JPH0445795A - C型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法 - Google Patents
C型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、C型肝炎ウィルスの診断等に有効な、C型肝
炎ウィルスゲノムの構造領域から翻訳される新規な抗原
、その産生方法及びこの抗原を用いたC型肝炎関連抗体
の検出方法に関するものである。
炎ウィルスゲノムの構造領域から翻訳される新規な抗原
、その産生方法及びこの抗原を用いたC型肝炎関連抗体
の検出方法に関するものである。
さらに詳しくは、C型肝炎ウィルス(以下HC■という
)構造遺伝子領域にコードされるペプチドであって、5
DS−PAGEで分子量が約22キロダルトンを示す新
規なHCV抗原ポリペプチド(以下p22と略す)、こ
のHCV抗原ポリペプチドの産生方法、このポリペプチ
ドを利用したC型肝炎関連抗体の検出方法に関する。
)構造遺伝子領域にコードされるペプチドであって、5
DS−PAGEで分子量が約22キロダルトンを示す新
規なHCV抗原ポリペプチド(以下p22と略す)、こ
のHCV抗原ポリペプチドの産生方法、このポリペプチ
ドを利用したC型肝炎関連抗体の検出方法に関する。
1見血韮薯
HCVはウィルス性肝炎のひとつであるC型肝炎の病原
ウィルスとして最近同定された。C型肝炎はわが国にお
ける輸血後肝炎のほとんどを占めること、一過性感染の
他に持続性感染のあること(わが国では全人口の約12
%が持続性感染者)が特徴である。急性C型肝炎のうち
約半数が慢性化し、また慢性肝炎は徐々に肝硬変、肝癌
へと移行する。また持続性感染者の比率は世界各地で全
人口の1〜3%を占めると報告されている。すなわちC
型肝炎は、全世界の重大な感染症であり、−その予防、
早期診断並びに治僚は世界的な重要Il!題になってい
る。
ウィルスとして最近同定された。C型肝炎はわが国にお
ける輸血後肝炎のほとんどを占めること、一過性感染の
他に持続性感染のあること(わが国では全人口の約12
%が持続性感染者)が特徴である。急性C型肝炎のうち
約半数が慢性化し、また慢性肝炎は徐々に肝硬変、肝癌
へと移行する。また持続性感染者の比率は世界各地で全
人口の1〜3%を占めると報告されている。すなわちC
型肝炎は、全世界の重大な感染症であり、−その予防、
早期診断並びに治僚は世界的な重要Il!題になってい
る。
HCVはプラス鎖RNAウィルスでそのウィルスゲノム
は約1万塩基からなる。ゲノムの5°側にウィルス構造
蛋白をコードする構造遺伝子領域があり、その下流には
非構造(non−structural、NS)遺伝子
領域がある。現在までのところ、このウィルスのコード
する抗原蛋白はひとつも同定されていない、現在までに
報告されている唯一の抗原抗体測定法は、HCV非構造
遺伝子領域の−1(NS3からMS411域にかけて)
の363アミノ酸を含む、酵母で産生された融合蛋白(
C100)に対する抗体(抗C100抗体)検出法であ
る。この抗体検出法でHCVに対する重置の既往をある
程度知ることが出来るため、この検出法はC型肝炎ウィ
ルスの診断に利用されている。また、この検出法で陽性
の血液は感染性の)(CVを含むことが多いため、現在
わが国ではこの検出法が輸血用血液のスクリーニングに
使用されている。
は約1万塩基からなる。ゲノムの5°側にウィルス構造
蛋白をコードする構造遺伝子領域があり、その下流には
非構造(non−structural、NS)遺伝子
領域がある。現在までのところ、このウィルスのコード
する抗原蛋白はひとつも同定されていない、現在までに
報告されている唯一の抗原抗体測定法は、HCV非構造
遺伝子領域の−1(NS3からMS411域にかけて)
の363アミノ酸を含む、酵母で産生された融合蛋白(
C100)に対する抗体(抗C100抗体)検出法であ
る。この抗体検出法でHCVに対する重置の既往をある
程度知ることが出来るため、この検出法はC型肝炎ウィ
ルスの診断に利用されている。また、この検出法で陽性
の血液は感染性の)(CVを含むことが多いため、現在
わが国ではこの検出法が輸血用血液のスクリーニングに
使用されている。
上記C100抗体は、C型肝炎発症後陽性になるために
通常3〜6ケ月を要するため、この間C型肝炎の診断法
としては利用できないことが、最大の閏題点として拳げ
られる。また、抗C100抗体陰性の血液だけを輸血し
た症例でも、C型肝炎ウィルスの発生がある程度見られ
ることから、この抗体検査だけでは、輸血後肝炎の半分
程度しかスクリーンアウトできないと予想されており、
斬たな抗体検査あるいはウィルス構造蛋白抗原の検出法
が期待されている。:iたC100抗原は非構造蛋白遺
伝子由来であることから、より直接的な診断法や将来の
ワクチン材料の候補として、ウィルス構造蛋白の同定と
その抗原抗体検出系の確立が極めて重要であった。
通常3〜6ケ月を要するため、この間C型肝炎の診断法
としては利用できないことが、最大の閏題点として拳げ
られる。また、抗C100抗体陰性の血液だけを輸血し
た症例でも、C型肝炎ウィルスの発生がある程度見られ
ることから、この抗体検査だけでは、輸血後肝炎の半分
程度しかスクリーンアウトできないと予想されており、
斬たな抗体検査あるいはウィルス構造蛋白抗原の検出法
が期待されている。:iたC100抗原は非構造蛋白遺
伝子由来であることから、より直接的な診断法や将来の
ワクチン材料の候補として、ウィルス構造蛋白の同定と
その抗原抗体検出系の確立が極めて重要であった。
t・
本発明者らは、以上のような問題点を解決すべく研究を
重ねてきた結果、HCV構造遺伝子領域のcDNAを培
11m胞中で発現させ、C型肝炎患者血清を用いた蛍光
抗体法およびウェスタンプロット法により、C型肝炎患
者血清と特異的に反応する分子量約22キロダルトンの
HCV遺伝子由来の新規ポリペプチド<p22>を見い
だしこれを分離して本発明を完成するに至った。
重ねてきた結果、HCV構造遺伝子領域のcDNAを培
11m胞中で発現させ、C型肝炎患者血清を用いた蛍光
抗体法およびウェスタンプロット法により、C型肝炎患
者血清と特異的に反応する分子量約22キロダルトンの
HCV遺伝子由来の新規ポリペプチド<p22>を見い
だしこれを分離して本発明を完成するに至った。
次いで、上記で用いたHCV構造遺伝子領域のcDNA
断片を挿入した発現ベクターをトランスフェクトして培
養細胞株を形質転換し、クローニングすることにより得
られる新たな細胞株からHCV関連抗原p22を抽出
精製する方法、さらにこの)(CV楕遣遺伝子領域のc
DNA断片を挿入されたバキュロウィルス発現ベクター
を夜盗蛾由来の培養細胞株Sf細胞に感染させることに
より、HCVp22を効率よく大量に培養細胞系で産生
させ抽出・精製する方法を開発した。
断片を挿入した発現ベクターをトランスフェクトして培
養細胞株を形質転換し、クローニングすることにより得
られる新たな細胞株からHCV関連抗原p22を抽出
精製する方法、さらにこの)(CV楕遣遺伝子領域のc
DNA断片を挿入されたバキュロウィルス発現ベクター
を夜盗蛾由来の培養細胞株Sf細胞に感染させることに
より、HCVp22を効率よく大量に培養細胞系で産生
させ抽出・精製する方法を開発した。
さらに、このようにして得られるHCVp22を用いて
、p22抗体を検出するELISAキットを構築し、こ
れが従来のHCV抗体測定法と比較して非常に優れてい
ることを確認した。
、p22抗体を検出するELISAキットを構築し、こ
れが従来のHCV抗体測定法と比較して非常に優れてい
ることを確認した。
また本発明は、上記の分子量約22キロダルトンのp2
2のみならず、この全ペプチドをその一部に含むことを
特徴とする、さらに分子量の大きいHCV関連ポリペプ
チド、この産生方法およびこれを用いたHCV抗体検出
方法をも提供するものである。
2のみならず、この全ペプチドをその一部に含むことを
特徴とする、さらに分子量の大きいHCV関連ポリペプ
チド、この産生方法およびこれを用いたHCV抗体検出
方法をも提供するものである。
以下本発明のp22およびその関連ポリペプチド、その
産生方法並びに該抗原を利用したHCV抗体の検出に関
して詳細に説明する。
産生方法並びに該抗原を利用したHCV抗体の検出に関
して詳細に説明する。
(1)p22
近縁のワラビウイルスの遺伝子配置、この蛋白が塩基性
アミノ酸に富み、N−N鎖を持たないなどの実験結果か
ら、本発明のP22はC型肝炎ウィルス構造蛋白のひと
つであるヌクレオカプシド蛋白であると考えられた。近
縁のワラビウイルスなどの例からも、HCVの構造蛋白
は、動物細胞及び昆虫細胞に存在する酵素(シグナラー
ゼ)により、前駆体蛋白から切り出されて生成すると考
えられた。
アミノ酸に富み、N−N鎖を持たないなどの実験結果か
ら、本発明のP22はC型肝炎ウィルス構造蛋白のひと
つであるヌクレオカプシド蛋白であると考えられた。近
縁のワラビウイルスなどの例からも、HCVの構造蛋白
は、動物細胞及び昆虫細胞に存在する酵素(シグナラー
ゼ)により、前駆体蛋白から切り出されて生成すると考
えられた。
本発明者らの研究の結果、本発明のp22は、HCV構
造遺伝子にコードされるHCVの前駆体ポリペプチドが
、細胞中においてプロセッシングを受けることにより生
じるポリペプチドであることが見いだされた。このこと
から、本発明のp22は、HCV本来のヌクレオカプシ
ド蛋白と同じポリペプチドであると考えられ、HCV関
連抗体を検出する上で非常に重要な抗原であると考えら
れる。また、本発明の抗原は、このような抗体の検出系
のみならず、HCVの感染を防御することを目的とした
ワクチンの為の重要な材料ともなるものである。
造遺伝子にコードされるHCVの前駆体ポリペプチドが
、細胞中においてプロセッシングを受けることにより生
じるポリペプチドであることが見いだされた。このこと
から、本発明のp22は、HCV本来のヌクレオカプシ
ド蛋白と同じポリペプチドであると考えられ、HCV関
連抗体を検出する上で非常に重要な抗原であると考えら
れる。また、本発明の抗原は、このような抗体の検出系
のみならず、HCVの感染を防御することを目的とした
ワクチンの為の重要な材料ともなるものである。
本発明者らの、各種HCVcDNA断片を用いた発現実
験によって、本発明のp22は、HCV遺伝子がコード
している非常に長いHCV @ 躯体ポリペプチドの最
もN末端(アミン末端)に位置するポリペプチドである
と推察された。またこのポリペプチドは親水性で、塩基
性のアミノ酸に富むことが塩基配列上推定された。
験によって、本発明のp22は、HCV遺伝子がコード
している非常に長いHCV @ 躯体ポリペプチドの最
もN末端(アミン末端)に位置するポリペプチドである
と推察された。またこのポリペプチドは親水性で、塩基
性のアミノ酸に富むことが塩基配列上推定された。
さらに、上記前駆体ポリペプチドにコードされる最初の
アミノ酸(メチオニン)から数えて、約180〜190
番目のアミノ酸の領域が、特に疎水性の強いアミノ酸配
列となっていることから、この領域のアミノ酸がングナ
ラーゼによって認識され、ltg体ポリペプチドから切
断されて本発明のポリペプチドが生じるものと考えられ
た。
アミノ酸(メチオニン)から数えて、約180〜190
番目のアミノ酸の領域が、特に疎水性の強いアミノ酸配
列となっていることから、この領域のアミノ酸がングナ
ラーゼによって認識され、ltg体ポリペプチドから切
断されて本発明のポリペプチドが生じるものと考えられ
た。
(2)p22および関連ペプチドの産生方法本発明のp
22は、HC〜′構造遠伝子領域のCDNAを、培g
L細胞で発現させることによって大量に得ることができ
る。宿主!ll!!!lとなる培養細胞としては、通常
用いられているcoss胞やCHoa+m等の動物細胞
を用いることが可能であり、形質転換方法、培貧方法も
常法に従い実施することができる。
22は、HC〜′構造遠伝子領域のCDNAを、培g
L細胞で発現させることによって大量に得ることができ
る。宿主!ll!!!lとなる培養細胞としては、通常
用いられているcoss胞やCHoa+m等の動物細胞
を用いることが可能であり、形質転換方法、培貧方法も
常法に従い実施することができる。
一方、動1@紹胞と同等のングナラーゼを有しない大腸
菌や酵母を発現の宿主にした場合には、あらかじめp
22をコードする遺伝子領域のみをオープンリーデング
フレームの形にして発現後のプロセッシングを受ける必
要の無いよう発現させることは可能と考えられる。しか
しながら、P22ポリペプチドをコードしている遺伝子
領域よりも長めのcD−NAを用いて発現させる場合に
は、シグナラーゼによるプロセッシングが受けられない
と考えられることから、大腸菌や酵母による発現ではR
22の発現は容易ではないと考えられる。
菌や酵母を発現の宿主にした場合には、あらかじめp
22をコードする遺伝子領域のみをオープンリーデング
フレームの形にして発現後のプロセッシングを受ける必
要の無いよう発現させることは可能と考えられる。しか
しながら、P22ポリペプチドをコードしている遺伝子
領域よりも長めのcD−NAを用いて発現させる場合に
は、シグナラーゼによるプロセッシングが受けられない
と考えられることから、大腸菌や酵母による発現ではR
22の発現は容易ではないと考えられる。
さらに効率よくR22を発現させるためには、バキュロ
ウィルスをベクターとして用い、昆虫細胞に導入するこ
とによってその目的を達成することができる。
ウィルスをベクターとして用い、昆虫細胞に導入するこ
とによってその目的を達成することができる。
このようなウィルスベクターは、バキュロウィルスに分
類されるウィルスであればいかなるものでもよく5 例
えばオートグラファ カリフオルニカ(^utogra
pha Ca1ifornica)、トリコプルシアニ
(Trichoplusf ni)、ラキプルシア・オ
ウ(Rachjplusia ou)、ガレリア メロ
ネラ(Galleria 5ellonella>、或
はボンビツクス・モリ(B。
類されるウィルスであればいかなるものでもよく5 例
えばオートグラファ カリフオルニカ(^utogra
pha Ca1ifornica)、トリコプルシアニ
(Trichoplusf ni)、ラキプルシア・オ
ウ(Rachjplusia ou)、ガレリア メロ
ネラ(Galleria 5ellonella>、或
はボンビツクス・モリ(B。
−byx■0r1)などが例示される。 これらのウィ
ルスの中でもオートグラファ・カリフオルニカ(^cN
PVと略す)が好適である。
ルスの中でもオートグラファ・カリフオルニカ(^cN
PVと略す)が好適である。
組換えウィルスの作製に当たっては、まずバキュロウィ
ルスの増殖に非必須なりNA領領域組み込んだ第一の組
換えベクターが作製される。この場合、前記領域にバキ
ュロウィルス内で機能するプロモーターを存在させるこ
とが必要であり、さらにプロモーターの下流に適当な制
限酵素切断配列を有する合成リンカ−を挿入することが
好ましい。
ルスの増殖に非必須なりNA領領域組み込んだ第一の組
換えベクターが作製される。この場合、前記領域にバキ
ュロウィルス内で機能するプロモーターを存在させるこ
とが必要であり、さらにプロモーターの下流に適当な制
限酵素切断配列を有する合成リンカ−を挿入することが
好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりNA領領域は、例えばバキ
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子[LL14i11e
rら 5cience、 219. R715−7
21(1983)]など、外来性DNAの挿入による変
異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない
領域を言う。
ュロウィルスのポリヘトリン遺伝子[LL14i11e
rら 5cience、 219. R715−7
21(1983)]など、外来性DNAの挿入による変
異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼさない
領域を言う。
ちなみに、ポリヘトリンは、およそ29.000タルト
ンの分子量の蛋白質であり、AcVPVゲノムのEc。
ンの分子量の蛋白質であり、AcVPVゲノムのEc。
R1断片上にその遺伝子が存在することが示されており
、 [G、E、Sm1thら、 J、Virol、、
45.R215−225(1983) ]、ポリヘ
トリン遺伝子のDNA配列はGE、 Sm1thらの論
文[VirologL 131. R561−565(
1983) ]に示されている。
、 [G、E、Sm1thら、 J、Virol、、
45.R215−225(1983) ]、ポリヘ
トリン遺伝子のDNA配列はGE、 Sm1thらの論
文[VirologL 131. R561−565(
1983) ]に示されている。
また、バキュロウィルス内で機能するプロモーターとは
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものなら如
何なる塩基配列のものでもよく、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター 10にポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
、合成・天然を問わずバキュロウィルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能しえるものなら如
何なる塩基配列のものでもよく、その具体例としては、
例えばバキュロウィルスのポリヘトリンをコードする遺
伝子のプロモーター 10にポリペプチドをコードする
バキュロウィルス遺伝子のプロモーターなどが例示され
る。
また発現量を増加させるためには2 ポリヘトリン遺伝
子プロモーターとポリヘトリン遺伝子の5非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させポリヘトリンの3°非翻訳
領域が続いているベクターを用いることが好ましい、こ
のようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高く
なることが示されている(松浦ら、J、GenJiro
l、 68. R1233−125θ(1987)、特
開平1−285198号〕。
子プロモーターとポリヘトリン遺伝子の5非翻訳領域の
直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘトリンの構造
遺伝子配列を完全に欠失させポリヘトリンの3°非翻訳
領域が続いているベクターを用いることが好ましい、こ
のようなベクターは、外来遺伝子の発現量が極めて高く
なることが示されている(松浦ら、J、GenJiro
l、 68. R1233−125θ(1987)、特
開平1−285198号〕。
本発明に用いられるHC■構造遺伝子領域のCDNAに
関しては、先に本出願人らにより単離されており(米国
出願408.405号)、またこのようなHCV遺伝子
断片は、出願人によって微生物工業技術研究所に寄託さ
れており(pS7−28e:微工研条寄第2638号、
psi−713c:微工研条寄第2637号およびP[
]]1−1216C:微工研条寄第2594号、これら
の遺伝子断片を代表的な出発材料として用いることが可
能である。
関しては、先に本出願人らにより単離されており(米国
出願408.405号)、またこのようなHCV遺伝子
断片は、出願人によって微生物工業技術研究所に寄託さ
れており(pS7−28e:微工研条寄第2638号、
psi−713c:微工研条寄第2637号およびP[
]]1−1216C:微工研条寄第2594号、これら
の遺伝子断片を代表的な出発材料として用いることが可
能である。
発現ベクターに組み込むHCV−cDNAとしては、H
CVゲノムにコードされる前駅体ペプチドの翻訳開始コ
ドン(^π メチオニン)からシグナラーゼによる認!
1部位(メチオニンから数えて180〜190番目のア
ミノM>の前後までを少なくとも含むDNA断片である
。
CVゲノムにコードされる前駅体ペプチドの翻訳開始コ
ドン(^π メチオニン)からシグナラーゼによる認!
1部位(メチオニンから数えて180〜190番目のア
ミノM>の前後までを少なくとも含むDNA断片である
。
また、さらに長いc D N A、例えばメチオニンか
ら数えて400番目程度のアミノ酸までをコードする遺
伝子等を用いて培養細胞で発現させた場合においても、
宿主細胞内でプロセッシングを受けて目的のR22を得
ることが出来る。
ら数えて400番目程度のアミノ酸までをコードする遺
伝子等を用いて培養細胞で発現させた場合においても、
宿主細胞内でプロセッシングを受けて目的のR22を得
ることが出来る。
このようにして、培養細胞においてR22を発現させる
時に、組み込むHCV構造遺伝子とじてサイズの大きな
遺伝子を用いる場合には、本発明のp22のペプチドの
アミノ酸を有し、さらに分子サイズの大きいポリペプチ
ドが副産物として一部得られる。このようなp22のペ
プチドを含むさらに分子量の大きなHCV抗原について
もヒトC型肝炎患者血清と特異的に反応することが確認
された。すなわち、本発明は、p22ポリペプチドをそ
の一部に有する、分子量のさらに大きいHC■抗原も提
供するものである。このポリペプチドの分子量に関して
は、組み込むHCV−cDNAの長さに応じて変化し、
例えば、メチオニンをN末端として289個のアミノ酸
をコードするHCVcDNAを用いた場合には約35キ
ロダルトン、また同様に441アミノ酸をコードするH
CVcDNAを用いた場合には約50キロダルトンのポ
リペプチドが得られる。
時に、組み込むHCV構造遺伝子とじてサイズの大きな
遺伝子を用いる場合には、本発明のp22のペプチドの
アミノ酸を有し、さらに分子サイズの大きいポリペプチ
ドが副産物として一部得られる。このようなp22のペ
プチドを含むさらに分子量の大きなHCV抗原について
もヒトC型肝炎患者血清と特異的に反応することが確認
された。すなわち、本発明は、p22ポリペプチドをそ
の一部に有する、分子量のさらに大きいHC■抗原も提
供するものである。このポリペプチドの分子量に関して
は、組み込むHCV−cDNAの長さに応じて変化し、
例えば、メチオニンをN末端として289個のアミノ酸
をコードするHCVcDNAを用いた場合には約35キ
ロダルトン、また同様に441アミノ酸をコードするH
CVcDNAを用いた場合には約50キロダルトンのポ
リペプチドが得られる。
(3)T)22を含んだ組換えHCV構造蛋白質を用い
たHCV関連抗体の検出 本発明の組換えHCV構造蛋白質を抗原として使用する
ことにより、これに特異的なHCV抗体を検出すること
ができ、このことによって従来不可観であった、C型肝
炎の早期診断が可能となる。
たHCV関連抗体の検出 本発明の組換えHCV構造蛋白質を抗原として使用する
ことにより、これに特異的なHCV抗体を検出すること
ができ、このことによって従来不可観であった、C型肝
炎の早期診断が可能となる。
測定方法としては、通常の酵素sum法(E I A)
、RIA、蛍光抗体法および凝集法等いずれでも用いる
ことができる。
、RIA、蛍光抗体法および凝集法等いずれでも用いる
ことができる。
すなわち、本発明により、HCVの構造遺伝子に由来す
るp22について、抗体検査法が確立され、血清および
組織診断が可能になった。
るp22について、抗体検査法が確立され、血清および
組織診断が可能になった。
抗p22抗体は、正常人、A型肝炎患者およびB型肝炎
患者の血清からは検出されず、また、C型肝炎発症のか
なり早い時期に陽性になる傾向が認められたことから、
この抗体を検出する検査法は、C型肝炎の早期診断およ
び輸血血液のスクリーニングを可能にするものである。
患者の血清からは検出されず、また、C型肝炎発症のか
なり早い時期に陽性になる傾向が認められたことから、
この抗体を検出する検査法は、C型肝炎の早期診断およ
び輸血血液のスクリーニングを可能にするものである。
以下、本発明を実施例に従ってさらに詳細に説明するが
、何等これに限定されるものではない。
、何等これに限定されるものではない。
HCV構造遺伝子に関しては、先に本尭明者らにより日
本人の非A非B型肝炎病原保菌者から逆転写PCR法に
よってクローニングされており、特許出願されている(
米国特許出願No、 408.405 ) 。
本人の非A非B型肝炎病原保菌者から逆転写PCR法に
よってクローニングされており、特許出願されている(
米国特許出願No、 408.405 ) 。
本発明のHCV抗原蛋白質の発現には、プラスミドpS
?−28c、 psl−713c、 psl−71
3gおよびPUI−1216cに組み込まれている各c
DNAを使用した9通常の方法に従い、これら4つのc
DNAの共通部分の塩基配列を制限酵素で部分切断し、
他のクローンと再結合することにより、これらのクロー
ン全体をひとつながりにしたcDNAを持つプラスミド
pS7/1−216を作成した。下記に、使用した各プ
ラスミドの寄託番号と、構築されたプラスミドpS7/
1−216に用いた(クローン化された)それぞれの遺
伝子断片暮を示す。
?−28c、 psl−713c、 psl−71
3gおよびPUI−1216cに組み込まれている各c
DNAを使用した9通常の方法に従い、これら4つのc
DNAの共通部分の塩基配列を制限酵素で部分切断し、
他のクローンと再結合することにより、これらのクロー
ン全体をひとつながりにしたcDNAを持つプラスミド
pS7/1−216を作成した。下記に、使用した各プ
ラスミドの寄託番号と、構築されたプラスミドpS7/
1−216に用いた(クローン化された)それぞれの遺
伝子断片暮を示す。
ps7−28c 微工研条寄第2638号ps]−7
13g なし psi−7]3c 微工研条寄第2637号pU1−
1216c微工研条寄第2594号5′端−B5U36
1 Bsu361− !3all Sail−Ddel Ddel−3’端 さらに、各1ラスミドに組み込まれているHCVの塩基
配列の領域と構築されたプラスミドpS7/1−216
に組み込まれた領域を下記に示す、塩基の番号は、いず
れもプラスミドps7−28Cの日本のHCVcDNA
の最初の塩基を1番とした場合の番号である。
13g なし psi−7]3c 微工研条寄第2637号pU1−
1216c微工研条寄第2594号5′端−B5U36
1 Bsu361− !3all Sail−Ddel Ddel−3’端 さらに、各1ラスミドに組み込まれているHCVの塩基
配列の領域と構築されたプラスミドpS7/1−216
に組み込まれた領域を下記に示す、塩基の番号は、いず
れもプラスミドps7−28Cの日本のHCVcDNA
の最初の塩基を1番とした場合の番号である。
ps7−28c 1−572
1−518psi−713g 51]]
−1100519−874Psi−713C51]1−
1100 875−1083ps+−713g
は寄託されていないが、psi−713Cと比較して6
27番目のG〈グアニン)が^(アデニン)に、104
1041番目チミン)がC(シトシン)に変異している
だけであり、コードするアミノ酸配列は両cDNA断片
とも同じものである。
1−518psi−713g 51]]
−1100519−874Psi−713C51]1−
1100 875−1083ps+−713g
は寄託されていないが、psi−713Cと比較して6
27番目のG〈グアニン)が^(アデニン)に、104
1041番目チミン)がC(シトシン)に変異している
だけであり、コードするアミノ酸配列は両cDNA断片
とも同じものである。
このようにして作成されたpS7/I −216は14
13塩基の日本のHCVのcDNAを有し、その3°末
端にはBa−旧とEcoRlのリンカ−が付加されてい
る。
13塩基の日本のHCVのcDNAを有し、その3°末
端にはBa−旧とEcoRlのリンカ−が付加されてい
る。
このcDNAには、はぼ全長を占める大きなオープンリ
ーディングフレームが存在し、その塩基の91番目に翻
訳開始コドンと思われる^TG配列が見られた。
ーディングフレームが存在し、その塩基の91番目に翻
訳開始コドンと思われる^TG配列が見られた。
次にこのpS7/1−216を翻訳開始コドンの上流1
2堪基の位置にある^ee1部位で部分切断後、Pst
Iリンカ−を付加した0次にcDNAの3°喝に付加し
であるEcoRI部位にさらにKpn Iリンカ−を付
加し、cDNAをPst I −1ipn 1断片とし
て回収し、これを培養細胞系における発現ベクターpc
DL−8Rα296[大部豊ら、Mo1. Ce11.
Biol、、 8.466−472<1988) ]
のPst I −Kpn I部位にクローン化した。
2堪基の位置にある^ee1部位で部分切断後、Pst
Iリンカ−を付加した0次にcDNAの3°喝に付加し
であるEcoRI部位にさらにKpn Iリンカ−を付
加し、cDNAをPst I −1ipn 1断片とし
て回収し、これを培養細胞系における発現ベクターpc
DL−8Rα296[大部豊ら、Mo1. Ce11.
Biol、、 8.466−472<1988) ]
のPst I −Kpn I部位にクローン化した。
この発現ベクターは、大部らによって開発され、強力な
プロモーター スプライシング配列、ポリA配列からな
る。このようにして作成されたが発現プラスミドpsR
316である(第1図参照)。
プロモーター スプライシング配列、ポリA配列からな
る。このようにして作成されたが発現プラスミドpsR
316である(第1図参照)。
psR316を基にして、HCV楕遣遺伝子の一部が欠
失した2種類のプラスミドpsR312およびpsR3
16d46を作成した(第1図参照)。
失した2種類のプラスミドpsR312およびpsR3
16d46を作成した(第1図参照)。
psR312は、HCVcDNA配列の957番目のP
vu1部位から下流をEcoRIと二重切断後、ポリメ
ラーゼで修復して結合することにより欠失させた。
vu1部位から下流をEcoRIと二重切断後、ポリメ
ラーゼで修復して結合することにより欠失させた。
psR316d46ハ、HCVcDNA配列ノ21θ配
列上210番目のAp轟1部位で部分切断し、リガーゼ
で結合させることにより、210−411の201塩基
を欠失させた。この場合にはHCVcDNAの翻訳フレ
ームは保持されており、アミ71167個の欠失が起き
ていると考えられる。
列上210番目のAp轟1部位で部分切断し、リガーゼ
で結合させることにより、210−411の201塩基
を欠失させた。この場合にはHCVcDNAの翻訳フレ
ームは保持されており、アミ71167個の欠失が起き
ていると考えられる。
上記の3種のプラスミド各々20珂を2X 10G個の
サル賢細胞由来培am胞株であるCO5−1m胞[Y、
Gluzumao、 Ce11. 23. p
175−182 (1981):] ’\リン酸カ
ルシウム法によりトランスフェクトした。
サル賢細胞由来培am胞株であるCO5−1m胞[Y、
Gluzumao、 Ce11. 23. p
175−182 (1981):] ’\リン酸カ
ルシウム法によりトランスフェクトした。
2日後に、常法に従って、慢性C型肝炎患者血清を用い
て、蛍光抗体法で抗原を染色した。また、同じ日に紐胞
内蛋白質をウェスタンプロット法により、上記慢性C型
肝炎患者血清を用いて検出した。
て、蛍光抗体法で抗原を染色した。また、同じ日に紐胞
内蛋白質をウェスタンプロット法により、上記慢性C型
肝炎患者血清を用いて検出した。
蛍光抗体法では、約10%の細胞において、細胞質内に
限局して細顆粒状に染色される抗原を認めた。この蛍光
は、psR316およびpSR312を用いた時は同程
度に検出されたが、psR316d46の場合にはほと
んど検出されず、またHCVcDNAを組み込んでいな
いベクターpcDL−8Rα296のみでは全く検出さ
れなかった。
限局して細顆粒状に染色される抗原を認めた。この蛍光
は、psR316およびpSR312を用いた時は同程
度に検出されたが、psR316d46の場合にはほと
んど検出されず、またHCVcDNAを組み込んでいな
いベクターpcDL−8Rα296のみでは全く検出さ
れなかった。
ウェスタンプロット法ではpsR316を用いると分子
量22キロダルトンの蛋白質が極めて太いバンドとして
検出されたく第2図参照)、このバンドは、psR31
2でも同様に検出されたが、psR316d46あるい
はベクターpcDL−8Ra296では検出されず、蛍
光抗体法で見られた抗原を検出していると考えられた。
量22キロダルトンの蛋白質が極めて太いバンドとして
検出されたく第2図参照)、このバンドは、psR31
2でも同様に検出されたが、psR316d46あるい
はベクターpcDL−8Ra296では検出されず、蛍
光抗体法で見られた抗原を検出していると考えられた。
ここで用いた日本のHCVcDNAに由来する翻訳可能
領域の長さは、psR316では441アミノ酸であり
、pSR312では289アミノ酸であるにもかかわら
ず、検出された主要蛋白質の分子量が22キロダルトン
であることは、この蛋白質が翻訳された後にcoss胞
の中で蛋白質のプロセシングにより切断されて生じたと
考えられる。同様の機構は、このウィルスに近縁と考え
られているフラビウイルスE C,N、 Riceら、
5cience、 229. p726−733(19
85) :]の構造道伝子領域の蛋白質でも観察されて
おり、遺伝子から翻訳された1R駆体ペプチドが細胞内
の酵素シグナラーゼにより切断されると考えられる。
領域の長さは、psR316では441アミノ酸であり
、pSR312では289アミノ酸であるにもかかわら
ず、検出された主要蛋白質の分子量が22キロダルトン
であることは、この蛋白質が翻訳された後にcoss胞
の中で蛋白質のプロセシングにより切断されて生じたと
考えられる。同様の機構は、このウィルスに近縁と考え
られているフラビウイルスE C,N、 Riceら、
5cience、 229. p726−733(19
85) :]の構造道伝子領域の蛋白質でも観察されて
おり、遺伝子から翻訳された1R駆体ペプチドが細胞内
の酵素シグナラーゼにより切断されると考えられる。
p22がpsR316、psR312で検出されるがp
s1316d46では検出できないことから、p22を
コードする領域は、アミノ酸配列最初のNet (メチ
オニン)から289番目のアミノ酸の間にあり、psR
316d46ノ欠失をそのコード領域に含んでいるもの
と考えられる。さらに、コードされるアミノ酸配列の1
80番目から190番目付近に疎水性アミノ酸が連続す
るシグナルペプチド様の配列が見られ、これがングナラ
ーゼの切断認識部位と推測された。また、pSR316
646では、】4キロダルトンの蛋白質が弱いバンドと
して検出されるが、これは本来の922が201塩基の
欠失により67アミノ酸短くなった蛋白質が検出されて
いると考えられた。
s1316d46では検出できないことから、p22を
コードする領域は、アミノ酸配列最初のNet (メチ
オニン)から289番目のアミノ酸の間にあり、psR
316d46ノ欠失をそのコード領域に含んでいるもの
と考えられる。さらに、コードされるアミノ酸配列の1
80番目から190番目付近に疎水性アミノ酸が連続す
るシグナルペプチド様の配列が見られ、これがングナラ
ーゼの切断認識部位と推測された。また、pSR316
646では、】4キロダルトンの蛋白質が弱いバンドと
して検出されるが、これは本来の922が201塩基の
欠失により67アミノ酸短くなった蛋白質が検出されて
いると考えられた。
また、ウェスタンプロットでは、p22以外にマイナー
な蛋白質として、 PSll1316を用いた時には
約50キロダルトンのバンド、psR312では約35
キロダルトンのバンドが検出された。これらのバンドは
、プラスミドが含むHCVペプチドのコード領域全体の
蛋白質の大きさには一致していることから、恐らく発現
に用いなcDNA全長から翻訳された前駆体蛋白であろ
うと考えられた。
な蛋白質として、 PSll1316を用いた時には
約50キロダルトンのバンド、psR312では約35
キロダルトンのバンドが検出された。これらのバンドは
、プラスミドが含むHCVペプチドのコード領域全体の
蛋白質の大きさには一致していることから、恐らく発現
に用いなcDNA全長から翻訳された前駆体蛋白であろ
うと考えられた。
バ ロ いた
psR316の構築に用いたものと同じcDNA断片(
へccI部位切断−EcoRI )をポリメラーゼ処理
により、その末端を平滑末端にし、同じポリメラーゼに
より平滑末端にしたプラスミドpAcYi41 [松浦
ら、 J、 Gen、 Virol、 68.
p1233−1250. <1987)コ のB&
−II部位にクローン化することによりpAc316を
構築した。
へccI部位切断−EcoRI )をポリメラーゼ処理
により、その末端を平滑末端にし、同じポリメラーゼに
より平滑末端にしたプラスミドpAcYi41 [松浦
ら、 J、 Gen、 Virol、 68.
p1233−1250. <1987)コ のB&
−II部位にクローン化することによりpAc316を
構築した。
さらに、このプラスミドをバキュロウィルスDNAとと
もに昆虫由来培養細胞[スボドプテラ・フルジペルタ細
胞(Spodoptera frugiperda c
ells)コにコートランスフェクションを行い、常法
に従って、組換えバキュロウィルスを分離した。
もに昆虫由来培養細胞[スボドプテラ・フルジペルタ細
胞(Spodoptera frugiperda c
ells)コにコートランスフェクションを行い、常法
に従って、組換えバキュロウィルスを分離した。
このウィルスをMOIIOでSf細胞に感染させ、72
時間後にp22の発現を調べた。 lXl0″個の感
染細胞を、5DS−PAGE (SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動)で泳動後、クマシーブリリアント
ブルー(CBB)で染色すると、発現蛋白質として22
キロダルトンの蛋白質が検出された。
時間後にp22の発現を調べた。 lXl0″個の感
染細胞を、5DS−PAGE (SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動)で泳動後、クマシーブリリアント
ブルー(CBB)で染色すると、発現蛋白質として22
キロダルトンの蛋白質が検出された。
このバンドはHCVcDNAを組み込んでいない本来の
バキュロウィルス感染細胞では検出できなかった。また
、慢性C型肝炎患者血清を用いた蛍光抗体法で感染細胞
の100%に細胞質に特異的な蛍光を検出した。検出細
胞のウェスタンプロット法による検出では、この発現系
でもやはり22キロダルトンの蛋白質が主要な発現産物
として検出された。COS細胞の場合と同様にツニカマ
イシン添加により、この蛋白のみかけの分子量は変化し
なかったことから、N−糖鎖は付加されていないものと
考えられた。また、等電点も極めて塩基性であることか
ら、ここで検出されている22キロダルトンの蛋白質は
CO8細胞で同定されたp22と、この積土方法の範囲
内では区別できない蛋白であることかわかった。
バキュロウィルス感染細胞では検出できなかった。また
、慢性C型肝炎患者血清を用いた蛍光抗体法で感染細胞
の100%に細胞質に特異的な蛍光を検出した。検出細
胞のウェスタンプロット法による検出では、この発現系
でもやはり22キロダルトンの蛋白質が主要な発現産物
として検出された。COS細胞の場合と同様にツニカマ
イシン添加により、この蛋白のみかけの分子量は変化し
なかったことから、N−糖鎖は付加されていないものと
考えられた。また、等電点も極めて塩基性であることか
ら、ここで検出されている22キロダルトンの蛋白質は
CO8細胞で同定されたp22と、この積土方法の範囲
内では区別できない蛋白であることかわかった。
C■ いたHCV
検ユL誌
上記の組換えバキュロウィルスを感染させたHCV構造
タンパク発現感染細胞(AeHCV−3F9)を回収し
、PBSで2回洗浄した後、5X106細胞/mlの濃
度になるよう2mM EDT^と0.1sMDTTを添
加した50■間トリス塩Wfi緩衝液(p)t8. O
’Iに浮遊させた。
タンパク発現感染細胞(AeHCV−3F9)を回収し
、PBSで2回洗浄した後、5X106細胞/mlの濃
度になるよう2mM EDT^と0.1sMDTTを添
加した50■間トリス塩Wfi緩衝液(p)t8. O
’Iに浮遊させた。
この細胞浮遊液を超音波を用いて破砕し、その後遠心外
IN (12000x G、20分間、4℃)すること
によりその上清を回収した。これを、33%飽和になる
ように飽和硫酸アンモニウムを加え、再び遠心分離に処
した後、沈殿画分にPBSを5X 10’個の細胞につ
き1−1づつ加え、超音波処理によって溶解し、分注し
てHCv抗原蛋白を得た。これらは、−80”Cで凍結
保存し、免疫測定法用の抗原として使用する場合には、
超音波処理後ただちにELISAプレートにコーティン
グさせた。
IN (12000x G、20分間、4℃)すること
によりその上清を回収した。これを、33%飽和になる
ように飽和硫酸アンモニウムを加え、再び遠心分離に処
した後、沈殿画分にPBSを5X 10’個の細胞につ
き1−1づつ加え、超音波処理によって溶解し、分注し
てHCv抗原蛋白を得た。これらは、−80”Cで凍結
保存し、免疫測定法用の抗原として使用する場合には、
超音波処理後ただちにELISAプレートにコーティン
グさせた。
上記粗精製HCV抗原をPBSで50倍に希釈し、EL
ISA96穴用マイクロタイタープレートに100IA
づつ加え、4℃で一晩放置することによりELISAプ
レートにコーティングした。
ISA96穴用マイクロタイタープレートに100IA
づつ加え、4℃で一晩放置することによりELISAプ
レートにコーティングした。
このプレートを、PBS−Tweenで2回洗浄し、各
ウェルに20OAの3%スキムミルク添加PBSを添加
し、室温で1時間放置してブロッキングを行った。
ウェルに20OAの3%スキムミルク添加PBSを添加
し、室温で1時間放置してブロッキングを行った。
このプレートに、HCV抗体測定の対象となる血清を各
ウェルに100Δ添加し、室温で2時間放置した。
ウェルに100Δ添加し、室温で2時間放置した。
このプレートを、PBS−Tweenで4回洗浄し、各
ウェルに100−の396スキムミルク添加PBS−T
weenで希釈したアルカリフォスファターゼwmヤギ
抗ヒト免疫グロブリンを添加し、室温で1時間放置した
。
ウェルに100−の396スキムミルク添加PBS−T
weenで希釈したアルカリフォスファターゼwmヤギ
抗ヒト免疫グロブリンを添加し、室温で1時間放置した
。
このプレートをPBS−Tweenで4回洗浄し、各ウ
ェルに700−のアルカリフォスファターゼ基質液を加
えた。
ェルに700−のアルカリフォスファターゼ基質液を加
えた。
室温で1〜2時間放置し、陽性反応のA405の吸収が
15前後の値となった時に全ウェルの吸光度を測定した
。
15前後の値となった時に全ウェルの吸光度を測定した
。
このアッセイを用いて実際の患者血清を測定し、次のよ
うな結果が得られた。
うな結果が得られた。
典型的な輸血後非A非B型肝炎を発症した2症例につい
て、発症直後から経時的に血液を採取し、肝機能検査、
現在唯一のHCVの抗体検査である抗C100抗体、そ
して該p22ペプチドに対する抗体の有無について調べ
た。12ケ月の観察期間を通じて抗C100抗体の検出
されない1症例においてもGPT値の上昇とほぼ同時に
p22抗体の上昇が認められた。
て、発症直後から経時的に血液を採取し、肝機能検査、
現在唯一のHCVの抗体検査である抗C100抗体、そ
して該p22ペプチドに対する抗体の有無について調べ
た。12ケ月の観察期間を通じて抗C100抗体の検出
されない1症例においてもGPT値の上昇とほぼ同時に
p22抗体の上昇が認められた。
又、もう1例では、抗C100抗体が輸血後4ケ月に上
昇したが、P22に対する抗体は、それに先立つ3ケ月
前、つまり発症とほぼ同時に検出された。この抗体の検
出は、該蛋白を用いるウェスタンプロット法によっても
同一の結果であった。
昇したが、P22に対する抗体は、それに先立つ3ケ月
前、つまり発症とほぼ同時に検出された。この抗体の検
出は、該蛋白を用いるウェスタンプロット法によっても
同一の結果であった。
次に、健常人5人の血液及び非A非B型肝炎患者(抗C
100抗体陽性6人、抗C100抗体陰性4人)の血清
を一点で調べた。健常人では陽性数O1抗C100抗体
陽性非A非B型慢性肝炎患者6例中5例、抗C100抗
体陰性非A非B型慢性肝炎患者4例中4例が陽性であっ
た。
100抗体陽性6人、抗C100抗体陰性4人)の血清
を一点で調べた。健常人では陽性数O1抗C100抗体
陽性非A非B型慢性肝炎患者6例中5例、抗C100抗
体陰性非A非B型慢性肝炎患者4例中4例が陽性であっ
た。
以上の結果から下記のことが確認された。
■正常人ではこの抗体は検出されない。
■非AII−B型肝炎では90%陽性となる。
■抗C100抗体が陰性の、臨床的に診断された非A非
B型肝炎患者でも、この方法に従えばほぼ100%陽性
となる。
B型肝炎患者でも、この方法に従えばほぼ100%陽性
となる。
■抗C100抗体が陽性の血清でもこの抗体が陰性にな
ることもある。
ることもある。
これらの結果から、p22に対する抗体は、現在もしく
は過去におけるHCVの感染に伴い特異的に検出される
ことが確認された。この抗体は感染のごく初期に誘導さ
れることから、その検出はC型肝炎の早期診断にきわめ
て有用である。
は過去におけるHCVの感染に伴い特異的に検出される
ことが確認された。この抗体は感染のごく初期に誘導さ
れることから、その検出はC型肝炎の早期診断にきわめ
て有用である。
第1図は、発現プラスミドPSR316、psR312
およびpsR316d46に組み込まれたHCV−cD
NA[片のHCVゲノム上の領域を示したプラスミドの
構造図を示す。 第2図は、実施例(2)でのそれぞれのプラスミドで形
質転換された細胞の細胞内蛋白質のウェスタンプロット
の結果を示す模式図である。十はツニカマイシン(Tm
) 処理、 −はTm未処理のサン プルを示す。
およびpsR316d46に組み込まれたHCV−cD
NA[片のHCVゲノム上の領域を示したプラスミドの
構造図を示す。 第2図は、実施例(2)でのそれぞれのプラスミドで形
質転換された細胞の細胞内蛋白質のウェスタンプロット
の結果を示す模式図である。十はツニカマイシン(Tm
) 処理、 −はTm未処理のサン プルを示す。
Claims (14)
- (1)C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域から発現される
分子量約22キロダルトンのC型肝炎ウィルス抗原ポリ
ペプチド。 - (2)該抗原ポリペプチドが、C型肝炎ウイルスゲノム
にコードされる前駆体ポリペプチドの最もN末端に位置
するペプチド断片である前記第(1)項記載のポリペプ
チド。 - (3)前記第(1)項のポリペプチドをその一部に有す
るC型肝炎ウィルス抗原ポリペプチド。 - (4)分子量が約35キロダルトンである前記第(3)
項記載のポリペプチド。 - (5)分子量が約50キロダルトンである前記第(3)
項記載のポリペプチド。 - (6)C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のcDNA断片
を挿入した発現ベクターを培養細胞株に導入し、得られ
た形質転換株を培養することを特徴とする分子量約22
キロダルトンのC型肝炎ウィルス抗原ポリペプチドおよ
び/またはその関連ペプチドの産生方法。 - (7)該培養細胞株が動物細胞である前記第(6)項記
載の産生方法。 - (8)該培養細胞株が昆虫細胞である前記第(6)項記
載の産生方法。 - (9)該発現ベクターが組換えバキュロウイルスである
前記第(8)項記載の産生方法。 - (10)該C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のcDNA
断片が、C型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
少なくとも180番目のアミノ酸をコードする領域まで
を含むDNA断片である前記第(6)項記載の産生方法
。 - (11)該C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のcDNA
断片が、C型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
少なくとも190番目のアミノ酸をコードする領域まで
を含むDNA断片である前記第(6)項記載の産生方法
。 - (12)該C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のcDNA
断片が、C型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
289番目のアミノ酸をコードする領域までを含むDN
A断片である前記第(6)項記載の産生方法。 - (13)該C型肝炎ウィルス構造遺伝子領域のcDNA
断片が、C型肝炎ウイルスゲノムにコードされる前駆体
ポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳開始コドンから
411番目のアミノ酸をコードする領域までを含むDN
A断片である前記第(6)項記載の産生方法。 - (14)上記第(1)項記載のC型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチドおよび/または第(3)項記載のC型肝炎ウ
ィルス抗原ポリペプチドを抗原として使用し、これに特
異的な抗体を検出することを特徴とするC型肝炎ウィル
ス抗体の検出方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2154542A JP3050395B2 (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | C型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法 |
PCT/JP1991/000724 WO1991019744A1 (en) | 1990-06-12 | 1991-05-29 | Hepatitis c virus antigen polypeptide, production thereof, and detection of antibody |
US07/952,543 US5734019A (en) | 1990-06-12 | 1991-05-29 | Hepatitis C virus antigen polypeptide, production method therefor, and antibody detection method |
CA002084521A CA2084521C (en) | 1990-06-12 | 1991-05-29 | Hepatitis c virus antigen polypeptide, production method therefor, and antibody detection method |
US08/452,287 US5714314A (en) | 1990-06-12 | 1995-05-26 | Hepatitis C virus antigen polypeptide, production method therefor, and antibody detection method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2154542A JP3050395B2 (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | C型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0445795A true JPH0445795A (ja) | 1992-02-14 |
JP3050395B2 JP3050395B2 (ja) | 2000-06-12 |
Family
ID=15586537
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2154542A Expired - Lifetime JP3050395B2 (ja) | 1990-06-12 | 1990-06-12 | C型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、その産生方法および抗体の検出方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5734019A (ja) |
JP (1) | JP3050395B2 (ja) |
CA (1) | CA2084521C (ja) |
WO (1) | WO1991019744A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06153960A (ja) * | 1992-10-16 | 1994-06-03 | Evernew Biotec Inc | C型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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