JPH0445795A - Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスの診断等に有効な、Ｃ型肝
炎ウィルスゲノムの構造領域から翻訳される新規な抗原
、その産生方法及びこの抗原を用いたＣ型肝炎関連抗体
の検出方法に関するものである。
炎ウィルスゲノムの構造領域から翻訳される新規な抗原
、その産生方法及びこの抗原を用いたＣ型肝炎関連抗体
の検出方法に関するものである。
さらに詳しくは、Ｃ型肝炎ウィルス（以下ＨＣ■という
）構造遺伝子領域にコードされるペプチドであって、５
ＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が約２２キロダルトンを示す新
規なＨＣＶ抗原ポリペプチド（以下ｐ２２と略す）、こ
のＨＣＶ抗原ポリペプチドの産生方法、このポリペプチ
ドを利用したＣ型肝炎関連抗体の検出方法に関する。
）構造遺伝子領域にコードされるペプチドであって、５
ＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が約２２キロダルトンを示す新
規なＨＣＶ抗原ポリペプチド（以下ｐ２２と略す）、こ
のＨＣＶ抗原ポリペプチドの産生方法、このポリペプチ
ドを利用したＣ型肝炎関連抗体の検出方法に関する。
１見血韮薯
ＨＣＶはウィルス性肝炎のひとつであるＣ型肝炎の病原
ウィルスとして最近同定された。Ｃ型肝炎はわが国にお
ける輸血後肝炎のほとんどを占めること、一過性感染の
他に持続性感染のあること（わが国では全人口の約１２
％が持続性感染者）が特徴である。急性Ｃ型肝炎のうち
約半数が慢性化し、また慢性肝炎は徐々に肝硬変、肝癌
へと移行する。また持続性感染者の比率は世界各地で全
人口の１〜３％を占めると報告されている。すなわちＣ
型肝炎は、全世界の重大な感染症であり、−その予防、
早期診断並びに治僚は世界的な重要Ｉｌ！題になってい
る。
ウィルスとして最近同定された。Ｃ型肝炎はわが国にお
ける輸血後肝炎のほとんどを占めること、一過性感染の
他に持続性感染のあること（わが国では全人口の約１２
％が持続性感染者）が特徴である。急性Ｃ型肝炎のうち
約半数が慢性化し、また慢性肝炎は徐々に肝硬変、肝癌
へと移行する。また持続性感染者の比率は世界各地で全
人口の１〜３％を占めると報告されている。すなわちＣ
型肝炎は、全世界の重大な感染症であり、−その予防、
早期診断並びに治僚は世界的な重要Ｉｌ！題になってい
る。
ＨＣＶはプラス鎖ＲＮＡウィルスでそのウィルスゲノム
は約１万塩基からなる。ゲノムの５°側にウィルス構造
蛋白をコードする構造遺伝子領域があり、その下流には
非構造（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、ＮＳ）遺伝子
領域がある。現在までのところ、このウィルスのコード
する抗原蛋白はひとつも同定されていない、現在までに
報告されている唯一の抗原抗体測定法は、ＨＣＶ非構造
遺伝子領域の−１（ＮＳ３からＭＳ４１１域にかけて）
の３６３アミノ酸を含む、酵母で産生された融合蛋白（
Ｃ１００）に対する抗体（抗Ｃ１００抗体）検出法であ
る。この抗体検出法でＨＣＶに対する重置の既往をある
程度知ることが出来るため、この検出法はＣ型肝炎ウィ
ルスの診断に利用されている。また、この検出法で陽性
の血液は感染性の）（ＣＶを含むことが多いため、現在
わが国ではこの検出法が輸血用血液のスクリーニングに
使用されている。
は約１万塩基からなる。ゲノムの５°側にウィルス構造
蛋白をコードする構造遺伝子領域があり、その下流には
非構造（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、ＮＳ）遺伝子
領域がある。現在までのところ、このウィルスのコード
する抗原蛋白はひとつも同定されていない、現在までに
報告されている唯一の抗原抗体測定法は、ＨＣＶ非構造
遺伝子領域の−１（ＮＳ３からＭＳ４１１域にかけて）
の３６３アミノ酸を含む、酵母で産生された融合蛋白（
Ｃ１００）に対する抗体（抗Ｃ１００抗体）検出法であ
る。この抗体検出法でＨＣＶに対する重置の既往をある
程度知ることが出来るため、この検出法はＣ型肝炎ウィ
ルスの診断に利用されている。また、この検出法で陽性
の血液は感染性の）（ＣＶを含むことが多いため、現在
わが国ではこの検出法が輸血用血液のスクリーニングに
使用されている。
上記Ｃ１００抗体は、Ｃ型肝炎発症後陽性になるために
通常３〜６ケ月を要するため、この間Ｃ型肝炎の診断法
としては利用できないことが、最大の閏題点として拳げ
られる。また、抗Ｃ１００抗体陰性の血液だけを輸血し
た症例でも、Ｃ型肝炎ウィルスの発生がある程度見られ
ることから、この抗体検査だけでは、輸血後肝炎の半分
程度しかスクリーンアウトできないと予想されており、
斬たな抗体検査あるいはウィルス構造蛋白抗原の検出法
が期待されている。：ｉたＣ１００抗原は非構造蛋白遺
伝子由来であることから、より直接的な診断法や将来の
ワクチン材料の候補として、ウィルス構造蛋白の同定と
その抗原抗体検出系の確立が極めて重要であった。
通常３〜６ケ月を要するため、この間Ｃ型肝炎の診断法
としては利用できないことが、最大の閏題点として拳げ
られる。また、抗Ｃ１００抗体陰性の血液だけを輸血し
た症例でも、Ｃ型肝炎ウィルスの発生がある程度見られ
ることから、この抗体検査だけでは、輸血後肝炎の半分
程度しかスクリーンアウトできないと予想されており、
斬たな抗体検査あるいはウィルス構造蛋白抗原の検出法
が期待されている。：ｉたＣ１００抗原は非構造蛋白遺
伝子由来であることから、より直接的な診断法や将来の
ワクチン材料の候補として、ウィルス構造蛋白の同定と
その抗原抗体検出系の確立が極めて重要であった。
ｔ・
本発明者らは、以上のような問題点を解決すべく研究を
重ねてきた結果、ＨＣＶ構造遺伝子領域のｃＤＮＡを培
１１ｍ胞中で発現させ、Ｃ型肝炎患者血清を用いた蛍光
抗体法およびウェスタンプロット法により、Ｃ型肝炎患
者血清と特異的に反応する分子量約２２キロダルトンの
ＨＣＶ遺伝子由来の新規ポリペプチド＜ｐ２２＞を見い
だしこれを分離して本発明を完成するに至った。
重ねてきた結果、ＨＣＶ構造遺伝子領域のｃＤＮＡを培
１１ｍ胞中で発現させ、Ｃ型肝炎患者血清を用いた蛍光
抗体法およびウェスタンプロット法により、Ｃ型肝炎患
者血清と特異的に反応する分子量約２２キロダルトンの
ＨＣＶ遺伝子由来の新規ポリペプチド＜ｐ２２＞を見い
だしこれを分離して本発明を完成するに至った。
次いで、上記で用いたＨＣＶ構造遺伝子領域のｃＤＮＡ
断片を挿入した発現ベクターをトランスフェクトして培
養細胞株を形質転換し、クローニングすることにより得
られる新たな細胞株からＨＣＶ関連抗原ｐ２２を抽出
精製する方法、さらにこの）（ＣＶ楕遣遺伝子領域のｃ
ＤＮＡ断片を挿入されたバキュロウィルス発現ベクター
を夜盗蛾由来の培養細胞株Ｓｆ細胞に感染させることに
より、ＨＣＶｐ２２を効率よく大量に培養細胞系で産生
させ抽出・精製する方法を開発した。
断片を挿入した発現ベクターをトランスフェクトして培
養細胞株を形質転換し、クローニングすることにより得
られる新たな細胞株からＨＣＶ関連抗原ｐ２２を抽出
精製する方法、さらにこの）（ＣＶ楕遣遺伝子領域のｃ
ＤＮＡ断片を挿入されたバキュロウィルス発現ベクター
を夜盗蛾由来の培養細胞株Ｓｆ細胞に感染させることに
より、ＨＣＶｐ２２を効率よく大量に培養細胞系で産生
させ抽出・精製する方法を開発した。
さらに、このようにして得られるＨＣＶｐ２２を用いて
、ｐ２２抗体を検出するＥＬＩＳＡキットを構築し、こ
れが従来のＨＣＶ抗体測定法と比較して非常に優れてい
ることを確認した。
、ｐ２２抗体を検出するＥＬＩＳＡキットを構築し、こ
れが従来のＨＣＶ抗体測定法と比較して非常に優れてい
ることを確認した。
また本発明は、上記の分子量約２２キロダルトンのｐ２
２のみならず、この全ペプチドをその一部に含むことを
特徴とする、さらに分子量の大きいＨＣＶ関連ポリペプ
チド、この産生方法およびこれを用いたＨＣＶ抗体検出
方法をも提供するものである。
２のみならず、この全ペプチドをその一部に含むことを
特徴とする、さらに分子量の大きいＨＣＶ関連ポリペプ
チド、この産生方法およびこれを用いたＨＣＶ抗体検出
方法をも提供するものである。
以下本発明のｐ２２およびその関連ポリペプチド、その
産生方法並びに該抗原を利用したＨＣＶ抗体の検出に関
して詳細に説明する。
産生方法並びに該抗原を利用したＨＣＶ抗体の検出に関
して詳細に説明する。
（１）ｐ２２
近縁のワラビウイルスの遺伝子配置、この蛋白が塩基性
アミノ酸に富み、Ｎ−Ｎ鎖を持たないなどの実験結果か
ら、本発明のＰ２２はＣ型肝炎ウィルス構造蛋白のひと
つであるヌクレオカプシド蛋白であると考えられた。近
縁のワラビウイルスなどの例からも、ＨＣＶの構造蛋白
は、動物細胞及び昆虫細胞に存在する酵素（シグナラー
ゼ）により、前駆体蛋白から切り出されて生成すると考
えられた。
アミノ酸に富み、Ｎ−Ｎ鎖を持たないなどの実験結果か
ら、本発明のＰ２２はＣ型肝炎ウィルス構造蛋白のひと
つであるヌクレオカプシド蛋白であると考えられた。近
縁のワラビウイルスなどの例からも、ＨＣＶの構造蛋白
は、動物細胞及び昆虫細胞に存在する酵素（シグナラー
ゼ）により、前駆体蛋白から切り出されて生成すると考
えられた。
本発明者らの研究の結果、本発明のｐ２２は、ＨＣＶ構
造遺伝子にコードされるＨＣＶの前駆体ポリペプチドが
、細胞中においてプロセッシングを受けることにより生
じるポリペプチドであることが見いだされた。このこと
から、本発明のｐ２２は、ＨＣＶ本来のヌクレオカプシ
ド蛋白と同じポリペプチドであると考えられ、ＨＣＶ関
連抗体を検出する上で非常に重要な抗原であると考えら
れる。また、本発明の抗原は、このような抗体の検出系
のみならず、ＨＣＶの感染を防御することを目的とした
ワクチンの為の重要な材料ともなるものである。
造遺伝子にコードされるＨＣＶの前駆体ポリペプチドが
、細胞中においてプロセッシングを受けることにより生
じるポリペプチドであることが見いだされた。このこと
から、本発明のｐ２２は、ＨＣＶ本来のヌクレオカプシ
ド蛋白と同じポリペプチドであると考えられ、ＨＣＶ関
連抗体を検出する上で非常に重要な抗原であると考えら
れる。また、本発明の抗原は、このような抗体の検出系
のみならず、ＨＣＶの感染を防御することを目的とした
ワクチンの為の重要な材料ともなるものである。
本発明者らの、各種ＨＣＶｃＤＮＡ断片を用いた発現実
験によって、本発明のｐ２２は、ＨＣＶ遺伝子がコード
している非常に長いＨＣＶ ＠ 躯体ポリペプチドの最
もＮ末端（アミン末端）に位置するポリペプチドである
と推察された。またこのポリペプチドは親水性で、塩基
性のアミノ酸に富むことが塩基配列上推定された。
験によって、本発明のｐ２２は、ＨＣＶ遺伝子がコード
している非常に長いＨＣＶ ＠ 躯体ポリペプチドの最
もＮ末端（アミン末端）に位置するポリペプチドである
と推察された。またこのポリペプチドは親水性で、塩基
性のアミノ酸に富むことが塩基配列上推定された。
さらに、上記前駆体ポリペプチドにコードされる最初の
アミノ酸（メチオニン）から数えて、約１８０〜１９０
番目のアミノ酸の領域が、特に疎水性の強いアミノ酸配
列となっていることから、この領域のアミノ酸がングナ
ラーゼによって認識され、ｌｔｇ体ポリペプチドから切
断されて本発明のポリペプチドが生じるものと考えられ
た。
アミノ酸（メチオニン）から数えて、約１８０〜１９０
番目のアミノ酸の領域が、特に疎水性の強いアミノ酸配
列となっていることから、この領域のアミノ酸がングナ
ラーゼによって認識され、ｌｔｇ体ポリペプチドから切
断されて本発明のポリペプチドが生じるものと考えられ
た。
（２）ｐ２２および関連ペプチドの産生方法本発明のｐ
２２は、ＨＣ〜′構造遠伝子領域のＣＤＮＡを、培ｇ
Ｌ細胞で発現させることによって大量に得ることができ
る。宿主！ｌｌ！！！ｌとなる培養細胞としては、通常
用いられているｃｏｓｓ胞やＣＨｏａ＋ｍ等の動物細胞
を用いることが可能であり、形質転換方法、培貧方法も
常法に従い実施することができる。
２２は、ＨＣ〜′構造遠伝子領域のＣＤＮＡを、培ｇ
Ｌ細胞で発現させることによって大量に得ることができ
る。宿主！ｌｌ！！！ｌとなる培養細胞としては、通常
用いられているｃｏｓｓ胞やＣＨｏａ＋ｍ等の動物細胞
を用いることが可能であり、形質転換方法、培貧方法も
常法に従い実施することができる。
一方、動１＠紹胞と同等のングナラーゼを有しない大腸
菌や酵母を発現の宿主にした場合には、あらかじめｐ
２２をコードする遺伝子領域のみをオープンリーデング
フレームの形にして発現後のプロセッシングを受ける必
要の無いよう発現させることは可能と考えられる。しか
しながら、Ｐ２２ポリペプチドをコードしている遺伝子
領域よりも長めのｃＤ−ＮＡを用いて発現させる場合に
は、シグナラーゼによるプロセッシングが受けられない
と考えられることから、大腸菌や酵母による発現ではＲ
２２の発現は容易ではないと考えられる。
菌や酵母を発現の宿主にした場合には、あらかじめｐ
２２をコードする遺伝子領域のみをオープンリーデング
フレームの形にして発現後のプロセッシングを受ける必
要の無いよう発現させることは可能と考えられる。しか
しながら、Ｐ２２ポリペプチドをコードしている遺伝子
領域よりも長めのｃＤ−ＮＡを用いて発現させる場合に
は、シグナラーゼによるプロセッシングが受けられない
と考えられることから、大腸菌や酵母による発現ではＲ
２２の発現は容易ではないと考えられる。
さらに効率よくＲ２２を発現させるためには、バキュロ
ウィルスをベクターとして用い、昆虫細胞に導入するこ
とによってその目的を達成することができる。
ウィルスをベクターとして用い、昆虫細胞に導入するこ
とによってその目的を達成することができる。
このようなウィルスベクターは、バキュロウィルスに分
類されるウィルスであればいかなるものでもよく５ 例
えばオートグラファ カリフオルニカ（＾ｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ）、トリコプルシアニ
（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｆ ｎｉ）、ラキプルシア・オ
ウ（Ｒａｃｈｊｐｌｕｓｉａ ｏｕ）、ガレリア メロ
ネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ５ｅｌｌｏｎｅｌｌａ＞、或
はボンビツクス・モリ（Ｂ。
類されるウィルスであればいかなるものでもよく５ 例
えばオートグラファ カリフオルニカ（＾ｕｔｏｇｒａ
ｐｈａ Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ）、トリコプルシアニ
（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｆ ｎｉ）、ラキプルシア・オ
ウ（Ｒａｃｈｊｐｌｕｓｉａ ｏｕ）、ガレリア メロ
ネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ５ｅｌｌｏｎｅｌｌａ＞、或
はボンビツクス・モリ（Ｂ。
−ｂｙｘ■０ｒ１）などが例示される。 これらのウィ
ルスの中でもオートグラファ・カリフオルニカ（＾ｃＮ
ＰＶと略す）が好適である。
ルスの中でもオートグラファ・カリフオルニカ（＾ｃＮ
ＰＶと略す）が好適である。
組換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウィ
ルスの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の組
換えベクターが作製される。この場合、前記領域にバキ
ュロウィルス内で機能するプロモーターを存在させるこ
とが必要であり、さらにプロモーターの下流に適当な制
限酵素切断配列を有する合成リンカ−を挿入することが
好ましい。
ルスの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の組
換えベクターが作製される。この場合、前記領域にバキ
ュロウィルス内で機能するプロモーターを存在させるこ
とが必要であり、さらにプロモーターの下流に適当な制
限酵素切断配列を有する合成リンカ−を挿入することが
好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領領域は、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子［ＬＬ１４ｉ１１ｅ
ｒら ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１９． Ｒ７１５−７
２１（１９８３）］など、外来性ＤＮＡの挿入による変
異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない
領域を言う。
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子［ＬＬ１４ｉ１１ｅ
ｒら ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１９． Ｒ７１５−７
２１（１９８３）］など、外来性ＤＮＡの挿入による変
異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない
領域を言う。
ちなみに、ポリヘトリンは、およそ２９．０００タルト
ンの分子量の蛋白質であり、ＡｃＶＰＶゲノムのＥｃ。
ンの分子量の蛋白質であり、ＡｃＶＰＶゲノムのＥｃ。
Ｒ１断片上にその遺伝子が存在することが示されており
、 ［Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈら、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、
４５．Ｒ２１５−２２５（１９８３） ］、ポリヘ
トリン遺伝子のＤＮＡ配列はＧＥ、 Ｓｍ１ｔｈらの論
文［ＶｉｒｏｌｏｇＬ １３１． Ｒ５６１−５６５（
１９８３） ］に示されている。
、 ［Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈら、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、
４５．Ｒ２１５−２２５（１９８３） ］、ポリヘ
トリン遺伝子のＤＮＡ配列はＧＥ、 Ｓｍ１ｔｈらの論
文［ＶｉｒｏｌｏｇＬ １３１． Ｒ５６１−５６５（
１９８３） ］に示されている。
また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものなら如
何なる塩基配列のものでもよく、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター １０にポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものなら如
何なる塩基配列のものでもよく、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター １０にポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
また発現量を増加させるためには２ ポリヘトリン遺伝
子プロモーターとポリヘトリン遺伝子の５非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させポリヘトリンの３°非翻訳
領域が続いているベクターを用いることが好ましい、こ
のようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高く
なることが示されている（松浦ら、Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏ
ｌ、 ６８． Ｒ１２３３−１２５θ（１９８７）、特
開平１−２８５１９８号〕。
子プロモーターとポリヘトリン遺伝子の５非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させポリヘトリンの３°非翻訳
領域が続いているベクターを用いることが好ましい、こ
のようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高く
なることが示されている（松浦ら、Ｊ、ＧｅｎＪｉｒｏ
ｌ、 ６８． Ｒ１２３３−１２５θ（１９８７）、特
開平１−２８５１９８号〕。
本発明に用いられるＨＣ■構造遺伝子領域のＣＤＮＡに
関しては、先に本出願人らにより単離されており（米国
出願４０８．４０５号）、またこのようなＨＣＶ遺伝子
断片は、出願人によって微生物工業技術研究所に寄託さ
れており（ｐＳ７−２８ｅ：微工研条寄第２６３８号、
ｐｓｉ−７１３ｃ：微工研条寄第２６３７号およびＰ［
］］１−１２１６Ｃ：微工研条寄第２５９４号、これら
の遺伝子断片を代表的な出発材料として用いることが可
能である。
関しては、先に本出願人らにより単離されており（米国
出願４０８．４０５号）、またこのようなＨＣＶ遺伝子
断片は、出願人によって微生物工業技術研究所に寄託さ
れており（ｐＳ７−２８ｅ：微工研条寄第２６３８号、
ｐｓｉ−７１３ｃ：微工研条寄第２６３７号およびＰ［
］］１−１２１６Ｃ：微工研条寄第２５９４号、これら
の遺伝子断片を代表的な出発材料として用いることが可
能である。
発現ベクターに組み込むＨＣＶ−ｃＤＮＡとしては、Ｈ
ＣＶゲノムにコードされる前駅体ペプチドの翻訳開始コ
ドン（＾π メチオニン）からシグナラーゼによる認！
１部位（メチオニンから数えて１８０〜１９０番目のア
ミノＭ＞の前後までを少なくとも含むＤＮＡ断片である
。
ＣＶゲノムにコードされる前駅体ペプチドの翻訳開始コ
ドン（＾π メチオニン）からシグナラーゼによる認！
１部位（メチオニンから数えて１８０〜１９０番目のア
ミノＭ＞の前後までを少なくとも含むＤＮＡ断片である
。
また、さらに長いｃ Ｄ Ｎ Ａ、例えばメチオニンか
ら数えて４００番目程度のアミノ酸までをコードする遺
伝子等を用いて培養細胞で発現させた場合においても、
宿主細胞内でプロセッシングを受けて目的のＲ２２を得
ることが出来る。
ら数えて４００番目程度のアミノ酸までをコードする遺
伝子等を用いて培養細胞で発現させた場合においても、
宿主細胞内でプロセッシングを受けて目的のＲ２２を得
ることが出来る。
このようにして、培養細胞においてＲ２２を発現させる
時に、組み込むＨＣＶ構造遺伝子とじてサイズの大きな
遺伝子を用いる場合には、本発明のｐ２２のペプチドの
アミノ酸を有し、さらに分子サイズの大きいポリペプチ
ドが副産物として一部得られる。このようなｐ２２のペ
プチドを含むさらに分子量の大きなＨＣＶ抗原について
もヒトＣ型肝炎患者血清と特異的に反応することが確認
された。すなわち、本発明は、ｐ２２ポリペプチドをそ
の一部に有する、分子量のさらに大きいＨＣ■抗原も提
供するものである。このポリペプチドの分子量に関して
は、組み込むＨＣＶ−ｃＤＮＡの長さに応じて変化し、
例えば、メチオニンをＮ末端として２８９個のアミノ酸
をコードするＨＣＶｃＤＮＡを用いた場合には約３５キ
ロダルトン、また同様に４４１アミノ酸をコードするＨ
ＣＶｃＤＮＡを用いた場合には約５０キロダルトンのポ
リペプチドが得られる。
時に、組み込むＨＣＶ構造遺伝子とじてサイズの大きな
遺伝子を用いる場合には、本発明のｐ２２のペプチドの
アミノ酸を有し、さらに分子サイズの大きいポリペプチ
ドが副産物として一部得られる。このようなｐ２２のペ
プチドを含むさらに分子量の大きなＨＣＶ抗原について
もヒトＣ型肝炎患者血清と特異的に反応することが確認
された。すなわち、本発明は、ｐ２２ポリペプチドをそ
の一部に有する、分子量のさらに大きいＨＣ■抗原も提
供するものである。このポリペプチドの分子量に関して
は、組み込むＨＣＶ−ｃＤＮＡの長さに応じて変化し、
例えば、メチオニンをＮ末端として２８９個のアミノ酸
をコードするＨＣＶｃＤＮＡを用いた場合には約３５キ
ロダルトン、また同様に４４１アミノ酸をコードするＨ
ＣＶｃＤＮＡを用いた場合には約５０キロダルトンのポ
リペプチドが得られる。
（３）Ｔ）２２を含んだ組換えＨＣＶ構造蛋白質を用い
たＨＣＶ関連抗体の検出 本発明の組換えＨＣＶ構造蛋白質を抗原として使用する
ことにより、これに特異的なＨＣＶ抗体を検出すること
ができ、このことによって従来不可観であった、Ｃ型肝
炎の早期診断が可能となる。
たＨＣＶ関連抗体の検出 本発明の組換えＨＣＶ構造蛋白質を抗原として使用する
ことにより、これに特異的なＨＣＶ抗体を検出すること
ができ、このことによって従来不可観であった、Ｃ型肝
炎の早期診断が可能となる。
測定方法としては、通常の酵素ｓｕｍ法（Ｅ Ｉ Ａ）
、ＲＩＡ、蛍光抗体法および凝集法等いずれでも用いる
ことができる。
、ＲＩＡ、蛍光抗体法および凝集法等いずれでも用いる
ことができる。
すなわち、本発明により、ＨＣＶの構造遺伝子に由来す
るｐ２２について、抗体検査法が確立され、血清および
組織診断が可能になった。
るｐ２２について、抗体検査法が確立され、血清および
組織診断が可能になった。
抗ｐ２２抗体は、正常人、Ａ型肝炎患者およびＢ型肝炎
患者の血清からは検出されず、また、Ｃ型肝炎発症のか
なり早い時期に陽性になる傾向が認められたことから、
この抗体を検出する検査法は、Ｃ型肝炎の早期診断およ
び輸血血液のスクリーニングを可能にするものである。
患者の血清からは検出されず、また、Ｃ型肝炎発症のか
なり早い時期に陽性になる傾向が認められたことから、
この抗体を検出する検査法は、Ｃ型肝炎の早期診断およ
び輸血血液のスクリーニングを可能にするものである。
以下、本発明を実施例に従ってさらに詳細に説明するが
、何等これに限定されるものではない。
、何等これに限定されるものではない。
ＨＣＶ構造遺伝子に関しては、先に本尭明者らにより日
本人の非Ａ非Ｂ型肝炎病原保菌者から逆転写ＰＣＲ法に
よってクローニングされており、特許出願されている（
米国特許出願Ｎｏ、 ４０８．４０５ ） 。
本人の非Ａ非Ｂ型肝炎病原保菌者から逆転写ＰＣＲ法に
よってクローニングされており、特許出願されている（
米国特許出願Ｎｏ、 ４０８．４０５ ） 。
本発明のＨＣＶ抗原蛋白質の発現には、プラスミドｐＳ
？−２８ｃ、 ｐｓｌ−７１３ｃ、 ｐｓｌ−７１
３ｇおよびＰＵＩ−１２１６ｃに組み込まれている各ｃ
ＤＮＡを使用した９通常の方法に従い、これら４つのｃ
ＤＮＡの共通部分の塩基配列を制限酵素で部分切断し、
他のクローンと再結合することにより、これらのクロー
ン全体をひとつながりにしたｃＤＮＡを持つプラスミド
ｐＳ７／１−２１６を作成した。下記に、使用した各プ
ラスミドの寄託番号と、構築されたプラスミドｐＳ７／
１−２１６に用いた（クローン化された）それぞれの遺
伝子断片暮を示す。
？−２８ｃ、 ｐｓｌ−７１３ｃ、 ｐｓｌ−７１
３ｇおよびＰＵＩ−１２１６ｃに組み込まれている各ｃ
ＤＮＡを使用した９通常の方法に従い、これら４つのｃ
ＤＮＡの共通部分の塩基配列を制限酵素で部分切断し、
他のクローンと再結合することにより、これらのクロー
ン全体をひとつながりにしたｃＤＮＡを持つプラスミド
ｐＳ７／１−２１６を作成した。下記に、使用した各プ
ラスミドの寄託番号と、構築されたプラスミドｐＳ７／
１−２１６に用いた（クローン化された）それぞれの遺
伝子断片暮を示す。
ｐｓ７−２８ｃ 微工研条寄第２６３８号ｐｓ］−７
１３ｇ なし ｐｓｉ−７］３ｃ 微工研条寄第２６３７号ｐＵ１−
１２１６ｃ微工研条寄第２５９４号５′端−Ｂ５Ｕ３６
１ Ｂｓｕ３６１− ！３ａｌｌ Ｓａｉｌ−Ｄｄｅｌ Ｄｄｅｌ−３’端 さらに、各１ラスミドに組み込まれているＨＣＶの塩基
配列の領域と構築されたプラスミドｐＳ７／１−２１６
に組み込まれた領域を下記に示す、塩基の番号は、いず
れもプラスミドｐｓ７−２８Ｃの日本のＨＣＶｃＤＮＡ
の最初の塩基を１番とした場合の番号である。
１３ｇ なし ｐｓｉ−７］３ｃ 微工研条寄第２６３７号ｐＵ１−
１２１６ｃ微工研条寄第２５９４号５′端−Ｂ５Ｕ３６
１ Ｂｓｕ３６１− ！３ａｌｌ Ｓａｉｌ−Ｄｄｅｌ Ｄｄｅｌ−３’端 さらに、各１ラスミドに組み込まれているＨＣＶの塩基
配列の領域と構築されたプラスミドｐＳ７／１−２１６
に組み込まれた領域を下記に示す、塩基の番号は、いず
れもプラスミドｐｓ７−２８Ｃの日本のＨＣＶｃＤＮＡ
の最初の塩基を１番とした場合の番号である。
ｐｓ７−２８ｃ １−５７２
１−５１８ｐｓｉ−７１３ｇ ５１］］
−１１００５１９−８７４Ｐｓｉ−７１３Ｃ５１］１−
１１００ ８７５−１０８３ｐｓ＋−７１３ｇ
は寄託されていないが、ｐｓｉ−７１３Ｃと比較して６
２７番目のＧ〈グアニン）が＾（アデニン）に、１０４
１０４１番目チミン）がＣ（シトシン）に変異している
だけであり、コードするアミノ酸配列は両ｃＤＮＡ断片
とも同じものである。
１−５１８ｐｓｉ−７１３ｇ ５１］］
−１１００５１９−８７４Ｐｓｉ−７１３Ｃ５１］１−
１１００ ８７５−１０８３ｐｓ＋−７１３ｇ
は寄託されていないが、ｐｓｉ−７１３Ｃと比較して６
２７番目のＧ〈グアニン）が＾（アデニン）に、１０４
１０４１番目チミン）がＣ（シトシン）に変異している
だけであり、コードするアミノ酸配列は両ｃＤＮＡ断片
とも同じものである。
このようにして作成されたｐＳ７／Ｉ −２１６は１４
１３塩基の日本のＨＣＶのｃＤＮＡを有し、その３°末
端にはＢａ−旧とＥｃｏＲｌのリンカ−が付加されてい
る。
１３塩基の日本のＨＣＶのｃＤＮＡを有し、その３°末
端にはＢａ−旧とＥｃｏＲｌのリンカ−が付加されてい
る。
このｃＤＮＡには、はぼ全長を占める大きなオープンリ
ーディングフレームが存在し、その塩基の９１番目に翻
訳開始コドンと思われる＾ＴＧ配列が見られた。
ーディングフレームが存在し、その塩基の９１番目に翻
訳開始コドンと思われる＾ＴＧ配列が見られた。
次にこのｐＳ７／１−２１６を翻訳開始コドンの上流１
２堪基の位置にある＾ｅｅ１部位で部分切断後、Ｐｓｔ
Ｉリンカ−を付加した０次にｃＤＮＡの３°喝に付加し
であるＥｃｏＲＩ部位にさらにＫｐｎ Ｉリンカ−を付
加し、ｃＤＮＡをＰｓｔ Ｉ −１ｉｐｎ １断片とし
て回収し、これを培養細胞系における発現ベクターｐｃ
ＤＬ−８Ｒα２９６［大部豊ら、Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、、 ８．４６６−４７２＜１９８８） ］
のＰｓｔ Ｉ −Ｋｐｎ Ｉ部位にクローン化した。
２堪基の位置にある＾ｅｅ１部位で部分切断後、Ｐｓｔ
Ｉリンカ−を付加した０次にｃＤＮＡの３°喝に付加し
であるＥｃｏＲＩ部位にさらにＫｐｎ Ｉリンカ−を付
加し、ｃＤＮＡをＰｓｔ Ｉ −１ｉｐｎ １断片とし
て回収し、これを培養細胞系における発現ベクターｐｃ
ＤＬ−８Ｒα２９６［大部豊ら、Ｍｏ１． Ｃｅ１１．
Ｂｉｏｌ、、 ８．４６６−４７２＜１９８８） ］
のＰｓｔ Ｉ −Ｋｐｎ Ｉ部位にクローン化した。
この発現ベクターは、大部らによって開発され、強力な
プロモーター スプライシング配列、ポリＡ配列からな
る。このようにして作成されたが発現プラスミドｐｓＲ
３１６である（第１図参照）。
プロモーター スプライシング配列、ポリＡ配列からな
る。このようにして作成されたが発現プラスミドｐｓＲ
３１６である（第１図参照）。
ｐｓＲ３１６を基にして、ＨＣＶ楕遣遺伝子の一部が欠
失した２種類のプラスミドｐｓＲ３１２およびｐｓＲ３
１６ｄ４６を作成した（第１図参照）。
失した２種類のプラスミドｐｓＲ３１２およびｐｓＲ３
１６ｄ４６を作成した（第１図参照）。
ｐｓＲ３１２は、ＨＣＶｃＤＮＡ配列の９５７番目のＰ
ｖｕ１部位から下流をＥｃｏＲＩと二重切断後、ポリメ
ラーゼで修復して結合することにより欠失させた。
ｖｕ１部位から下流をＥｃｏＲＩと二重切断後、ポリメ
ラーゼで修復して結合することにより欠失させた。
ｐｓＲ３１６ｄ４６ハ、ＨＣＶｃＤＮＡ配列ノ２１θ配
列上２１０番目のＡｐ轟１部位で部分切断し、リガーゼ
で結合させることにより、２１０−４１１の２０１塩基
を欠失させた。この場合にはＨＣＶｃＤＮＡの翻訳フレ
ームは保持されており、アミ７１１６７個の欠失が起き
ていると考えられる。
列上２１０番目のＡｐ轟１部位で部分切断し、リガーゼ
で結合させることにより、２１０−４１１の２０１塩基
を欠失させた。この場合にはＨＣＶｃＤＮＡの翻訳フレ
ームは保持されており、アミ７１１６７個の欠失が起き
ていると考えられる。
上記の３種のプラスミド各々２０珂を２Ｘ １０Ｇ個の
サル賢細胞由来培ａｍ胞株であるＣＯ５−１ｍ胞［Ｙ、
Ｇｌｕｚｕｍａｏ、 Ｃｅ１１． ２３． ｐ
１７５−１８２ （１９８１）：］ ’＼リン酸カ
ルシウム法によりトランスフェクトした。
サル賢細胞由来培ａｍ胞株であるＣＯ５−１ｍ胞［Ｙ、
Ｇｌｕｚｕｍａｏ、 Ｃｅ１１． ２３． ｐ
１７５−１８２ （１９８１）：］ ’＼リン酸カ
ルシウム法によりトランスフェクトした。
２日後に、常法に従って、慢性Ｃ型肝炎患者血清を用い
て、蛍光抗体法で抗原を染色した。また、同じ日に紐胞
内蛋白質をウェスタンプロット法により、上記慢性Ｃ型
肝炎患者血清を用いて検出した。
て、蛍光抗体法で抗原を染色した。また、同じ日に紐胞
内蛋白質をウェスタンプロット法により、上記慢性Ｃ型
肝炎患者血清を用いて検出した。
蛍光抗体法では、約１０％の細胞において、細胞質内に
限局して細顆粒状に染色される抗原を認めた。この蛍光
は、ｐｓＲ３１６およびｐＳＲ３１２を用いた時は同程
度に検出されたが、ｐｓＲ３１６ｄ４６の場合にはほと
んど検出されず、またＨＣＶｃＤＮＡを組み込んでいな
いベクターｐｃＤＬ−８Ｒα２９６のみでは全く検出さ
れなかった。
限局して細顆粒状に染色される抗原を認めた。この蛍光
は、ｐｓＲ３１６およびｐＳＲ３１２を用いた時は同程
度に検出されたが、ｐｓＲ３１６ｄ４６の場合にはほと
んど検出されず、またＨＣＶｃＤＮＡを組み込んでいな
いベクターｐｃＤＬ−８Ｒα２９６のみでは全く検出さ
れなかった。
ウェスタンプロット法ではｐｓＲ３１６を用いると分子
量２２キロダルトンの蛋白質が極めて太いバンドとして
検出されたく第２図参照）、このバンドは、ｐｓＲ３１
２でも同様に検出されたが、ｐｓＲ３１６ｄ４６あるい
はベクターｐｃＤＬ−８Ｒａ２９６では検出されず、蛍
光抗体法で見られた抗原を検出していると考えられた。
量２２キロダルトンの蛋白質が極めて太いバンドとして
検出されたく第２図参照）、このバンドは、ｐｓＲ３１
２でも同様に検出されたが、ｐｓＲ３１６ｄ４６あるい
はベクターｐｃＤＬ−８Ｒａ２９６では検出されず、蛍
光抗体法で見られた抗原を検出していると考えられた。
ここで用いた日本のＨＣＶｃＤＮＡに由来する翻訳可能
領域の長さは、ｐｓＲ３１６では４４１アミノ酸であり
、ｐＳＲ３１２では２８９アミノ酸であるにもかかわら
ず、検出された主要蛋白質の分子量が２２キロダルトン
であることは、この蛋白質が翻訳された後にｃｏｓｓ胞
の中で蛋白質のプロセシングにより切断されて生じたと
考えられる。同様の機構は、このウィルスに近縁と考え
られているフラビウイルスＥ Ｃ，Ｎ、 Ｒｉｃｅら、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９． ｐ７２６−７３３（１９
８５） ：］の構造道伝子領域の蛋白質でも観察されて
おり、遺伝子から翻訳された１Ｒ駆体ペプチドが細胞内
の酵素シグナラーゼにより切断されると考えられる。
領域の長さは、ｐｓＲ３１６では４４１アミノ酸であり
、ｐＳＲ３１２では２８９アミノ酸であるにもかかわら
ず、検出された主要蛋白質の分子量が２２キロダルトン
であることは、この蛋白質が翻訳された後にｃｏｓｓ胞
の中で蛋白質のプロセシングにより切断されて生じたと
考えられる。同様の機構は、このウィルスに近縁と考え
られているフラビウイルスＥ Ｃ，Ｎ、 Ｒｉｃｅら、
５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２９． ｐ７２６−７３３（１９
８５） ：］の構造道伝子領域の蛋白質でも観察されて
おり、遺伝子から翻訳された１Ｒ駆体ペプチドが細胞内
の酵素シグナラーゼにより切断されると考えられる。
ｐ２２がｐｓＲ３１６、ｐｓＲ３１２で検出されるがｐ
ｓ１３１６ｄ４６では検出できないことから、ｐ２２を
コードする領域は、アミノ酸配列最初のＮｅｔ （メチ
オニン）から２８９番目のアミノ酸の間にあり、ｐｓＲ
３１６ｄ４６ノ欠失をそのコード領域に含んでいるもの
と考えられる。さらに、コードされるアミノ酸配列の１
８０番目から１９０番目付近に疎水性アミノ酸が連続す
るシグナルペプチド様の配列が見られ、これがングナラ
ーゼの切断認識部位と推測された。また、ｐＳＲ３１６
６４６では、】４キロダルトンの蛋白質が弱いバンドと
して検出されるが、これは本来の９２２が２０１塩基の
欠失により６７アミノ酸短くなった蛋白質が検出されて
いると考えられた。
ｓ１３１６ｄ４６では検出できないことから、ｐ２２を
コードする領域は、アミノ酸配列最初のＮｅｔ （メチ
オニン）から２８９番目のアミノ酸の間にあり、ｐｓＲ
３１６ｄ４６ノ欠失をそのコード領域に含んでいるもの
と考えられる。さらに、コードされるアミノ酸配列の１
８０番目から１９０番目付近に疎水性アミノ酸が連続す
るシグナルペプチド様の配列が見られ、これがングナラ
ーゼの切断認識部位と推測された。また、ｐＳＲ３１６
６４６では、】４キロダルトンの蛋白質が弱いバンドと
して検出されるが、これは本来の９２２が２０１塩基の
欠失により６７アミノ酸短くなった蛋白質が検出されて
いると考えられた。
また、ウェスタンプロットでは、ｐ２２以外にマイナー
な蛋白質として、 ＰＳｌｌ１３１６を用いた時には
約５０キロダルトンのバンド、ｐｓＲ３１２では約３５
キロダルトンのバンドが検出された。これらのバンドは
、プラスミドが含むＨＣＶペプチドのコード領域全体の
蛋白質の大きさには一致していることから、恐らく発現
に用いなｃＤＮＡ全長から翻訳された前駆体蛋白であろ
うと考えられた。
な蛋白質として、 ＰＳｌｌ１３１６を用いた時には
約５０キロダルトンのバンド、ｐｓＲ３１２では約３５
キロダルトンのバンドが検出された。これらのバンドは
、プラスミドが含むＨＣＶペプチドのコード領域全体の
蛋白質の大きさには一致していることから、恐らく発現
に用いなｃＤＮＡ全長から翻訳された前駆体蛋白であろ
うと考えられた。
バ ロ いた
ｐｓＲ３１６の構築に用いたものと同じｃＤＮＡ断片（
へｃｃＩ部位切断−ＥｃｏＲＩ ）をポリメラーゼ処理
により、その末端を平滑末端にし、同じポリメラーゼに
より平滑末端にしたプラスミドｐＡｃＹｉ４１ ［松浦
ら、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６８．
ｐ１２３３−１２５０． ＜１９８７）コ のＢ＆
−ＩＩ部位にクローン化することによりｐＡｃ３１６を
構築した。
へｃｃＩ部位切断−ＥｃｏＲＩ ）をポリメラーゼ処理
により、その末端を平滑末端にし、同じポリメラーゼに
より平滑末端にしたプラスミドｐＡｃＹｉ４１ ［松浦
ら、 Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６８．
ｐ１２３３−１２５０． ＜１９８７）コ のＢ＆
−ＩＩ部位にクローン化することによりｐＡｃ３１６を
構築した。
さらに、このプラスミドをバキュロウィルスＤＮＡとと
もに昆虫由来培養細胞［スボドプテラ・フルジペルタ細
胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃ
ｅｌｌｓ）コにコートランスフェクションを行い、常法
に従って、組換えバキュロウィルスを分離した。
もに昆虫由来培養細胞［スボドプテラ・フルジペルタ細
胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃ
ｅｌｌｓ）コにコートランスフェクションを行い、常法
に従って、組換えバキュロウィルスを分離した。
このウィルスをＭＯＩＩＯでＳｆ細胞に感染させ、７２
時間後にｐ２２の発現を調べた。 ｌＸｌ０″個の感
染細胞を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ （ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）で泳動後、クマシーブリリアント
ブルー（ＣＢＢ）で染色すると、発現蛋白質として２２
キロダルトンの蛋白質が検出された。
時間後にｐ２２の発現を調べた。 ｌＸｌ０″個の感
染細胞を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ （ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動）で泳動後、クマシーブリリアント
ブルー（ＣＢＢ）で染色すると、発現蛋白質として２２
キロダルトンの蛋白質が検出された。
このバンドはＨＣＶｃＤＮＡを組み込んでいない本来の
バキュロウィルス感染細胞では検出できなかった。また
、慢性Ｃ型肝炎患者血清を用いた蛍光抗体法で感染細胞
の１００％に細胞質に特異的な蛍光を検出した。検出細
胞のウェスタンプロット法による検出では、この発現系
でもやはり２２キロダルトンの蛋白質が主要な発現産物
として検出された。ＣＯＳ細胞の場合と同様にツニカマ
イシン添加により、この蛋白のみかけの分子量は変化し
なかったことから、Ｎ−糖鎖は付加されていないものと
考えられた。また、等電点も極めて塩基性であることか
ら、ここで検出されている２２キロダルトンの蛋白質は
ＣＯ８細胞で同定されたｐ２２と、この積土方法の範囲
内では区別できない蛋白であることかわかった。
バキュロウィルス感染細胞では検出できなかった。また
、慢性Ｃ型肝炎患者血清を用いた蛍光抗体法で感染細胞
の１００％に細胞質に特異的な蛍光を検出した。検出細
胞のウェスタンプロット法による検出では、この発現系
でもやはり２２キロダルトンの蛋白質が主要な発現産物
として検出された。ＣＯＳ細胞の場合と同様にツニカマ
イシン添加により、この蛋白のみかけの分子量は変化し
なかったことから、Ｎ−糖鎖は付加されていないものと
考えられた。また、等電点も極めて塩基性であることか
ら、ここで検出されている２２キロダルトンの蛋白質は
ＣＯ８細胞で同定されたｐ２２と、この積土方法の範囲
内では区別できない蛋白であることかわかった。
Ｃ■ いたＨＣＶ
検ユＬ誌
上記の組換えバキュロウィルスを感染させたＨＣＶ構造
タンパク発現感染細胞（ＡｅＨＣＶ−３Ｆ９）を回収し
、ＰＢＳで２回洗浄した後、５Ｘ１０６細胞／ｍｌの濃
度になるよう２ｍＭ ＥＤＴ＾と０．１ｓＭＤＴＴを添
加した５０■間トリス塩Ｗｆｉ緩衝液（ｐ）ｔ８． Ｏ
’Ｉに浮遊させた。
タンパク発現感染細胞（ＡｅＨＣＶ−３Ｆ９）を回収し
、ＰＢＳで２回洗浄した後、５Ｘ１０６細胞／ｍｌの濃
度になるよう２ｍＭ ＥＤＴ＾と０．１ｓＭＤＴＴを添
加した５０■間トリス塩Ｗｆｉ緩衝液（ｐ）ｔ８． Ｏ
’Ｉに浮遊させた。
この細胞浮遊液を超音波を用いて破砕し、その後遠心外
ＩＮ （１２０００ｘ Ｇ、２０分間、４℃）すること
によりその上清を回収した。これを、３３％飽和になる
ように飽和硫酸アンモニウムを加え、再び遠心分離に処
した後、沈殿画分にＰＢＳを５Ｘ １０’個の細胞につ
き１−１づつ加え、超音波処理によって溶解し、分注し
てＨＣｖ抗原蛋白を得た。これらは、−８０”Ｃで凍結
保存し、免疫測定法用の抗原として使用する場合には、
超音波処理後ただちにＥＬＩＳＡプレートにコーティン
グさせた。
ＩＮ （１２０００ｘ Ｇ、２０分間、４℃）すること
によりその上清を回収した。これを、３３％飽和になる
ように飽和硫酸アンモニウムを加え、再び遠心分離に処
した後、沈殿画分にＰＢＳを５Ｘ １０’個の細胞につ
き１−１づつ加え、超音波処理によって溶解し、分注し
てＨＣｖ抗原蛋白を得た。これらは、−８０”Ｃで凍結
保存し、免疫測定法用の抗原として使用する場合には、
超音波処理後ただちにＥＬＩＳＡプレートにコーティン
グさせた。
上記粗精製ＨＣＶ抗原をＰＢＳで５０倍に希釈し、ＥＬ
ＩＳＡ９６穴用マイクロタイタープレートに１００ＩＡ
づつ加え、４℃で一晩放置することによりＥＬＩＳＡプ
レートにコーティングした。
ＩＳＡ９６穴用マイクロタイタープレートに１００ＩＡ
づつ加え、４℃で一晩放置することによりＥＬＩＳＡプ
レートにコーティングした。
このプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、各
ウェルに２０ＯＡの３％スキムミルク添加ＰＢＳを添加
し、室温で１時間放置してブロッキングを行った。
ウェルに２０ＯＡの３％スキムミルク添加ＰＢＳを添加
し、室温で１時間放置してブロッキングを行った。
このプレートに、ＨＣＶ抗体測定の対象となる血清を各
ウェルに１００Δ添加し、室温で２時間放置した。
ウェルに１００Δ添加し、室温で２時間放置した。
このプレートを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、各
ウェルに１００−の３９６スキムミルク添加ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで希釈したアルカリフォスファターゼｗｍヤギ
抗ヒト免疫グロブリンを添加し、室温で１時間放置した
。
ウェルに１００−の３９６スキムミルク添加ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎで希釈したアルカリフォスファターゼｗｍヤギ
抗ヒト免疫グロブリンを添加し、室温で１時間放置した
。
このプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、各ウ
ェルに７００−のアルカリフォスファターゼ基質液を加
えた。
ェルに７００−のアルカリフォスファターゼ基質液を加
えた。
室温で１〜２時間放置し、陽性反応のＡ４０５の吸収が
１５前後の値となった時に全ウェルの吸光度を測定した
。
１５前後の値となった時に全ウェルの吸光度を測定した
。
このアッセイを用いて実際の患者血清を測定し、次のよ
うな結果が得られた。
うな結果が得られた。
典型的な輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎を発症した２症例につい
て、発症直後から経時的に血液を採取し、肝機能検査、
現在唯一のＨＣＶの抗体検査である抗Ｃ１００抗体、そ
して該ｐ２２ペプチドに対する抗体の有無について調べ
た。１２ケ月の観察期間を通じて抗Ｃ１００抗体の検出
されない１症例においてもＧＰＴ値の上昇とほぼ同時に
ｐ２２抗体の上昇が認められた。
て、発症直後から経時的に血液を採取し、肝機能検査、
現在唯一のＨＣＶの抗体検査である抗Ｃ１００抗体、そ
して該ｐ２２ペプチドに対する抗体の有無について調べ
た。１２ケ月の観察期間を通じて抗Ｃ１００抗体の検出
されない１症例においてもＧＰＴ値の上昇とほぼ同時に
ｐ２２抗体の上昇が認められた。
又、もう１例では、抗Ｃ１００抗体が輸血後４ケ月に上
昇したが、Ｐ２２に対する抗体は、それに先立つ３ケ月
前、つまり発症とほぼ同時に検出された。この抗体の検
出は、該蛋白を用いるウェスタンプロット法によっても
同一の結果であった。
昇したが、Ｐ２２に対する抗体は、それに先立つ３ケ月
前、つまり発症とほぼ同時に検出された。この抗体の検
出は、該蛋白を用いるウェスタンプロット法によっても
同一の結果であった。
次に、健常人５人の血液及び非Ａ非Ｂ型肝炎患者（抗Ｃ
１００抗体陽性６人、抗Ｃ１００抗体陰性４人）の血清
を一点で調べた。健常人では陽性数Ｏ１抗Ｃ１００抗体
陽性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者６例中５例、抗Ｃ１００抗
体陰性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者４例中４例が陽性であっ
た。
１００抗体陽性６人、抗Ｃ１００抗体陰性４人）の血清
を一点で調べた。健常人では陽性数Ｏ１抗Ｃ１００抗体
陽性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者６例中５例、抗Ｃ１００抗
体陰性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者４例中４例が陽性であっ
た。
以上の結果から下記のことが確認された。
■正常人ではこの抗体は検出されない。
■非ＡＩＩ−Ｂ型肝炎では９０％陽性となる。
■抗Ｃ１００抗体が陰性の、臨床的に診断された非Ａ非
Ｂ型肝炎患者でも、この方法に従えばほぼ１００％陽性
となる。
Ｂ型肝炎患者でも、この方法に従えばほぼ１００％陽性
となる。
■抗Ｃ１００抗体が陽性の血清でもこの抗体が陰性にな
ることもある。
ることもある。
これらの結果から、ｐ２２に対する抗体は、現在もしく
は過去におけるＨＣＶの感染に伴い特異的に検出される
ことが確認された。この抗体は感染のごく初期に誘導さ
れることから、その検出はＣ型肝炎の早期診断にきわめ
て有用である。
は過去におけるＨＣＶの感染に伴い特異的に検出される
ことが確認された。この抗体は感染のごく初期に誘導さ
れることから、その検出はＣ型肝炎の早期診断にきわめ
て有用である。
第１図は、発現プラスミドＰＳＲ３１６、ｐｓＲ３１２
およびｐｓＲ３１６ｄ４６に組み込まれたＨＣＶ−ｃＤ
ＮＡ［片のＨＣＶゲノム上の領域を示したプラスミドの
構造図を示す。 第２図は、実施例（２）でのそれぞれのプラスミドで形
質転換された細胞の細胞内蛋白質のウェスタンプロット
の結果を示す模式図である。十はツニカマイシン（Ｔｍ
） 処理、 −はＴｍ未処理のサン プルを示す。
およびｐｓＲ３１６ｄ４６に組み込まれたＨＣＶ−ｃＤ
ＮＡ［片のＨＣＶゲノム上の領域を示したプラスミドの
構造図を示す。 第２図は、実施例（２）でのそれぞれのプラスミドで形
質転換された細胞の細胞内蛋白質のウェスタンプロット
の結果を示す模式図である。十はツニカマイシン（Ｔｍ
） 処理、 −はＴｍ未処理のサン プルを示す。
Claims (14)
- （１）Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域から発現される
分子量約２２キロダルトンのＣ型肝炎ウィルス抗原ポリ
ペプチド。 - （２）該抗原ポリペプチドが、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム
にコードされる前駆体ポリペプチドの最もＮ末端に位置
するペプチド断片である前記第（１）項記載のポリペプ
チド。 - （３）前記第（１）項のポリペプチドをその一部に有す
るＣ型肝炎ウィルス抗原ポリペプチド。 - （４）分子量が約３５キロダルトンである前記第（３）
項記載のポリペプチド。 - （５）分子量が約５０キロダルトンである前記第（３）
項記載のポリペプチド。 - （６）Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のｃＤＮＡ断片
を挿入した発現ベクターを培養細胞株に導入し、得られ
た形質転換株を培養することを特徴とする分子量約２２
キロダルトンのＣ型肝炎ウィルス抗原ポリペプチドおよ
び／またはその関連ペプチドの産生方法。 - （７）該培養細胞株が動物細胞である前記第（６）項記
載の産生方法。 - （８）該培養細胞株が昆虫細胞である前記第（６）項記
載の産生方法。 - （９）該発現ベクターが組換えバキュロウイルスである
前記第（８）項記載の産生方法。 - （１０）該Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のｃＤＮＡ
断片が、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
少なくとも１８０番目のアミノ酸をコードする領域まで
を含むＤＮＡ断片である前記第（６）項記載の産生方法
。 - （１１）該Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のｃＤＮＡ
断片が、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
少なくとも１９０番目のアミノ酸をコードする領域まで
を含むＤＮＡ断片である前記第（６）項記載の産生方法
。 - （１２）該Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のｃＤＮＡ
断片が、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
２８９番目のアミノ酸をコードする領域までを含むＤＮ
Ａ断片である前記第（６）項記載の産生方法。 - （１３）該Ｃ型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のｃＤＮＡ
断片が、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
４１１番目のアミノ酸をコードする領域までを含むＤＮ
Ａ断片である前記第（６）項記載の産生方法。 - （１４）上記第（１）項記載のＣ型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチドおよび／または第（３）項記載のＣ型肝炎ウ
ィルス抗原ポリペプチドを抗原として使用し、これに特
異的な抗体を検出することを特徴とするＣ型肝炎ウィル
ス抗体の検出方法。
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