JPH0772150A - ＩｇＥの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アレルギー反応を誘発する能力を有するＩｇ
Ｅを選択的に検出又は測定することができるＩｇＥの検
出又は測定方法を提供する。 【構成】 試料中のＩｇＥとＦｃεＲＩα鎖とを反応せ
しめ、そして該反応を検出又は測定することを特徴とす
る、試料中のＩｇＥの検出又は測定方法；並びにこの方
法のための試薬、及びキット。 【効果】 アレルギー反応を誘発する能力を有するＩｇ
Ｅを選択的に測定することができるため、アレルギー診
断、寄生虫感染、重症肝障害、湿疹、ＩｇＥミエローマ
等の種々の疾患の診断に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、本来のアレルギー反応
を誘発する機能を有する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を
特異的に検出・測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの即時型（アナフィラキシー型）ア
レルギー（またはＩ型アレルギーとも呼ばれる）反応
は、おおよそ以下のような機序で起こると考えられてい
る。アレルギー抗原が体内に侵入すると、その抗原に対
する特異的なＩｇＥ抗体が体内に産生され、産生された
ＩｇＥは、好塩基球、肥満細胞表面に存在する抗体特異
的な受容体（ＦｃεＲＩ）を介して結合する。ＦｃεＲ
Ｉと結合したＩｇＥが抗原と特異的に反応することによ
り、受容体の凝集が起こり、細胞から蓄えられていたヒ
スタミンなどの活性アミンが放出され、続いてロイコト
リエン、プロスタグランジンや種々のサイトカインが合
成放出され、これらの物質により種々のアレルギー反応
が誘発される。

【０００３】このため、血中のＩｇＥ量を定量すること
はＩ型アレルギー疾患に於て、とくにアトピー性疾患に
於ては重要な診断規準となる。ＩｇＥの量は上記のＩ型
アレルギー以外にも、寄生虫感染、重症肝障害、湿疹、
ＩｇＥミエローマでも上昇することが知られており、血
中ＩｇＥ量を定量することはこれらの疾患を判別するこ
とに役立つ。

【０００４】現在抗体を組み合わせたＥＬＩＳＡ系やＲ
ＩＡ系により血中のＩｇＥ量を測定することが可能であ
り、例えば結合競合法、抗体（ポリクローナル、または
モノクローナル抗体、もしくはこれらの組み合わせ）を
用いたサンドイッチ法により行なわれている（原田重
徳、アレルギーの臨床、第１１刊、ｐ１６−、１９９
１）。それによれば、健常人の血中ＩｇＥ量は１００〜
３００IU／ml（１IU／mlはほぼ２ng／mlに相当する) の
範囲にあるが、アトピー性疾患の場合にはそれよりも高
値を示すことが多く、ときには１００００IU／mlを越す
ような例も知られている。

【０００５】しかしながら、ＩｇＥに対する抗体の特異
性を利用した前記の方法においては、血中に存在するＩ
ｇＥが機能するものであるのか否かを判定することは出
来ない。つまり抗原抗体反応を用いているかぎりにおい
ては、血中のＩｇＥがアレルギー反応を引き起こすべ
く、肥満細胞上に存在するレセプターに結合する能力を
持たないものでも検出され、さらに分解を受けたもの、
変性されてしまったものであっても検出されてしまう。
すなわち生体内において機能しアレルギー反応を誘発で
きるもの、機能を持たずアレルギー反応を誘発できない
ものの両者を検出していることになる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は生体
内でアレルギー反応を誘発する能力を持ったＩｇＥを選
択的に測定する方法を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、ＦｃεＲＩ分子のα鎖
とＩｇＥとの特異的反応を用いて、アレルギー反応を誘
発する能力を持ったＩｇＥを選択的に検出・測定する方
法を確立した。従って本発明は、試料中のＩｇＥとＦｃ
εＲＩα鎖とを反応せしめ、そして該反応を検出又は測
定することを特徴とする、試料中のＩｇＥの検出方法を
提供する。

【０００８】１つの態様においては、この方法はサンド
イッチ方式であり、（１）ＦｃεＲＩα鎖を結合してい
る固体キャリヤーと分析用試料とを接触せしめる段階、
（２）該固体キャリヤーと、ＩｇＥに対する標識された
抗体とを接触せしめる段階、及び（３）該固体キャリヤ
ーに結合した標識を検出又は測定する段階をこの順序で
含んで成り、あるいは（１）ＩｇＥに対する抗体を結合
した固体キャリヤーと分析用試料とを接触せしめる段
階、（２）該固体キャリヤーと、標識されたＦｃεＲＩ
α鎖とを接触せしめる段階、及び（３）該固体キャリヤ
ーに結合した標識を検出又は測定する段階を、この順序
で含んで成る。

【０００９】本発明はまた、ＦｃεＲＩα鎖を含んで成
る、ＩｇＥ検出又は測定用試薬に関する。本発明はま
た、ＦｃεＲＩα鎖、及びＩｇＥに対する抗体を含んで
成る、ＩｇＥの検出又は測定用キットに関する。これら
の試薬又はキットにおいて、ＦｃεＲＩα鎖は好ましく
は可溶性ＦｃεＲＩα鎖であり、抗体はモノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体もしくは抗血清、又はこれら
の組合わせである。

【００１０】上記試薬又はキットにおいて、ＦｃεＲＩ
α鎖及びＩｇＥに対する抗体は、測定方式に依存して溶
液もしくは凍結乾燥物の形態であり、又はキャリヤーに
結合している。これらは、常用のキャリヤー、例えばラ
テックス粒子、ビーズ、マイクロタイタープレート、試
験管等の表面に結合している場合があり、また、常用の
標識、例えば放射性標識、蛍光標識、酵素、アビジン又
はビオチン等により標識されている場合がある。

【００１１】

【具体的な説明】ＦｃεＲＩは１分子のα鎖、１分子の
β鎖、２分子のγ鎖から構成される４量体として細胞膜
上に存在する。これらのサブユニットのうちＩｇＥとの
結合に必要十分な機能を持つ分子はα鎖である（Kinet,
J.P.(1990),Curr.Opinion Immunol.２,p499-505)。ヒト
のα鎖を暗号化しているｃＤＮＡ配列は清水らによって
報告された（Shimizu,A.,Tepler,I.,Benfey,P.N.,Beren
stein,E.H.,Siraganian,R.P.,and Reder,P.(1988)Proc.
Natul,Acad.Sci.U.S.A. 85,p1907-1911 、特表平３−５
０２８７８）。

【００１２】公表されている配列によればヒトα鎖は２
２１のアミノ酸から成り立っていると考えられるが、分
離精製したα鎖は５０〜６０キロダルトンであること、
これをＮグリカナーゼなどの酵素処理により糖鎖を除去
することにより分子量が小さくなることから、α鎖は著
しく糖鎖修飾された形で生体中において合成されてい
る。また暗号化されている配列から２箇所の分子内ジス
ルフィド結合を持つことが予想され、分子内に膜貫通領
域を持つ膜蛋白質であることが示された。このα鎖遺伝
子をＣＯＳ７細胞を用いて一過性に発現させるために
は、γ鎖の同時発現のみで十分であった。

【００１３】この分子内の膜貫通領域を除去した形で発
現できるようにしたｃＤＮＡをＣＨＯ細胞を用いて安定
的に発現させたところ、約４０〜５０キロダルトンのも
のが細胞外に分泌産生された。この可溶化されたα鎖は
ＩｇＥとの高い親和性の結合活性を持っており、Ｎグリ
カナーゼによって糖鎖を除去したものも同様のＩｇＥに
対する高い親和性を示した（Blank,U.,Ra,C.,and Kine
t,J.-P.(1991)J.Biol.Chem.266, p2639-2646)。

【００１４】本発明は、アレルギー反応を誘発する能力
を有するＩｇＥと選択的又は特異的に結合する能力を有
するＦｃεＲＩα鎖又はその断片を利用した、アレルギ
ー反応を誘発する能力を有するＩｇＥの検出又は測定方
法を提供する。この方法において使用するＦｃεＲＩα
鎖としては、その全長形態のものでもよく、また膜貫通
部位が除去された可溶性ＦｃεＲＩα鎖でもよい。ま
た、これらは糖鎖が結合したものでもよく、糖鎖を有し
ないものでもよい。

【００１５】α鎖の膜貫通部位を除去した形で作らせた
組換え体が作る可溶化されたα鎖は、ＩｇＥとの高い親
和性の結合活性を持っているので、可溶化されたα鎖を
利用することが好ましい。さらに可溶性ＦｃεＲＩα鎖
は、本発明者等によって明らかになったところによれ
ば、可溶性ＦｃεＲＩα鎖遺伝子を組み込ませた組換え
バキュロウイルスを昆虫細胞に感染させることにより、
大量に、効率良く産生させることが出来る。

【００１６】また本発明者等によって可能になった、可
溶性ＦｃεＲＩα鎖遺伝子発現ベクターを導入した改変
された酵母組換え体を用いることにより、可溶性Ｆｃε
ＲＩα鎖を効率良く産生させることが可能である。また
ＣＨＯのような培養細胞で産生されたものを用いること
も可能である。このように組換え体で産生させた可溶性
ＦｃεＲＩα鎖を用いることにより、再現良く可溶性Ｆ
ｃεＲＩα鎖を得ることが出来、細胞から調製したもの
を用いることと比較して好ましい。

【００１７】本願発明におけるＩｇＥ−ＦｃεＲＩ特異
的結合を利用した測定方法の方式としては、抗原−抗体
の特異的反応を利用する従来からの免疫測定の種々の方
式を用いることができる。その１つの方式として、いわ
ゆるサンドイッチ系の応用が考えられる。例えば可溶性
ＦｃεＲＩα鎖を、マイクロプレート、ビーズ、ニトロ
セルロース膜、ナイロン膜等の酵素免疫学的検出法（例
えばＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ等）、放射性免疫学的検出法
（例えばＲＩＡ等）等で一般に用いられる担体に結合さ
せ、それを検体と反応させることにより、検体中の機能
を持つＩｇＥを担体上にある可溶性ＦｃεＲＩα鎖に結
合させる。

【００１８】一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標
識したＩｇＥに特異的に結合する抗体（モノクローナル
抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの組み
合わせ）と反応させ、可溶性ＦｃεＲＩα鎖に結合した
ＩｇＥに結合させる。一般に用いられる方法により結合
していない分画を洗い、標識されている酵素等を検出す
ることにより可溶性ＦｃεＲＩα鎖に結合している機能
を持ったＩｇＥを定量することが可能となる。

【００１９】またＩｇＥに特異的に結合する抗体（モノ
クローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、又はそれ
らの組み合わせ）をマイクロプレート、ビーズ、ニトロ
セルロース膜、ナイロン膜等の酵素免疫学的検出法（例
えばＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ等）、放射性免疫学的検出法
（例えばＲＩＡ等）等で一般に用いられる担体に結合さ
せ、それを検体と反応させることにより、検体中のＩｇ
Ｅを担体上にあるＩｇＥに特異的に結合する抗体（モノ
クローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、又はそれ
らの組み合わせ）に結合させる。

【００２０】一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標
識した可溶性ＦｃεＲＩα鎖と反応させ、抗体に結合さ
せた機能を持つＩｇＥに結合させる。一般に用いられる
方法により結合していない分画を洗い、標識されている
酵素等を検出することにより可溶性ＦｃεＲＩα鎖に結
合できる機能を持ったＩｇＥを定量することが可能とな
る。

【００２１】ここで肝要なことは、用いる抗体が、可溶
性ＦｃεＲＩα鎖とＩｇＥとの結合を阻害しないもので
あること、可溶性ＦｃεＲＩα鎖と結合したＩｇＥに結
合しうるものであることであり、このような抗体は前述
の系を組み立て、その系に適用してみることにより、目
的の抗体を得ることが出来る。また可溶性ＦｃεＲＩα
鎖はＩｇＥのＣＨ３ドメインに結合することが知られて
いる（Helm,B. 等、Nature, 331, p180-183,1988) こと
から、前述のような活性を持つ抗体は以下のような方法
により作ることも可能であろう。例えば、ＩｇＥのＣＨ
３ドメイン以外の領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ４ドメイ
ン）に対応するアミノ酸配列からなるペプチド（ポリペ
プチド）を、遺伝子工学的手法（組換え体を用いたポリ
ペプチドの産生方法）、化学合成法によるペプチド合成
手法を利用して産生させる。

【００２２】これを免疫源として、適当な宿主を免疫
し、一般に用いられている方法によって抗体（抗血清）
を得ることが出来る。これらの中からさらに選択するこ
とにより、前述のような活性を持つ抗体を効率良く作る
ことが可能となる。またＩｇＥのＦｃ領域を免疫源とし
て免疫して得た抗体から、ＣＨ３ドメインに結合する抗
体を除くことによっても、前述のような活性を持つ抗体
を効率良く作ることが可能となろう。ここでＣＨ３ドメ
インに結合する抗体を除く方法としては、適当な方法に
より産生させたＣＨ３ドメインの配列を持つペプチドを
結合させたカラムを作り、そのカラムに抗体を結合させ
ることにより達成されるであろう。

【００２３】このようにして選択した抗体、作製した抗
体を用い、前述のような系を組むことにより、可溶性Ｆ
ｃεＲＩα鎖に結合する機能を持ったＩｇＥを定量する
ことが可能となる。例えば実施例に記載した方法に従え
ば、１ngから１００ngの機能を持つＩｇＥの検出が可能
となる。本発明の測定方法の方式としては、前記のサン
ドイッチ方式の他に種々の方式を用いることができる。

【００２４】例えば標識した可溶性ＦｃεＲＩα鎖を用
いることにより、アレルギー反応を誘発する抗原を調べ
ることが可能となる。例えば、抗原を担体に結合させ
る。ここで担体とは免疫学測定法（酵素免疫学的検出
法、放射性免疫学的検出法）で一般に用いられているマ
イクロプレート、ビーズ、可溶性ポリマー、スポンジ、
ニトロセルロース膜、ナイロン膜等のものが考えられ
る。この抗原を結合させた担体を検体と反応させる。反
応終了後、非結合分画を適当な方法により洗い、そこに
標識した可溶性ＦｃεＲＩα鎖を加えることにより反応
させる。反応終了後、非結合分画を適当な方法により洗
い、標識されている酵素等を検出することにより、抗原
に結合するＩｇＥの検出が可能になる。種々の抗原を準
備することにより、アレルギー反応を誘発する抗原を検
出することが可能となる。

【００２５】逆に可溶性ＦｃεＲＩα鎖を結合させた担
体を検体と接触させ、検体中のＩｇＥを結合させる。反
応終了後非結合分画を適当な方法で洗い、そこに標識し
た抗原を加え、反応させる。反応終了後、非結合分画を
洗い、適した方法で標識を検出する。この方法によって
もアレルギー反応を誘発する抗原の検出が可能になる。

【００２６】本発明において、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩα鎖
反応の検出又は測定に用いる標識は、常用の免疫測定法
において用いられる種々の標識を、測定方式に依存して
選択して使用することができる。例えば、放射性標識、
例えば ¹²⁵Ｉ標識；蛍光標識、例えばＦＩＴＣ、ローダ
ミン；酵素標識、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素等が使用される。

【００２７】これらの標識は、測定方式に従って、Ｆｃ
εＲＩα鎖、ＩｇＥ、又はその他の試薬に結合される。
この場合、結合は常用の手段、例えばグルタルアルデヒ
ド法、過ヨウ素酸酸化法、ＭＢＳ法、ジアゾカップリン
グ法、マレイミド法により行うことができる。酵素等の
標識を他の試薬に結合させる場合には、上記の手段のほ
かに、アビジンとビオチンとの特異的結合を用いること
もできる。この場合、アビジン及びビオチン（これらも
標識と称する場合がある）と他の試薬との結合は、例え
ば上記の常用の手段により行うことができる。

【００２８】ＩｇＥ、ＦｃεＲＩα鎖、抗−ＩｇＥ抗体
等の試薬は、測定方式に応じて、キャリヤーに結合させ
て使用する場合があり、これらのキャリヤーとしては、
常用の免疫測定において使用されるもの、例えばプレー
ト、例えばマイクロタイタープレート、ビーズ、ラテッ
クス粒子等が挙げられる。これらの材料の材質としては
常用のものを使用することができる。これらのキャリヤ
ーにＩｇＥ、ＦｃεＲＩα鎖、抗−ＩｇＥ抗体等の試薬
を結合させるには、これらのキャリヤーに結合するため
に常用されている手段、例えば適当な溶媒に希釈したも
のを接触させることにより結合させる、カップリング剤
でプレート等に架橋させる、電気的に膜に移行させる、
膜等に疎水的に結合させる等により行うことができる。

【００２９】本発明の反応は、通常、水性媒体中で行わ
れる。従って、ＩｇＥ、ＦｃεＲＩα鎖、抗−ＩｇＥ、
その他の試薬は水性媒体中の溶液又は懸濁液の形で使用
される場合がある。これらの場合の水性媒体としては、
緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液等の常用の緩衝液が好適に使用さ
れる。

【００３０】本発明はまた、ＩｇＥの検出又は測定用試
薬に関する。この試薬は、ＦｃεＲＩα鎖、例えば可溶
性ＦｃεＲＩα鎖、ＩｇＥ、又は抗−ＩｇＥ抗体等を含
んでなる。これらの試薬は、前記のごとき水性媒体中の
溶液又は懸濁液、キャリヤー、例えばビーズ、プレー
ト、例えばマイクロタイター、試験管、ニトロセルロー
ス膜、ナイロン膜等の固体キャリヤー、ラテックス粒
子、等の表面に結合した形態であることができる。さら
に、前記溶液又は懸濁液を凍結乾燥した形態であっても
よい。

【００３１】本発明はまた、前記の試薬又はその原料を
２種以上含んで成るＩｇＥ測定用キットに関する。キッ
トの構成成分は、そのキットを使用する測定方式に依存
して異る。例えば、サンドイッチ法用キットの１つの態
様は、（１）ＦｃεＲＩα鎖（好ましくは可溶性Ｆｃε
ＲＩα鎖を表面に固定した前記のごとき固体キャリヤ
ー、及び（２）前記のごとき標識により標識された、Ｉ
ｇＥに対する抗体の溶液又はその凍結乾燥物を含んで成
る。サンドイッチ法用キットの他の態様は、（１）Ｉｇ
Ｅに対する抗体を表面に結合した前記のごとき固体キャ
リヤー、及び（２）前記のごとき標識により標識された
ＦｃεＲＩα鎖（好ましくは可溶性ＦｃεＲＩα鎖）の
溶液又はその凍結乾燥物、を含んで成る。

【００３２】これらのキットはさらに、検出用試薬、反
応媒体用又は試薬や試料希釈用の緩衝液等を含むことも
できる。

【００３３】

【発明の効果】本発明の方法に従えば、いままでの方法
では識別不可能であった、アレルギー反応を誘発する能
力を持ったＩｇＥを選択的に、かつ定量的に測定でき、
アレルギー診断や寄生虫感染、重症肝障害、湿疹、Ｉｇ
Ｅミエローマ等の種々の疾病の診断に有効である。

【００３４】

【実施例】以下実施例により、本発明のさらに詳細な説
明を行なうが、本発明は実施例にのみ限定されるもので
はない。実施例１．ビオチン標識可溶性ＦｃεＲＩα断片を用い
たＩｇＥ検出系

【００３５】（１）可溶性ＦｃεＲＩα断片のビオチン
標識 バキュロウイルス発現系で発現分泌精製された可溶性Ｆ
ｃεＲＩα断片のビオチン標識は以下のように行った。
精製された可溶性ＦｃεＲＩα断片を０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液中に０．２mg
／mlとなるように調製した。この溶液２．９mlに１．７
mg／mlのＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を
３０μｌ加えて穏やかに攪拌しながら室温で２時間反応
させた。さらに０．２Ｍグリシン溶液pH８．０を加えて
室温で１時間穏やかに攪拌した。この溶液を０．２Ｍ塩
化ナトリウム、２０mMトリス塩酸緩衝液pH７．６に対し
て透析して反応試薬を除去し、ビオチン標識可溶性Ｆｃ
εＲＩα断片を得た。

【００３６】（２）ＩｇＥ測定用マイクロタイタープレ
ートの調製 試料中のＩｇＥ量を測定するために、以下の系を構築し
た。抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（ヤマサ社製）を
５０mM炭酸ナトリウム緩衝液pH９．３５で１０００倍に
希釈し、マイクロタイタープレート（ヌンク社製マイク
ロウエルモジュールプレートマキシソープＦ−８）の各
穴にその０．１mlずつを入れて４℃で一晩コーティング
した。各穴を洗浄液（１５０mM塩化ナトリウム、０．０
５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２０mMトリス塩酸緩衝
液pH７．４）で洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１
５０mM塩化ナトリウム、２０mMトリス塩酸緩衝液pH７．
４を添加し、４℃で一晩ブロッキングを行った。このＩ
ｇＥ測定用マイクロタイタープレートは使用するまで４
℃で保存した。

【００３７】（３）ＩｇＥの検出 ＩｇＥ測定用マイクロタイタープレートの各穴を洗浄液
で洗浄した後、これに希釈用溶液（０．２％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ、１５０mM塩化ナトリウム、０．０５％（ｗ／
ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２０mMトリス塩酸緩衝液pH７．
４）で各濃度に希釈したＩｇＥ標準溶液あるいはＩｇＥ
試料溶液を０．１ml添加した。室温で２時間静置した
後、各穴を洗浄液で洗浄し、上で調製したビオチン標識
可溶性ＦｃεＲＩα断片を希釈用溶液で１０００倍に希
釈したものを０．１ml添加してさらに室温で２時間静置
した。

【００３８】各穴を洗浄液で洗浄し、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識アビジン（ベクター社製）を希釈用溶液
で５０００倍に希釈したものを０．１ml添加して室温で
２時間静置した。各穴を洗浄液で洗浄した後、基質とし
てＨＲＰ発色キット（メディックスバイオテク社製）を
０．１ml添加し室温で１０分間遮光して反応させた。反
応停止は各穴に０．０２５mlの１０％（ｗ／ｖ）硫酸を
添加した。各穴の４５０nmの吸光度をマイクロタイター
プレートリーダーで測定した。その結果、この系により
１ng以上のＩｇＥを検出することができた。結果を図１
において白円で示す。

【００３９】（４）上記ＩｇＥ測定系の反応時間短縮法 上記ＩｇＥの検出法で反応時間を短縮するために、Ｉｇ
Ｅ溶液とビオチン標識可溶性ＦｃεＲＩα断片を別々に
２時間反応させるのではなく、ＩｇＥ溶液とビオチン標
識可溶性ＦｃεＲＩα断片をそれぞれ最終濃度、最終液
量が上と等しくなるように同時に添加し、室温で２時間
静置した。以下の操作は上記と同じとし、両方法の差を
比較した。

【００４０】その結果、両方法のＩｇＥ検出限界量は変
わらず、１ngから１０ngのＩｇＥについてはほぼ等しい
吸光度を示したので、この方法で反応時間の短縮が可能
であった。結果を図１において黒円で示す。次に、本発
明において使用する可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖の製造方
法を参考例として具体的に説明する。

【００４１】参考例１．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片を持つプラスミドの調製 ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を持つプラスミドＢＳ−
ＳＫ（＋）ｈｅｒαから、ＤＮＡ合成機（8700DNA Synt
hesizer, MilliGen ／Biosearch)を用いて合成したプラ
イマーＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応により目的とする可溶
性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を調製した。プライマ
ーとしてはＮＴＶプライマーとＰＡＳプライマーを作製
した。それぞれの配列は以下に示すものである。

【００４２】ＮＴＶプライマー；５′−AAAAACTCGAGATG
GCTCCTGCCATGGAATCCCCTACT（配列番号：１） ＰＡＳプライマー；５′−AAAAAGGATCCTTAAGCTTTTATTAC
AGTAATGTTGA(配列番号：２） ＰＣＲ反応は次に示す条件で行なった。１００μｌの反
応液〔１ngプラスミドＢＳ−ＳＫ（＋）ｈｅｒαＤＮ
Ａ、１μＭＮＴＶプライマー、１μＭＰＡＳプライマ
ー、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM
ＫＣｌ、１．５mMＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ ｇｅｌａ
ｔｉｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴ
Ｐ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、
２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ（宝酒造）〕を調製し、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（Perkin Elmer Cetus社) を用いて、９４
℃にて１分間、５０℃にて２分間、７２℃にて３分間の
反応を３０サイクル行なわせた。

【００４３】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ット（BIO101社）を用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ〕中
に回収した。そこに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０
mM ＭｇＣｌ₂ 〕を２μｌ加え、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
をそれぞれ１μｌ加え３７℃において１時間反応させ
た。

【００４４】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＢａｍＨ
ＩおよびＸｈｏＩで切断したクローニングベクターｐＴ
３Ｔ７Ｕ１９Ｘ（特願平３−１０６６００号）１０ngと
ともにＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）Ａ液３
０μｌおよびＢ液６μｌと混合し、１６℃、１時間反応
させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶液１０μ
ｌを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ (Stratagene社) を
Ｈａｎａｈａｎの方法〔DNA cloning:A practical appr
oach（ed.D.M.Glover), vol.1, p109-, IRC press (188
5)〕に従って形質転換させ、Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍ
ｐプレートに蒔き、白色のコロニーを選択することによ
りアンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損のコロ
ニーを選択した。

【００４５】選択したコロニーをＬ−ａｍｐ培地で培養
し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させることに
より組換え体ファージを調製した。調製した組換え体か
ら一本鎖ＤＮＡを調製し、調製したＤＮＡ約０．８μｇ
をDNA Sequencing System/Taq polymerase（アプライド
バイオシステム社) を用い、メーカーの推奨する条件に
従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 370A
（version 1.30、アプライドバイオシステム社) を用い
て分析し塩基配列を決定した。

【００４６】またアルカリ溶菌法により調製した組換え
体プラスミドＤＮＡ約１μｇをＭ１３ＲＰＩプライマー
（アプライドバイオシステム社）を用い、Ｃｙｃｌｉｎ
ｇｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法 (アプライドバイオシステム
社テクニカルマニュアル)によりメーカーの推奨する方
法に従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 37
0A（version 1.30、アプライドバイオシステム社) を用
いて分析し塩基配列を決定した。

【００４７】両者の方法により決定した配列のうち、構
造遺伝子部分が既に報告されているヒトＦｃεＲＩα鎖
遺伝子のものと異なっておらず、翻訳開始コドンの前に
ＮＴＶプライマーによって導入されたＸｈｏＩサイトが
あり、かつコードされているアミノ酸配列の２５番目の
バリンを第１位とした場合に第１７２位のアラニンをコ
ードするコドンの直後にＰＡＳプライマーによって導入
された翻訳終了コドンＴＡＡとＢａｍＨＩサイトがある
ことが確認された組換え体プラスミドｐＮＴＶ２を得
た。

【００４８】参考例２．ヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片の単離 ＫＵ８１２細胞（４×１０⁷ 細胞）からTotal RNA Sepa
rator Kit(Clontech社）を用い、メーカーの推奨する方
法に則り、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからmRNA
Separator Kit（Clontech社）を用い、メーカーの推奨
する方法に従いｐｏｌｙＡ ＲＮＡを精製した。４０μ
ｇのｐｏｌｙＡ ＲＮＡを得ることが出来た。このうち
５μｇを用い、Time Saver cDNA 合成キット（ファルマ
シア社）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、二本
鎖ｃＤＮＡを合成した。

【００４９】得られたｃＤＮＡ液（１５０μｌ）の内の
一部、１０μｌを用いて、前述のＮＴＶプライマー、Ｐ
ＡＳプライマーを用い、１００μｌの反応液（１μＭ
ＮＴＶプライマー、１μＭ ＰＡＳプライマー、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、
１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ ｇｅｌａｔｉ
ｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２
００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、２．５Ｕ
ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
〔宝酒造〕）を調製し、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、９４℃にて１分間、５０℃にて２分
間、７２℃にて３分間の反応を３０サイクル行なわせ
た。

【００５０】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ットを用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）、１mMＥＤＴＡ〕中に回収した。そ
こに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０mM ＭｇＣｌ
₂ 〕を２μｌ加え、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩをそれぞれ１
μｌ加え３７℃において１時間反応させた。

【００５１】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＸｈｏ
Ｉ、ＢａｍＨＩで切断したクローニングベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）、１０ngとともにＤＮＡ
ライゲーションキット、Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混
合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。
得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬｌ−ｂ
ｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に従って形質転換させ、
Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコ
ロニーを選択することによりアンピシリン耐性で、βガ
ラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。

【００５２】コロニーから調製したプラスミドＤＮＡ
１．５μｇをDye primer cycling sequencing kit(アプ
ライドバイオシステム社）を用い、Ｍ１３ＲＰ１または
−２１Ｍ１３プライマーをもちいて、メーカーの推奨す
る条件に従い反応させ、反応産物をＤＮＡ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａを用いて分析し挿入断
片の塩基配列を決定した。

【００５３】挿入された断片は報告の配列と同じ配列を
持ち、翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＸｈｏＩサイトが
あり、第２４位のバリンを第１位とした場合に１７２位
に存在するアラニンのコドンの直下に翻訳停止コドンと
ＢａｍＨＩサイトが挿入されていることが確認された。
このようにして得られたプラスミドは、実施例２におい
てｐＮＴＶ２の代わりに用いることが出来ることは明ら
かである。

【００５４】参考例３．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖の発
現プラスミドの作製 可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子を持つプラスミドｐＮ
ＴＶ２ １μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１００mM ＮａＣｌ、７mM
ＭｇＣｌ₂ 、１２Ｕ ＸｈｏＩ、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕
で３７℃において１時間反応させた。反応終了後フェノ
ール／クロロホルムによりＤＮＡを抽出した後、エタノ
ール沈殿法により回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡプ
ランティングキット〔宝酒造〕を用いて、メーカーの推
奨する方法により平滑末端化した。反応液を０．８％ア
ガロース電気泳動にかけ、分離した約０．６kbの断片を
アガロース小片からＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて
１０μｌのＴＥ液中に回収した。

【００５５】一方バキュロウィルス発現ベクターである
ｐＡｃＹＭ１（Matsuura, Y.ら、J.Gen.Virol. 68, p12
33−1255）１μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、７mM
ＭｇＣｌ₂ 、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕で３７℃において
１時間反応させた。反応液を０．８％アガロース電気泳
動にかけ、分離した約１０kbの断片をアガロース小片か
らＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて１０μｌのＴＥ液
中に回収した。

【００５６】この回収した断片を含む溶液２μｌと、ｐ
ＮＴＶ２から回収した断片を含む溶液３μｌとをそれぞ
れＤＮＡライゲーションキットＡ液２５μｌ、Ｂ液５μ
ｌと混合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結さ
せた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いてそれぞれ大
腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に従って
形質転換させ、Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択した。コロニーのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素部位を調べそれぞれの断片が連結された
プラスミドを持つ形質転換体を選別することによりバキ
ュロウィルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−ＮＴＶ
を得た。

【００５７】参考例４．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖発現
組換えウィルスの単離 夜盗蛾腸培養細胞であるＳｆ−９細胞株にバキュロウィ
ルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−ＮＴＶ、１０μ
ｇと天然型バキュロウィルスＤＮＡ１μｇを燐酸カルシ
ウム沈殿法により感染させた。感染の方法は松浦（実験
医学８刊、ｐ２８１−２８４，１９９０）の方法に従っ
た。感染後プラークアッセイ法によりポリヘドリンを合
成していないプラークを選択した。このプラークアッセ
イを３回行なうことにより組換えウィルスを単離した。

【００５８】単離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity
of infection)＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％
ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社）中で７２時間培
養し、培養上清の一部をウェスターンプロッティング法
により分析することにより、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖
発現組換えウィルスであるＡｃ−ＮＴＶを単離した。単
離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity of infection)
＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％ＦＣＳを含むＧ
ｒａｃｅ培地(Gibco社）中で７２時間培養し培養上清を
回収することにより、約１×１０⁸ pfu／mlの組換えウ
ィルスを回収した。

【００５９】参考例５．発現及び発現産物の精製 組み換えウィルスをＭＯＩ（multiplicity of infectio
n)＝５でＳｆ−９細胞（４×１０⁸ 細胞）に感染させ、
１０％ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社）中４００
mlで７２時間培養し培養上清を回収した。回収した上清
中に硫安を飽和濃度６０％となるように加えた後、４℃
で２時間保温した。１００００rpm で３０分間遠心し、
沈殿物を回収した。

【００６０】回収した沈殿物をＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ〔pH７．５〕、１５０mMＮａＣｌ）に溶解さ
せた後、同溶液に対して４℃、１夜透析した。透析後液
を回収し、ＴＢＳで平衡化したセファクリルＳ２００カ
ラム（２．６cm×６０cm）にかけＴＢＳにて分離した。
分子量３万から４万付近に相当する分画を集めた。抗Ｆ
ｃεＲＩαモノクローナル抗体カラムの作製を以下のよ
うに行なった。ＢｒＣＮ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシア社製）を１mM塩酸中で
室温で１５分間膨潤させた。１mM塩酸を用いてグラスフ
ィルター上で膨潤ゲルの洗浄と膨潤を繰り返した後、カ
ップリング緩衝液（０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ
重炭酸ナトリウム pH８．３）で洗浄した。

【００６１】直ちにこのゲル２mlを、カップリング緩衝
液に溶解した精製抗ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体溶
液２ml（５mg／ml）に加え、室温で２時間穏やかに攪拌
した。上清を除き、０．２Ｍグリシン塩酸、pH８．０に
ゲルを懸濁し、室温で２時間穏やかに攪拌した。次にこ
れをカップリング緩衝液と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液 pH４．０で繰り返し洗浄し、抗
ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体カラムを得た。

【００６２】ゲル濾過により得られた画分の抗ＦｃεＲ
Ｉαモノクローナル抗体カラムによる精製を以下のよう
に行なった。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリ
ス塩酸緩衝液 pH７．６で平衡化した抗ＦｃεＲＩαモ
ノクローナル抗体カラムに、培養上清をゲル濾過して得
られたＦｃεＲＩαを含む画分をかけ、平衡化に用いた
緩衝液にてカラムを充分に洗浄した。

【００６３】次に、３Ｍチオシアン酸ナトリウムと０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリス塩酸緩衝液 pH
７．６でカラムからの溶出を行ない、溶出された画分を
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
pH７．６に対して直ちに透析し、可溶性ＦｃεＲＩα
断片精製標品を得た。

【００６４】参考例６．精製標品の純度検定 精製標品の純度検定をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法を用いて以下のように行なった。精製標品を
濃縮し、試料用緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、
５％２−メルカプトエタノール、７％グリセロール、
０．００５％ブロムフェノールブルーを含む６２．５mM
トリス塩酸緩衝液 pH６．８）に懸濁し、１００℃で５
分間煮沸した。

【００６５】この試料を分離ゲル濃度が１０−２０％の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用濃度勾配平
板ゲル（第一化学薬品株式会社製）を用いて電気泳動
し、銀染色キット（第一化学薬品株式会社製）でゲルを
染色して蛋白質の検出を行なった。その結果、分子量３
０ｋ〜３５ｋ付近に広がった単一のバンドが検出され
た。

【００６６】参考例７．ＩｇＥとの結合活性の測定 ９６穴プレート（Nunc Immuno Module Maxisorp F16)に
１００μｌ／wellの割合でｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅ
ｒ（０．３mg／ｌ ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩ
α鎖、１．５９ｇ／ｌ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、２．９３ｇ／ｌ
ＮａＨＣＯ₃、pH９．３５）を加え、４℃で一昼夜保
温した。その後、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを捨
て、２００μｌ／wellの割合でＴＴＢＳ溶液〔２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０〕を加えることにより、各
ｗｅｌｌを洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返し
た。

【００６７】洗浄後、２００μｌ／wellの割合でブロッ
キング溶液〔２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、
９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１％ ＢＳＡ〕を加え、４℃で一
昼夜保温し、ブロッキングを行なった。ブロッキング溶
液を捨て、先に述べたＴＴＢＳ溶液による洗浄操作を３
度繰り返した。次に、あらかじめ用意しておいた活性測
定用の一連のサンプル希釈液を、８０μｌ／wellの割合
で加え、速やかに２０μｌのＩｇＥ溶液〔１０ng／２０
μｌ ヒトＩｇＥ（ヤマサ醤油）、２０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．４）、９ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ ＢＳＡ〕を加え、軽く攪
拌した。

【００６８】室温で２時間保温した後、先に述べたＴＴ
ＢＳ溶液による洗浄操作を３度繰り返した。次に、ＴＴ
ＢＳ−０．２％ ＢＳＡ溶液を用いて１０００倍に希釈
したPeroxidase conjugated IgG Fraction Goat Anti-H
uman IgE（Epsilon Chain Specific：CAPPEL社）を１０
０μｌ／well加え、室温で２時間保温した。ＴＴＢＳ溶
液による洗浄操作を４度繰り返した後、TMB Peroxidase
Substrate(KIRKEGAARD & PERRY LABOBATORIES社）とPe
roxidase Solution B(KIRKEGAARD &PERRYLABOBATORIES
社）を等量混合したものを、１００μｌ／well加えて室
温で１０分間保温し、１０％ｗ／ｖのＨ₂ ＳＯ₄ を２５
μｌ／well加えて、反応を停止した。その後、Ａ４５０
を測定することにより、精製した可溶性ＦｃεＲＩα鎖
の測定を行なった。

【００６９】これにより、活性のある可溶性ヒトＦｃε
ＲＩα鎖がサンプル中に存在する場合、ヒトＩｇＥと結
合することにより、ＥＬＩＳＡプレートにコートされた
ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩα鎖と結合するヒト
ＩｇＥが減少するためにＡ４５０の測定値が陽性コント
ロールに比べて低下する。この系に、スタンダードとし
て、ＣＨＯ細胞由来の可溶性ＦｃεＲＩα鎖をＴＴＢＳ
−０．２％ ＢＳＡ溶液にて希釈した液をサンプル希釈
液の代わりに用いることにより、サンプル中の可溶性ヒ
トＦｃεＲＩα鎖の定量を行なうことができる。

【００７０】この方法により、４００mlから精製した可
溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖は、２mgのＣＨＯ産生の可溶性
ヒトＦｃεＲＩα鎖に相当するＩｇＥ結合活性を持つこ
とが明かとなった。

【００７１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAACTCGA GATGGCTCCT GCCATGGAAT CCCCTACT 38

【００７２】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAAGGATC CTTAAGCTTT TATTACAGTA ATGTTGA 37

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１において得たＩｇＥ濃度と測定
値（Ａ４５０）との関係を示すグラフである。グラフ
中、白円は実施例１の（３）において得た結果を示し、
黒円は実施例１の（４）で得た結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 谷田 以誠 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 羅 智靖 千葉県千葉市花見川区花園２−14−13

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と
   ＩｇＥ結合受容体α鎖（ＦｃεＲＩα鎖）とを反応せし
   め、そして該反応を検出又は測定することを特徴とす
   る、試料中のＩｇＥの検出又は測定方法。
2. 【請求項２】 ＦｃεＲＩα鎖を含んで成る、ＩｇＥの
   検出又は測定用試薬。
3. 【請求項３】 （１）請求項２に記載の試薬と、及び
   （２）ＩｇＥに対する抗体を含んで成る試薬を含んで成
   る、ＩｇＥの検出又は測定用キット。