JPH10332696A

JPH10332696A - 多価被検物質の免疫化学的測定

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Publication number: JPH10332696A
Application number: JP10154051A
Authority: JP
Inventors: Stefan Dr Brust; シユテフアン・ブルスト; Hans-Peter Dr Hauser; ハンス−ペーター・ハウザー; Stefan Dr Knapp; シユテフアン・クナプ; Helmut Dr Peters; ヘルムート・ペーターズ
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 1998-12-18
Anticipated expiration: 2018-06-03
Also published as: JP4063405B2; CA2234416C; EP0882985A2; ATE223047T1; ES2183251T3; EP0882985B1; US6120990A; EP0882985A3; DE59805288D1; DE19723463A1; CA2234416A1

Abstract

(57)【要約】【課題】組換えにより調製される結合パートナーの使
用を含み、同時に数種の被検物質を既知方法で測定でき
る診断試験システムにおける感度および特異性の改善。【解決手段】第一および第二の結合パートナーを被検
物質と接触させ被検物質への結合パートナーの結合を既
知の方法によって検出するサンプル中の被検物質を定性
的または定量的に検出する免疫化学的方法であり、両結
合パートナーを同一の宿主内において融合タンパク質の
発現のために異なるベクター（Ｖ１およびＶ２）を用い
て組換えにより調製し、第一の結合パートナーはベクタ
ーＶ１中に融合タンパク質Ｆ１として発現させ、第二の
結合パートナーはベクターＶ２中に融合タンパク質Ｆ２
として発現させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検物質を定性的
または定量的に検出するための免疫化学的方法におい
て、第一および第二の結合パートナーを被検物質と接触
させ、被検物質への結合パートナーの結合を既知方法に
よって検出する方法に関する。本発明によれば、両結合
パートナーは、同一の宿主内において融合タンパク質の
発現のために異なるベクター（Ｖ１およびＶ２）を用い
て、すなわち第一の結合パートナーはベクターＶ１中で
融合タンパク質Ｆ１として発現させ、第二の結合パート
ナーはベクターＶ２中で融合タンパク質Ｆ２として発現
させて、組換えにより調製される。同時に数種の被検物
質の測定にも使用できるこの新規な方法の利点は、その
感度および特異性が既知の方法の場合に比べて優れてい
るという事実にある。

【０００２】

【従来の技術】疾患を誘発する物質、たとえば、ウイル
ス、細菌、寄生虫、アレルゲン、自己抗原または特定の
医薬に対する特異的抗体の形成を伴う疾患の診断のため
の慣用の免疫学的方法は、疾患誘発物質の抗原性特徴と
複合体を形成するこれらの抗体の能力に基づくものであ
る。

【０００３】ある種のイムノアッセイ法においては、た
とえば、特異的抗体（被検抗体）の含有物を試験するサ
ンプルを、疾患誘発物質の抗原性構造を適当な既知の支
持材料上に固定化してその抗原性構造と接触させる。サ
ンプル中に存在する被検抗体は、支持材料上に固定化さ
れた疾患誘発物質の抗原性構造に免疫複合体として結合
し、ついで検出される。検出抗体、またはサンプルの被
検抗体もしく被検物質それ自体と複合体を形成できる他
の特異的受容体（たとえば、プロテインＡ）を検出に使
用することができる。

【０００４】一般に、検出試薬は結合した抗体の量の測
定を可能にする標識をもっている。一般的な標識の例に
は、放射活性同位元素、酵素、蛍光物質、リン光物質ま
たは化学発光物質、安定な不対電子を有する物質、赤血
球、ラテックス粒子、磁性粒子および金属ゾルがある。
これらの方法を実施するためには、均一および不均一
（単一工程および多重工程）試験の両実施態様が知られ
ている。不均一実施態様の場合は、方法の各工程は分離
過程（洗浄工程）で終結する。しかしながら不均一イム
ノアッセイの場合、実施が極めて容易な単一工程法は疾
患マーカーのすべての検出には適当ではない。技術的理
由から、２工程または多重工程法を用いなければならな
いことが多い。

【０００５】二重抗原サンドイッチイムノアッセイまた
は抗体ブリッジ試験と呼ばれる方法が知られている。こ
れらの方法では、１種または２種以上の固相抗原、検出
される特異的被検物質（単数または複数）、および１種
または２種以上の標識された接合抗原を互いに接触させ
る。特異的被検物質の存在下には、接合抗原上の標識に
よって測定できる複合体が形成される。ドメインが多数
のコピー中に存在する被検物質の抗原結合ドメインによ
って架橋される抗原の均一な提示は、複合体の形成速度
および安定性に重要である。

【０００６】使用される抗原が、天然に存在する原核細
胞もしくは真核細胞または組換えにより改変された原核
細胞もしくは真核細胞から単離されるか、あるいは化学
合成により得られる実施態様は、本技術分野の熟練者に
は周知である。これらの実施態様は、とくに被検物質の
両結合パートナーが同一宿主から単離された場合に、こ
れらの大部分の場合で２つの結合パートナーの抗原提
示、グリコシル化の程度およびコンフォーメーションが
酷似することから、極めて感度が高い。しかしながら、
これらの実施態様の場合の欠点は、固定化相および標識
相の両者に存在する宿主の特異的構成成分および／また
は不純物が、これらの宿主の特異的構成成分および／ま
たは不純物に対する受容体の存在の可能性により偽陽性
反応を招くことであり得ることである。

【０００７】結合パートナーまたはそれらの抗原的に活
性な残基を含まない宿主の特異的構成成分および／また
は不純物を添加することによりこの干渉を抑制する方法
は本技術分野の熟練者には周知である。しかしながら、
この干渉の抑制は低グレードの非特異的反応の場合にし
か成功しない。実質的に大量の干渉抑制成分の使用が要
求される強力な非特異的干渉の場合には、しかしなが
ら、特異的なシグナルも強力に阻害されるという欠点が
ある。

【０００８】EP-0 307 149 には、宿主の特異的構成成
分および／または不純物による干渉を可能な最大限度ま
で回避するための他の方法が開示されている。この特許
には異なる宿主生物体から単離される組換えにより調製
されるタンパク質に基づく二重抗原サンドイッチ酵素イ
ムノアッセイが記載されている。この方法の利点は均一
な不純物による干渉は極めて少ないかまたは全くない一
方、用いられる２つの受容体、Ｒ１およびＲ２が異なる
宿主生物体中で異なるフォールディングを受け、異なっ
て提示されるという欠点がある。これは検出すべき被検
物質との特異性の低い反応を招来し、その結果、二重抗
原サンドイッチ酵素イムノアッセイの感度を低下させ
る。

【０００９】二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイ
における非特異的干渉の回避の可能性に関する限りでの
他の選択は熟練者には周知のように、一方では組換えに
より調製されたタンパク質から、他方では合成により調
製されたペプチドから試験を構成することである。この
場合も、２つの受容体Ｒ１およびＲ２の異なるフォール
ディングと提示により感度の低下を生じる。

【００１０】宿主システムにおける組換えタンパク質の
発現については多様な選択が熟練者に周知である。既知
の方法（Current Protocols of Molecular Biology, Wi
leyInterscience, 1995, 補遺30）は、所望の宿主中で
の複製が可能で、さらに、ベクター含有細胞の選択を可
能にする選択可能な性質、たとえば抗生物質抵抗性をコ
ードするいわゆるベクターに所望の抗原をコードするＤ
ＮＡ配列をクローン化するために使用される。ベクター
はまた、組換え抗原の遺伝子の５′末端に、宿主のＲＮ
Ａポリメラーゼ、または他の方法で利用されるＲＮＡポ
リメラーゼが組換え抗原のｍＲＮＡのコピーを開始させ
ることができる配列のプロモーター配列も包含しなけれ
ばならない。理想的には、このプロモーターは、たとえ
ばｌａｃリプレッサーシステムにＩＰＴＧを添加するこ
とにより達成できるように特異的に誘導することが可能
である。ベクターは、ｍＲＮＡの翻訳を終結させるＤＮ
Ａ配列も含有しなければならない。

【００１１】ｍＲＮＡにおける翻訳開始は、この場合
は、ベクターシステムによってまたは組換え抗原ＤＮＡ
自体によって提供されることができる。この関連で、熟
練者は異種残基のないタンパク質の成熟発現を融合タン
パク質の発現から区別する。この例では融合タンパク質
はベクターによってコードされるペプチドまたはタンパ
ク質（融合残基）と組換え抗原（抗原残基）から構成さ
れる融合生成物であるとして理解される。診断における
使用のための成熟発現の利点は、発現した抗原が非特異
的反応を誘発する可能性がある融合残基を伴わないこと
である。欠点は、宿主に対して異種のタンパク質の発現
の強度が極めて低いことが多く、通常、成熟タンパク質
の精製に親和性クロマトグラフィーを使用できる可能性
がないことである。

【００１２】これに対し、異種タンパク質を宿主内で容
易に発現されるタンパク質とともに融合タンパク質とし
て発現させると発現率の上昇を生じる。理想的には、発
現率の上昇に加えて、融合残基は、親和性クロマトグラ
フィーによる精製の可能性も付与する。しかしながら、
融合残基に結合親和性を有する物質がこの残基に結合す
る結果として、融合残基で望ましくない反応が起こると
いう欠点がある。実施に際しては、したがって、診断試
験系において非特異的反応を生じるタンパク質プレパレ
ーションがいずれの発現方法によっても、すなわち融合
残基の存在により、また融合残基の不存在下には、たと
えば親和性クロマトグラフィーによる抗原の有効な精製
法のない方法のいずれかによって得られることが多い。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はしたがって、
組換えによって調製される結合パートナーの使用を包含
する診断試験システムの能率の改善という目的に基づく
ものである。驚くべきことに、２またはそれ以上の組換
えにより調製した結合パートナーを用いる場合、これら
の結合パートナーを融合タンパク質の発現のために異な
るベクターを用いて同一の宿主内で調製させると、高い
特異性と、高い有用な感度を有する免疫化学的試験シス
テムの構築が可能であることが見出されたのである。こ
のようなシステムは、特異性および有用な感度に関し
て、２またはそれ以上の結合パートナーが融合タンパク
質の発現のために同一のベクターを用いて同一の宿主内
で調製された既知の実施態様に比較して著しく優れてい
る。たとえば融合タンパク質の発現のために異なるベク
ターを用い同一の宿主内で調製された２種の結合パート
ナーＦ１およびＦ２を用いる二重抗原サンドイッチ酵素
イムノアッセイは、Ｆ１およびＦ２が融合タンパク質の
発現のために同一のベクターを用いて同一の宿主内で調
製された二重抗原サンドイッチ酵素イムノアッセイに比
較して感度が著しく優れ、はるかに特異的であることが
わかる。

【００１４】本発明の意味の範囲内において、検出され
る被検物質は、たとえば疾患誘導物質もしくはワクチン
によって誘導される抗体、多重ハプテンもしくは多価タ
ンパク質、たとえば疾患誘導物質それ自体とすることが
できる。したがって、基盤となる目的は、組換えによっ
て調製される結合パートナーの有利な使用を可能にする
と同時に、一方では優れた診断効率を達成する診断方法
を提供することにより達成される。新規な方法は、試験
の特異性に関し上述した欠点を伴うことなく、この融合
タンパク質の使用を可能にする。

【００１５】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
第一および第二の結合パートナーを被検物質と接触さ
せ、被検物質への結合パートナーの結合を既知の方法に
よって検出するサンプル中の被検物質を定性的または定
量的に検出する免疫化学的方法において、２種の結合パ
ートナーを同一の宿主内において融合タンパク質の発現
のために異なるベクター（Ｖ１およびＶ２）を用いて組
換えにより調製し、第一の結合パートナーはベクターＶ
１中に融合タンパク質Ｆ１として発現させ、第二の結合
パートナーはベクターＶ２中に融合タンパク質Ｆ２とし
て発現させることからなる方法に関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】この場合の宿主は細菌または酵母
とすることが好ましい。とくに好ましい実施態様におい
ては、宿主生物体として大腸菌を使用する。好ましい被
検物質は抗体であり、とくに好ましい抗体はウイルス、
細菌および寄生虫に対する抗体である。上述の免疫化学
的方法が、異なる被検物質、たとえばＨＴＶ１およびＨ
ＴＶ２または、ＨＴＶ１および／もしくはＨＴＶ２とＨ
ＣＶの同時測定に使用できるという事実は、熟練者には
周知の通りである。このような実施態様も本発明に包含
される。

【００１７】本発明の意味の範囲内において、結合パー
トナーは被検物質に対する１または２以上の生物親和性
結合部位を有する特異的結合パートナーである。結合パ
ートナーまたはこれらの結合パートナーの成分は、固相
に直接または生物親和性相互作用によって結合させるこ
とができる。この場合、固相としては、マイクロタイト
レーションプレート、磁性粒子、ラテックス粒子、また
は化学マトリックスを含有する試験エレメント、たとえ
ば繊維もしくは膜を含有する試験モジュールを使用する
ことが好ましい。結合パートナーまたはこれらの結合パ
ートナーの成分はまた、直接標識すること（接合体）、
または生物親和性相互作用によって標識に結合させるこ
とができる。

【００１８】結合パートナーと標識から構成されるこの
ような接合体の製造方法は熟練者には周知の通りであ
る。標識は酵素（たとえば、ペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはウレアー
ゼ）またはハプテン（たとえば、ビオチンまたはジゴキ
シゲニン）または蛍光化合物（たとえばＦＩＴＣ）また
はルミネッセンス化合物（たとえばアクリジニウムエス
テルまたは金属／キレート錯化合物）または金属ゾル
（たとえば金）または粒子（たとえばラテックス）とす
ることができる。このような接合体はたとえば、化学試
薬を用いる連結によりまたは生物親和性相互作用によ
り、それらの出発材料の生物親和性機能を維持したまま
調製することができる。ハイブリッド分子はまた化学合
成、ハイブリドーマ技術または遺伝子操作法によって生
成させることができる。

【００１９】本発明はまた、上述の方法に使用するため
の試薬に関する。被検物質を特異的に検出するための結
合パートナーの組合せは、Ｆ１：宿主システムＡからの融合タンパク質であって、
融合タンパク質の発現にはベクターＶ１を用い、方法Ｍ
１により精製された融合タンパク質、Ｆ２：宿主システムＡからの融合タンパク質であって、
融合タンパク質の発現にはベクターＶ２を用い方法Ｍ１
またはＭ２により精製された融合タンパク質、である。

【００２０】被検物質を特異的に検出するための結合パ
ートナーの好ましい組合せは、Ｆ１：宿主システムＡからの融合タンパク質であって、
融合タンパク質の発現にはベクターＶ１を用い、方法Ｍ
１により精製された融合タンパク質、Ｆ２：宿主システムＡからの融合タンパク質であって、
融合タンパク質の発現にはベクターＶ２を用い方法Ｍ２
によって精製された融合タンパク質、である。

【００２１】被検物質を特異的に検出するための結合パ
ートナーのとくに好ましい組合せはＦ１：宿主システムＡからの生理的緩衝液に不溶性の融
合タンパク質であって融合タンパク質の発現にはベクタ
ーＶ１を用い、方法Ｍ１によって精製された融合タンパ
ク質、Ｆ２：宿主システムＡからの生理的緩衝液に可溶性の融
合タンパク質であって融合タンパク質の発現にはベクタ
ーＶ２を用い、方法Ｍ２によって精製された融合タンパ
ク質、である。

【００２２】本発明の意味の範囲内において、宿主シス
テムは融合タンパク質を発現するベクターでトランスフ
ォーム可能で、ついでベクターの存在について選択でき
て、しかもこのベクターを複製し、ベクター中にクロー
ン化されている組換え遺伝子の転写および翻訳が可能な
生物体である。本発明の意味の範囲内において、融合タ
ンパク質の発現のためのベクターは、適当な宿主内で複
製が可能で、ベクターを含有する宿主生物体の選択を可
能にする選択可能な性質をコードする核酸である。融合
タンパク質を発現させるためのベクターは理想的には、
その下流に組換え抗原の遺伝子をクローン化することが
可能で、したがって組換え抗原の特異的な転写および翻
訳を可能にする誘導性のプロモーターを有する。

【００２３】本発明の意味の範囲内において、融合タン
パク質の発現のための好ましいベクターは、各宿主内で
容易に発現できる構成部分に融合する標的タンパク質を
発現する。本発明の意味の範囲内において、融合タンパ
ク質の発現のためのとくに好ましいベクターは、各宿主
内で容易に発現できる２つの異なる構成部分に融合する
標的タンパク質を発現する。本発明の意味の範囲内にお
いて、融合タンパク質の発現のためのとくに極めて好ま
しいベクターは、各宿主内で容易に発現できる２つの異
なる構成部分であって、それぞれの相当する構成部分は
各融合タンパク質の異なる精製方法での精製を可能にす
る構成部分に融合する標的タンパク質を発現する。

【００２４】本発明の意味の範囲内において精製方法と
は、宿主システム内で発現する標的タンパク質を純粋な
形に調製することができる方法である。分泌される抗原
が調製されていない場合には、宿主生物体はまず破壊さ
れなければならない。これを行うための様々な方法たと
えばフレンチプレスで著しい圧力差を発生させる方法
は、熟練者には周知である。これに続く抗原の精製は、
熟練者には周知であり、抗原の物理化学的性質たとえば
溶解度、等電点、電荷、サイズおよび電気泳動移動度を
使用する方法に基づいて行われる。標的タンパク質のと
くに高度な濃縮はそのタンパク質が親和性クロマトグラ
フィーによる精製を可能にするマトリックスに特異的お
よび可逆的に結合することができれば達成可能である。

【００２５】新規な試薬はヒトおよび動物の多数の診断
方法に使用できる。これらの方法の例としては、ウイル
ス（たとえばＡ、ＢおよびＣ型肝炎ならびにＨＩＶの様
々な型のウイルス）、細菌および寄生虫病原体の構造的
特徴、またアレルギー疾患に対する多様な免疫グロブリ
ンクラスの抗体を検出するための単一工程または多重工
程試験を挙げることができる。他の例には、単一工程ま
たは多重検出方法での疾患誘発物質たとえばウイルス
（たとえばＢ型肝炎ウイルス）、細菌、寄生虫およびア
レルゲン、また疾患マカー（たとえば腫瘍マーカー）の
検出がある。

【００２６】

【実施例】本発明はまた以下の実施例によって分類され
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１：ＨＩＶ抗体の検出のための酵素イムノアッセイ１ａ）組換えタンパク質pMAL-gp41およびpSEM-gp41の調
製ＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡはＰＣＲにより調製し
た。ＨＩＶ株HIV1-BH10をＰＣＲの鋳型とした。この場
合、増幅により得られたフラグメントは、bp7209〜bp75
08（図５）（配列番号：１）を包含した。そのフラグメ
ントの５′末端に制限切断部位BamＨＩを、３′末端にX
abＩを挿入すると、発現ベクターpMAL-c2（New England
Biolabs）、およびｐＳＥＭ（Knappら, Biotechnique
s, 1990, 8(3): 280-281）へのクローニングが可能にな
った。組換えタンパク質を発現させて、pSEM-gp41（図
１）の場合は封入体から７Ｍ尿素中により分別尿素抽出
し、ついでゲルクロマトグラフィーにより精製し、pMAL
-gp41（図２）の場合は製造業者の説明書に従って親和
性クロマトグラフィーで精製した。両タンパク質とも１
ｇ／Ｌの濃度に調整した。pMAL-gp41タンパク質は５０m
M炭酸ナトリウム、pH８.０中に、pSEM-gp41タンパク質
は５０mM炭酸ナトリウム、６Ｍ尿素、pH８.０中に存在
させる。

【００２７】１ｂ）固相Ｉ（新規システム）の調製Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Nunc, Roskil
de, Denmark）を４℃にて２４時間、コーティング溶液
［５０mM炭酸ナトリウム、pH９.５中組換えpSEM-gp41
（実施例１ａ記載のプレパレーション）６００μg／
Ｌ］１００μlを各ウエルに存在させてインキュベート
する。マイクロタイトレーションプレートのウエルをつ
いで３回各回３００μlの洗浄液(５０mM Tris, ０.１％
Tween ２０, pH７.２）で洗浄する。マイクロタイトレ
ーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を
排除した場合、約１年間安定である。

【００２８】１ｃ）固相II（対照システム）の調製Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Nunc, Roskil
de, Denmark）を４℃にて２４時間、コーティング溶液
［５０mM炭酸ナトリウム、pH９.５中組換えpMAL-gp41
（実施例１ａ記載のプレパレーション）６００μg／
Ｌ］１００μlを各ウエルに存在させてインキュベート
する。マイクロタイトレーションプレートのウエルをつ
いで３回各回３００μlの洗浄液（５０mM Tris, ０.１
％Tween ２０，pH７.２）で洗浄する。マイクロタイト
レーションプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気
を排除した場合、約１年間安定である。

【００２９】１ｄ）接合体の調製１０倍モル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリル−スクシ
ンイミドを組換えpMAL-gp41（実施例１ａ記載のプレパ
レーション）１０mgに加え、混合物を１時間室温でイン
キュベートする。未反応のヘテロ二官能性試薬をゲル濾
過（Sephdex G-25）により１００mMリン酸ナトリウム、
５mMニトリロ酢酸、pH６.０を用いて分離する。西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（Boehringer Mannheim, Mannhei
m, FRG）１０mgを１０mMリン酸ナトリウム、１００mM食
塩、pH８.０中、１０倍モル過剰の２−イミノチオラン
とともに室温で１時間インキュベートする。遊離の修飾
試薬をついでゲル濾過（Sephdex G-25）により１００mM
リン酸ナトリウム、５mMニトリロ酢酸、pH６.０を用い
て分離する。２つの溶出液（ＳＨ−活性化ペルオキシダ
ーゼおよびマレイミド−修飾ＨＩＶ１タンパク質）を合
わせて室温で一夜インキュベートする。１００mM Ｎ−
エチルマレイミド１／１０容で反応を停止させたのち、
接合体を非反応ＨＩＶ１タンパク質からゲル濾過（Seph
dex G-25）によって精製する。濃縮（２mg／ml）したの
ち、接合体は−２０℃で保存する。

【００３０】１ｅ）ＨＩＶ１抗体を検出するための酵素
イムノアッセイ抗−ＨＩＶ１抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
は以下のように実施する：２５μlのサンプル緩衝液
（０.３Ｍ Tris／ＨＣｌ, １％アルブミン、２％Tween
２０, pH７.２）を実施例１ａおよび１ｂに記載のよう
に調製したマイクロタイトレーションプレートのウエル
中１００μlのヒト血清と３７℃で３０分間インキュベ
ートする。プレートを５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween ２
０で４回洗浄したのち実施例１ｃに記載のようにして調
製した接合体１２５μl（０.１Ｍ Tris／ＨＣl，１mMグ
リシン，０.２％アルブミン，０.４％Pluronic Ｆ６
４，pH８.１中１：１０００）をピペットで加える。３
０分のインキュベーション（＋３７℃）をさらに４回の
洗浄工程によって停止させる。結合した抗−ＨＩＶ１抗
体の量に正相関する結合したペルオキシダーゼ活性を、
Ｈ₂Ｏ₂／テトラメチルベンチジンの添加により測定す
る。室温に３０分置いたのち０.５Ｍ硫酸を加えて基質
の変換を停止させる。吸光は４５０nmで測定する。抗−
ＨＩＶ１陽性血清、正常な抗−ＨＩＶ１陰性血清および
対照システムにおいて偽陽性である選ばれた抗−ＨＩＶ
１陰性血清を、対照システムおよび新規な酵素イムノア
ッセイの両者で検討した。検討の結果（吸光単位）を表
１に示す。

【００３１】

【表１】

【００３２】２つの試験システムにおけるシグナルに
は、とくに抗−ＨＩＶ陰性サンプルの場合に著しい差が
認められる。抗−ＨＩＶ陽性血清は、２つの試験システ
ムにおいて同様に反応する。

【００３３】実施例２： T.pallidum抗体の検出のための酵素イムノアッセイ２ａ）組換え抗原の調製 T.pallidum抗原をコードするＤＮＡはＰＣＲによって調
製した。この場合、T.pallidummのNicholas株のゲノム
ＤＮＡをＰＣＲの鋳型とした。ＰＣＲプライマーはタン
パク質TpN17の全リーディングフレーム（図６）（配列
番号：２）が増幅され、BamＨI切断部位およびXbaI切断
部位が増幅配列のそれぞれ５′および３′末端に導入さ
れるように設計された。これにより、制限エンドヌクレ
アーゼBamＨIおよびXbaIを使用して、発現ベクターpMAL
-c2（New England Biolabs）およびｐＳＥＭ（Knappら,
Biotechniques, 1990, 8(3): 280-281）へのクローニ
ングが可能になった。組換えタンパク質を発現させてpS
EM-TpN17（図３）の場合は封入体から７Ｍ尿素中での分
別尿素抽出、ついでゲルクロマトグラフィーにより精製
し、pMAL-TpN17（図４）の場合は製造業者の説明書に従
って親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパ
ク質は１ｇ／Ｌの濃度に調整した。pMAL-TpN17タンパク
質は、５０mM炭酸ナトリウム、pH８.０中、pSEM-TpN17
タンパク質は５０mM炭酸ナトリウム、６Ｍ尿素、pH８.
０中に存在させる。

【００３４】２ｂ）固相Ｉ（新規システム）の調製Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Nunc, Roskil
de, Denmark）を４℃にて２４時間、コーティング溶液
［５０mM炭酸ナトリウム、pH９.５中組換えpSEM-TpN17
（実施例２ａ記載のプレパレーション）３mg／Ｌ］１０
０μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マ
イクロタイトレーションプレートのウエルをついで３回
各回３００μlの洗浄液（５０mM Tris, ０.１％Tween
２０, pH７.２）で洗浄する。マイクロタイトレーショ
ンプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除し
た場合、約１年間安定である。

【００３５】２ｃ）固相II（対照システム）の調製Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Nunc, Roskil
de, Denmark）を４℃にて２４時間、コーティング溶液
［５０mM炭酸ナトリウム、pH９.５中組換えpMAL-TpN17
（実施例２ａ記載のプレパレーション）３mg／Ｌ］１０
０μlを各ウエルに存在させてインキュベートする。マ
イクロタイトレーションプレートのウエルをついで３回
各回３００μlの洗浄液（５０mM Tris, ０.１％Tween
２０, pH７.２）で洗浄する。マイクロタイトレーショ
ンプレートをシリカゲル上で乾燥すると、空気を排除し
た場合、約１年間安定である。

【００３６】２ｄ）接合体の調製１０倍モル過剰のＮ−γ−マレイミドブチリル-スクシ
ンイミドを組換えpMAL-TpN17（実施例２ａ記載のプレパ
レーション）１０mgに加え、混合物を１時間室温でイン
キュベートする。未反応のヘテロ二官能性試薬をゲル濾
過（Sephdex G-25）により１００mMリン酸ナトリウム、
５mMニトリロ酢酸、pH６.０を用いて分離する。

【００３７】西洋ワサビペルオキシダーゼ（Boehringer
Mannheim, Mannheim, FRG）１０mgを１０mMリン酸ナト
リウム、１００mM食塩、pH８.０中、１０倍モル過剰の
２−イミノチオランとともに室温で１時間インキュベー
トする操作を、２回実施する。遊離の修飾試薬をついで
ゲル濾過（Sephdex G-25）により１００mMリン酸ナトリ
ウム、５mMニトリロ酢酸、pH６.０を用いて分離する。

【００３８】溶出液（ＳＨ−活性化ペルオキシダーゼお
よびマレイミド−修飾T.pallidummタンパク質）を合わ
せて室温で一夜インキュベートする。１００mM Ｎ−エ
チルマレイミド１／１０容で反応を停止させたのち、接
合体を非反応T.pallidummタンパク質からゲル濾過（Sep
hdex G-25）によって精製する。濃縮（２mg／ml）した
のち接合体は−２０℃で保存する。

【００３９】２ｅ）抗−T.pallidumm抗体を検出するた
めの酵素イムノアッセイ抗−T.pallidumm抗体を検出するための酵素イムノアッ
セイは、以下のように実施する：２５μlのサンプル緩
衝液（０.３Ｍ Tris／ＨＣl, １％アルブミン，２％Twe
en ２０, pH７.２）を実施例２ａおよび２ｂに記載のよ
うに調製したマイクロタイトレーションプレートのウエ
ル中１００μlのヒト血清と３７℃で３０分間インキュ
ベートする。プレートを５０mM ＰＢＳ、０.１％Tween
２０で４回洗浄したのち実施例１ｃに記載のように調製
した接合体１２５μl（０.１Ｍ Tris／ＨＣｌ，１mMグ
リシン，０.２％アルブミン，０.４％Pluronic Ｆ６
４，pH８.１中１：１０００）をピペットで加える。３
０分のインキュベーション（＋３７℃）をさらに４回の
洗浄工程によって停止させる。結合した抗−T.pallidum
m抗体の量に正相関する結合したペルオキシダーゼ活性
を、Ｈ₂Ｏ₂／テトラメチルベンチジンの添加により測定
する。室温に３０分置いたのち、０.５Ｍ硫酸を加えて
基質の変換を停止させる。吸光は４５０nmで測定する。
抗−T.pallidumm陽性血清、正常な抗−T.pallidumm陰性
血清、対照システムおよび新規な酵素イムノアッセイの
両者で検討した。検討の結果（吸光単位）を表２に示
す。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】２つの試験システムにおけるシグナル形成
には、とくに抗−T.pallidum陰性サンプルの場合に著し
い差が認められる。一部の抗−T.pallidum陰性血清は、
対照システムでは偽陽性の反応を与えるが、新規なシス
テムではこのようなことはない。抗−T.pallidum陽性血
清は２つの試験システムで同様に反応する。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３００配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：生物名：ヒト免疫不全ウイルス１型株名：ＢＨ１０直接の起源：クローン名：pMAL41／2 配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１..３００配列： TTA TTG TCT GGT ATA GTG CAG CAG CAG AAC AAT TTG CTG AGG GCT ATT 48 Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 1 5 10 15 GAG GCG CAA CAG CAT CTG TTG CAA CTC ACA GTC TGG GGC ATC AAG CAG 96 Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 20 25 30 CTC CAG GCA AGA ATC CTG GCT GTG GAA AGA TAC CTA AAG GAT CAA CAG 144 Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 35 40 45 CTC CTG GGG ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC ACC ACT GCT 192 Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 50 55 60 GTG CCT TGG AAT GCT AGT TGG AGT AAT AAA TCT CTG GAA CAG ATT TGG 240 Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 65 70 75 80 AAT AAC ATG ACC TGG ATG GAG TGG GAC AGA GAA ATT AAC AAT TAC ACA 288 Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 85 90 95 AGC TTA ATA CAC 300 Ser Leu Ile His 100

【００４４】配列番号：２配列の長さ：１００配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 20 25 30 Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 35 40 45 Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 50 55 60 Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 65 70 75 80 Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 85 90 95 Ser Leu Ile His 100

【００４５】配列番号：３配列の長さ：３７２配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：環状ハイポセフィカル：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：生物名：Ｔrepenoma pallidum 直接の起源：クローン名：pMAL Tpn15 配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１..３７２配列： TGT TCA TTT AGT TCT ATC CCG AAT GGC ACG TAC CGG GCG ACG TAT CAG 48 Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln 105 110 115 GAT TTT GAT GAG AAT GGT TGG AAG GAC TTT CTC GAG GTT ACT TTT GAT 96 Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp 120 125 130 GGT GGC AAG ATG GTG CAG GTG GTT TAC GAT TAT CAG CAT AAA GAA GGG 144 Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly 135 140 145 CGG TTT AAG TCC CAG GAC GCT GAC TAC CAT CGG GTC ATG TAT GCA TCC 192 Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser 150 155 160 TCG GGC ATA GGT CCT GAA AAG GCC TTC AGA GAG CTC GCC GAT GCT TTG 240 Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu 165 170 175 180 CTT GAA AAG GGT AAT CCC GAG ATG GTG GAT GTG GTC ACC GGT GCA ACT 288 Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr 185 190 195 GTT TCT TCC CAG AGT TTC AGG AGG TTG GGT CGT GCG CTT CTG CAG AGT 336 Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gln Ser 200 205 210 GCG CGG CGC GGC GAG AAG GAA GCC ATT ATT AGC AGG 372 Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 215 220

【００４６】配列番号：４配列の長さ：１２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Cys Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg Ala Thr Tyr Gln 1 5 10 15 Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp 20 25 30 Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys Glu Gly 35 40 45 Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val Met Tyr Ala Ser 50 55 60 Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu Ala Asp Ala Leu 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val Thr Gly Ala Thr 85 90 95 Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Arg Ala Leu Leu Gln Ser 100 105 110 Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 115 120

【００４７】配列番号：５配列の長さ：４０８配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：環状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）ハイポセフィカル：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：生物名：Ｔrepenoma pallidum 直接の起源：クローン名：pMAL-TPN17 配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１..４０５配列： TGT GTC TCG TGC ACA ACC GTG TGT CCG CAC GCC GGG AAG GCC AAA GCG 48 Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala 125 130 135 140 GAA AAG GTA GAG TGC GCG TTG AAG GGA GGT ATC TTT CGG GGT ACG CTA 96 Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu 145 150 155 CCT GCG GCC GAT TGC CCG GGA ATC GAT ACG ACT GTG ACG TTC AAC GCG 144 Pro Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala 160 165 170 GAT GGC ACT GCG CAA AAG GTA GAG CTT GCC CTT GAG AAG AAG TCG GCA 192 Asp Gly Thr Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala 175 180 185 CCT TCT CCT CTT ACC TAT CGC GGT ACG TGG ATG GTA CGT GAA GAC GGA 240 Pro Ser Pro Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly 190 195 200 ATT GTC GAA CTC TCG CTT GTG TCC TCG GAG CAA TCG AAG GCA CCG CAC 288 Ile Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His 205 210 215 220 GAG AAA GAG CTG TAC GAG CTG ATA GAC AGT AAC TCC GTT CGC TAC ATG 336 Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met 225 230 235 GGC GCT CCC GGC GCA GGA AAG CCT TCA AAG GAG ATG GCG CCG TTT TAC 384 Gly Ala Pro Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Tyr 240 245 250 GTG CTC AAA AAA ACA AAG AAA TAG 408 Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 255

【００４８】配列番号：６配列の長さ：１３５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Cys Val Ser Cys Thr Thr Val Cys Pro His Ala Gly Lys Ala Lys Ala 1 5 10 15 Glu Lys Val Glu Cys Ala Leu Lys Gly Gly Ile Phe Arg Gly Thr Leu 20 25 30 Pro Ala Ala Asp Cys Pro Gly Ile Asp Thr Thr Val Thr Phe Asn Ala 35 40 45 Asp Gly Thr Ala Gln Lys Val Glu Leu Ala Leu Glu Lys Lys Ser Ala 50 55 60 Pro Ser Pro Leu Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Met Val Arg Glu Asp Gly 65 70 75 80 Ile Val Glu Leu Ser Leu Val Ser Ser Glu Gln Ser Lys Ala Pro His 85 90 95 Glu Lys Glu Leu Tyr Glu Leu Ile Asp Ser Asn Ser Val Arg Tyr Met 100 105 110 Gly Ala Pro Gly Ala Gly Lys Pro Ser Lys Glu Met Ala Pro Phe Tyr 115 120 125 Val Leu Lys Lys Thr Lys Lys 130 135

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターpSEM-gp41の構造を示す。

【図２】発現ベクターpMAL-gp41の構造を示す。

【図３】発現ベクターpSEM-TpN-17の構造を示す。

【図４】発現ベクターpMAL-TpN-17の構造を示す。

【図５】ＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡ配列と対応する
タンパク質のアミノ酸配列を示す。

【図６】T.pallidum抗原をコードするＤＮＡ配列と対応
するタンパク質のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者シユテフアン・クナプドイツ連邦共和国35043マルブルク．ヴエーアスホイザーシユトラーセ６ (72)発明者ヘルムート・ペーターズドイツ連邦共和国35043マルブルク．フエルトベルクシユトラーセ60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一および第二の結合パートナーを被検
物質と接触させ、被検物質への結合パートナーの結合を
既知方法を用いて検出することによりサンプル中の被検
物質を定性的または定量的に検出する免疫化学的方法に
おいて、２種の結合パートナーを同一の宿主において融
合タンパク質の発現のために異なるベクター（Ｖ１およ
びＶ２）を用いて組換えにより調製し、第一の結合パー
トナーはベクターＶ１中で融合タンパク質Ｆ１として発
現させ、第二の結合パートナーはベクターＶ２中で融合
タンパク質Ｆ２として発現させることからなる方法。
【請求項２】少なくとも２種の被検物質を定性的また
は定量的に検出し、１種の被検物質あたり２種の結合パ
ートナーを用い、これらの２種の結合パートナーは、異
なる宿主中で異なる被検物質の結合パートナーの発現を
可能にする、同一の宿主において融合タンパク質の発現
のために異なるベクターを用い組換えにより融合タンパ
ク質として調製する請求項１記載の方法。
【請求項３】１種または２種以上の結合パートナーを
固相上に固定化する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法
である請求項３記載の方法。
【請求項５】宿主は真核細胞生物体である請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】宿主は原核細胞生物体である請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】宿主は細菌である請求項６記載の方法。
【請求項８】細菌は大腸菌である請求項７記載の方
法。
【請求項９】発現に関連して、融合タンパク質Ｆ１ま
たはＦ２の一方は可溶性分画から大量に得られ、融合タ
ンパク質Ｆ１またはＦ２の他方は不溶性分画から大量に
得られる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】検出される被検物質を、固相上に固定
化された融合タンパク質および検出可能な免疫複合体が
生成するように標識できる可溶性融合タンパク質Ｆ２と
接触させ、この場合、融合タンパク質の発現のための宿
主には細菌たとえば大腸菌を使用し、Ｆ１は不溶性分画
から大量に得られ、Ｆ２は細菌溶解物の可溶性分画から
大量に得られる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】Ｆ１はベクターｐＳＥＭ中で発現さ
せ、Ｆ２はベクターｐＭＡＬ中で発現させる請求項１〜
１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】被検物質（単数または複数）は抗体で
ある請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】抗体はウイルス、細菌、寄生虫、アレ
ルゲン、自己抗原もしくは医薬または上述の抗原の部分
に対する抗体である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】抗体はＨＩＶ１および／またはＨＩＶ
２または T.pallidumに対する抗体である請求項１２記
載の方法。
【請求項１５】請求項１〜１４のいずれかに記載の少
なくとも２種の結合パートナーおよびそれに記載された
方法の実施に必要な付加成分から構成されるキット。