JP2015027306A - Srsv検出キット - Google Patents
Srsv検出キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015027306A JP2015027306A JP2014198943A JP2014198943A JP2015027306A JP 2015027306 A JP2015027306 A JP 2015027306A JP 2014198943 A JP2014198943 A JP 2014198943A JP 2014198943 A JP2014198943 A JP 2014198943A JP 2015027306 A JP2015027306 A JP 2015027306A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- srsv
- strain
- nlv
- peptide
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 92
- 241001502514 Small round structured virus Species 0.000 claims abstract description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 50
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 126
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 7
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 4
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 4
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 4
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 241000509413 Snow Mountain virus Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N chlorotrifluoroethylene Chemical compound FC(F)=C(F)Cl UUAGAQFQZIEFAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- -1 uranyl acetic acid Chemical compound 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 206010017918 Gastroenteritis viral Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16023—Virus like particles [VLP]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】特定の塩基配列又は該塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列をで示されるHu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP遺伝子。
【選択図】なし
Description
他方、わが国では、平成9年にSRSVが食品衛生法における食中毒原因因子に指定され、SRSVによる食中毒が発生した場合にはその感染ルートの特定が必須となり、感染者の便及び食品中のSRSVを簡便で且つ確実に検出同定する方法が望まれていた。
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(c)配列番号3に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(e)配列番号5に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(f)配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(g)配列番号7に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(h)配列番号8に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(i)配列番号9に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(j)配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(k)配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのSRSV関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするSRSV検出キットを提供するものである。
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(c)配列番号3に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのSRSV関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするSRSV遺伝子型判別のためのSRSV検出キットを提供するものである。
(e)配列番号5に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(f)配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(g)配列番号7に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(h)配列番号8に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(i)配列番号9に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(j)配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
(k)配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチド若しくは該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチド又はそれらの部分ペプチド、
よりなる群から選択された一つのSRSV関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を全て含有することを特徴とするSRSV遺伝子型判別のためのSRSV検出キットを提供するものである。
本発明のSRSV検出キットは、前記(a)〜(k)群の11種類の特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するSRSV関連ウイルス構成ペプチドに対する抗体を用いることを特徴とするものである。このうち、(d)群、(i)群、(j)群及び(k)群に属するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのSRSV関連ウイルス株(下記表1)とは異なる新規ペプチドであり、これらに対する抗体を含めて11種類の抗体を含有したキットすることにより、SRSV関連ウイルスを漏れなく検出することができる。
(a)群における配列番号1に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばDesert Shield/90/SA株(ジーンバンク登録番号:U04469)由来のもの等が包含される。
(b)群における配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Seto 124/1989/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばKY−89/89J株(ジーンバンク登録番号:L23828)及びNorwalk/68/US株(ジーンバンク登録番号:M876611)由来のもの等が包含される。
(c)群における配列番号3に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばSouthampton/91/UK株(ジーンバンク登録番号:L07418)由来のもの等が包含される。
(d)群における配列番号4に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号4に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのSRSV関連ウイルス株(下記表1)と構造遺伝子(配列番号15)の相同性が75%未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
(e)群における配列番号5に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Narita 104/1997/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばBristol/93/UK株(ジーンバンク登録番号:X76716)、Lordsdale/93/UK(ジーンバンク登録番号:X86557)、Camberwell/94/AU株(ジーンバンク登録番号:U46500)由来のもの等が包含される。
(f)群における配列番号6に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばMexico/89/MEX株(ジーンバンク登録番号:U22498)、Auckland株(ジーンバンク登録番号:U460391)、Toronto/77/CA株(ジーンバンク登録番号:U02030)、OTH−25/89/J(ジーンバンク登録番号:L23830)由来のもの等が包含される。
(g)群における配列番号7に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばSnow Mountain/76/US株(ジーンバンク登録番号:U70059)、Melksham/89/UK株(ジーンバンク登録番号:X81879)由来のもの等が挙げられる。
(h)群における配列番号8に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられ、該アミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有するペプチドとしては、例えばHawaii/71/US株(ジーンバンク登録番号:U07611)由来のもの等が包含される。
(i)群における配列番号9に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号9に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのSRSV関連ウイルス株(下記表1)と構造遺伝子(配列番号20)の相同性が75%未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
(j)群における配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号10に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのSRSV関連ウイルス株(下記表1)と構造遺伝子(配列番号21)の相同性が70%未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
(k)群における配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば日本のSRSV感染患者の糞便由来Hu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP株のウイルス構成ペプチドが挙げられる。
斯かる配列番号11に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、現在までにジーンバンクに登録されている全てのSRSV関連ウイルス株(下記表1)と構造遺伝子(配列番号22)の相同性が70%未満であり、これまでに報告のない新規な配列を有するペプチドである。
これらのSRSV関連ウイルス構成ペプチドは、そのRNAポリメラーゼ領域の約120アミノ酸についてのホモロジー解析によれば2つの遺伝子型に分類することができる。即ち、(a)〜(d)群のペプチドの属するI型と、(e)〜(k)群のペプチドが属するII型に分類される。
SRSV感染患者の便よりセチルトリメチルアンモニウムブロマイド法等を用いて、ウイルスRNAを抽出し、オリゴ−dTプライマー及び逆転写酵素によりcDNAを作製し、これと各SRSV関連ウイルスの構造遺伝子領域を増幅するプライマーを用いてPCRを行うことにより構造遺伝子断片を増幅する。
斯かる構造遺伝子断片は、一度大腸菌クローニングベクターを用いてTAクローニングを行いプラスミドに組み込まれる。
上記で得られた(a)〜(k)群の各ウイルス構造遺伝子の断片を適当な発現系を用いて発現させるか或いは、該ウイルス構成ペプチドから遺伝子工学的に作製された中空ウイルス粒子を用いることにより、各ウイルスに対する抗体を得ることができる。以下に大腸菌を用いた場合の発現と、中空ウイルス粒子の作製について説明する。
各SRSV関連ウイルスの構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを、構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化後構造遺伝子領域を回収し、例えば、pGEX(GST融合蛋白発現ベクター;ファルマシア製)、pTrc99A(大腸菌発現ベクター;ファルマシア製)、pTrxFus(チオレドキシン融合蛋白発現ベクター;インビトロゲン社製)、pET(pT7RNAプロモーターを用いた発現ベクター;ノバゲン社製)、マルトース結合蛋白又はβガラクトシダーゼの融合蛋白発現ベクター等に組み込む。このとき、組み込む構造遺伝子領域は、完全長でもよいし、部分的な領域でもよく、好ましくはSRSVの抗原エピトープを最低一つ有する部分的な領域である方がよい。このようにして構造遺伝子領域を組み込んだ遺伝子発現ベクターを遺伝子発現に適した大腸菌、例えば、BL21株、DH10B株、JM109株、XL1−Blue株等で形質転換する。得られた形質転換体を一般的な培養液、例えばL−broth等で培養することにより遺伝子発現を行うことができる。発現には、遺伝子発現誘導剤、例えばIPTG等を添加することや、PLプロモーターを用いた場合、熱ショックを与えることが好ましい。
発現されたペプチドの精製は、一般的な大腸菌を用いた発現蛋白の精製法に従えばよく、例えば、発現蛋白が可溶化していたならばGSTカラム又はマルトース結合蛋白用カラムを用いたアフィニティー精製を行えばよく、発現蛋白が不溶化していたならば、Niキレートを用いたアフィニティー精製を行えばよい。
SRSV関連ウイルスの構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを、構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化し構造遺伝子領域を回収し、例えばpVL1393等のバキュロウイルストランスファーベクターに組み込む。斯かるトランスファーベクターと直鎖状で増殖必須遺伝子領域を欠失させてあるバキュロウイルスDNAと共にトランスフェクションし、昆虫細胞内で相同組換えを起こさせることにより目的とする組換えバキュロウイルスを作製することができる。
かくして得られた中空ウイルス粒子は、内部に遺伝子を持たないため感染性はないが、構造がウイルス粒子とほぼ同じ形をしているので、ウイルス粒子と同等な抗原性を持つものである。
得られたウイルス構成ポリペプチド又は中空ウイルス粒子を動物に免疫することにより、抗SRSV関連ウイルス抗体を調製することができる。尚、斯かる抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れでもよい
例えば、中空ウイルス粒子を用いた場合の免疫抗体の作製は、精製された各SRSV関連ウイルスの中空ウイルス粒子を常法に従ってウサギに免疫し、分離血清より中空ウイルス粒子に対するIgG抗体(抗SRSV抗体)を取得することができる。尚、抗体の分離精製にはDEAEセファロースクロマトグラフィー等の手段が用いられる。
かくして得られた(a)〜(k)群からなる11種類の中空ウイルス粒子と対応する抗SRSV抗体を用いてその交差反応性を測定すると、後記表2に示すように各SRSV関連ウイルス間では交差反応は全く示さない。従って、本発明のSRSVの検出法によれば、SRSVの11種類の血清型を同時に判別することが可能である。また、このことは同時に遺伝子型Iと遺伝子型IIの判別が可能であることも示している。
上記で得られた各抗SRSV抗体を用いた検体中のSRSVの検出は、通常用いられる抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法、例えばサンドイッチ法によるラジオイムノアッセイや酵素免疫測定法(ELISA)等を用いることができるが、特にELISAが好ましい。即ち、11種類の抗SRSV抗体をマイクロプレートに分注してSRSVスクリーニングプレートを作製し、SRSV感染患者の便から調製した便乳剤の希釈液を当該プレートのウェルに加えて反応させた後、各ウイルスのパーオキシダーゼ(POD)標識抗SRSV抗体を加えて反応させる。次いで基質液(過酸化水素を含むTMB)を加えて反応させた後、0.6N硫酸を加えて反応を停止させ、ELISAオートリーダーでウェルの吸光度(450nm/630nm)を測定することによりSRSVを検出できる。
また、遺伝子型の判別は、(a)〜(d)群のペプチドに対する抗体を混合固定化したマイクロプレート(I型プレート)又は(e)〜(k)群のペプチドに対する抗体を混合固定化したマイクロプレート(II型プレート)を用いたキットとすることにより可能となる。
尚、本発明の各抗SRSV抗体をラテックスや磁気ビーズ等の担体を用いて固定化することにより、検体中のSRSV関連ウイルスを確実に捕捉することができ、ラテックスならば遠心操作、磁気ビーズならば磁石でSRSV捕捉担体を回収することができ、回収後にウイルスRNAを抽出し利用することができる。
実施例1 SRSV関連ウイルスの構造遺伝子のクローニング
(1)cDNA合成
SRSV患者の便(0.5〜1.0g)に9mLのPBSと1mLのダイフロンを加え、ホモジナイズした。次いで、3000rpmで20分間遠心してその上清を回収し、10%便乳剤とした。
この便乳剤1mLを用い、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド法によりSRSVのRNAを抽出し、最終的に0.1%ジエチルピロカーボネート液30μLに浮遊させた。この浮遊液を用いて、Oligo−dT(12−18)プライマー及びAMV(Avian Myeloblastosis Virus)(生化学工業社製)由来逆転写酵素によりcDNAを作製した。
(1)で作製したcDNAと、以下に示す構造遺伝子領域を増幅するプライマーを用いてPCRを行い、PCR後、アガロースゲル電気泳動法により増幅させた構造遺伝子断片を分離し、SuprecTM−01(TAKARA)を用いて回収した。
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP遺伝子:G1/F2(配列番号23)、Oligo−dT(33)(配列番号24)
Hu/NLV/Seto 124/1989/JP遺伝子:G1/F2(配列番号23)、G1/R0(配列番号25)
Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP遺伝子:G1/F2(配列番号23)、Oligo−dT(33)(配列番号24)
Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP遺伝子:D5(配列番号26)、CV−U4(配列番号27)
Hu/NLV/Narita 104/1997/JP遺伝子:97k104/F1(配列番号28)、97k104/R1(配列番号29)
Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP遺伝子:G2/F3(配列番号30)、MV−R1(配列番号31)
Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP遺伝子:G2/F3(配列番号30)、SMV−R1(配列番号32)
Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP遺伝子:G2/F3(配列番号30)、G2/R0(配列番号33)
Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP遺伝子:97k104/F1(配列番号28)、Oligo−dT(33)(配列番号24)
Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP遺伝子:G2/F3(配列番号30)、Oligo−dT(33)(配列番号24)
Hu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP遺伝子:GFCR7(配列番号34)、Oligo−dT(33)(配列番号24)
回収した構造遺伝子断片を、大腸菌クローニングベクターpCRII(INVITROGEN社製)にTAクローニングを行った。これらのクローンからウイルスの構造遺伝子を組み込むプラスミドpCRII/645、pCRII/124、pCRII/258、pCRII/Chiba、pCRII/104、pCRII/809、pCRII/754、pCRII/76、pCRII/47、pCRII/7k、pCRII/10−25を得た。
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP株、Hu/NLV/Seto 124/1989/JP株、Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP株、Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP株、Hu/NLV/Narita 104/1997/JP株、Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP株、Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP株、Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP株、Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP株、Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP株及びHu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP株の構造遺伝子の塩基配列の決定は、以下の方法により行った。
(1)トランスファーベクターの構築
実施例1(3)で得られた構造遺伝子領域を組み込んだプラスミドを構造遺伝子領域を切断しない制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動法によって分離後、構造遺伝子領域をSuprecTM−01(TAKARA)により回収した。次いで、回収した遺伝子断片を、同じ制限酵素で消化したバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393(INVITROGEN社製)に組み込み、トランスファーベクターを作製した。
0.5μgのバキュロウイルスDNA(Baculo-Gold)と1μgの(1)で得られたトランスファーベクターを8μLの蒸留水に溶解し、2倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で15分間放置する。昆虫細胞用培地Ex−cell400に懸濁した1×105個のSf9細胞を26.5℃で30分間プラスティックシャーレ(直径3.5cm)内に吸着後、トランスファーベクターとBaculo−Gold混合液を細胞に滴下し26.5℃で培養した。24時間後、培養液を10%牛胎児血清及び2%BTB(GIBCO BRL社製)を含むTC100(GIBCO BRL社製;以後TC100)培地に交換し、更に培養を継続した。
(2)で得られた組換えバキュロウイルスを5日間培養した後、培養上清をTC100等の昆虫細胞培養用メディウムを用いて10倍に希釈した。その0.1mLを取り、直径3.5cmのプラスチックシャーレに培養した3×106個のSf9細胞に接種した。26.5℃、60分間吸着後1%アガロースME(低融点アガロース)を含むTC100培養液2mLを重層し26.5℃で培養した。更に、培養開始後4日目に0.005%のニュートラルレッドを含むTC1001mLを重層して26.5℃で培養した。翌日出現したプラークをマイクロチップでかき取り、TC100培地に懸濁した。
(3)で得られた懸濁液を1×107個のSf9細胞に接種し、26.5℃、60分間吸着後TC100を加え、26.5℃で3から4日間培養した。この培養液を2500rpm、10分間、4℃で遠心し、培養上清を回収した。この回収した培養上清を、1×107個のSf9細胞に接種し、26.5℃、60分間吸着後TC100を加え、26.5℃で3から4日間培養した。
次いで、この培養上清を直径3.5cmのプラスチックシャーレに培養した3×107個のSf9細胞に接種し、26.5℃で60分間吸着後1%アガロースME(低融点アガロース)を含むTC100培養液2mLを重層し26.5℃で培養した。次いで培養開始後4日目に0.005%のニュートラルレッドを含むTC 100を1mL重層して26.5℃で培養した。翌日出現したプラークを計測し、組換えバキュロウイルスの感染力価を算出し、組換えバキュロウイルスシードの感染力価とした。
(1)組換えバキュロウイルスを用いた構造蛋白の発現
Sf9昆虫細胞に対して組換えバキュロウイルスをM.O.I.(Multiplicity of infection)1から10で感染させた。この時、組換えウイルス液を細胞に滴下させ、静かに振とうさせながら約60分程度吸着させた。その後、TC 100昆虫細胞用培地を添加し、26.5℃、5から6日間培養した。
組換えウイルス感染培養上清を経時的に採取し、SDS−PAGEで分離後をクーマシーブルー染色で検出し、予想される分子量により発現蛋白の妥当性を確認した。また、SDS−PAGEで蛋白を分離後ニトロセルロース膜に転写し、SRSVの回復期血清によるウエスターンブロッティング法で発現蛋白を同定した。
組換えバキュロウイルスシードをM.O.I.1から10で感染させ、約60分吸着後、Ex−cell400を添加し、26.5℃で3日間培養した。次いで、プロテアーゼ阻害剤、例えばペプスタチンA及びリューペプチンを培養液に最終濃度1mMになるように加え更に2から3日間培養を続けた。
静置後、加えておいたプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファーで中空ウイルス粒子を懸濁させ回収した。次いで、回収した中空ウイルス粒子に、CsClを3.8g加えたプロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファー又はPBS(−)を加え13mLとし、16℃、35000rpm、24から48時間超遠心した。超遠心後、中空ウイルス粒子が集まっている青白いバンドを回収し、プロテアーゼ阻害剤入りグレースバッファーを用いて5倍希釈後、ベックマンTL100.3ローターで45000rpm、3時間超遠心して、中空ウイルス粒子を沈殿させた。
精製SRSV中空ウイルス粒子をグレースバッファーで適宜希釈して、Bradford法により蛋白量を測定した。
精製SRSV中空ウイルス粒子は、ウラニル酢酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で検鏡し中空ウイルス粒子を形成しているかを確認した(図2〜12)。
(1)中空ウイルス粒子に対する免疫抗体の作製
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP株、Hu/NLV/Seto 124/1989/JP株、Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP株、Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP株、Hu/NLV/Narita 104/1997/JP株、Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP株、Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP株、Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP株、Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP株、Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP株及びHu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP株から得られた精製SRSV中空ウイルス粒子500μgを含む1mLのリン酸緩衝液(pH7.2)と1mLのフロインドの不完全アジュバントを混合し、3kgのニュージーランド白色ウサギに常法に従って免疫した。3週間後、0.25μgのSRSV中空ウイルス粒子を含むリン酸緩衝液(pH7.2)1mLとフロインドの不完全アジュバント1mLを混合して免疫した(追加免疫)。次いで、3週間後追加免疫と同様に免疫を行い、この約7から10日間後に全採血し、血清成分を分離した。
AE精製IgG抗体(抗SRSV抗体)とした。
抗SRSV抗体を過ヨウ素酸改良法〔酵素免疫測定法,2:91(1982)〕でPOD標識した。即ちPODを4mg/mLになるように蒸留水で溶解し、0.1M過ヨウ素酸ナトリウム0.2mLを加え、室温で約20分間反応させた。次いで1mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)で一晩透析した。透析後、0.2M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5)を0.02mL加え、pH9.5にすると同時に抗SRSV抗体を8mg加えた。
室温で約2時間反応させ、4mg/mL水酸化ホウ素ナトリウムを0.1mL加え、4℃で約2時間反応させた。反応後、10mMリン酸バッファーを用いてセファクリルS−200によるゲル濾過を行い、UV波長280nmでモニタリングしてPOD標識抗SRSV抗体画分を集めた。
抗SRSV抗体を炭酸バッファー(pH9.5)で各々0.5−10μg/mL濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート(ヌンク社製)に100μL/ウェルで分注し、4℃で一晩静置した。18時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度0.05% Tween20を含むPBS200μL/ウェルで3〜4回洗浄後、最終濃度0.5%牛血清アルブミン(BSA)と0.05%Tween 20を含む10mM PBS(pH7.2)200μL/ウェル加えて4℃一晩静置し、抗SRSV抗体固相マイクロプレートを作製した。
(1)抗原検出ELISA
各精製SRSV中空ウイルス粒子をそれぞれ緩衝液(10mMPBS(pH7.2)に最終濃度0.2%牛血清アルブミン(BSA)と0.05%Tween 20を含む溶液)で4ng/mLから0.04ng/mLまで希釈した。
次いで、希釈した各中空ウイルス粒子(VLP)を、それぞれの抗SRSV抗
体固相マイクロプレートのウェルに100μL加え、室温60分間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度0.05% Tween20を含む10mM PBS(pH7.2)をウェルに200μL加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも3回行った。洗浄後、緩衝液で20000倍に希釈した各血清型のPOD標識抗SRSV抗体を100μL/ウェル加え、室温60分間反応させた。洗浄後、過酸化水素を含むTMB溶液を100μL/ウェル加え、室温で30分間反応させた。反応後、0.6Nの硫酸を100μL/ウェル加え、ELISAオートリーダーでウェルの吸光度(450nm/630nm)を測定した。結果を表2に示す。
遺伝子型Iに属するSRSV(Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP株、Hu/NLV/Seto 124/1989/JP株、Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP株、Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP株)の抗SRSV抗体を炭酸バッファー(pH9.5)で0.5−10μg/mL濃度に希釈混合し、ポリスチレン平型マイクロプレート(ヌンク社製)に100μL/ウェルで分注し、4℃で一晩静置した。18時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度0.05% Tween20を含むPBS200μL/ウェルで3〜4回洗浄後、最終濃度0.5%牛血清アルブミン(BSA)と0.05% Tween20を含む10mM PBS(pH7.2)を200μL/ウェル加えて4℃一晩静置し、遺伝子型Iの各血清型に対する抗SRSV−IgG抗体を混合固相したマイクロプレート(I型プレート)を作製した。
SRSV(Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP株、Hu/NLV/Seto 124/1989/JP株、Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP株、Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP株、Hu/NLV/Narita 104/1997/JP株、Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP株、Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP株、Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP株、Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP株、Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP株及びHu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP株)の各抗SRSV抗体をそれぞれ単独に炭酸バッファー(pH9.5)で0.5−10μg/mL濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート(ヌンク社製)に100μL/ウェルで分注し、4℃で一晩静置した。18時間以上静置したマイクロプレートを最終濃度0.05% Tween20を含むPBS200μL/ウェルで3〜4回洗浄後、最終濃度0.5%牛血清アルブミン(BSA)と0.05% Tween20を含む10mM PBS(pH7.2)を200μL/ウェル加えて4℃で一晩静置し、抗SRSV抗体固相マイクロプレート(血清型別プレート)を作製した。
SRSV患者の便検体に対し、試験例1と同様にELISAを行った。結果を表3に示す。
尚、本発明のキットによりなされた型別は、PCR及び塩基配列の解析によりなされた型別と一致した(表4)。
Claims (4)
- 配列番号22で示される塩基配列からなるHu/NLV/Osaka 10−25/1999/JP遺伝子。
- 配列番号22で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項2に記載のベクターをバキュロウイルスDNAと共に昆虫細胞にトランスフェクションし、得られた組換バキュロウイルスを昆虫細胞に感染させ、SRSVの構造タンパク質を発現させることを特徴とする、中空ウイルス粒子の作製方法。
- 請求項3に記載の方法により作製された中空ウイルス粒子。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014198943A JP5852720B2 (ja) | 1999-06-22 | 2014-09-29 | Srsv検出キット |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17592899 | 1999-06-22 | ||
JP1999175928 | 1999-06-22 | ||
JP2014198943A JP5852720B2 (ja) | 1999-06-22 | 2014-09-29 | Srsv検出キット |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013008548A Division JP5639669B2 (ja) | 1999-06-22 | 2013-01-21 | Srsv検出キット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015027306A true JP2015027306A (ja) | 2015-02-12 |
JP5852720B2 JP5852720B2 (ja) | 2016-02-03 |
Family
ID=16004712
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001505195A Expired - Lifetime JP4629935B2 (ja) | 1999-06-22 | 2000-06-22 | Srsv検出キット |
JP2010157975A Expired - Lifetime JP5409534B2 (ja) | 1999-06-22 | 2010-07-12 | Srsv検出キット |
JP2013008548A Expired - Lifetime JP5639669B2 (ja) | 1999-06-22 | 2013-01-21 | Srsv検出キット |
JP2014198943A Expired - Lifetime JP5852720B2 (ja) | 1999-06-22 | 2014-09-29 | Srsv検出キット |
Family Applications Before (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001505195A Expired - Lifetime JP4629935B2 (ja) | 1999-06-22 | 2000-06-22 | Srsv検出キット |
JP2010157975A Expired - Lifetime JP5409534B2 (ja) | 1999-06-22 | 2010-07-12 | Srsv検出キット |
JP2013008548A Expired - Lifetime JP5639669B2 (ja) | 1999-06-22 | 2013-01-21 | Srsv検出キット |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7067638B1 (ja) |
EP (1) | EP1186890B1 (ja) |
JP (4) | JP4629935B2 (ja) |
KR (2) | KR100771402B1 (ja) |
AU (1) | AU768992B2 (ja) |
CA (2) | CA2375337C (ja) |
ES (1) | ES2398413T3 (ja) |
NO (1) | NO331078B1 (ja) |
WO (1) | WO2000079280A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100771402B1 (ko) | 1999-06-22 | 2007-10-30 | 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 | Srsv 검출 킷트 |
US20040073006A1 (en) * | 2000-11-15 | 2004-04-15 | Tsutomu Kageyama | Antibody against norwalk virus and method of detecting virus by using the antibody |
US20030198959A1 (en) * | 2002-03-28 | 2003-10-23 | Kurnit David M. | Methods and compositions for analysis of urine samples in the diagnosis and treatment of kidney diseases |
JP2007537137A (ja) * | 2003-09-24 | 2007-12-20 | モンタナ ステート ユニバーシティ | ノロウィルスモノクローナル抗体及びペプチド |
ES2514316T3 (es) | 2005-11-22 | 2014-10-28 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus |
EP2601970B1 (en) | 2006-09-29 | 2016-10-26 | Takeda Vaccines, Inc. | Norovirus vaccine formulations |
PL2134360T3 (pl) * | 2007-03-14 | 2016-05-31 | Takeda Vaccines Inc | Oczyszczanie cząstek wirusopodobnych |
JP2009000063A (ja) | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスrna検出方法 |
US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
CN101918028B (zh) | 2007-09-18 | 2015-01-07 | 莱戈赛特医药股份有限公司 | 赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的疫苗 |
KR101793161B1 (ko) * | 2008-08-08 | 2017-11-03 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 강화된 교차 반응성을 가진 복합체 캡시드 아미노산 서열들을 포함하는 바이러스-유사 입자들 |
WO2011091279A2 (en) * | 2010-01-21 | 2011-07-28 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Targeted heterologous antigen presentation on calicivirus virus-like particles |
CN103154242B (zh) | 2010-07-06 | 2015-09-30 | 诺华股份有限公司 | 诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法 |
DE102011118031B4 (de) | 2011-06-23 | 2013-08-01 | Technische Universität Dresden | Calicivirus bindende Peptide, dafür kodierende Nukleinsäuren, deren Verwendungen und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierung und zum Nachweis von Caliciviren |
ES2926487T3 (es) | 2011-07-11 | 2022-10-26 | Takeda Vaccines Inc | Formulaciones parenterales de vacunas de norovirus |
JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
WO2023060086A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-13 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for determining norovirus-reactive antibodies |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2029219A1 (en) | 1989-11-08 | 1991-05-09 | Mary K. Estes | Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses |
WO1991007502A1 (en) | 1989-11-08 | 1991-05-30 | Baylor College Of Medicine | Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses |
US6572862B1 (en) * | 1989-11-08 | 2003-06-03 | Baylor College Of Medicine | Methods and reagents to detect and characterize Norwalk and related viruses |
WO1994005700A2 (en) * | 1992-09-07 | 1994-03-17 | Baylor College Of Medicine | Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses |
WO1997006823A1 (en) * | 1995-08-16 | 1997-02-27 | University Of Massachusetts Medical Center | Monoclonal antibodies for detecting norwalk virus |
KR100771402B1 (ko) | 1999-06-22 | 2007-10-30 | 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 | Srsv 검출 킷트 |
-
2000
- 2000-06-22 KR KR1020017016410A patent/KR100771402B1/ko active IP Right Grant
- 2000-06-22 KR KR1020067022159A patent/KR100762092B1/ko active IP Right Grant
- 2000-06-22 WO PCT/JP2000/004095 patent/WO2000079280A1/ja active IP Right Grant
- 2000-06-22 CA CA2375337A patent/CA2375337C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 JP JP2001505195A patent/JP4629935B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 EP EP00940803A patent/EP1186890B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 US US09/926,799 patent/US7067638B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 CA CA2783140A patent/CA2783140C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-22 AU AU55678/00A patent/AU768992B2/en not_active Expired
- 2000-06-22 ES ES00940803T patent/ES2398413T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-18 NO NO20016189A patent/NO331078B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-13 US US11/402,998 patent/US7575753B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-07-07 US US12/498,495 patent/US8067560B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-12 JP JP2010157975A patent/JP5409534B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-10-06 US US13/267,250 patent/US8357792B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-01-21 JP JP2013008548A patent/JP5639669B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-09-29 JP JP2014198943A patent/JP5852720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6015035759; Virus Genes Vol.20, No.3, 200005, pp.227-236 * |
JPN6015035760; ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究 平成11年度 , 20000410, p.39-46 * |
JPN6015035761; ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究 平成11年度 , 20000410, p.47-50 * |
JPN6015035762; ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究 平成10年度 , 19990408, p.48-49 * |
JPN6015035763; 下痢症ウイルスの検出法、予防法、汚染指標および疫学に関する研究 研究報告書 平成9-11年度 厚生科学研 , 19990922, p.78-80 * |
JPN6015035764; 感染・炎症・免疫 Vol.29, No.1, 19990320, pp.46-48 * |
JPN6015035765; 平成6年度ヒューマンサイエンス基礎研究事業 官民共同プロジェクト研究報告 第1分野 ライフサイエンス , 19951120, pp.105-107 * |
JPN6015035767; 食品衛生研究 Vol.48, No.7, 19980705, pp.65-75 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20016189L (no) | 2001-12-21 |
US7575753B2 (en) | 2009-08-18 |
AU5567800A (en) | 2001-01-09 |
JP2010268808A (ja) | 2010-12-02 |
JP5409534B2 (ja) | 2014-02-05 |
JP2013099348A (ja) | 2013-05-23 |
NO20016189D0 (no) | 2001-12-18 |
CA2375337A1 (en) | 2000-12-28 |
US7067638B1 (en) | 2006-06-27 |
CA2783140A1 (en) | 2000-12-28 |
NO331078B1 (no) | 2011-09-26 |
WO2000079280A1 (fr) | 2000-12-28 |
EP1186890B1 (en) | 2013-01-02 |
KR100771402B1 (ko) | 2007-10-30 |
EP1186890A1 (en) | 2002-03-13 |
US20090305420A1 (en) | 2009-12-10 |
AU768992B2 (en) | 2004-01-15 |
ES2398413T3 (es) | 2013-03-19 |
KR20020033107A (ko) | 2002-05-04 |
KR20060129540A (ko) | 2006-12-15 |
US8067560B2 (en) | 2011-11-29 |
JP4629935B2 (ja) | 2011-02-09 |
CA2783140C (en) | 2016-07-26 |
EP1186890A4 (en) | 2005-05-04 |
KR100762092B1 (ko) | 2007-10-04 |
CA2375337C (en) | 2012-09-25 |
US20120142054A1 (en) | 2012-06-07 |
US8357792B2 (en) | 2013-01-22 |
JP5852720B2 (ja) | 2016-02-03 |
JP5639669B2 (ja) | 2014-12-10 |
US20060177820A1 (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5852720B2 (ja) | Srsv検出キット | |
US5847101A (en) | Non-A, non-B hepatitis virus genomic cDNA and antigen polypeptide | |
CA2111108A1 (en) | Hepatitis c diagnostics and vaccines | |
JP3217600B2 (ja) | 非a非b型肝炎ウイルス関連抗原のイムノアッセイ、それに使用するモノクローナル抗体、およびこの抗体を産生するハイブリドーマ | |
US20080138794A1 (en) | Method for detecting or measuring HBV | |
JPH09500009A (ja) | C型肝炎ウイルス4、5及び6型 | |
CA1341343C (en) | Immunoassay and biological constructs for use therein | |
JP4064432B2 (ja) | E型肝炎ウイルス中空粒子、それをコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を含む組換えベクターの作製方法と利用方法 | |
Zhang et al. | Expression of outer capsid protein VP5 of grass carp reovirus in E. coli and analysis of its immunogenicity | |
JPH10234383A (ja) | E型肝炎ウイルス中空粒子、それをコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を含む組換えベクターの作製方法と利用方法 | |
JP2869063B2 (ja) | LAVに対する抗体と免疫的に反応性であるgagによりコードされたペプチドの発現及び使用 | |
Xie et al. | Detection of antibody to hepatitis delta virus in human serum by double antigen sandwich ELISA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150908 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151201 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151204 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5852720 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |