ES2211929T3 - Metodo de determinacion inmunologico. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE DETERMINACION INMUNOLOGICA-QUIMICA SEGUN EL PRINCIPIO DE COMPETITIVIDAD, DONDE SE DETERMINA LA CONCENTRACION DEL ANALITO EN UNA PRIMERA ETAPA DEL PROCEDIMIENTO Y EL ANALITO CONTINUA CON UN PRIMER Y UN SEGUNDO PARTNER DE ENLACE ESPECIFICOS Y CON UNION A UN TERCER PARTNER ESPECIFICO, DE FORMA QUE EL PRIMER PARTNER DE UNION ESPECIFICO SE ENCUENTRA UNIDO A UN PORTADOR INSOLUBLE EN AGUA Y EL SEGUNDO PARTNER DE UNION ESPECIFICO ESTA PROVISTO CON UN MARCADO DE GENERACION DE SEÑAL.
Description
Método de determinación inmunológico.
El presente invento concierne a un método
inmunoquímico de determinación según el principio competitivo, en
el cual se determina la concentración del analito en un
procedimiento de 1 etapa, y el analito compite en este caso con un
primer y un segundo partícipes específicos en la fijación en cuanto
a la fijación a un tercer partícipe específico en la fijación,
siendo unido el primer partícipe específico en la fijación a un
soporte insoluble en agua, y siendo provisto el segundo partícipe
específico en la fijación de una marcación generadora de señal.
Los métodos inmunológicos de determinación han
adquirido una importancia sobresaliente, desde que se efectuó la
primera descripción de un procedimiento radioinmunológico (1959) y
del primer procedimiento inmunoenzimático, en muchos sectores del
diagnóstico clínico.
En un procedimiento inmunoenzimático para la
determinación de un analito pasan a utilizarse partícipes
inmunológicos en la fijación y en la reacción, tales como p.ej.
haptenos, antígenos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Los
partícipes utilizados en la fijación y en la reacción pueden por una
parte presentarse en tal caso unidos a una fase sólida o pueden
estar conjugados con una marca generadora de señal, p.ej. una
enzima de marcación a través, p.ej., de un enlace covalente. Como
fase sólida se utilizan cuerpos moldeados cóncavos, tales como
p.ej. tubitos o cavidades en forma de placas de microtitulación,
pero también cuerpos moldeados convexos, tales como p.ej. esferas.
También encuentran utilización fases sólidas planas, tales como
p.ej. tiras de ensayo. Como enzimas de marcación se emplean con
frecuencia fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa
y peroxidasa de rábano picante, utilizándose como substratos
compuestos cromógenos, fluorógenos o luminiscentes. Las
composiciones de los tampones de muestra, de incubación y de
lavado, así como de los diferentes reactivos de substratos y
cromógenos, son conocidos para un experto en la materia.
A diferencia de los procedimientos
inmunoenzimáticos homogéneos, en el caso de procedimientos
inmunoenzimáticos heterogéneos, los partícipes en la reacción, no
fijados, son separados de los partícipes en la reacción, fijados,
mediante una separación de fases y subsiguientes etapas de lavado.
En tal caso, se establece diferencia entre el procedimiento de 1
etapa y el de 2 etapas. Mientras que en el procedimiento de 1 etapa
se lleva a cabo en total solamente 1 etapa de separación
(separación entre "fijado y libre" (bound/free)), ésta, en el
caso del procedimiento en 2 etapas, se lleva a cabo después de cada
etapa individual de incubación o reacción.
En términos generales, los procedimientos
inmunoenzimáticos se clasifican, según los principios inmunológicos
de reacción, en técnicas no competitivas y competitivas. Las
técnicas no competitivas (ensayos en "emparedado") se
distinguen porque los partícipes en la reacción, fijados a una fase
sólida y generadores de una señal, se presentan en un gran exceso
molar en comparación con el analito que se ha de determinar. Para
la estructuración del complejo en "emparedado" se necesitan por
lo menos dos sitios de fijación del analito, que son reconocidos en
cada caso por uno de los partícipes en la reacción fijados a una
fase sólida o generadores de una señal. La actividad de señalización
medida del complejo en "emparedado" que se ha formado, es en
tal caso directamente proporcional a la concentración del
analito.
Por el contrario, en el caso de las técnicas
competitivas, uno de los partícipes en la reacción, por causa de
pequeña concentración, se presenta limitando la formación del
complejo inmunológico, de manera tal que tiene lugar una
competencia entre partícipes en la reacción y el analito en cuanto a
por lo menos un sitio de fijación del partícipe común en la
fijación. Dentro de las técnicas competitivas, éstas pueden ser
subdivididas a su vez en dos grupos. En el primero de los grupos,
el número de los partícipes insolubilizados en la fijación es menor
que el número de los partícipes en la reacción, generadores de una
señal, y de la molécula que se ha de determinar, mientras que, en el
caso del segundo grupo, la concentración del partícipe en la
reacción, generador de una señal, es menor que el número de los
partícipes insolubilizados en la fijación y de las moléculas de
analito libres. En ambos casos, la actividad de señalización del
complejo formado es inversamente proporcional a la concentración
medida del analito.
Al realizar una comparación entre ambos
principios inmunológicos de reacción, se puede comprobar que las
conocidas técnicas competitivas son inferiores a las técnicas no
competitivas en lo que se refiere a la sensibilidad, el margen de
medición, la especificidad, la robustez y el período de tiempo de
incubación (EKINS R. (1985) CURRENT CONCEPTS AND FUTURE
DEVELOPMENTS: IN ALTERNATIVE IMMUNOASSAYS).
La diversa afinidad de los anticuerpos de suero,
que se han de detectar, determina por lo tanto muy esencialmente si
se ha de emplear el procedimiento de 1 etapa o el de 2 etapas. Al
detectar anticuerpos de baja afinidad, se ha manifestado como
ventajoso el procedimiento de 2 etapas frente al procedimiento de 1
etapa, especialmente si el período de tiempo de incubación del suero
se lleva a cabo como primera etapa durante una noche. Sin embargo,
hay que prestar atención a que en la segunda etapa de incubación no
se establezca ningún equilibrio entre los partícipes en la reacción
generadores de una señal, fijados, y los no fijados, lo cual
conduciría a una expulsión de anticuerpos analitos de baja afinidad.
La detección de anticuerpos de baja afinidad se puede hacer en
principio mejor con el procedimiento de 2 etapas que con el
procedimiento de 1 etapa, que es más fácil de realizar por el
usuario y más corto.
La pureza del antígeno fijado a una fase sólida,
por cuya fijación compiten, en un procedimiento inmunoenzimático
competitivo, tanto los anticuerpos que se han de detectar como
también los partícipes en la reacción, generadores de una señal,
desempeña un importante papel. Es decisiva para la sensibilidad de
la detección, en tal caso, la densidad de epítopos del antígeno
insolubilizado (KENNY G. et al. (1983) J. CLIN. MICROBIOL.
17, 655-665). Si se emplea una mezcla de proteínas,
tal como sucede, p.ej., en el caso de un antígeno de virus HAV
purificado, se puede perjudicar considerablemente la sensibilidad
de la detección cuando las porciones proteínicas específicas del
virus constituyan sólo una pequeña proporción en la proteína global
empleada. Con el fin de evitar esto, se debe de utilizar por lo
tanto, en los procedimientos conocidos, un antígeno
correspondientemente purificado en alto grado, estando vinculada la
producción del necesario grado de pureza con un considerable gasto,
y ejecutándose ésta correspondientemente de un modo difícil, caro y
largo (PURCELL R. et al. (1976) JOURNAL OF IMMUNOLOGY 118,
349-356). Especialmente en el caso de la detección
de anticuerpos anti-HAV de baja afinidad, que son
formados inmediatamente después de haberse efectuado una
vacunación, los diferentes dispositivos de ensayo para diagnóstico
obtenibles comercialmente presentan una mala sensibilidad. Tan sólo
mediante el empleo de un antígeno de HAV purificado o del antígeno
de una vacuna, se pudo mejorar la sensibilidad al efectuar la
detección de anticuerpos de baja afinidad (DELEM A. (1992)
BIOLOGICALS 20, 289-291).
La misión que constituye el fundamento del
presente invento consistió, por lo tanto, en desarrollar un
procedimiento que permitiese la detección de anticuerpos de baja
afinidad con ayuda del procedimiento de 1 etapa, y en tal caso se
puede utilizar un antígeno que se ha purificado sólo de modo
mínimo.
El problema planteado por esta misión se resolvió
en lo esencial mediante las formas de realización puestas a punto
en las reivindicaciones.
El procedimiento inmunoquímico conforme al
invento, para la determinación de un analito mediante un
procedimiento competitivo heterogéneo de determinación, incluye las
siguientes etapas:
- a)
- incubación del analito con unos partícipes en la fijación específicos, primero, segundo y tercero, estando fijado el primer partícipe específico en la fijación a una fase sólida insoluble en agua (partícipe en la reacción fijado a la fase sólida) y estando provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de una señal (partícipe en la reacción generador de una señal), y compitiendo el analito y los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, en cuanto a la fijación al tercer partícipe específico en la fijación (partícipe común en la fijación);
- b)
- separación de la marcación generadora de una señal, fijada a la fase sólida a través del tercer partícipe específico en la fijación, con respecto de la porción no fijada;
- c)
- medición de la señal generable por la porción fijada de la marcación; y
- d)
- determinación de la concentración de analito mediante comparación de los valores hallados en la etapa c) con una curva patrón, trazada en las mismas condiciones o calculada teóricamente,
caracterizado porque el analito es un anticuerpo
específico del virus de la hepatitis A (HAV), porque como primer
partícipe específico en la fijación se utiliza un anticuerpo o
correspondientes fragmentos de anticuerpo policlonal dirigido contra
HAV, como segundo partícipe específico en la fijación se utiliza un
anticuerpo o correspondientes fragmentos de anticuerpo monoclonal
dirigido contra HAV y como tercer partícipe específico en la
fijación se utiliza un antígeno HAV y porque los primer y segundo
partícipes específicos en la fijación reconocen diferentes lugares
de fijación en el tercer partícipe en la fijación.
Las fases sólidas, como tales, son en sí
conocidas para un experto en la materia. Ventajosamente, se emplean
fases sólidas insolubles en agua, tales como p.ej. partículas de
látex, partículas atraíbles magnéticamente o placas de
microtitulación.
Las marcaciones generadoras de una señal, como
tales, son en sí conocidas para un experto en la materia. Una de
tales marcaciones puede ser conjugada o bien directamente a los
pertinentes partícipes específicos en la fijación o a través de un
acoplamiento reversible, en sí conocido para un experto en la
materia, tal como p.ej. fijaciones entre biotina y estreptavidina,
fos y jun o anticuerpos y antígenos.
Como marcación generadora de una señal se emplean
preferiblemente componentes que están capacitados para la
quimioluminiscencia o fluorescencia, o enzimas que pueden convertir
substratos luminógenos, fluorógenos o cromógenos. En el caso de las
enzimas, se prefiere especialmente la peroxidasa de rábano picante.
En el caso de las marcaciones quimioluminiscentes, se prefieren
especialmente los compuestos descritos en los documentos de
solicitudes de patente europeas
EP-A-0.257.541 y
EP-A-0.330.050.
Usualmente, en el caso de los procedimientos
inmunoquímicos descritos, después de la separación de la fase
sólida y de la fase líquida, se mide la señal o bien en la fase
sólida o bien en el material sobrenadante separado. A partir de la
señal medida, se determina, de un modo en sí conocido para un
experto en la materia, la concentración del analito mediante una
denominada curva patrón. Para el trazado de la curva patrón, se
miden, mediando utilización del correspondiente procedimiento de
determinación, las señales para concentraciones conocidas del
analito, y éstas se convierten bien sea gráficamente o
matemáticamente, a la forma de una curva. Tal curva patrón también
se puede calcular teóricamente con una cierta exactitud, basándose
en las propiedades físicas y químicas conocidas de los partícipes
específicos en la fijación.
El procedimiento conforme al invento es aplicable
en el caso de métodos inmunoquímicos, en los cuales tiene lugar una
competencia entre el analito que se ha de determinar y los
partícipes en la reacción, generadores de una señal, y/o los
partícipes en la reacción insolubilizados, en cuanto a la fijación a
un partícipe común en la fijación.
El procedimiento conforme al invento se distingue
además porque el partícipe común en la fijación ha de ser purificado
sólo en un grado mínimo. Se ha establecido como esencial que el
partícipe común en la fijación tenga por lo menos dos diferentes
sitios de fijación, siendo reconocido uno de los sitios de fijación
por los partícipes en la reacción insolubilizados, mientras que los
partícipes en la reacción, generadores de una señal, se fijan al
segundo sitio de fijación. En el caso de la presencia del analito a
detectar, se efectúa entonces una competencia específica de la
molécula de analito con los partícipes en la reacción, generadores
de una señal, y/o los insolubilizados, en cuanto a la fijación al
partícipe común en la fijación. Se ha establecido como esencial en
tal caso para el procedimiento conforme al invento que, en el caso
de la ausencia de un analito, la formación de un complejo en
"emparedado" que forma una señal no sea impedida por la
competencia entre los partícipes en la reacción, insolubilizados, y
los generadores de una señal.
Sorprendentemente, en el caso del procedimiento
conforme al invento para la detección de anticuerpos contra el virus
de hepatitis A (HAV), se comprobó que en el caso de la ausencia de
un analito (= testigo negativo) no aparecía ninguna competencia
entre los partícipes en la reacción, generadores de una señal (=
conjugado de anticuerpos monoclonales específicos
anti-HAV) y los insolubilizados en la reacción
(anticuerpos policlonales específicos anti-HAV), en
cuanto a la fijación al partícipe común en la fijación (= antígeno
de HAV) y con ello se hace posible la formación de un complejo en
"emparedado", generador de una señal. Esto resultaba
sorprendente, por cuanto que los conocidos anticuerpos monoclonales
contra HAV pueden bloquear casi totalmente la fijación al virus de
anticuerpos policlonales en diferentes procedimientos inmunológicos
competitivos (LEMON S. et al. (1993) VIROLOGY 4,
285-295; HUGHES J. et al. (1984) J. VIROL.
52, 465-473; STAPLETON J. et al. (1987) J.
VIROL. 61, 491-498). Por el contrario, en el caso de
la presencia de moléculas de analito (= anticuerpos específicos
anti-HAV = testigo positivo) también se pudo
comprobar con sorpresa que puede tener lugar una competencia
específica en cuanto a los partícipes comunes en la fijación, entre
el analito y los partícipes en la reacción insolubilizados y/o los
partícipes en la reacción, generadores de una señal.
También era sorprendente la comprobación de que
el partícipe común en la fijación debía ser purificado sólo de modo
mínimo o nada en absoluto, para detectar ya con el procedimiento de
1 etapa anticuerpos de baja afinidad, que pueden aparecer en la fase
temprana de una infección o después de haberse efectuado una
vacunación. En el procedimiento conforme al invento, se proporcionan
posiblemente, mediante la presencia de partícipes en la reacción,
fijados a una fase sólida, las premisas que permiten una competencia
especialmente eficaz y específica entre el analito y los partícipes
en la reacción, generadores de una señal y/o fijados a una fase
sólida, en cuanto a los sitios de fijación del partícipe común en la
fijación. "Purificado de modo mínimo" en el sentido del
presente invento quiere decir que la proporción de proteína
específica es menor que 80%, preferiblemente menor que 50%, muy
preferiblemente menor que 20%.
Preferiblemente, en el marco del invento se
utilizan, como partícipes en la reacción, anticuerpos o fragmentos
definidos de anticuerpos. La preparación de anticuerpos policlonales
o monoclonales (KÖHLER G. y MILSTEIN C. (1975) NATURE 256,
497-497) se efectúa de acuerdo con un método en sí
conocido para un experto en la materia. Junto con anticuerpos
policlonales, se pueden emplear también anticuerpos monoclonales o
sus fragmentos (F(ab')_{2} o Fab'). Correspondientemente al
procedimiento conforme al invento, en este caso un partícipe en la
reacción es fijado a la fase sólida insoluble en agua, mientras que
el segundo partícipe en la reacción es empleado como componente
generador de una señal. Conforme al procedimiento según el invento,
un anticuerpo policlonal es fijado a la fase sólida y un anticuerpo
monoclonal, que está conjugado con una enzima de marcación, es
utilizado como partícipe en la reacción, generador de una señal. La
preparación del conjugado monoclonal, utilizado en el invento, es
asimismo conocida para un experto en la materia (artículo
recopilativo: ISHIKAWA E. et al. (1983) J. IMMUNOASSAY 4,
209-327).
La idoneidad de los anticuerpos utilizados se
puede determinar p.ej. mediante experimentos en sí conocidos para un
experto en la materia.
El procedimiento conforme al invento se puede
aplicar a todos los métodos inmunológicos de detección, en los
cuales pueda tener lugar en inmunoanálisis heterólogos una
competencia específica entre el analito y un partícipe en la
reacción fijado a una fase sólida y/o un partícipe en la reacción
generador de una señal, en cuanto a por lo menos dos sitios de
fijación de un partícipe común en la fijación.
Los siguientes Ejemplos deben de explicar el
invento:
HAV: Virus de hepatitis A
POD: Peroxidasa
SH: Grupos sulfhidrilo
ATCC: American Tissue Cell Culture
Se hacen reaccionar anticuerpos monoclonales
contra HAV con un reactivo heterobifuncional (TARRIMORE et
al. (1983) J. IMM. METH. 62, 123-131), después
de ello, se incuban con peroxidasa activada por SH (KING et
al. (1978) BIOCHEMISTRY 17, 1499-1506) y a
continuación se purifican por cromatografía en gel.
Para la preparación del antígeno de HAV se
infectan células obtenibles comercialmente, tales como p.ej.
fibroblastos pulmonares embrionales diploides humanos, con una cepa
de virus de hepatitis A caracterizada, tal como p.ej. la ATCC
HM-175. Después de varios días, el material
sobrenadante celular retirado se centrifuga, el sedimento celular
obtenido se recoge en un usual tampón de almacenamiento y el
antígeno se inactiva según un procedimiento conocido para un experto
en la materia. El antígeno inactivado se puede utilizar
ulteriormente sin ninguna purificación adicional.
El procedimiento conforme al invento no se limita
en tal caso al método antes señalado para la preparación del
antígeno de HAV, sino que también se pueden utilizar otros
procedimientos de preparación conocidos para un experto en la
materia a fin de aislar antígenos. Además de ello, se pueden emplear
también en el procedimiento conforme al invento preparaciones de
antígenos de HAV obtenibles comercialmente.
A una solución de revestimiento (carbonato de
sodio 0,01 mol/l pH 9,6) se le añade, bajo ligera agitación, una
determinada cantidad de anticuerpos anti-HAV
policlonales humanos (16 \mug/ml), y se homogeneiza durante
aproximadamente 30 minutos. El revestimiento de las cavidades
individuales de una placa de microtitulación se efectúa a
continuación con un volumen de revestimiento de 150 \mul. Después
de una incubación durante una noche a la temperatura ambiente, la
solución de revestimiento se filtra con succión y las cavidades
individuales de la placa de microtitulación se lavan dos veces con
una solución de lavado (ácido cítrico 0,25 mol/l/Tris 0,05 mol/l, pH
7,4). A continuación de la última etapa de lavado, se succionan
hasta quedar vacías las cavidades individuales de la placa de
microtitulación y se encierran conjuntamente con un agente desecante
empaquetado (p.ej. gel de sílice) por sellado en hojas de aluminio.
Las placas revestidas de microtitulación se almacenan a 4ºC hasta su
utilización.
El procedimiento conforme al invento es un ensayo
inmunoenzimático competitivo según el procedimiento de 1 etapa. A
las cavidades de una placa de microtitulación, que están revestidas
con anticuerpos policlonales humanos específicos
anti-HAV, se les añaden consecutivamente una muestra
a investigar (25 \mul), un conjugado (= anticuerpo monoclonal
específico anti-HAV conjugado con POD, 50 \mul) y
el antígeno de HAV (50 \mul). La placa revestida de
microtitulación, el conjugado y el antígeno de HAV se tomaron del
estuche de ensayo anti-HAV Enzygnost® (número de
encargo OQEC Behringwerke AG, Marburg). Si, en tal caso, la muestra
a investigar contiene los anticuerpos anti-HAV que
se han de determinar, éstos compiten con las moléculas del conjugado
y/o con los anticuerpos policlonales insolubilizados específicos
anti-HAV, en cuanto a la fijación al antígeno de
HAV. Después de un período de tiempo de incubación de 2 horas a
37ºC, se eliminan el conjugado en exceso y los reaccionantes no
fijados, mediante filtración con succión y lavado repetido 4 veces,
p.ej. con el procesador II ELISA de Behring o el procesador III
ELISA de Behring (Behringwerke AG, Marburg) y se determina la
cantidad del conjugado fijado mediante la adición de 100 \mul de
una solución de substrato y cromógeno (Behringwerke AG, número de
encargo OUVP) (temperatura ambiente, durante 30 min, protegida de la
luz). La reacción enzimática del cromógeno dihidrocloruro de
tetrametilbencidina se interrumpe mediante la adición de 100 \mul
de ácido sulfúrico 0,5 N, y se determina fotométricamente la
extinción a 450 nm. La extinción medida es en tal caso
indirectamente proporcional a la concentración de anticuerpo
anti-HAV, contenido en la muestra.
El procedimiento conforme al invento es un ensayo
inmunoenzimático según el procedimiento de 1 etapa, que contiene un
anticuerpo policlonal de origen humano, específico
anti-HAV, fijado a la fase sólida, y como anticuerpo
de conjugado, un anticuerpo monoclonal de ratón específico
anti-HAV. El procedimiento de comparación se
diferencia del procedimiento conforme al invento en que el
anticuerpo policlonal en fase sólida ha sido reemplazado por un
anticuerpo monoclonal.
En la Tabla 1 se representa el procedimiento
conforme al invento con el procedimiento enteramente monoclonal
alternativo, en relación con la intensidad de señal del testigo
negativo y el límite determinado de detección.
Valor de extinción | Límite de | |
del testigo negativo | detección | |
Procedimiento | ||
conforme al invento | 1.427 mE | 13 UI/l |
Procedimiento | ||
enteramente monoclonal | 543 mE | 28 UI/l |
La mayor intensidad de señal del testigo negativo
y el mejorado límite de detección del procedimiento conforme al
invento, constituido por un anticuerpo anti-HAV
policlonal y otro monoclonal, pone de manifiesto claramente la
superioridad del procedimiento conforme al invento frente a un
procedimiento enteramente monoclonal, alternativo.
El límite de detección del procedimiento conforme
al invento fue determinado con ayuda de diluciones definidas de un
patrón anti-HAV (patrón de WHO). En la Figura 1 se
reproducen en una representación semilogarítmica los valores medidos
de extinción de diferentes concentraciones de anticuerpos.
Condicionado por la constitución competitiva del ensayo, los valores
de extinción disminuyen al aumentar la concentración de los
anticuerpos.
La sensibilidad analítica calculada asciende a
13,4 UI/l, habiendo sido dividido a la mitad como valor de corte el
valor de la extinción del testigo negativo.
Con ayuda de seroconversiones de vacunas, se pudo
mostrar qué anticuerpos contra HAV de baja afinidad se pueden
detectar en una fase muy temprana con el procedimiento conforme al
invento. En la Figura 2 se representa la evolución cronológica de
una típica seroconversión anti-HAV (0193). Se
tomaron muestras de sueros en diferentes momentos a partir de
voluntarios de vacunación, y éstas se investigaron con el
procedimiento conforme al invento. Los valores representados de la
relación corresponden en tal caso a valores de cocientes entre las
extinciones medidas y al valor de corte. Unos valores de la relación
< 1 indican que con la aparición detectable de anticuerpos
anti-HAV ha tenido lugar una seroconversión. Tal
como se representa en la Figura 2, ya a partir de la segunda semana
después de haberse efectuado la vacunación, se pudieron detectar
seroconversiones con el procedimiento conforme al invento.
En la Figura 3 se cuantificaron los valores
medidos de la extinción de la seroconversión 0193 investigada con
ayuda de la curva de calibración de la Figura 1. Ya a partir de la
20 semana, se determinó una concentración de anticuerpos que
sobrepasa con claridad el valor de protección en vacunación de 20
UI/l.
Claims (9)
1. Procedimiento inmunoquímico para la
determinación de un analito mediante un procedimiento competitivo
heterogéneo de determinación, que incluye las siguientes etapas:
- a)
- incubación del analito con unos partícipes en la fijación específicos, primero, segundo y tercero, estando fijado el primer partícipe específico en la fijación a una fase sólida insoluble en agua y estando provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de una señal, y compitiendo el analito y los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, en cuanto a la fijación al tercer partícipe específico en la fijación;
- b)
- separación de la marcación generadora de una señal, fijada a la fase sólida a través del tercer partícipe específico en la fijación, con respecto de la porción no fijada;
- c)
- medición de la señal generable por la porción fijada de la marcación; y
- d)
- determinación de la concentración de analito mediante comparación de los valores hallados en la etapa c) con una curva patrón, trazada en las mismas condiciones o calculada teóricamente,
caracterizado porque el analito es un
anticuerpo específico del virus de la hepatitis A (HAV), porque como
primer partícipe específico en la fijación se utiliza un anticuerpo
o correspondientes fragmentos de anticuerpo policlonal dirigido
contra HAV, como segundo partícipe específico en la fijación se
utiliza un anticuerpo o correspondientes fragmentos de anticuerpo
monoclonal dirigido contra HAV y como tercer partícipe específico en
la fijación se utiliza un antígeno HAV y porque los primer y segundo
partícipes específicos en la fijación reconocen diferentes lugares
de fijación en el tercer partícipe en la fijación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como método inmunoquímico de
determinación se utiliza el procedimiento de 1 etapa.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque como componente generador de una señal
se utiliza una enzima.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque como enzima se utiliza peroxidasa de
rábano picante.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el analito que se ha de determinar es un
anticuerpo específico anti-HAV, de las subclases IgM
y/o IgG.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el tercer partícipe específico en la
fijación se emplea en una baja etapa de purificación que presenta un
contenido específico en proteínas de menos de 80%.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el tercer partícipe específico en la
fijación se emplea en una baja etapa de purificación que presenta un
contenido específico en proteínas de menos de 50%.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el tercer partícipe específico en la
fijación se emplea en una baja etapa de purificación que presenta un
contenido específico en proteínas de menos de 20%.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el tercer partícipe específico en la
fijación es un antígeno de HAV cultivado en un cultivo celular.
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