede no
estar orientado en la configuración adecuada necesaria para expresar
completamente el motivo estructural del epítopo, permitiendo así un
reconocimiento óptimo del anticuerpo. Sin embargo, acoplando los
péptidos antigénicos individualmente a través de unión covalente
específica de la orientación a un componente transportador, cada
determinante antigénico puede exponerse completamente para
reconocimiento y unirse a un anticuerpo anti-VHC.
Además, empleando una combinación de diferentes péptidos
superpuestos codificados a partir de regiones diferentes del genoma
de VHC que corresponden a los determinantes antigénicos principales,
puede conseguirse un ámbito más amplio de reactividad inmunoquímica
en comparación con una proteína de fusión o un polipéptido de cadena
larga. El producto resultante es una composición de antígenos
mosaico que comprende un número mayor de epítopos que se asocian
sólo a péptidos de interés. En cambio, las proteínas de fusión o
polipéptidos de cadena larga pueden contener sólo un número limitado
de epítopos, o epítopos escasamente expuestos, debido a efectos de
impedimento estérico que tienen como resultado un plegamiento
aberrante de proteínas.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar una composición de antígenos mosaico que es altamente
inmunorreactiva con anticuerpos contranti-VHC y
comprende dos o más péptidos diferentes, caracterizada porque cada
péptido: consta en una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo constituido por MSTNPKPQRKTK
RNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6); está acoplado covalentemente en N terminal o C-terminal a un componente transportador; y tiene una proporción entre péptido y masa de transportador comprendida en el intervalo de 0,5 a 8,0, evitando así los inconvenientes de usar proteínas de fusión recombinantes y péptidos sintéticos de cadena larga.
RNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6); está acoplado covalentemente en N terminal o C-terminal a un componente transportador; y tiene una proporción entre péptido y masa de transportador comprendida en el intervalo de 0,5 a 8,0, evitando así los inconvenientes de usar proteínas de fusión recombinantes y péptidos sintéticos de cadena larga.
La composición de la invención puede usarse para
la detección y diagnóstico de infección por VHC debido a su alta
especificidad, selectividad y sensibilidad de unión a anticuerpos
contranti-VHC.
Un objeto más de la presente invención es
proporcionar una combinación específica de diferentes péptidos
antigénicos de la invención obtenidos de la región central del
genoma de VHC que comprende sitios antigénicos principales y muestra
un alto nivel de inmunorreactividad ventajosa en la detección de
anticuerpos contranti-VHC.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición de antígenos mosaico que comprende
esencialmente una pluralidad de diferentes fragmentos de péptidos,
preferentemente seis en número, obtenidos de la región central del
genoma de VHC que están unidos covalentemente a un componente
transportador y que comprende dos o más péptidos diferentes,
caracterizada porque cada péptido: consta de una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por
MSTNPKPQRKTKRNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2),
GQIVGGVYLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4),
ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6);
está acoplado covalentemente en N terminal o
C-terminal a un componente transportador; y tiene
una proporción entre péptido y masa de transportador comprendida en
el intervalo de 0,5 a 8,0. Se ha determinado que varios sitios
epitópicos están contenidos en la región N-terminal
de la proteína de núcleo de VHC que son altamente inmunorreactivos
y, por tanto, útiles en la detección de anticuerpos de VHC. Así,
según la presente invención, un análisis serológico extenso ha
conducido al refinamiento y mayor definición de péptidos
inmunorreactivos que son útiles en la detección y diagnóstico de
infección por VHC. Además, el empleo de una combinación única de
seis péptidos de VHC solapados diferentes proporciona una
composición de antígenos mosaico que tiene un ámbito más amplio de
reactividad inmunológica y posee una expresión epitópica más
consistente que los antígenos de VHC producidos por tecnología
recombinante. Por tanto, las combinaciones de péptidos de antígenos
de VHC identificadas y desveladas en la presente memoria descriptiva
tienen sensibilidad aumentada y mayor especificidad para
proporcionar una detección más eficiente y consistente de
anticuerpos de VHC. Para determinar la eficacia de los péptidos
objeto para la detección de infección por VHC, se sometieron a
prueba de inmunorreactividad péptidos individuales, así como varias
combinaciones, con muestras especiales seleccionados previamente a
través de la detección selectiva de pacientes con sueros normales y
con VHC. Dichos paneles séricos se han caracterizado bien y se
proporcionan en los Ejemplos.
Según un aspecto particular de la invención, se
proporcionan seis péptidos de VHC diferentes que tienen secuencias
de aminoácidos definidas del modo siguiente, que se usan en la
composición de la invención:
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptido | Secuencia de aminoácidos | Posición del resto | ID SEC N°: |
| MDL-1 | MSTNPKPQRKTKRNTNRR | 1-18 | 1 |
| MDL 2 | KTKRNTNRRPQDVKF | 10-24 | 2 |
| MDL 3 | GQIVGGVYLPRRGP | 28-42 | 3 |
| MDL-4 | GPRLGVRATRKTSERSQP | 41-57 | 4 |
| MDL-5 | ATRKTSERSQPRGRRQPI | 48-65 | 5 |
| MDL-6 | PKARQPEGRAWAQPG | 66-80 | 6 |
en la que los códigos únicos de tres letras de
cada resto de aminoácido se identifican como:
\newpage
| A | Ala | alanina | L | Leu | leucina |
| R | Arg | arginina | K | Lys | lisina |
| N | Asn | asparagina | M | Met | metionina |
| D | Asp | ácido aspártico | F | Phe | fenilalanina |
| C | Cis | cisteína | P | Pro | prolina |
| E | Glu | ácido glutámico | S | Ser | serina |
| Q | Gln | glutamina | T | Thr | treonina |
| G | Gly | glicina | W | Trp | triptófano |
| H | His | histidina | Y | Tyr | tirosina |
| I | Ile | isoleucina | V | Val | valina |
La Figura 2 ilustra el modo en que estas
secuencias se extienden a las posiciones de restos de aminoácidos de
la poliproteína de VHC codificadas para la región central del genoma
de VHC.
Los péptidos definidos por los ID SEC Nº: 1, 2,
3, 4, 5 y 6 se han encontrado excepcionalmente inmunorreactivos con
anticuerpos de VHC. Una ventaja de esta reactividad es que el uso de
una combinación de los péptidos según la invención aumentará la
especificidad y la sensibilidad del ensayo inmunológico cuando se
compare con el uso de proteínas de fusión recombinantes o
polipéptidos grandes que sólo contienen un número limitado de
determinantes antigénicos. Además, el autor de la invención ha
determinado a través de extensa experimentación que la combinación y
selección de los seis péptidos descritos anteriormente, cada uno de
los cuales se extiende a una región de la proteína de núcleo entre
las posiciones 1 y 80, son óptimos para proporcionar sensibilidad y
especificidad aumentadas en la detección de anticuerpos
contranti-VHC. Se sintetizó un panel de péptidos
solapados entre las posiciones 1 y 186 y se sometió a prueba la
inmunorreactividad con un panel de suero humano disponible
comercialmente. Sin embargo, basándose en los resultados
experimentales, se determinó que toda la inmunorreactividad se
concentró en la región entre las posiciones 1 y 80. En consecuencia,
el empleo de cualquier péptido obtenido de una proteína de núcleo
situada después de la posición 80 daría como resultado una
composición que mostraría menor especificidad y sensibilidad y es,
por tanto, menos preferido en la práctica de la invención.
Según la presente invención, se ha determinado
también a través de extensa experimentación que los péptidos tienen
una longitud comprendida entre 15 y 19 restos de aminoácidos para
actuar óptimamente como antígeno de captura. Después de la
conjugación con un componente transportador, existe una mayor
tendencia a que los péptidos que tienen una longitud mayor que 20
restos de aminoácidos se plieguen para interaccionar con el
componente transportador, lo que puede alterar la expresión de
epítopos lineales que son esenciales para el reconocimiento de
anticuerpos de VHC. Por otra parte, se espera que la selección de
péptidos de menos de 12 restos de aminoácidos de longitud comprometa
probablemente su inmunorreactividad, debido a la capacidad limitada
de un anticuerpo de reconocer y unirse con eficacia a un
determinante antigénico que tenga un número de restos de aminoácidos
inferior al mínimo requerido.
Los péptidos de la presente invención pueden
prepararse por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo
procedimientos de síntesis química. Preferentemente, los péptidos
pueden sintetizarse fácilmente usando técnicas estándar, como el
procedimiento de síntesis de Merrifield [Merrifield (1963) J Am Chem
Soc 85:2149-2154]. Las ventajas de usar péptidos
sintéticos son bien conocidas. Por ejemplo, cuando se preparan
sintéticamente, puede controlarse la calidad de las composiciones de
péptidos de la presente invención y, en consecuencia, se puede
garantizar la reproducibilidad de los resultados de prueba. Además,
como se requieren cantidades muy pequeñas de péptido para cada
procedimiento de prueba, y dado que el gasto de preparar un péptido
es bajo, el coste resultante de la detección selectiva de líquidos
corporales para anticuerpos contra VHC es relativamente bajo. Otro
problema que puede minimizarse usando péptidos sintéticos es la
evitación de la reactividad cruzada con otros anticuerpos y un
aumento de los resultados de falso positivo causados por la
presencia de materiales antigénicos de los sistemas de expresión
usados en las pruebas de diagnóstico de tipo recombinante.
Se espera que en la medida en que se conserve la
actividad inmunoquímica de los péptidos de manera que sigan siendo
reconocibles por anticuerpos contranti-VHC, varios
aminoácidos de los péptidos según la invención puedan borrarse,
insertarse o sustituirse por otros aminoácidos o análogos o
derivados de aminoácidos debido a variaciones entre cepas entre
diferentes aislados de VHC. Se pretende que el uso de péptidos
antigénicos de VHC que tienen dichas secuencias de aminoácidos
diferentes esté dentro del ámbito de la presente invención, siempre
que, sin embargo, la variación no reduzca significativamente la
reactividad inmunoquímica del péptido con sueros de personas
infectadas con VHC. Otros tipos de análogos o derivados pueden
incluir también modificaciones químicas del péptido para facilitar
la conjugación a una molécula transportadora.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición particular de diferentes péptidos
seleccionados del grupo de secuencias de aminoácidos definidas por
ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. El uso de una composición peptídica de
los péptidos objeto proporciona la composición de antígenos mosaico
con un espectro más amplio de inmunorreactividad frente a un mayor
número de cepas de VHC, potenciando así la capacidad de los péptidos
antigénicos de reaccionar con anticuerpos específicos para un
intervalo más amplio de variantes de VHC.
Las diversas combinaciones de los péptidos objeto
se han sometido a ensayo de inmunorreactividad en la detección de
anticuerpos contranti-VHC a través de una extensa
experimentación, cuyos resultados se proporcionan en los
Ejemplos.
La composición de antígenos mosaico comprende una
pluralidad de seis péptidos antigénicos diferentes obtenidos de la
región central del genoma de VHC que están conjugados
individualmente en un componente transportador (por ejemplo,
proteínas, polipéptidos sintéticos o polímeros) o a una superficie
de soporte sólido químicamente activa. Preferentemente, los péptidos
están acoplados químicamente a un componente transportador. Más
preferentemente, se usa una proteína que no muestra interreactividad
con otros anticuerpos en suero humano y, por tanto, no afecta
adversamente a la sensibilidad y especificidad globales del
ensayo.
La composición de antígenos mosaico de la
presente invención está formada por acoplamiento químico de una
pluralidad de pequeños péptidos sintéticos a una proteína
transportadora antes de su uso como inmunorreactivo. Los péptidos
antigénicos, definidos por las ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, se han
hecho suficientemente antigénicos para reconocimiento y unión por un
anticuerpo mediante conjugación del extremo terminal amino o
carboxilo de cada péptido individual en una proteína transportadora.
Basándose en la selección y concentración particulares de péptidos
de la invención que se ensamblan conjuntamente en forma de un
conjugado, la suma de las propiedades antigénicas proporciona un
inmunorreactivo altamente eficaz para determinar infección por VHC
basándose en su especificidad, selectividad y sensibilidad
aumentadas de unión a anticuerpos contranti-VHC.
La presentación de los péptidos antigénicos de
VHC como una composición de antígenos mosaico que tiene la
configuración tridimensional descrita en la presente memoria
descriptiva supera ciertos inconvenientes que se encuentran a menudo
al usar otras disposiciones convencionales como, por ejemplo, en la
forma de proteínas de fusión recombinantes o polipéptidos de cadena
larga. Se espera que basándose en el plegamiento tridimensional de
estas moléculas grandes sea probable que la estructura terciaria
limite la exposición de algunos epítopos en la superficie de la
molécula, confiriendo por tanto menor inmunorreactividad a la
molécula en la unión a anticuerpos frente a VHC. En contraste, los
péptidos de cadena pequeña de la presente invención tienen
secuencias que carecen de aminoácidos extraños que puedan interferir
con la presentación (o exposición) de los epítopos. Inmovilizando
cada péptido en la superficie de una proteína transportadora, la
superficie global de cada péptido se hace accesible y, por tanto,
más fácilmente disponible para reactividad óptima con un anticuerpo
de entrada. En consecuencia, esta configuración tiende a aumentar la
sensibilidad del ensayo.
Además, la inmovilización de los péptidos en una
proteína transportadora a través de una unión covalente en sus
términos supera otros inconvenientes conocidos cuando se emplean
procedimientos que implican aplicación de los péptidos directamente
a una superficie de soporte sólido. A menudo, este procedimiento
produce una menor inmunorreactividad debido a que ciertos péptidos
antigénicos (por ejemplo, péptidos que tienen menos de 50 restos de
aminoácidos en longitud) no se unen bien a materiales de soporte
sólido para su incorporación en ensayos de diagnóstico debido a sus
propiedades intrínsecas. Por otra parte, el uso de una combinación y
formulación particulares de más de un péptido diferente hace cada
vez más difícil determinar condiciones apropiadas que serán
adecuadas idealmente para inmovilizar el grupo en conjunto.
Alternativamente, la inmunorreactividad de un péptido antigénico
puede aumentarse sustancialmente a través de acoplamiento covalente
a una proteína transportadora porque no se excluyen péptidos debido
a una baja unión a un soporte sólido de dispositivos de ensayo
convencionales, ni el antígeno se configura inadecuadamente para
provocar un enmascaramiento potencial de los epítopos a través de
impedimentos estéricos. El producto resultante es un antígeno
conjugado que comprende un gran número de epítopos que se asocian
sólo con los péptidos en sí. En consecuencia, la mejora en el
rendimiento del ensayo se obtiene no sólo por una combinación de
péptidos antigénicos conjugados, sino también a través de esta
disposición tridimensional particular que potencia la sensibilidad
y especificidad de unión globales de los péptidos a anticuerpos
contranti-VHC.
Para facilitar la unión covalente a la proteína
transportadora, cada fragmento de péptido de VHC está modificado
químicamente en su extremo terminal de carboxilo o amino según
técnicas bien conocidas para expertos en la materia. Según una forma
de realización preferida de la presente invención, cada péptido
sintético se modifica químicamente por la adición de un solo resto
de cisteína en su extremo terminal amino o carboxilo. Se muestra que
los péptidos de la presente invención son altamente reactivos cuando
se unen a proteínas transportadoras a través de cisteínas situadas
en sus términos C.
La conjugación de los péptidos con la proteína
transportadora (por ejemplo, HSA) puede conseguirse mediante medios
de unión a péptidos convencionales usando agente de unión adecuado
como, por ejemplo: MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida),
sulfo-MBS (éster de m-maleimidobenzoil
-N-hidroxisulfosuccinimida), SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
N-succinimidilo), sulfo-SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo), SMCC
(4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo), sulfo-SMCC
(4-(N-maleimido-
metil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo), SMPB (4-(p-maleimidofenil)-butirato de succinimidilo), sulfo-SMPB (4-(p-maleimidofenil)-butirato de sulfosuccinimidilo), LC-SPDP (6-[3(2-piridilditio)-propionamido] hexanoato de succinimidilo), sulfo-LC-SPDP (6-[3(2-piridilditio)-propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo), GMBS (éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida), sulfo-GMBS (éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida), SMPT (4-succinimidil-oxicarbonil-á-metil-á(2-piridilditio)tolueno), sulfo-LC-SMPT (hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[á-metil-á-(2-piridilditio)-toluamido]). Un agente de reticulación preferido usado en la práctica de la invención es éster de maleimidobenzoil -N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS).
metil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo), SMPB (4-(p-maleimidofenil)-butirato de succinimidilo), sulfo-SMPB (4-(p-maleimidofenil)-butirato de sulfosuccinimidilo), LC-SPDP (6-[3(2-piridilditio)-propionamido] hexanoato de succinimidilo), sulfo-LC-SPDP (6-[3(2-piridilditio)-propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo), GMBS (éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida), sulfo-GMBS (éster de N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida), SMPT (4-succinimidil-oxicarbonil-á-metil-á(2-piridilditio)tolueno), sulfo-LC-SMPT (hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[á-metil-á-(2-piridilditio)-toluamido]). Un agente de reticulación preferido usado en la práctica de la invención es éster de maleimidobenzoil -N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS).
La composición de antígenos mosaico que comprende
una pluralidad de péptidos diferentes seleccionados del grupo de
secuencias definido en las ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 puede
emplearse en inmunoensayos usados para detectar en líquidos
corporales la presencia de anticuerpos contranti-VHC
y, por tanto, ayudar al facultativo o clínico en el diagnóstico de
infección por VHC. En consecuencia, la presente invención
proporciona un inmunoensayo para detectar anticuerpos
contranti-VHC en una muestra biológica de prueba
usando la composición de antígeno mosaico.
Esencialmente, puede emplearse cualquier formato
de inmunoensayo que se diseñe para utilizar la composición de
antígenos mosaico como reactivo de captura para detectar anticuerpos
contranti-VHC. En general, una muestra biológica de
prueba sospechosa de contener anticuerpos
contranti-VHC se pone en contacto y se incuba con la
composición de antígenos mosaico durante un tiempo y en condiciones
que permiten que se produzcan interacciones anticuerpo/antígeno.
Preferentemente, la composición de antígenos mosaico se une a un
soporte sólido. Dependiendo del tipo de muestra biológica de prueba,
puede diluirse con un reactivo tampón adecuado, concentrarse o
ponerse en contacto con el soporte sólido sin cualquier manipulación
(o procesamiento) anterior. Por ejemplo, normalmente se prefiere
probar muestras de suero o plasma que se han diluido previamente, o
concentrar muestras como orina, para determinar la presencia y/o
cantidad de anticuerpo presente. Si en la muestra de prueba están
presentes anticuerpos contranti-VHC, se formará un
complejo inmunitario (es decir, complejo
antígeno-anticuerpo) con la composición de antígenos
mosaico y se une (o enlaza) al soporte sólido. Posteriormente se
lava el soporte sólido con una solución tampón para eliminar
cualquier componente no enlazado e irrelevante. Después de lavado,
el complejo inmunitario se detecta con un reactivo indicador y se
deja incubar durante un tiempo y en condiciones para que se forme un
segundo complejo. Los complejos inmunitarios se detectan por
cualquiera de una serie de técnicas conocidas, dependiendo del
formato del ensayo Por ejemplo, comúnmente se emplea un conjugado de
una inmunoglobulina antimamífero marcada con un componente generador
de señal como reactivo indicador. Pueden emplearse varios
componentes generadores de señales para ayudar a la detección de
complejos inmunitarios que se forman, como es convencional en la
técnica. Así, los componentes de generación de señales adecuados
incluyen, sin limitación, enzimas, radionúclidos, fracciones
luminiscentes, fluorescentes y quimioluminiscentes, partículas
magnéticas y partículas visibles directamente, como oro coloidal. La
presencia de un complejo inmunitario confirma la presencia de
anticuerpos contra VHC en la muestra de prueba y se determina
midiendo la señal generada. Como con muchos indicadores de
reactivos, la cantidad de anticuerpo presente es normalmente
proporcional a la señal generada. La presencia del complejo
inmunitario en la muestra de prueba puede detectarse visualmente o
instrumentalmente usando, por ejemplo, un dispositivo automatizado
de barrido e interpretación.
En consecuencia, un aspecto más de la presente
invención proporciona un procedimiento para diagnóstico o detección
in vitro de anticuerpos contranti-VHC
presentes en un sujeto que comprende las siguientes etapas:
- puesta en contacto de una muestra biológica de
prueba con una composición de antígenos mosaico que comprende una
pluralidad de péptidos diferentes definidos por las ID SEC Nº: 1, 2,
3, 4, 5 y 6; y
- detección de un complejo inmunitario formado
entre anticuerpos contra VHC en dicha muestra biológica y dicha
composición peptídica, caracterizada porque la presencia de dicho
complejo es indicativa de la presencia de anticuerpos contra VHC en
dicha muestra biológica.
La presente invención también proporciona un kit
de prueba para realizar un inmunoensayo que contiene la composición
de antígenos mosaico como un componente esencial. En consecuencia,
el kit contendrá normalmente, en contenedores adecuados, la
composición de antígenos mosaico, las formulaciones de anticuerpos
de control (positivo y/o negativo), el diluyente de muestra y/o el
tampón de lavado, y un reactivo indicador. Si el reactivo indicador
tiene una enzima como componente generador de señal, entonces el kit
también contiene un sustrato para la enzima si no genera una señal
directamente. La composición de antígenos mosaico se inmoviliza
preferentemente en un soporte sólido que es inmunológicamente
compatible con la composición de antígenos mosaico. En el kit se
incluirán generalmente instrucciones para realizar el ensayo.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención
proporciona un kit de prueba de diagnóstico para determinar la
presencia de anticuerpos contranti-VHC en una
muestra biológica de prueba, que comprende:
- una composición de antígenos mosaico que
comprende una pluralidad de diferentes péptidos definidos por los ID
SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, estando la composición de antígenos
mosaico preferentemente inmovilizada en un soporte sólido;
- un reactivo indicador, constituido
preferentemente por inmunoglobina antihumana de mamífero o proteína
estafilocócica A marcada con oro coloidal;
- estándares de control;
- un diluyente de muestra y/o tampón de lavado
para eliminar el material no unido; e
- instrucciones para realizar el ensayo.
En una forma de realización preferida de la
invención, el tipo de inmunoensayo empleado se basa en un formato de
ensayo de anticuerpo de captura que usa un sistema de ensayo de
punteado por inmunofiltración con fines de comodidad y utilidad en
el que se ha inmovilizado una o más especies de la composición de
antígenos mosaico en un soporte sólido para efectuar una reacción.
Las técnicas de punteado por inmunofiltración son bien conocidas en
la técnica. Por ejemplo, se añade una muestra a un panel de la
composición de antígenos mosaico dispuesto en una configuración en
un soporte sólido. Preferentemente, el soporte sólido es una
membrana de nitrocelulosa asegurada y protegida por un cartucho de
prueba y la unión de la composición al soporte es a través de
acoplamiento covalente o de absorción pasiva. El soporte sólido
preparado se pone en contacto con una muestra de prueba que efectúa
la captura de cualquier anticuerpo anti-VHC que
pueda estar presente en la muestra. Si existe algún anticuerpo, lo
reconocerá y se unirá a la composición de antígenos mosaico, con el
resultado de la formación de un complejo inmunitario
(antígeno-anticuerpo). Los anticuerpos capturados se
detectan por reacción del complejo inmunitario con un reactivo
indicador que es preferentemente una inmunoglobulina antihumana o
proteína A marcada con un componente que genera una señal
colorimétrica, como micropartículas de oro coloidal o poliestireno
teñido u otros tipos de tintes detectables visualmente.
Para ayudar a comprender la invención, se definen
a continuación varios términos.
Anticuerpo se refiere a una familia de
proteínas glicosiladas denominadas inmunoglobulinas, que pueden
combinarse específicamente con un antígeno. Por tanto, el término
"anticuerpo" es un término funcional, y puede estar también en
plural como "anticuerpos".
Antígeno se refiere a un compuesto que es
reconocido por un anticuerpo específico.
Muestra biológica de prueba se refiere a
un líquido biológico que es la fuente posible de los anticuerpos de
interés. Estos componentes son bien conocidos en la técnica e
incluyen muestras biológicas de prueba que pueden someterse a ensayo
mediante los procedimientos descritos en la presente memoria
descriptiva. Los ejemplos incluyen, sin limitación, líquidos
corporales humanos y animales como sangre completa, suero, plasma,
líquido cefalorraquídeo, orina y líquidos linfáticos.
Reactivo o inmunorreactivo de captura se
refiere a un antígeno que puede interaccionar con el analito de
interés (es decir, anticuerpo) y que permite la discriminación (o
separación) física entre analito y compuesto irrelevante o molécula
encontrados en la muestra para análisis. Normalmente, el reactivo de
captura está unido (o inmovilizado) directa o indirectamente a un
material de soporte sólido, permitiendo así la separación del
analito de la muestra de prueba.
Componente transportador incluye cualquier
polipéptido, proteína o polímero sintético o de ocurrencia natural
que tiene un peso molecular mayor que aproximadamente 5.000 daltons.
Las proteínas transportadoras representativas incluyen albúmina de
suero bovino (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina
de suero humano (HSA),
poli-L-lisina, gammaglobulina
bovina, citocromo C y otras macromoléculas similares.
Epítopo se refiere a aquella porción de un
antígeno que es reconocida específicamente por un anticuerpo.
También se refiere al sitio de determinante antigénico.
Complejo inmunitario se refiere a la
combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epítopo en un
antígeno.
Reactivo indicador comprende un componente
generador de señal capaz de generar una señal detectable por medios
externos que, a su vez, se conjuga con una molécula que puede unirse
específicamente uno de los miembros del complejo inmunitario que se
va a detectar.
Proteína de fusión recombinante es un
polipéptido en el que el o los antígenos virales forman parte de una
única cadena continua de aminoácidos y, por tanto, no está presente
en la naturaleza. Los antígenos virales pueden estar conectados
directamente entre sí mediante enlaces peptídicos o estar separados
mediante secuencias heterólogas de aminoácidos intermedias.
En la siguiente descripción, la invención se
explicará con la ayuda de las figuras anexas que ilustran formas de
realización preferidas de la presente invención y en las que:
La Figura 1 ilustra las distintas regiones de la
poliproteína codificadas por el genoma de VHC (aislado japonés) que
comprende la proteína de núcleo (C), la proteína de envoltura
principal (E1), la proteína de envoltura/proteína no estructural
(E2/NS1) y proteínas no estructurales (NS2, NS3, N4A, N4B y N5)
(Kato, N. y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:9524-9528); y
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
dentro de la región central del genoma de VHC y la posición de cada
uno de los seis péptidos, identificados como MDL-1 a
MDL-6, dentro de la secuencia.
El mayor ámbito y aplicabilidad de la presente
invención resultarán más evidentes a partir de la descripción
detallada y los ejemplos que se ofrecen a continuación. Sin embargo,
debe entenderse que la descripción detallada y los ejemplos
específicos, aunque indican formas de realización preferidas de la
invención, se ofrecen sólo a modo de ilustración, dado que para los
expertos en la materia, a partir de esta descripción detallada y de
estos ejemplos resultarán evidentes diversos cambios y
modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención.
Para desarrollar un inmunoensayo específico y
sensible que permita realizar un diagnóstico fiable la infección por
virus de la hepatitis C (VHC), es importante primero identificar
las regiones inmunodominantes del VHC que son beneficiosas para la
detección selectiva de esta enfermedad. La posible poliproteína de
VHC codificada para el genoma de VHC comprende 7 regiones distintas
que pueden contener potencialmente marcadores de diagnóstico útiles
para infección por VHC. Estas regiones son el núcleo (C) y la
envoltura (E1 y E2/N1), que codifican proteínas estructurales, y las
regiones NS2, NS3, NS4A/NS4B y NS5 (Kato, N. y col. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 9524-9528), que codifican
proteínas no estructurales. La Figura 1 ilustra la organización del
genoma de VHC que codifica una única poliproteína que se segmenta
para generar proteínas estructurales y no estructurales.
La extensa investigación de regiones
estructurales y no estructurales regiones del genoma de VHC ha
determinado que existen aproximadamente 200 determinantes
antigénicos diferentes adecuados para la utilización en diagnóstico
de VHC basado en procedimientos de detección selectiva realizados
para evaluar su reactividad inmunoquímica.
En particular, estudios previos han demostrado
que los péptidos obtenidos de la región central son altamente
adecuados para diagnóstico de VHC basado en los resultados obtenidos
con paneles de muestras humanas (Jackson y col. (1997) J Med Virol
51, 67-79; Hosein y col. (1991) Proc Natl Acad Sci
USA 86, 3647-3651; Nasoff y col. (1991) Proc Natl.
Acad Sci USA 88, 5462-5466; Shirai y col. (1994) J
Virol 68, 3334-3342; véase Cuthbert, J (1994) Clin
Microb Reviews 7, 505-532 para una revisión
extensa). Además, usando paneles de seroconversión se ha descubierto
que el uso de péptidos de la región central también acorta el
"período de ventana" para la detección de anticuerpos
contranti-VHC en sueros de individuos infectados
(Hosein y col. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88,
3647-3651, Cuthbert, J (1994) Clin Microb Reviews 7,
505-532). Además de contener varias regiones
inmunodominantes, o epítopos, la secuencia de región núcleo/cápside
de VHC se conserva de forma elevada y posee así un alto grado de
homología de secuencias entre las diferentes cepas de virus. Sobre
esta base, se ha postulado que los antígenos o péptidos obtenidos de
la región central son buenos candidatos para diagnóstico
anti-VHC y útiles para el desarrollo de una prueba
clínica que ofrezca discriminación mínima o nula entre los
diferentes genotipos de VHC.
La presente invención proporciona seis péptidos
antigénicos diferentes que se obtienen esencialmente de la región
central que, según se cree, definen la proteína de nucleocápside de
VHC. La región central se extiende desde el
N-terminal de la poliproteína de VHC a
aproximadamente el aminoácido 191 según se indica en la Figura 1. La
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 es la secuencia del
aislado JK1G de VHC.
Estos nuevos péptidos son útiles para el
diagnóstico de infección por VHC y contienen secuencias de
aminoácidos que poseen varios epítopos sucesivos dentro de la
proteína de nucleocápside que son altamente reactivos con
anticuerpos específicos a VHC. Se analizaron comparativamente las
propiedades antigénicas de cada péptido corto entre una serie de
candidatos posibles para determinar las mejores secuencias de
péptidos para detección de anticuerpos contranti-VHC
humanos encontrados en sueros de pacientes infectados. En
consecuencia, el autor de la invención ha determinado que la
combinación y selección de los seis péptidos descritos en la
presente memoria descriptiva que se extienden a una región de la
proteína de núcleo entre las posiciones 1 y 80 son altamente
inmunorreactivos con anticuerpos contranti-VHC
encontrados en sueros de individuos infectados. Se sintetizó un
panel de péptidos solapados entre las posiciones 1 y 186 y se
sometió a ensayo su inmunorreactividad con panel de suero humano
bien caracterizado. Sin embargo, basándose en los resultados, se
determinó que toda la inmunorreactividad se concentraba en la región
entre las posiciones 1 y 80.
Los péptidos antigénicos tienen las secuencias de
aminoácidos definidas del modo siguiente:
| Péptido | Secuencia de aminoácidos | Posición del resto | ID SEC N°: |
| MDL 1 | MSTNPKPQRKTKRNTNRR | 1-18 | 1 |
| MDL-2 | KTKRNTNRRPQDVKF | 10-24 | 2 |
| MDL-3 | GQIVGGVYLPRRGP | 28-42 | 3 |
| MDL-4 | GPRLGVRATRKTSERSQP | 41-57 | 4 |
| MDL-5 | ATRKTSERSQPRGRRQPI | 48-65 | 5 |
| MDL-6 | PKARQPEGRAWAQPG | 66-80 | 6 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 2 ilustra el modo en que secuencias se
extienden a las posiciones de restos de aminoácidos de la
poliproteína VHC codificada por la región central del genoma de
VHC.
Cada una de las seis secuencias de péptidos se
solapa con su secuencia adyacente o secuencial en un grado que varía
en las distintas partes entre aproximadamente 2 y 10 restos de
aminoácidos. Por tanto, los péptidos contienen colectivamente
secuencias en las que se ha encontrado ya que existen epítopos. El
autor de la invención ha descubierto que el solapamiento de regiones
entre los seis péptidos demuestra una mayor reactividad
inmunoquímica cuando se usan en combinación entre sí, al contrario
del uso de una sola secuencia. Además, se ha descubierto que los
seis péptidos diferentes de la presente invención muestran alta
sensibilidad en la detección de anticuerpos dirigidos con respecto a
la región central de la poliproteína de VHC. Una ventaja de esta
reactividad es que la selección y combinación particular de los seis
péptidos antigénicos según la invención aumenta enormemente la
especificidad y la sensibilidad del ensayo inmunológico, permitiendo
así determinar un diagnóstico más fiable de infección por VHC. Es
más probable detectar los anticuerpos que existen como respuesta a
un intervalo de variantes de VHC usando una combinación de péptidos
antigénicos en oposición a una proteína o polipéptido que tienen un
solo epítopo.
Para determinar la eficacia de los péptidos
objeto en la detección de anticuerpos de VHC, se sometió a prueba
la inmunorreactividad de los péptidos con muestras seleccionadas
previamente a través de la detección selectiva de miles de pacientes
con sueros normales y con VHC. En los Ejemplos se proporciona
información relativa a paneles séricos específicos de VHC.
Los péptidos tienen una longitud de 15 a 19
restos de aminoácidos para los que se ha determinado también que
funcionan óptimamente como antígenos de captura en el diseño y
desarrollo de la composición de antígenos mosaico. Después de la
inmovilización en un componente transportador, existe una tendencia
aumentada a que los péptidos tengan una longitud de más de 20 restos
de aminoácidos para adquirir estructuras tridimensionales aberrantes
debido a un plegamiento o interacción inadecuados con el componente
transportador, lo que es probable que produzca una exposición
reducida de determinantes antigénicos lineales. Por otra parte, se
espera que la selección de péptidos de menos de 12 restos de
aminoácidos de longitud comprometa probablemente su
inmunorreactividad debido a la capacidad limitada de un anticuerpo
de reconocer eficazmente y unirse a un determinante antigénico que
tiene menos de un número mínimo requerido de restos de
aminoácidos.
Los nuevos péptidos pueden prepararse por
procedimientos conocidos en la técnica que incluyen procedimientos
sintéticos químicos y tecnología de ADN recombinante. Los péptidos
representativos usados en la práctica de la invención que contienen
dominios antigénicos de la proteína de nucleocápside de VHC son
preferentemente péptidos obtenidos sintéticamente que tienen las
secuencias de aminoácidos definidas por los ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5
y 6. En consecuencia, los péptidos se han preparado a través de
síntesis química usando procedimientos de fase sólida automatizados
de manera que es posible evitar problemas asociados al uso de
tecnología recombinante. El uso de este procedimiento proporciona un
péptido antigénico reproducible de alta integridad con rendimientos
consistentes y, en consecuencia, puede garantizarse la
reproducibilidad de los resultados de prueba con respecto a aquellos
procedimientos que obtienen antígenos por tecnología
recombinante.
Los péptidos de la presente invención pueden
prepararse usando técnicas estándar de síntesis química que son
conocidas para los expertos en la materia de los péptidos, como la
tecnología de síntesis en fase sólida de Merrifield (Merrifield, J.
Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). Otros ejemplos
de las muchas técnicas disponibles pueden encontrarse en J.M.
Stewart y J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H.
Freeman Co., San Francisco, 1969; J. Meienhofer, "Hormonal
Proteins and Peptides", vol. 2, pág. 46., Academic Press (Nueva
York), 1973 para síntesis de péptidos de fase sólida; E. Schroder y
K. Lubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (Nueva York),
1965 para síntesis en solución clásica, "Synthetic Peptides: A
Users Guide", W.H. Freeman & Co. (Nueva York), 1992; y Jones,
"The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press, Oxford,
1994.
En general, estos procedimientos comprenden la
adición secuencial de uno o más aminoácidos o aminoácidos
adecuadamente protegidos a una cadena de péptidos creciente.
Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido está
protegido por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o
derivado puede unirse entonces a un soporte sólido inerte o
utilizarse para adición del siguiente aminoácido en la secuencia que
tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) protegido
adecuadamente, en condiciones adecuadas para formar la unión de
amida. A continuación se elimina el grupo protector de estos restos
de aminoácidos recién añadidos y se añade el siguiente aminoácido
(protegido adecuadamente), y así sucesivamente. Después de haber
unido todos los aminoácidos deseados en la secuencia adecuada, se
eliminan los grupos protectores restantes (y los soportes sólidos) o
secuencialmente o a la vez, para dar el polipéptido final.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una composición particular de péptidos diferentes
seleccionados del grupo de secuencias de aminoácidos definido por
las ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. El uso de una composición
peptídica de los péptidos objeto proporciona la composición de
antígenos mosaico con un espectro más amplio de inmunorreactividad
frente a un mayor número de cepas de VHC, lo que potencia la
capacidad de los péptidos antigénicos de reaccionar con anticuerpos
específicos para un intervalo más amplio de variantes de VHC. Se ha
probado la inmunorreactividad de las diversas combinaciones de los
péptidos objeto en la detección de anticuerpos
contranti-VHC a través de extensa experimentación, y
los resultados se proporcionan en los Ejemplos. Las composiciones de
péptidos de la presente invención pueden estar formadas por uno o
más de péptidos MDL-1, MDL-2,
MDL-3, MDL-4, MDL-5
y MDL-6 (es decir, ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6,
respectivamente). En una forma de realización preferida de la
presente invención, las composiciones de péptidos incluyen una
combinación de los seis péptidos MDL-1,
MDL-2, MDL-3,
MDL-4, MDL-5 y MDL-6
para la detección y el diagnóstico de VHC. Por otra parte, las
proporciones eficaces de los péptidos objeto en composiciones se
encuentran normalmente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente
8,0 en una proporción entre péptido y masa de transportador. Más
preferentemente, la combinación de péptidos se encuentra entre
aproximadamente 1,0 y 4,0 en una proporción entre péptido y masa de
transportador. Una composición peptídica preferida especialmente
para la detección y diagnóstico de infección por VHC es una mezcla
de péptidos MDL-1, MDL-2,
MDL-3, MDL-4, MDL-5
y MDL-6 en una proporción entre péptido y masa de
transportador de aproximadamente 4:1:4:4:1:2, respectivamente.
Según un aspecto importante de la presente
invención, el rendimiento inmunorreactivo óptimo se obtiene cuando
los péptidos objeto se inmovilizan individualmente a través de unión
covalente específica de la orientación por su extremo terminal con
un componente transportador, en oposición a su uso como péptidos
libres. De este modo, la exposición plena de cada dominio antigénico
se aprovecha para el reconocimiento y unión a anticuerpos
contranti-VHC. Se ha determinado a través de
experimentación que la composición peptídica unida a transportador
produce proporciones más altas de pruebas positivas/negativas en la
detección de anticuerpos contranti-VHC que las
composiciones de péptidos libres. Sobre esta base, los péptidos
unidos a transportador muestran superioridad sobre los péptidos
libres cuando se emplean como inmunorreactivo en ensayos de
inmunodiagnóstico rápidos.
Los componentes transportadores adecuados
incluyen proteínas, polipéptidos o polímeros, siempre que no
muestren interreactividad con otros anticuerpos en suero humano y,
por tanto, afecten adversamente a la sensibilidad y especificidad
global del ensayo. Preferentemente, las macromoléculas usadas para
conjugación con los péptidos sintéticos de la invención incluyen
cualquier molécula de polipéptido o proteína sintética o de
ocurrencia natural que tenga un peso molecular mayor que
aproximadamente 5.000 daltons que sea inmunorreactiva con una
muestra de prueba que va a analizarse y que no contribuya a o
reduzca la reactividad de los péptidos sintéticos.
Así, una proteína transportadora es una
macromolécula que es no reactiva en el análisis diagnóstico de
anticuerpos contra VHC y que lleva grupos funcionales que permiten
que los péptidos sintéticos se unan químicamente a su superficie.
Entonces puede inmovilizarse el conjugado resultante, directa o
indirectamente, a un sustrato sólido para uso posterior en un ensayo
de diagnóstico. Las proteínas transportadoras usadas comúnmente
incluyen albúminas, globulinas y hemocianinas, todas las cuales
pueden obtenerse de muchas fuentes. Las proteínas transportadoras
representativas incluyen albúmina de suero bovino (BSA), hemocianina
de lapa californiana (KLH), albúmina de suero humano (HSA),
poli-L-lisina, gammaglobulina bovina
y otras moléculas de polipéptido similares. También se incluye el
sistema de puente avidina/biotina en el que los péptidos pueden
formar complejos con biotina a través de sus términos C o N y pueden
inmovilizarse en avidina o estreptavidina adsorbidas en la
superficie sólida ["Chemistry of Protein Conjugation and
Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)].
Según una forma de realización preferida de la
invención, el rendimiento óptimo global del ensayo se consigue
cuando se selecciona HSA como proteína transportadora en comparación
con otras proteínas. Algunas ventajas obtenidas de su uso proceden
de que se trata de un transportador con marcado de alta densidad
debido a la posesión de un alto número de restos de lisina en la
superficie de la proteína. En general, esto hace más sencillo
modificar HSA químicamente con un agente de reticulación
heterobifuncional y la hace soluble incluso después de la
conjugación con el péptido. Por otra parte, como la HSA es de origen
humano, se evitan las reacciones epitópicas inducidas por el
transportador debido a anticuerpos extraños o inducidos en la dieta
en la circulación. Se sabe que estos tipos de reacciones se provocan
por proteínas obtenidas de fuentes externas y, así, son
potencialmente capaces de generar reactividades de falso positivo
cuando se diagnostica infección por VHC. A este respecto, el
desarrollo de una composición de antígenos mosaico que emplea HSA
como proteína transportadora facilita su uso en ensayos rápidos
basados en membrana usando plataformas de ensayo de flujo lateral o
transversal.
Un medio alternativo de inmovilizar los péptidos
a través de unión covalente específica de la orientación es
acoplarlos directamente a superficies de soporte sólido
preactivadas. Por ejemplo, la inmovilización de los péptidos puede
lograrse usando una superficie de soporte sólido que tiene ciertas
propiedades o especificidades químicas, como haber sido expuesta a
grupos reactivos que facilitarán la unión al péptido. Dependiendo
del tipo de superficie de soporte sólido preactivada usada (por
ejemplo, micropocillos, microesferas, membrana), los péptidos objeto
pueden o no haberse funcionalizado con un grupo reactivo apropiado
en su extremo terminal para llevar a cabo una reacción con estas
superficies. Entre dichas superficies que tienen grupos reactivos
expuestos son las que tienen preferentemente un grupo -COOH, -CHO,
-NH_{2}, -OH o un grupo vinilo que contiene un doble enlace
-CH=CH_{2} que puede activarse para dar especialmente grupos -CHO,
-COOH, -NH_{2} u -OH. Dichas superficies están disponibles
comercialmente (por ejemplo, superficie Covalink^{TM} NH,
microesferas ProActive®, Cortex Biochem Megabeads^{TM}, Estapor®
(Bang Laboratories, Inc.) , DynaI®) en varias formas que tienen en
su superficie -COOH, -NH_{2}, -OH y otros grupos reactivos.
Ventajosamente, los péptidos objeto están
acoplados químicamente a un componente transportador debido a la
flexibilidad proporcionada por este formato particular. Por ejemplo,
una mayor densidad de la composición de antígenos mosaico así
producida es más fácil de caracterizar y manipular porque puede
concentrarse en una región localizada de una zona de prueba de un
dispositivo de inmunoensayo. A este respecto, el coste global de
producción puede reducirse significativamente durante la fabricación
a mayor escala, ya que puede emplearse una menor cantidad del
inmunorreactivo en un dispositivo de inmunodiagnóstico de tipo
rápido. Alternativamente, el uso de una superficie de soporte sólido
químicamente activa conlleva el uso de una región mayor de una zona
de prueba para conseguir rendimiento inmunorreactivo adecuado y,
así, es menos preferida en la práctica de la invención.
Existen muchas técnicas bien descritas para
acoplar péptidos a proteínas transportadoras. Dependiendo de los
tipos de péptidos usados, la unión puede darse en el extremo N, el
extremo C o en el sitio interno del péptido. El péptido puede
obtenerse también para acoplamiento. Se ofrecen descripciones
detalladas de una amplia variedad de procedimientos de acoplamiento,
por ejemplo, en Van Regenmortel, M.H.V. Brian, J.P. Muller, S, y
Plaue, S, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, Vol. 19, Synthetic Polypeptides as Antigens, Elsevier
Press, Amsterdam, NY, Oxford, 1988.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, cada péptido de VHC se modifica químicamente en
su extremo terminal de carboxilo para facilitar la unión covalente a
una proteína transportadora. Para facilitar la conjugación con la
proteína transportadora, se añaden restos de aminoácidos en el
extremo terminal de carboxilo de cada péptido que no se haya
proporcionado ya en cualquiera de las secuencias de los péptidos
originales definidos por ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Se añaden los
mismos restos de aminoácidos al extremo terminal de carboxilo de
cada péptido para proporcionar el grupo funcional apropiado que
participará en el enlace covalente entre el péptido y la proteína
transportadora. Aminoácidos como cisteína, metionina, arginina,
tirosina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico y derivados de
los mismos son útiles para injertarse en el extremo carboxilo de los
péptidos sintéticos suministrando el grupo funcional apropiado para
acoplamiento a una proteína transportadora. En la invención, se
selecciona un resto de cisteína como aminoácido carboxilo terminarl
que participa en la conjugación de cada péptido en la superficie de
una proteína a través de un enlace simple.
Se ha encontrado que un resto de cisteína añadido
en el extremo terminal de carboxilo de un péptido es particularmente
útil para formar conjugados con grupos reactivos -SH como el grupo
funcional maleimida. Los grupos -SH del antígeno sintético
(incorporados como restos de cisteinilo u homocisteinilo en la
cadena de polipéptidos) reaccionarán con transportadores adecuados
que hayan sido activados con grupos funcionales maleimida. La
función -SH puede incorporarse en el antígeno por incorporación de
un resto Cys (u homo-Cys) en unión de aminoácido o
por reacción de una función amino (-amino o -amino de lisina) con
cisteína tiolactona. Alternativamente, la función -SH en el antígeno
puede activarse como el 2- o 4-tiopiridildisulfuro y
enlazarse a grupos -SH en un transportador adecuado. Esta secuencia
puede también invertirse con el -SH transportador activado como
tiopiridildisulfuro.
Numerosos reactivos y procedimientos para
conjugar péptidos a moléculas de proteínas transportadoras son bien
conocidos en la técnica y pueden usarse para formar la composición
de antígenos mosaico de la presente invención. Los componentes que
se van a conjugar, los péptidos y la proteína transportadora
contienen normalmente uno o más de uno o más de los siguientes
grupos funcionales que pueden usarse para conjugación: grupos tio,
grupos amino, grupos carboxilo y grupos hidroxilo, grupos fosfato o
grupos sulfo. Sin embargo, si faltan grupos funcionales apropiados,
pueden introducirse mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. Dichos procedimientos incluyen el uso de moléculas de
reticulación homobifuncionales y heterobifuncionales.
Pueden funcionalizarse dos moléculas con grupos
tiol mediante oxidación de los tioles a disulfuros.
Alternativamente, dichas moléculas pueden conjugarse mediante unión
de los tioles con un reactivo homobifuncional, como una
bis-maleimida o un compuesto bishaloacetilo. Pueden
conjugarse dos moléculas funcionalizadas con grupos amina mediante
el uso de reactivos homobifuncionales como gluteraldehído o ésteres
de disuccinimidilo. Sin embargo, a menudo puede alcanzarse un mejor
control de un proceso de conjugación utilizando un reactivo
heterobifuncional. Por ejemplo, puede conjugarse una molécula
funcionalizada con grupos tiol a una molécula funcionalizada con
grupos amino por medio de un reactivo heterobifuncional que posee
funciones de ésteres de succidinimilo y maleimida. Los ejemplos de
agentes de reticulación heterobifuncionales incluyen
ciclohexano-1-carboxilato de
succinimidil-4-(N-maleimidometilo)
(SMCC), 4-(yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (SIAB) y
4-p-maleimidofenil)butirato
de succinimidilo.
Se ha determinado que los péptidos sintéticos de
la invención conservan un alto grado de inmunorreactividad cuando se
unen químicamente a través de sus extremos carboxi (extremos C) a
proteínas transportadoras. La conjugación de los péptidos a una
proteína transportadora puede lograrse mediante medios de unión a
péptidos convencionales usando un agente de enlace adecuado, como
ácido p-maleimidobenzoico, ácido
p-metilditiobenzoico, anhídrido del ácido maleico,
anhídrido del ácido succínico, gluteraldehído u otros agentes de
enlace similares.
Más preferentemente, la conjugación de la
proteína transportadora (por ejemplo, HSA) con los péptidos objeto
en los que se ha introducido una cisteína terminal de carboxilo
pueden conseguirse mediante un medio de unión a péptidos
convencional usando un agente de unión adecuado, como: MBS (éster de
m-maleidobenzoil-N-hidroxisuccinimida),
sulfo-MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida), SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
N-succinimidilo), sulfo-SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo), SMCC
(4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo), sulfo-SMCC
(4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo), SMPB
(4-(p-maleimidofenil)-butirato de
succinimidilo), sulfo-SMPB
(4-(p-maleimidofenil)-butirato de
sulfosuccinimidilo), LC-SPDP
(6-[3(2-piridilditio)-propionamido]
hexanoato de succinimidilo),
sulfo-LC-SPDP
(6-[3(2-piridilditio)-propionamido]hexanoato
de sulfosuccinimidilo), GMBS (éster de
N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida),
sulfo-GMBS (éster de
N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida),
SMPT
(4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)tolueno),
sulfo-LC-SMPT (hexanoato de
sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-toluamido]).
Un agente de reticulación preferido usado en la práctica de la
invención es éster de
maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida
(sulfo-MBS).
La composición de antígenos mosaico proporcionada
en la presente memoria descriptiva puede utilizarse esencialmente en
cualquier formato de inmunoensayo que emplea un antígeno asociado a
VHC como reactivo de captura, como medio para detectar anticuerpos
frente a VHC. Basándose en el formato físico del ensayo y en el tipo
de indicador o reactivo de imagen usado, existen varias variaciones
en el diseño global de un inmunoensayo que se establecen sobre el
principio básico de miembros de unión específicos (por ejemplo,
antígeno y anticuerpo).
Se han puesto en práctica muchas configuraciones
de ensayo bien conocidas para los expertos en la materia. Usando la
composición de antígenos mosaico según la presente invención, estos
ensayos pueden adaptarse para detectar anticuerpo
anti-VHC y se contemplan dentro del ámbito de esta
invención (Portsman, T. y S.Y. Kiessig, 1992, "Enzyme Immunoassay
Techniques: An Overview", Journal of Immunological Methods
150:5-21; Hamilton, R.G. y N.F. Adkinson, 1989,
"Quantitative Aspects of Other Solid Immunoassays" en: ELISA
and Other Solid Phase Immunoassays (D.M. Kemeny y S.J. Challacombe,
eds.), pág. 57-82, John Wiley and Sons Ltd.,
Chichester; Tijssen, P., 1985, "Outline of the Strategies for
Enzyme Immunoassays" en: Practice and Theory of Enzyme
Immunoassays (R.H. Burdon y P.H. van Knippenberg, eds) pág.
9-20 Elsevier, Amsterdam).
En general, un procedimiento de uso de la
composición de antígenos mosaico para detectar anticuerpo
anti-VHC implica la puesta en contacto de la
composición de antígenos mosaico con una muestra biológica de prueba
sospechosa de contener anticuerpos contranti-VHC
para formar una mezcla. La mezcla se incuba en condiciones y durante
un tiempo que permitirá que los anticuerpos de VHC específicos
presentes en la muestra se unan a composición de antígenos mosaico,
formando así un complejo inmunitario (complejo
antígeno-anticuerpo). La formación de un complejo
inmunitario entre los anticuerpos de la muestra y la composición de
antígenos mosaico es un indicio de que en la muestra están presentes
anticuerpos de VHC. Los complejos inmunitarios así formados se
detectan mediante una serie de técnicas conocidas, dependiendo del
tipo de formato de ensayo empleado. Las técnicas adecuadas implican
generalmente la adición de un reactivo indicador que comprende un
componente generador de señal que es capaz de generar una señal
medible y que está unido a un miembro de unión secundario (por
ejemplo, anticuerpo antihumano o proteína A estafilocócica) para
reconocimiento específico de los anticuerpos
contranti-VHC unidos a la composición de antígenos
mosaico. El complejo inmunitario y el reactivo indicador se incuban
durante un tiempo específico y en condiciones específicas para
permitir la detección con sensibilidad y especificidad adecuadas.
Los tipos de componentes generadores de señales que se usan
comúnmente en reactivos indicadores incluyen enzimas, sondas
fluorescentes, sustratos y sondas quimioluminiscentes, marcadores
radioactivos, coloides de metales, microesferas coloreadas y
microesferas fluorescentes. Por ejemplo, los ensayos que generan una
señal a partir del complejo inmunológico que usa anticuerpos o
proteínas marcados con enzimas se refieren como ELISA (ensayos de
inmunosorbente unido a enzima) que son adecuados para detección
selectiva clínica rápida y a gran escala de suero de pacientes,
sangre para transfusión o derivados de sangre. Por otra parte,
pueden usarse varias estrategias bien conocidas para amplificar la
señal en ELISA para mejorar la sensibilidad y el límite de
detección. Estas estrategias incluyen el uso de sistema de puente
avidina-biotina, reacciones de cascada de sustrato y
conjugados de anticuerpos de enzimas/antienzimas, y similares.
El tipo de inmunoensayo realizado en el que se
utiliza la composición de antígenos mosaico puede ser, sin
limitación, una versión competitiva o no competitiva de formatos
homogéneos o heterogéneos. En un formato heterogéneo, la composición
de antígenos mosaico está ligada normalmente al soporte sólido para
facilitar la captura del analito de la muestra de prueba y facilitar
la eliminación de sustancias ligadas no específicamente que pueden
causar interferencia. A continuación se describen los tipos de
soporte sólidos que pueden usarse. Un ejemplo clásico de formato
heterogéneo es el formato de ensayo de anticuerpo de captura en el
que la composición de antígenos mosaico está unida a un soporte
sólido para absorción pasiva o mediante acoplamiento químico
covalente. Este formato de ensayo se usa comúnmente para detección
de anticuerpos. El soporte sólido se pone en contacto con la muestra
de prueba y si existe anticuerpo anti-VHC,
reaccionará con la composición de antígenos mosaico para formar un
complejo inmunitario (antígeno-anticuerpo). El
soporte sólido se lava con una solución para eliminar cualquier
material unido no específicamente para asegurar la especificidad
adecuada de la prueba. El complejo inmunitario, que sigue unido al
soporte sólido, puede detectarse mediante la adición de un reactivo
indicador. El reactivo indicador puede ser un anticuerpo antihumano
o proteína A estafilocócica ligada a un componente generador de
señal que puede generar una señal cuando el reactivo indicador se
une al complejo inmunitario. Dependiendo del tipo de reactivo
indicador usado, los tipos específicos de ensayos de sándwich
ampliamente usados por los expertos en la materia incluyen ensayos
de inmunosorbente
unido a enzima (ELISA), inmunoensayos fluorescentes (FIA) y radioinmunoensayos (ensayos RIA), por citar algunos.
unido a enzima (ELISA), inmunoensayos fluorescentes (FIA) y radioinmunoensayos (ensayos RIA), por citar algunos.
Alternativamente, el ensayo puede estar en un
formato homogéneo, en el que una solución resultante de la
incubación de la muestra biológica de prueba con la composición de
antígenos mosaico no requiere separación del anticuerpo capturado y
libre antes de la detección de anticuerpos de VHC en una muestra. La
aglutinación es el ejemplo más común de un formato homogéneo. En
este formato de ensayo, la composición de antígeno mosaico se
inmovilizaría en micropartículas de alto índice de refracción, como
una perla de látex, que se incuba a continuación con la muestra de
prueba. Si hay algún anticuerpo anti-VHC presente,
se unirá con la composición de antígenos mosaico causando
aglutinación (o arracimamiento) de las micropartículas. La
aglutinación puede detectarse visualmente o espectrofotométricamente
para análisis turbimétrico.
Algunos formatos de ensayos alternativos para la
detección de anticuerpos contranti-VHC son las
versiones competitivas de formatos de ensayo heterogéneos y
homogéneos. Un ejemplo de formato de ensayo heterogéneo competitivo
para detección de anticuerpos contranti-VHC que usa
la composición de antígenos mosaico es formato de ensayo de captura
de anticuerpos competitivo. En este formato, se mide la capacidad
del anticuerpo anti-VHC (analito) para competir con
un anticuerpo anti-VHC marcado, como un anticuerpo
policlonal de proteína de núcleo de anti-VHC con una
enzima. La magnitud de la competencia puede ser proporcional a la
concentración de analito dentro de un intervalo analítico
especificado. Un ejemplo de una versión competitiva de ensayo
homogéneo sería el formato de ensayo de aglutinación competitiva. En
este formato, se mide la capacidad del anticuerpo
anti-VHC (analito) para competir con la unión de la
composición de antígenos mosaico en solución con una proteína de
núcleo de anti-VHC policlonal o monoclonal
inmovilizada en anticuerpo de micropartículas de poliestireno. La
competencia tendría como resultado un descenso en la aglutinación.
La magnitud de la competencia en aglutinación puede correlacionarse
con la concentración de analito, como en el caso del formato de
ensayo heterogéneo.
Los soportes sólidos ventajosos para inmovilizar
la composición de antígenos mosaico de la presente invención son
bien conocidos para los expertos en la materia. Un soporte adecuado
dependerá del tipo de formato de inmunoensayo que se realice. Sin
embargo, se desea que el tipo de soporte elegido tenga
características adecuadas para inmovilización de macromoléculas y no
interfiera con la inmunorreactividad de la composición de antígeno
composición ni con la producción de una señal detectable desde el
componente generador de señal. Los ejemplos de soportes sólidos
incluyen platos de microvaloración, tubos de ensayo, micropartículas
(por ejemplo, poliestireno, de vidrio o magnéticas), membranas de
nitrocelulosa y nailon, plástico, plástico derivado, metal y
silicio, y otros.
El componente generador de señal usado como medio
para detectar la formación de un complejo inmunológico a través de
la unión antígeno/anticuerpo anti-VHC permitirá la
detección visual de un precipitado o la acumulación de
tinte/partícula (por ejemplo, micropartículas de látex/oro coloidal)
o la detección basada en la instrumentación, espectrometría,
fluorometría, radiometría o similares. Los ejemplos de componentes
generadores de señales incluyen, sin limitación, compuestos
fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina y ficoeritrina),
compuestos luminiscentes, elementos radiactivos, enzimas (por
ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y
beta-gatactosidasa) usados con sustratos
cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes, partículas magnéticas y
partículas visibles directamente (por ejemplo, oro coloidal). Estos
componentes generadores de señales pueden usarse en combinación con
el sistema de puente avidina/biotina para mejorar el límite de
detección y la versatilidad del ensayo.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la muestra biológica de prueba sospechosa de
contener anticuerpo anti-VHC se pone en contacto con
un soporte sólido al que se ha inmovilizado la composición de
antígenos mosaico. La inmovilización se consigue mediante adsorción
pasiva o unión covalente con un soporte químicamente activado para
permitir la exposición óptima de la composición de antígenos mosaico
en la superficie de dicho soporte sólido para promover
reconocimiento de anticuerpos específicos. Un material de soporte
sólido preferido para la inmovilización de la composición de
antígenos mosaico es soporte basado en membrana adecuado para su uso
en dispositivos de ensayo lateral y transversal. Esto incluye
cualquier membrana o material poroso a través del cual pueda migrar
o difundirse fácilmente una muestra de prueba por acción capilar.
Los ejemplos de materiales adecuados incluyen nitrocelulosa, nailon,
fibra de vidrio de polipropileno y acetato de celulosa. La selección
de elementos individuales (o combinaciones) de componentes de
membrana se basa en las características físicas y bioquímicas de la
muestra de prueba sometida a ensayo. La fluidez, la concentración y
valoración de anticuerpos, la concentración de proteínas, la
presencia de sustancias de interferencia potencial como lípidos e
inmunoglobulinas interreactivas son factores importantes que pueden
dictar el uso de soporte específico para conseguir rendimientos
óptimos. La muestra que se va a someter a prueba se incuba durante
un período de tiempo especificado y en condiciones específicas con
el soporte sólido recubierto de antígeno para permitir el
reconocimiento inmunitario. Si sucede que en la muestra de prueba
hay algún anticuerpo anti-VHC, se producirá la
unión con la composición de antígenos mosaico para formar un
complejo inmunitario y, por tanto, se fijará al soporte sólido. El
soporte sólido se lava con un reactivo tampón adecuado para eliminar
cualquier material unido no específicamente (o irrelevantemente). A
continuación se detecta cualquier complejo inmunitario específico
que se forme con un reactivo indicador que comprende anticuerpo
antihumano o proteína A conjugada con un componente generador de
señal. Esta mezcla se incuba durante un período de tiempo específico
y en condiciones específicas suficientes para permitir el
reconocimiento entre el anticuerpo antihumano marcado y el
anticuerpo anti-VHC (muestra), unido a la
composición de antígenos mosaico inmovilizados. La presencia de
cualquier anticuerpo anti-VHC en la muestra de
prueba se determina así midiendo una señal generada desde el
reactivo indicador, ya sea visual o instrumentalmente, en la que
dentro de un intervalo de concentración de anticuerpos especificado,
la concentración de anticuerpo en la muestra es proporcional a la
cantidad de señal generada. Los estándares y los controles se tratan
de la misma forma que la muestra de prueba. Dependiendo del tipo de
muestra biológica de prueba usado para determinar la infección por
VHC, puede diluirse con un reactivo tampón adecuado, concentrarse o
ponerse en contacto con la fase sólida sin ninguna manipulación. Por
ejemplo, antes de probar la muestra biológica, se prefiere
normalmente diluir inicialmente muestras de suero o plasma, o
concentrar muestras como orina, para permitir que la muestra se
someta a prueba dentro del intervalo de trabajo del ensayo y, así,
determinar con precisión la presencia y/o cantidad de anticuerpo
presente.
La composición de antígenos mosaico descrita en
la presente memoria descriptiva se empaquetará normalmente en forma
de un kit de diagnóstico para su uso en la detección de infección
por VHC. El kit contendrá normalmente, en contenedores separados, la
composición de antígenos mosaico, muestras de control positivas y
negativas, un reactivo indicador como, por ejemplo, un anticuerpo
antihumano marcado y un componente generador de señales auxiliar
(por ejemplo, sustrato de enzima) si el reactivo indicador no genera
una señal directamente. Como se describe en la presente memoria
descriptiva, el término "contenedor separado" se refiere a
cualquier material como vidrio, plástico (por ejemplo, polietileno,
polipropileno o policarbonato), papel, papel de aluminio y similares
capaz de contener dentro de límites fijos la composición de
antígenos mosaico de la presente invención, así como otros
componentes proporcionados en el kit de prueba de diagnóstico. Así,
por ejemplo, un contenedor separado puede ser un vial de vidrio
usado para contener una cantidad predeterminada de la composición de
antígenos mosaico o puede ser también un pocillo de un plato de
microvaloración al que se ha inmovilizado la composición de
antígenos mosaico, es decir, se ha unido covalentemente de manera
que es capaz de ligarse inmunológicamente por un anticuerpo. En el
kit se incluirán generalmente instrucciones para llevar a cabo el
ensayo. Dichas instrucciones describen generalmente la concentración
de inmunorreactivo o al menos un parámetro de procedimiento de
ensayo como las cantidades relativas de inmunorreactivo y muestra
que se mezclarán, los períodos de tiempo para las mezclas de
inmunorreactivo/muestra, la temperatura, las condiciones tampón y
similares.
El reactivo indicador debe comprender un
componente generador de señal capaz de indicar la formación de un
complejo inmunitario entre anticuerpos contranti-VHC
y el antígeno mosaico de la presente invención. El reactivo
indicador del kit de prueba de diagnóstico puede proporcionarse en
forma líquida o liofilizada. Cuando el reactivo indicador utiliza
una enzima como componente generador de señal, el sustrato de la
enzima puede proporcionarse también en un contenedor separado del
kit de prueba de diagnóstico.
El componente generador de señal usado como medio
para detectar la formación de un complejo inmunitario a través de
unión antígeno-anticuerpo anti-VHC
permitirá la detección visual de un precipitado o un cambio de
color, o detección automatizada por fluorometría,
espectrofotometría, medida radiométrica o similares. Los ejemplos de
componentes generadores de señales incluyen, sin limitación,
compuestos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina y
ficoeritrina), compuestos luminiscentes, elementos radiactivos,
enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano
picante y beta-galactosidasa) usados con sustratos
cromogénicos, fluorogénicos o luminiscentes, partículas magnéticas y
partículas visibles directamente (por ejemplo, oro coloidal). Estos
componentes generadores de señales pueden usarse en combinación con
el sistema de puente avidina/biotina para mejorar el límite de
detección y la versatilidad del ensayo.
Si se desea, la composición de antígenos mosaico
de la presente invención puede inmovilizarse normalmente a un
material de soporte sólido por adsorción pasiva o a través de unión
covalente usando un soporte (superficie) químicamente activado. Se
dispone de varios protocolos y estrategias de inmovilización de
antígenos que son bien conocidos para los expertos en la materia.
Los soportes sólidos ventajosos para inmovilización de la
composición de antígenos mosaico de la presente invención son bien
conocidos para los expertos en la materia. Un soporte adecuado
dependerá del tipo de formato de inmunoensayo que se realice y de
las características físicas y químicas de la composición de
antígenos mosaico. Sin embargo, se desea que el tipo de soporte
escogido no interfiera con la inmunorreactividad de la composición
del antígeno ni con la producción de una señal detectable del
componente generador de señal. Los ejemplos de soportes sólidos
incluyen placas de microvaloración de poliestireno, tubos de ensayo
y micropartículas (por ejemplo, poliestireno, vidrio o microesferas
magnéticas, nitrocelulosa y membranas de nailon, etc ).
En una forma de realización preferida de la
invención, se emplea el sistema de ensayo de punteado por
inmunofiltración para su uso en la composición de antígenos mosaico
en un kit de diagnóstico. Brevemente, el sistema de ensayo de
punteado por inmunofiltración utiliza un panel de la composición de
antígenos mosaico colocado en una matriz sobre un soporte sólido de
nitrocelulosa que se asegura mediante un cartucho de prueba. La
composición de antígenos mosaico se confina dentro de una zona de
reacción específica a través de la inmovilización a la superficie de
la superficie de membrana de nitrocelulosa. La inmovilización se
consigue mediante adsorción pasiva de los conjugados de proteína
transportadora-péptido que permiten que los péptidos
antigénicos se inmovilicen en una orientación favorable para el
reconocimiento por anticuerpos para evitar fugas durante el
procedimiento de prueba. La muestra de prueba se aplica en la
membrana de nitrocelulosa punteada con antígeno de VHC, permitiendo
que los anticuerpos contranti-VHC presentes en la
muestra sean capturados por los antígenos inmovilizados después de
que tenga lugar la reacción, se lave el cartucho de prueba con un
tampón para eliminar los materiales no ligados y cualquier complejo
inmunitario formado a través de reacciones
antígeno-anticuerpo se identifique usando reactivos
detectores adecuados bien conocidos. Un reactivo detector preferido
es un anticuerpo de inmunoglobulina antihumana al que se acopla un
componente generador de señal, preferentemente uno que sea
visualmente detectable como oro coloidal o micropartículas de
poliestireno teñidas. Preferentemente, la detección podría
cuantificarse usando un instrumento para densitometría colorimétrica
usando tecnologías de reflectancia o análisis de imágenes.
Además de su utilidad como reactivos de
inmunodiagnóstico, la composición de antígenos mosaico de VHC
descrita en la presente memoria descriptiva puede utilizarse
potencialmente como inmunógeno para estimular la producción de
anticuerpos en mamíferos sanos, incluido el ser humano. El
procedimiento comprende la introducción de una cantidad eficaz de la
composición peptídica, incluyendo una mezcla de estos seis péptidos
conjugados con un componente transportador que es compatible con
fines de vacunación (es decir, para elevar la respuesta a
anticuerpos específicos a VHC), en el cuerpo de un mamífero sano por
inyección intraperitoneal o subcutánea.
Además, los animales pueden inmunizarse para
elevar los anticuerpos policlonales a los epítopos de péptidos de
diagnóstico o para producir una respuesta inmunitaria en ratones
para preparación para tecnología de hibridoma para preparar
anticuerpos monoclonales a los péptidos. Estos y otros usos de la
composición de antígenos mosaico de VHC descrita será evidente para
los expertos en la materia.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de
VHC recogida en la Tabla 1 se obtuvieron de las secuencias de
aminoácidos de la poliproteína codificada para el genoma de VHC. Los
restos de aminoácidos usados en los péptidos se dan según un código
de una sola letra, del modo siguiente: A=Ala=alanina,
R=Arg=arginina, N=Asn=asparagina, p=Asp=ácido aspártico,
C=Cys=cisteína, E=Glu=ácido glutámico, Q=Gln=glutamina,
G=Gly=glicina, H=His=histi-
dina, I=Ile=isoleucina, L=Leu=leucina, K=Lys=lisina, M=Met=metionina, F=Phe=fenilalanina, P=Pro=prolina, S=
Ser=serina, T=Thr=treonina, W=Trp=triptófano, Y=Tyr=tirosina y V=Val=valina.
dina, I=Ile=isoleucina, L=Leu=leucina, K=Lys=lisina, M=Met=metionina, F=Phe=fenilalanina, P=Pro=prolina, S=
Ser=serina, T=Thr=treonina, W=Trp=triptófano, Y=Tyr=tirosina y V=Val=valina.
| Péptido | Secuencia de aminoácidos | Posición |
| Antígeno de núcleo | ||
| MDL-1 | \hskip0.5cm MSTNPKPQRKTKRNTNRR | 1-18 |
| MDL-2 | \hskip0.5cm KTKRNTNRRPQDVKF | 10-24 |
| MDL-3 | \hskip0.5cm GQIVGGVYLLPRRGP | 28-42 |
| MDL-4 | \hskip0.5cm GPRLGVRATRKTSERSQP | 41-57 |
| MDL-5 | \hskip0.5cm ATRKTSERSQPRGRRQPI | 48-65 |
| MDL-6 | \hskip0.5cm PKARQPEGRAWAQPG | 66-80 |
| MDL-7 | \hskip0.5cm GNQGLGWAGWLLSPY | 87-101 |
| MDL-8 | \hskip0.5cm SRPSWGPTDPRRRSRNLG | 103-120 |
| MDL-9 | \hskip0.5cm LMGYPLVGAPLGGAARA | 133-150 |
| MDL-10 | \hskip0.5cm TGNLPGCSFSIFLLALLS | 165-183 |
| MDL-11 | \hskip0.5cm STNPKPQRKTKRNTNRRPQD | 2-21 |
| MDL-12 | \hskip0.5cm IPASAYEVRNVSGI | 187-200 |
| Péptido | Secuencia de aminoácidos | Posición |
| Región E1 | ||
| MDL-13 | \hskip0.5cm SSIVYEAADMIMHT | 210-223 |
| MDL-14 | \hskip0.5cm SGHRMAWDMMMNW | 314-326 |
| MDL-15 | \hskip0.5cm SRCWVALTPTLAARN | 236-250 |
| Región E2 | ||
| MDL-16 | \hskip0.5cm QLVNTNGSWHINRTALN | 412-429 |
| Región NS4A | ||
| MDL-17 | \hskip0.5cm EQGMQLAEQFKQKALGL | 1717-1734 |
Los péptidos MDL-7 a
MDL-17 se recogen sólo como comparación.
Los péptidos de la presente invención pueden
sintetizarse por procedimientos estándar de síntesis de péptido,
como el procedimiento de síntesis en fase sólida.
Los péptidos sintéticos de VHC usados en la
práctica de los procedimientos de esta invención se sintetizan
usando técnicas de síntesis estándar de fase sólida como, por
ejemplo, las descritas por Merrifield, Adv. Enzymol.
32:221-296 (1969), y Fields. G.B. y Noble, R.L.,
Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214 (1990) o,
por ejemplo, por el procedimiento de síntesis de péptido múltiple
simultáneo usando la técnica de fase sólida descrito por Houghten,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5131-5135 (1985). Los
péptidos sintetizados se analizan a continuación por cromatografía
líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase invertida en una columna
Vydac C-18 (Alltech Associates, Inc., Ill.) con un
gradiente lineal de acetonitrilo del 0 al 60% en ácido
trifluoroacético al 0,1%. A continuación se purifican los péptidos
hasta homogeneidad mediante HPLC preparatoria usando condiciones
óptimas sugeridas por la cromatografía analítica. Las composiciones
de aminoácidos y las concentraciones de péptidos aislados se
determinan por sometimiento a hidrólisis de 24 horas en HCI 6 N en
tubos evacuados a 110ºC y posterior análisis en un Analizador de
Alto Rendimiento Beckman Modelo 6300.
Pueden emplearse varias estrategias para la
preparación de la composición de antígenos mosaico de la presente
invención. La mayoría de las estrategias se basan en el uso de un
panel de péptidos sintéticos o fragmentos de antígenos recombinantes
correspondientes a regiones inmunodominantes de los antígenos
nativos. Estos componentes de antígenos se acoplan a menudo a un
transportador inmunológicamente inerte para mejorar la
inmovilización y/o aumentar la densidad de antígeno en el soporte
sólido. Ambos fragmentos de péptidos y antígenos recombinantes
pueden prepararse para conjugación con un transportador por injerto
de un resto de cisteína en el extremo carboxilo terminal o el
extremo amino terminal del péptido o fragmento, permitiendo así que
se produzca acoplamiento a través de un agente de reticulación
reactivo de sulfhidrilo. Alternativamente, los péptidos que
contienen cisteína y los fragmentos de antígenos recombinantes
pueden acoplarse directamente a una matriz activada con un agente de
reticulación reactivo de sulfhidrilo. En general, estos
procedimientos de unión tienen una influencia mínima o nula negativa
en la realización de reconocimiento de anticuerpos, ya que el
componente de antígeno está ligado al componente transportador, o el
soporte sólido, a través de su región terminal. El
antígeno/transportador del complejo molecular puede ser adsorbido
pasivamente o acoplado covalentemente a una matriz sólida (reactivo
de captura inmovilizado). Existen varios procedimientos para ambas
estrategias. A continuación se proporciona un ejemplo general para
la preparación de la composición de antígenos mosaico de la presente
invención para detección de anticuerpos
contranti-VHC.
Los péptidos marcados como MDL-1
a MDL-17 se sintetizaron químicamente con un resto
en C terminal de cisteína. Los péptidos pueden acoplarse
covalentemente usando una reacción de reticulación con molécula
transportadora como albúmina de suero humano o bovino, polilisina,
citocromo C, etc. Comúnmente se usan reactivos agentes de
reticulación heterobifuncionales SMCC
[succinimidil-4(N-maleimidometil)
ciclohexano-1-carboxilato] y MBS
(éster de m-maleidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) para
acoplamiento de péptidos que contienen sulfhidrilo con grupos amino
libres de proteínas transportadoras. La reacción se lleva a cabo en
dos etapas. La primera etapa consiste en hacer reaccionar el grupo
reactivo de succinimidilo de los agentes de reticulación (por
ejemplo, MBS o SMCC) con los grupos amino libres de la molécula
transportador para producir un transportador activado por el agente
de reticulación. La segunda etapa consiste en acoplar el
transportador activado por el agente de reticulación con uno o más
de los péptidos que contienen cisteína MDL-1 a
MDL-17. Los conjugados
péptido-transportador conjugados se inmovilizan por
adsorción pasiva en micropartículas de poliestireno, platos de
microvaloración de poliestireno, membrana de nitrocelulosa u otros
soportes sólidos usados en inmunoensayos.
En una forma de realización preferida de la
invención, la composición de antígenos mosaico que comprende los
péptidos marcados como MDL-1 a MDL-6
(es decir, ID SEC Nº: 1, 2, 3, 4, 5 y 6) se sintetizaron
químicamente con un resto de cisteína en término C (es decir, ID SEC
Nº: 7, 8, 9, 10, 11 y 12). Las proporciones preferidas entre los
péptidos MDL-1, MDL-2,
MDL-3, MDL-4, MDL5 y
MDL-6 y las masas de transportador usado fueron de
4:1:4:4:1:2. El conjugado péptido-transportador se
inmovilizó por adsorción pasiva en una membrana de
nitrocelulosa.
Se dispone de varias versiones de formatos de
ensayo de captura de anticuerpos que difieren principalmente en el
tipo de soportes sólidos empleados y en la tecnología de detección
utilizada para determinar la presencia de complejos inmunológicos
formados por reconocimiento y unión de
antígeno-anticuerpo. Se usó un procedimiento de
ensayo de punteado por inmunofiltración (MedMira Inc, Halifax, NS)
para probar la inmunorreactividad del conjugado
péptido-transportador basado en detección de oro
coloidal usando una membrana de nitrocelulosa como soporte sólido, y
se describe a continuación.
Las muestras positivas/negativas al VHC usadas
para evaluar la composición de antígenos mosaico fueron
proporcionadas por el Dr. Spencer Lee (Director de
Virología/Inmunología, División de Microbiología, Departamento de
Patología y Medicina de Laboratorio) del Queen Elizabeth II Health
Sciences Center (Halifax, Nova Scotia). Todas las muestras se
sometieron a prueba mediante la prueba de VCH de Abbott usando la
plataforma de sistema Axsym. Como prueba de confirmación se usó el
ensayo de inmunoanálisis Riba-II (Chiron).
Las moléculas transportadoras activadas con
maleimida (KLH, BSA y HSA) se adquirieron en Pierce (Rockford, IL) y
se conjugaron con péptidos que contienen cisteína usando una
proporción entre péptido y masa de transportador de 0,5, salvo que
se indique lo contrario.
Normalmente, los conjugados se adsorbieron
pasivamente a una concentración de 1 mg/ml (tampón de bicarbonato,
50 mM, pH 9,6) aplicando un microlitro de conjugado
péptido-transportador en la membrana de
nitrocelulosa. La membrana punteada con antígeno se secó al aire.
Antes de la prueba, se cebó la membrana con 3 gotas de tampón de
lavado (Tris/fosfato/cloruro de sodio, pH 9,6 que contenía Tween®20
al 0,25%). Las pruebas se realizaron del modo siguiente.
Se añadió una gota de suero de muestra a la
membrana y después de la absorción completa de la muestra, se lavó
la membrana con 4 gotas de tampón de lavado. Se añadieron cuatro
gotas de solución de proteína A/oro coloidal (concentración
correspondiente a una densidad óptica de 2 a 520 nm) a la membrana y
se lavó la membrana con 3 gotas más de solución de lavado. Se
anotaron los resultados visualmente en un plazo de 5 minutos después
de la terminación de la prueba.
La identificación de los epítopos lineales
principales se llevó a cabo usando péptidos seleccionados
correspondientes a diversas regiones de la poliproteína de VHC y
paneles de sueros humanos positivos y negativos de VHC bien
caracterizados. Adicionalmente, se realizó una comparación de
diferentes componentes transportadores basada en una valoración de
sensibilidad/especificidad de diversos conjugados
péptido-transportador.
Se probó la inmunorreactividad de una serie de 10
péptidos que cubren regiones de núcleo (n=6), E1 (n=3) y E2 (n=1) de
la poliproteína de VHC usando un panel de muestras positivas a VHC
(n=10) y negativas a VHC (n=10). Se excluyeron eventualmente del
estudio los péptidos MDL-11 y
MDL-12, obtenidos de la región central, y el
péptido MDL-17, obtenido de la región NS4A, debido a
su baja solubilidad en soluciones acuosas.
Los péptidos se conjugaron individualmente con
tres transportadores diferentes (BSA, HSA y KLH) y se adsorbieron
pasivamente en un soporte de membrana de nitrocelulosa. Se
realizaron pruebas mediante formato de ensayo de punteado por
inmunofiltración usando una plataforma de ensayo transversal
disponible comercialmente (MedMira Inc, Halifax, NS).
Los resultados se clasificaron basándose en las
intensidades aparentes de puntos, del modo siguiente:
\newpage
| Símbolo | Significado |
| - | negativo (sin reacción) |
| S | sombra (reacción límite/indeterminada) |
| W+ | reacción débil |
| +1/+2/+3/+4 | reacción positiva/intensidad relativa (1 bajo \rightarrow 4 alto) |
| Transportador KLH | Panel VHC positivo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | 3+ | 3+ | 2+ | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
| 2 | 2+ | 1+ | 1+ | 2+ | 1+ | 2+ | 3+ | 1+ | 1+ | 1+ |
| 3 | 4+ | 1+ | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ |
| 4 | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | - | 2+ | 2+ | - | 2+ | - |
| 5 | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | 1+ | 2+ | 1+ | - | 2+ | 1+ |
| 6 | 2+ | - | 2+ | 2+ | S | W+ | - | - | 1+ | 2+ |
| 13 | S | S | W+ | 1+ | S | S | S | 1+ | S | S |
| 14 | W+ | W+ | S | S | - | - | - | - | - | - |
| 15 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 16 | S | W+ | - | - | W+ | - | - | - | - | - |
| Transportador KLH | Panel VHC negativo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | S | S | S | - | - | S | - | - | S | |
| 2 | W+ | W+ | - | - | - | - | - | S | S | - |
| 3 | W+ | - | S | - | - | - | - | - | - | - |
| 4 | - | - | S | - | - | - | - | - | - | - |
| 5 | - | - | S | - | S | - | - | - | - | - |
| 6 | S | - | S | - | - | - | - | - | - | - |
| 13 | S | - | - | - | S | - | S | - | - | - |
| 14 | S | - | S | - | S | - | - | - | S | - |
| 15 | - | S | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 16 | S | - | S | S | - | - | - | - | - | - |
| Transportador BSA | Panel VHC positivo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | 2+ | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ |
| 2 | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 3+ | 1+ |
| 3 | 4+ | 1+ | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ |
| 4 | W+ | W+ | S | S | W+ | - | S | S | S | S |
| 5 | 3+ | 3+ | 2+ | 3+ | 1+ | 2+ | 2+ | 1+ | 2+ | 1+ |
| 6 | 3+ | 1+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ | S | S | 1+ | 2+ |
| 13 | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | W+ | W+ | W+ | S | 2+ | W+ |
| 14 | S | W+ | S | S | S | S | S | S | S | S |
| 15 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 16 | S | W+ | S | S | S | S | S | S | S | S |
\vskip1.000000\baselineskip
| Transportador BSA | Panel VHC negativo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | S | - | - | - | - | S | - | S | - | - |
| 2 | S | - | W+ | - | - | - | - | - | - | - |
| 3 | S | - | S | S | - | - | S | S | - | - |
| 4 | S | S | S | - | - | - | - | S | S | - |
| 5 | 1+ | S | W+ | S | - | - | - | S | S | S |
| 6 | W+ | S | S | S | S | - | S | S | - | - |
| 13 | W+ | - | - | - | - | S | S | S | S | S |
| 14 | S | - | S | S | S | S | S | S | S | - |
| 15 | S | S | S | - | S | - | W+ | S | - | - |
| 16 | S | S | - | S | - | - | - | - | S | - |
| Transportador HSA | Panel VHC positivo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | 2+ | 2+ | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ |
| 2 | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1+ | 2+ | 1+ |
| 3 | 3+ | 3+ | 2+ | 2+ | 3+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 1+ |
| 4 | W+ | W+ | - | S | S | S | - | - | - | - |
| 5 | - | - | S | S | - | - | S | - | - | - |
| 6 | 3+ | 2+ | 2+ | 1+ | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1+ |
| 13 | 1+ | 1+ | 2+ | 1+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ |
| 14 | - | - | W+ | S | S | 1+ | S | S | S | S |
| 15 | 2+ | 3+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 1+ | 1+ |
| 16 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
\vskip1.000000\baselineskip
| Transportador HSA | Panel VHC negativo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| MDL | ||||||||||
| 1 | - | - | - | W+ | - | - | - | 1+ | - | - |
| 2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 3 | S | - | - | - | - | W+ | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5 | - | - | - | - | 1+ | - | - | - | - | - |
| 6 | - | - | - | - | - | S | - | - | - | - |
| 13 | - | - | - | - | - | - | - | - | S | - |
| 14 | - | - | - | - | - | - | - | W+ | - | - |
| 15 | - | - | - | - | S | - | - | - | - | - |
| 16 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Los resultados muestran que los conjugados de
péptidos preparados con HSA (seguido de BSA y KLH) dieron menos
reacciones de falsos positivos con las muestras negativas a VHC.
Los conjugados preparados con péptidos
MDL-1, MDL-2 y MDL-3
de la región de núcleo dieron reactividad más consistente con
muestras positivas a VHC independientemente del transportador usado
para preparar los conjugados. No se observó reactividad
significativa con estos conjugados cuando se probó con muestras de
negativas a VHC. Por otra parte, los conjugados preparados con
péptidos MDL-4, MDL-5 y
MDL-6 de la región central dieron resultados
diferentes dependiendo del tipo de transportador usado. El péptido
MDL-4 fue reactivo con la mayoría de las muestras
positivas a VHC cuando se conjugó con KLH, pero fue marginalmente
reactivo no reactivo cuando se conjugó con BSA y HSA. El péptido
MDL-5 fue reactivo con la mayoría de las muestras
positivas a VHC cuando se conjugó con KLH y BSA, pero no reactivo
cuando se conjugó con HSA. El péptido MDL-6 fue
reactivo con la mayoría de las muestras
positivas a VHC cuando se conjugó con HSA y BSA, pero escasamente reactivo cuando se conjugó con KLH.
positivas a VHC cuando se conjugó con HSA y BSA, pero escasamente reactivo cuando se conjugó con KLH.
Los conjugados preparados con péptidos
MDL-12, MDL-13 y
MDL-14 de la región E1 mostraron inmunorreactividad
baja e inconsistente con las muestras positivas a VHC con
independencia del transportador usado.
Los conjugados preparados con péptido
MDL-15 de la región E2 fueron consistentemente no
reactivos o escasamente reactivos con las muestras positivas a VHC
con independencia del transportador usado.
Basándose en estos resultados, HSA es un
transportador preferido para conjugación de péptidos de VHC y para
aplicación de detección de anticuerpos
contranti-VHC. Los resultados sugieren que HSA da
mayor especificidad (es decir, relación
señal-ruido).
La mayoría de la inmunorreactividad se sitúa en
la región central, es decir, en los péptidos MDL-1
a MDL-6, inclusive. La reactividad de los péptidos
MDL-4, MDL-5 y MDL-6
parece depender del tipo de transportador usado, lo que se atribuye
probablemente al efecto de la densidad de péptidos en la molécula
del transportador.
Los péptidos obtenidos de las regiones E1 y E2 no
son no adecuados para diagnóstico de VHC.
Se llevó a cabo una valoración de la
inmunorreactividad de péptidos seleccionados correspondientes a
restos 80 a 200 de la región central usando paneles de sueros
humanos positivos y negativos a VHC bien caracterizados.
Se probó la inmunorreactividad de una serie de 4
péptidos que cubrían la región central correspondientes a restos 80
a 200 con paneles de muestras positivas a VHC (n=5) y negativas a
VHC (n=5). Los péptidos se conjugaron individualmente con HSA usando
una proporción entre péptido y masa de transportador de 1 y después
de adsorbieron pasivamente en un soporte de membrana de
nitrocelulosa. Las pruebas se realizaron por formato de ensayo de
punteado por inmunofiltración plataforma ensayo de flujo transversal
disponible comercialmente (MedMira Inc., Halifax, N.S.).
Los resultados se clasificaron basándose en las
intensidades de punto aparentes, del modo siguiente:
| Símbolo | Significado |
| - | negativo (sin reacción) |
| S | sombra (reacción límite/indeterminada) |
| W+ | reacción débil |
| +1/+2/+3/+4 | reacción positiva/intensidad relativa (1 bajo --> 4 alto) |
\vskip1.000000\baselineskip
| Panel VHC positivo | Panel VHC negativo | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| MDL | ||||||||||
| 7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 8 | - | - | - | S | - | - | - | - | - | - |
| 9 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Los péptidos obtenidos de la región central entre
los restos 80 y 200 no parecen incluir regiones inmunodominantes
importantes, ya que ninguna de las cinco muestras positivas a VHC
reaccionaron con estos péptidos.
Se llevó a cabo una evaluación de
inmunorreactividad de varias combinaciones de péptidos
correspondientes a los restos 1 a 80 de la región central con sueros
humanos positivos y negativos a VHC.
Se probó la inmunorreactividad de varias de 6
péptidos (es decir, MDL-1 a MDL-6)
correspondientes a los restos 1 a 80 de la región central con
paneles de muestras positivas a VHC (n=10) y negativas a VHC (n=10).
Los péptidos se conjugaron individualmente con HSA usando una
proporción entre péptido y masa de transportador de 1 y después se
adsorbieron pasivamente en un soporte de membrana de nitrocelulosa.
Las pruebas se realizaron por formato de ensayo de punteado por
inmunofiltración usando una plataforma de ensayo de flujo
transversal disponible comercialmente (MedMira Inc., Halifax,
N.S.).
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptidos | ||||||
| MDL-1 | MDL-2 | MDL-3 | MDL-4 | MDL-5 | MDL-6 | |
| Combinación | ||||||
| 1 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 2 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 3 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 4 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 5 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 6 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | |
| 7 | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd | \surd |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se clasificaron basándose en
intensidades de punto aparentes, del modo siguiente:
| Símbolo | Significado |
| - | negativo (sin reacción) |
| S | sombra (reacción límite/indeterminada) |
| W+ | reacción débil |
| +1/+2/+3/+4 | reacción positiva/intensidad relativa (1 bajo \rightarrow 4 alto) |
\vskip1.000000\baselineskip
La combinación 7 da la máxima sensibilidad (es
decir, la máxima intensidad de punto) con las 10 muestras positivas
en comparación con las combinaciones 1 a 6. Todas las combinaciones
dan una especificidad comparable (es decir, no hay ninguna reacción
importante con muestras negativas a VHC).
Se llevó a cabo una determinación de la
proporción entre péptido y masa de transportador óptima para la
preparación de la composición de antígenos mosaico.
Los péptidos correspondientes a los restos 1 a 80
de la región central (péptidos MLDL-1 a
MDL-6 inclusive) se conjugaron individualmente con
HSA a diversas proporciones (es decir, proporciones entre péptido y
masa de transportador) y se adsorbieron pasivamente en un soporte de
membrana de nitrocelulosa. Se evaluó la inmunorreactividad con suero
positivo a VHC diluido en serie preparado a partir de una reserva de
cinco muestras positivas a VHC bien caracterizadas. Se realizaron
las pruebas por formato de ensayo de punteado por inmunofiltración
usando una plataforma de ensayo transversal disponible
comercialmente (MedMira Inc., Halifax, N.S.). Las proporciones
óptimas entre péptido y transportador se determinaron como las
proporciones que dan una intensidad entre 2+ y 1+ con la preparación
del suero de la reserva diluida en 1 en 5.
Los resultados se clasificaron basándose en
intensidades de punto aparentes del modo siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| Símbolo | Significado |
| - | negativo (sin reacción) |
| S | sombra (reacción límite/indeterminada) |
| W+ | reacción débil |
| +1/+2/+3/+4 | reacción positiva/intensidad relativa (1 bajo \rightarrow 4 alto) |
| Proporción entre péptido y masa | Péptidos | |||||
| de transportador | MDL-1 | MDL-2 | MDL-3 | MDL-4 | MDL-5 | MDL-6 |
| 1 | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ |
| 0,5 | 2+/1+ | 2+ | 2+/1+ | 2+/1+ | 2+ | 2+ |
| 0,25 | 1+ | 2+ | 1+ | 1+ | 2+ | 2+/1+ |
| 0,125 | 1+ | 2+/1+ | 1+ | W+ | 2+/1+ | 1+ |
| 0,0625 | W+ | 1+ | W+ | W+ | 1+ | W+ |
Basándose en los resultados anteriores y en un
total de aproximadamente 25 a 30 péptidos por transportador, las
proporciones entre péptido y masa de transportador óptimas usando
péptidos MDL-1, MDL-2,
MDL-3, MDL-4, MDL-5
y MDL-6, y HSA como transportador, son las
siguientes:
| MDL | Proporción de masas péptido/HSA |
| 1 | 0,5 |
| 2 | 0,125 |
| 3 | 0,5 |
| 4 | 0,5 |
| 5 | 0,125 |
| 6 | 0,25 |
La singular combinación de péptidos de núcleo de
VHC proporcionada como una composición de antígenos mosaico que
tiene la configuración tridimensional descrita en la presente
memoria descriptiva produce una mayor especificidad y sensibilidad
para la detección de anticuerpos humanos específicos para VHC y,
así, es extraordinariamente útil en el desarrollo de procedimientos
y ensayos de diagnóstico fiables para la detección de VHC.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: MedMira Inc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición de antígenos mosaico de VHC
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: G. Ronald Bell & Associates
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 2450, Station D
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Ottawa
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Ontario
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Canadá
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): K1P 5W6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: ASCII (Texto)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 2.311.022
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de julio de 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: G. Ronald Bell & Associates
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 3543-001PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (613) 233-5684
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (613) 233-7941
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln
Asp Val Lys Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Pro Arg
Arg Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp
Ala Gln Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln
Asp Val Lys Phe Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro
Arg Arg Gly Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp
Ala Gln Pro Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Una composición peptídica que comprende dos o
más péptidos diferentes que son reconocidos por anticuerpos
contranti-VHC, caracterizada porque cada
péptido:
consta de una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por MSTNPKPQRKTKRNTNRR (ID SEC
Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLLPRRGP (ID SEC Nº:
3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC
Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6);
está acoplado covalentemente en N terminal o C
terminal a un componente transportador; y
tiene una proporción entre péptido y masa de
transportador comprendida en el intervalo de 0,5 a 8,0.
2. La composición peptídica según la
reivindicación 1 caracterizada porque comprende los péptidos
MSTNPKP
QRKTKRNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6).
QRKTKRNTNRR (ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLLPRRGP (ID SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6).
3. La composición peptídica según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque para cada péptido,
la proporción entre péptido y masa de transportador está en el
intervalo de 1,0 a 4,0.
4. La composición peptídica según la
reivindicación 2, caracterizada porque las proporciones entre
péptido y masa de transportador para los péptidos MSTNPKPQRKTKRNTNRR
(ID SEC Nº:1), KTKRNTNRRPQDVKF (ID SEC Nº:2), GQIVGGVYLLPRRGP (ID
SEC Nº: 3), GPRLGVRATRKTSERSQP (ID SEC Nº:4), ATRKTSERSQPRGRRQPI (ID
SEC Nº:5) y PKARQPEGRAWAQG (ID SEC Nº:6) son 4, 1, 4, 4, 1 y 2,
respectivamente.
5. La composición peptídica según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque cada
péptido comprende un resto de cisteína adicional
C-terminal.
6. La composición peptídica según la
reivindicación 5, caracterizada porque dicho componente
transportador es una proteína.
7. La composición peptídica según la
reivindicación 6, caracterizada porque dicha proteína es
albúmina de suero humano (HSA).
8. La composición peptídica según la
reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque cada péptido está
acoplado covalentemente a dicha proteína a través del resto de
cisteína C-terminal usando un agente de
reticulación.
9. La composición peptídica según la
reivindicación 8, caracterizada porque dicho agente de
reticulación se selecciona entre el grupo constituido por MBS (éster
de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida),
sulfo-MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida), SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
N-succinimidilo), sulfo-SIAB
((4-yodoacetil)aminobenzoato de
sulfosuccinimidilo), SMCC
(4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato
de succinimidilo), sulfo-SMCC
(4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato
de sulfosuccinimidilo), SMPB
(4-(p-maleimidofenil)-butirato de
succinimidilo), sulfo-SMPB
(4-(p-maleimidofenil)-butirato de
sulfosuccinimidilo), LC-SPDP
(6-[3(2-piridilditio)-propionamido]
hexanoato de succinimidilo),
sulfo-LC-SPDP
(6-[3(2-piridilditio)-propionamido]hexanoato
de sulfosuccinimidilo), GMBS (éster de
N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)succinimida),
sulfo-GMBS (éster de
N-(\gamma-maleimidobutiriloxi)sulfosuccinimida),
SMPT
(4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)tolueno),
sulfo-LC-SMPT (hexanoato de
sulfosuccinimidil-6-[\alpha-metil-\alpha-(2-piridilditio)-toluamido]).
10. La composición peptídica según la
reivindicación 8, caracterizada porque dicho agente de
reticulación es éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS).
11. Un procedimiento in vitro para la
detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (VHC) en
un sujeto, caracterizado porque comprende las etapas de:
puesta en contacto de una muestra biológica de
prueba de dicho sujeto con una composición peptídica según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y
detección de un complejo inmunitario formado
entre dicha composición peptídica y los anticuerpos contra VHC
presentes en dicha muestra biológica de prueba; en la que
la presencia de dicho complejo inmunitario es
indicativa de la presencia de anticuerpos contra VHC en dicho
sujeto.
12. El procedimiento in vitro según la
reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición
peptídica se inmoviliza en un soporte sólido.
13. El procedimiento in vitro según la
reivindicación 12, caracterizado porque dicho soporte sólido
es una membrana de nitrocelulosa.
14. El procedimiento in vitro según una
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado
porque la presencia de dicho complejo inmunitario está determinada
por la adición de un reactivo indicador.
15. El procedimiento in vitro según la
reivindicación 14, caracterizado porque dicho reactivo
indicador comprende un componente generador de señal unido a una
molécula capaz de unirse específicamente a un anticuerpo
anti-VHC humano.
16. El procedimiento in vitro según la
reivindicación 15, caracterizado porque dicho componente
generador de señal es oro coloidal.
17. El procedimiento in vitro según la
reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque dicha molécula
capaz de unirse específicamente a un anticuerpo
anti-VHC humano es una inmunoglobulina antihumana
de mamífero o proteína A estafilocócica.
18. Un kit para detectar anticuerpos contra el
virus de la hepatitis C (VHC) en un sujeto caracterizado
porque comprende:
una composición peptídica según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10 en un contenedor adecuado, en el que
dicha composición peptídica está inmovilizada en un soporte sólido;
y
un reactivo indicador.
19. El kit según la reivindicación 18, que
comprende además:
- -
- estándares de control; y
- -
- un diluyente de muestra o tampón de lavado.
20. El kit según la reivindicación 18 ó 19,
caracterizado porque dicho soporte sólido es una membrana de
nitrocelulosa.
21. El kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque dicho
reactivo indicador comprende un componente generador de señal unido
a una molécula capaz de unirse específicamente a un anticuerpo
anti-VHC humano.
22. El kit según la reivindicación 21,
caracterizado porque el componente generador de señal es oro
coloidal.
23. El kit según la reivindicación 21 ó 22
caracterizado porque dicha molécula capaz de unirse
específicamente a un anticuerpo anti-VHC humano es
una inmunoglobulina antihumana de mamífero o proteína A
estafilocócica.
24. El kit según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 23 caracterizado porque se proporciona
en un formato de ensayo de punteado por inmunofiltración.
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