JP4064432B2 - Ｅ型肝炎ウイルス中空粒子、それをコードする遺伝子及びそれらの遺伝子を含む組換えベクターの作製方法と利用方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスの中空粒子、並びに該中空粒子を作出する方法に関する。

Ｅ型肝炎はかつて経口型、水系、流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれ、１９９０年、Ｒｅｙｅｓらによってその起因ウイルス遺伝子がクローニングされて以来、Ｅ型肝炎と呼ばれるようになった。(Reyes et al:Science,vol.247 1335-1339.1990) また、Ｅ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＥＶ」と呼ぶことがある）は最も最近そのウイルス遺伝子がクローニングされたウイルスでもある。現在までのところ、ビルマ株、中国株、パキスタン株、メキシコ株等でＨＥＶの全遺伝子の塩基配列が決定されている。

これらのＨＥＶ株の解析により、次のことがわかっている。すなわち、ＨＥＶ遺伝子はプラスセンスの１本鎖ＲＮＡから成り立つ。全長は７１９４塩基で更にこの３’端にポリＡ配列が付着している。読み取り枠（ＯＲＦ）は３個あり、ＯＲＦ１、ＯＲＦ３、ＯＲＦ２の順に一部重複しながら配列している。ＯＲＦ１は約５０００塩基、ＯＲＦ２は約２０００塩基、ＯＲＦ３は３６９塩基である。ＯＲＦ３は、ＯＲＦ１と１塩基重複し、また、ＯＲＦ２とは３２８塩基重複している。非コード領域は、５’端が２７塩基、３’端が６８塩基と短い。 ＯＲＦ１は非構造蛋白質をコードし、０ＲＦ２は構造蛋白質をコードしている。ＯＲＦ３にコードされる蛋白質の機能は不明である。ＯＲＦ１からコードされるペプチドのアミノ酸配列を解析すると、メチルトランスフェラーゼ、パパイン様システインプロテアーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの各ドメインが存在する。これら非構造蛋白質の様々な酵素活性がＨＥＶ遺伝子の複製や発現、粒子形成等に関与し、ウイルス増殖を可能にしている。ＯＲＦ２から発現する蛋白質は構造蛋白質を形成するユニットになる。この構造蛋白質には少なくとも２個のＢ細胞エピトープ（抗原決定基）が存在する。ＯＲＦ３の配列は短く、わずか１２３個のアミノ酸をコードするにすぎない。機能蛋白質としては短いが、患者血清中にこの蛋白質と反応する抗体が検出される事から何等かの機能を有するものと考えられる。

一方、Ｅ型肝炎の診断は現在、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）による抗体測定法によって行われている。ReyesらはAbbott社と共同して融合発現蛋白質(Yabough PO, et al:Hepatitis E virus:identification of typecommon epitopes,J Viol 65: 5790-5797,1991)、内田らは化血研と共同して合成ペプチドを(Uchida T,et al:Anepidemic outbreak of hepatitis E in Yangon of Myanmer:antibody assay and animaltransmmision of the virus:Acta Pathol Jpn 43.94-98,1993)をそれぞれ抗原に使用した抗E型肝炎ウイルス特異抗体検出系を構築している。また、E型肝炎ウイルス構造蛋白質全長(ORF2)をバキュロウイルスを用いて発現している例も存在している。(Tsarev SA ,et al:ELISA forantibody to hepatitis E virus (HEV) based on complete open reading frame-2 protein expressed in insect cells: identification of HEV infection in primates.J Infect Dis 168:369-378,1993)これらの各特異抗体検出系にはそれぞれ問題点が存在している。

まず、大腸菌による融合蛋白質を用いた抗体検出系では、偽陽性が多すぎる事。一方、合成ペプチドを用いた特異抗体検出系は偽陰性が検出される状況にある。（内田俊和：Ｅ型肝炎ウイルスの分子生物学的研究：日本臨床 ５３巻 ９０１−９０５：１９９５増刊号）ＨＥＶの感染はまた特異抗体のみの検出ではなく、ＰＣＲ法によって直接遺伝子診断することも可能になっている。ＨＥＶは血清中に潜伏期や肝機能の指標であるトランスアミナーゼが高値の間について高力価でウイルス血症状態にある事も知られている。(Uchida T,et al: Virlence of hepatitis E virus with serial passage to cynomolgus monkeys and identification of viremia.In:Viral Hepatitis and Liver Disease,p526-527, Williams & Wilkins,Baltimore,1991.)

Reyes et al:Science,vol.247 1335-1339.1990 Yabough PO, et al:Hepatitis E virus:identification of typecommon epitopes,J Viol 65: 5790-5797,1991 Uchida T,et al:Anepidemic outbreak of hepatitis E in Yangon of Myanmer:antibody assay and animaltransmmision of the virus:Acta Pathol Jpn 43.94-98,1993 Tsarev SA ,et al:ELISA forantibody to hepatitis E virus (HEV) based on complete open reading frame-2 protein expressed in insect cells: identification of HEV infection in primates.J Infect Dis 168:369-378,1993 内田俊和：Ｅ型肝炎ウイルスの分子生物学的研究：日本臨床 ５３巻 ９０１−９０５：１９９５増刊号 Uchida T,et al: Virlence of hepatitis E virus with serial passage to cynomolgus monkeys and identification of viremia.In:Viral Hepatitis and Liver Disease,p526-527, Williams & Wilkins,Baltimore,1991

従来技術では、ＨＥＶの粒子を遺伝子工学的に生産することには成功していないし、ＨＥＶを感染させた細胞を培養することによりＨＥＶ粒子を生産することにすら成功していない。すなわち、従来のＨＥＶの検出のために行なわれているＥＬＩＳＡ等は、粒子以外のウイルス由来のタンパク質を抗原として用いている。このため、上記のように測定精度に満足できない。また、人為的にＨＥＶ粒子を得ることに成功していないため、ＨＥＶワクチンは開発のめどすら立っていない。

もし、ＨＥＶの中空粒子であってＨＥＶと同等の抗原性を有するものが得られれば、安全なワクチンとしての利用が可能であるし、また、ウイルス中空粒子の抗原性は、粒子以外のタンパク質の抗原性と比較して、より天然のウイルス粒子の抗原性に近い又は天然のウイルス粒子の抗原性と同じであると考えられるので、免疫測定のための試薬としても、従来のように粒子化していないタンパク質を用いるよりも測定精度が高いと考えられる。さらに、粒子化したタンパク質は粒子化していないタンパク質に比較して遥かに精製が容易である。また、新規なＨＥＶの遺伝子をクローニングしてその塩基配列を決定することにより、その新規なＨＥＶの診断に有用なウイルス粒子を利用することが可能になる。

従って、本発明の目的は、ＨＥＶの抗原性を有する直径約25nmのＨＥＶ中空粒子、及びその製造方法を提供することである。

本願発明者らは、ミャンマーで発生したＥ型肝炎の患者の便から新規なＨＥＶ株を分離し、その遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。さらに、本願発明者らは、この新規なＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち３３６ｎｔ〜１９８０ｎｔの領域のみを発現させることにより、ＨＥＶの抗原性を有する中空粒子を生産することが可能であることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、Ｅ型肝炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドから成るＥ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子をコードするＤＮＡを、バキュロウイルスベクターのバキュロウイルス遺伝子非必須領域内に挿入して組換えバキュロウイルスベクターを調製し、該組換えバキュロウイルスベクターを昆虫細胞Ｓｆ９に導入することで該組換えバキュロウィルスベクターの感染力価を上昇させた後に、該組換えバキュロウイルスベクターを昆虫細胞Ｔｎ５に導入することにより、該昆虫細胞中で前記中空粒子を構築させることを含む、Ｅ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子の作出方法を提供する。さらに、本発明は、 上記方法により得られ得る、Ｅ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子を提供する。

本発明により、ＨＥＶの直径約25nmの中空粒子、及びその製造方法が初めて提供された。ＨＥＶの中空粒子はＨＥＶと抗原性が同一又は少なくとも極めて近似していると考えられるので、ＨＥＶの中空粒子を利用した免疫測定によりＨＥＶを従来よりも正確に測定することが可能になる。また、本発明の中空粒子により、安全なＨＥＶワクチンを開発することが可能になった。

本願発明者らは、下記実施例で詳述する方法により、ミャンマーで発生したＥ型肝炎の患者の便から新規なＨＥＶ株を分離し、その遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。該新規ＨＥＶ株の遺伝子中のＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３の塩基配列及びそれによりコードされる推定アミノ酸配列並びに全遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２、３、４及び５に示す。

さらに、本願発明者らは、この新規なＨＥＶ遺伝子のＯＲＦ２のうち３３６ｎｔ〜１９８０ｎｔの領域（アミノ酸では第１１２〜第６６０番目のアミノ酸）のみを発現させることにより、ＨＥＶの抗原性を有する直径約25nmの中空粒子を生産することが可能であることを見出した。この中空粒子のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。下記比較例１に示すように、ＯＲＦ２の全長を発現させた場合には粒子は形成されない。それにもかかわらず、ＨＥＶのＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドのＮ末端側１１１アミノ酸を欠失させることにより直径約25nmのＨＥＶ中空粒子が形成されるという知見は驚くべき知見であり、本願発明はこの知見を基礎としている。

なお、ＨＥＶの抗原性を有する直径約25nmの中空粒子を構成するポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は端部に付加されたアミノ酸配列であって、配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する、ＨＥＶの抗原性を有する直径約25nmの中空粒子も本発明の範囲に含まれる。なお、ここで、「ＨＥＶの抗原性を有する」とは、抗ＨＥＶ抗体と検出可能な程度に免疫反応を起こすという意味である。

本発明は、上記ＨＥＶの直径約25nmの中空粒子をコードするＤＮＡを含み、宿主細胞中で該ＤＮＡを発現することができる組換えベクターをも提供する。この組換えベクターは、適当な宿主細胞中で中空粒子の生産が可能なものならば特に限定されないが、バキュロウイルス遺伝子非必須領域内に上記本発明のＤＮＡが挿入されて得られる組換えバキュロウイルスベクターであることが好ましい。この場合には宿主細胞は昆虫細胞が好ましく、特にＴｎ５細胞（文献及び入手先：Wicham, T. J. et al., (1992) Biotechnol. Prog. 8:391-396; Davis, T.R. et al., (1993) In Vitro Cell. & Dev. 29A:388-390; Invitrogen Corporationより市販）が好ましい。特に、下記実施例で作製された組換えバキュロウイルスベクターを昆虫細胞であるＳｆ９細胞中で発現させると、ＤＮＡの発現は確認されたが中空粒子は構築されなかった。これに対し、Ｔｎ５細胞中では直径約25nmの中空粒子が生産された。

本発明のＨＥＶ中空粒子は、下記実施例において具体的に記載するように、ＨＥＶタンパクと同じ抗原性を有している。従って、該中空粒子は、ＨＥＶ又は抗ＨＥＶ抗体を測定する免疫測定のための試薬として用いることができる。また、抗ＨＥＶ抗体を動物に生産させるための免疫原として用いることもできる。さらに、その精製が容易でかつ安全性が高いので、ＨＥＶに対するワクチンとしても用いることができる。さらに、クリオ電子顕微鏡或いはエックス線結晶解析による粒子の三次構造解析が考えられる。更に、精製粒子をプローブとして宿主細胞レセプター分子の分離同定、レセプター分子を高度に発現する形質転換細胞の樹立さらにまた、レセプター分子を発現するトランスジェニックマウスの作出も考えられる。

以下、本発明のＤＮＡのクローニング、該遺伝子の発現方法及び得られた中空粒子に対する特異抗体の作出等について、各工程毎により詳細に説明する。もっとも、以下に記載する各方法はあくまで好ましい方法を例として示すものであり、これらに限定されるものではない。

（１） Ｅ型肝炎ウイルスのＲＮＡを抽出する工程：
この工程の技術は従来の公知の常法、例えばフェノール抽出法等が例示される。今回は、０．５ｍｌのサル胆汁からRNA extraction kitであるRNAzolを用いてＲＮＡを抽出した。次に、Oligotex-dT30(Super)でｍＲＮＡを分離精製した。

（２） Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡに相補的な二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程：
この工程は例えば逆転写酵素を用いる公知の常法により実施する事が可能である。今回は、Oligo(dT)12-18をプライマーに、AMV(Avian Myeloblastosis Virus)(生化学工業社製)由来逆転写酵素でcDNAを調製した。

（３） 当該ウイルスｃＤＮＡをクローニングする工程：
この工程で使用可能なクローニングベクターとしては、大腸菌に代表される原核細胞を宿主とするプラスミド、及び、λファージ等に代表されるバクテリオファージ由来のベクター等公知のものを使用する事が出来る。この工程に於いてはクローニングベクターとその宿主細胞とを適当に組み合わせて使用する事が望ましい。クローニングベクターの具体的な例としては、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８，ｐＵＣ７，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＵＣ１９等が例示される。遺伝子の挿入方法は公知の常法に従えばよい。これらのベクターの構築にあたっては、遺伝子操作の容易である大腸菌系を使用する事が望ましい。また、使用するプラスミドベクターは特に限定されるものではない。今回は、産生したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリットを鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によるウイルス遺伝子の増幅を試みた。

HEV-D2 5'- TGGGTTCGCGACCATGCGACCCTCG-3' 5134-5157
HEV-U2 5'- CAACAGAAAGAAGGGGGGCACAAG-3' 7138-7161

これらの領域はAmplitaq（TAKARA社製）を用いてＯＲＦ２を含む２０２８塩基をＰＣＲ法を用いて増幅した。また、ＰＣＲ法の条件は９６℃ １．５分間、７２℃３分間を１サイクルとして４０サイクル行った。増複産物はアガロースゲル電気泳動法によって分離精製し、クローニングベクターｐＣＲII（インビトロジェン社製）にＴＡクローニングを行った。これらのクローンからｐＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）を得た。

（４） （３）で示されたｐＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）クローンに関して、Ｅ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２遺伝子全領域を発現させる工程：
プラスミドクローンｐＨＥＶ（Ｄ２Ｕ２）を制限酵素 ＮｒｕＩ及びＸｂａＩで消化切断し、アガロースゲル電気泳動法によって分離後、精製し、制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩで消化切断したバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３と結合し、トランスファーベクターｐＶＬ（Ｄ２Ｕ２）を作製した。

クローニングされたＥ型肝炎ウイルスのＯＲＦ２遺伝子内の領域を発現させる工程：
この工程では発現ベクターと当該ベクターが感染・増殖可能である宿主細胞を選択し適宜組み合わせて使用する事が望ましい。この工程で特に留意すべき点としてはＯＲＦ２をコードする遺伝子と公知の発現ベクターとを単純に連結したのみでは抗原性を有するＨＥＶ ＯＲＦ２蛋白質の発現は期待できない。Ｅ型肝炎ウイルス ＯＲＦ２をコードする遺伝子と公知の発現ベクターとの連結には概略的に以下に示す様な工夫を必要とする。

ａ）ＨＥＶ ＯＲＦ２の一部を発現ベクター内に組み込むため、遺伝子の翻訳開始及び終止領域を目的のフラグメントの前後にフレームを予め合わせた上で補充する必要がある。

ｂ）希望の抗原活性及び免疫原性を有する発現産物を獲得するために、ＯＲＦ２遺伝子の一部またどの部分を発現ベクター内に連結するのかを決定する。

今回、ＯＲＦ２の１１２番目のアミノ酸（塩基配列５４８０）からＣ末端まで（ＯＲＦ２のアミノ酸配列 ６６０、塩基配列 ７１２６）を発現するため、プライマーセットを用いて、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを鋳型にして約１．７ｋｂのＤＮＡをＰＣＲで増幅した。以下に使用したプライマーセットを示す。

HEV-D13 5'-AAGGATCCATGGCGGTCGCTCCAGCCCATGACACCCCGCCAGT-3'
HEV-U14 5'-GGTCTAGACTATAACTCCCGAGTTTTACCCACCTTCATCTT-3'

このプライマーセットによって増幅された産物は、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの配列を含む為、これらの制限酵素サイトで消化切断し、アガロースゲル電気泳動法によって分離精製後、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３と結合しｐＶＬ（Ｄ１３Ｕ１４）を作製した。

ｃ）発現産物の抗原性並びに免疫原性を高める為に発現する領域を限定する。
ｄ）発現産物の収量を高める。
ｅ）発現産物を細胞外へ分泌させ精製方法を容易にする。これらの工夫は主として発現ベクター側の改編によって達成可能である。

(5) 組換えバキュロウイルスを作製する工程：
組換えバキュロウイルスの作製に当たっては、まずバキュロウイルスの増殖に非必須な遺伝子領域内にＥ型肝炎ウイルス抗原蛋白質をコードする遺伝子の一部分を挿入する。ここでは一般に、トランスファーベクターとして、例えば、pAcYM1(J.General Virology,Vol.68,pp.1233-1250,1987)などが例示され、市販のものを用いることもできる。

これらのトランスファーベクターと野生株バキュロウイルスを昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞内にリポフェクチン（GIBCO BRL社製）等の物質を用いて導入し、昆虫細胞中に於て相同組換えがおこり組換えバキュロウイルスの作製が可能となる。具体的には、０．５μｇの直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（Baculo-Gold PHARMINGEN社製）と１μｇのトランスファーベクターを８μｌの蒸留水に溶解し、２倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で１５分間放置する。Ex cell 400培養液に懸濁した１×１０５個のＳｆ９細胞を２６．５℃で３０分間プラスティックシャーレ（直径３．５ｃｍ）内に吸着後、ＤＮＡ混合液を細胞に滴下し２６．５℃で培養した。２４時間後、培養液を８％牛胎児血清を含むＴＣ１００（GIBCO BRL社製）培地に交換し、更に、培養を継続した。

(6) 組換えウイルスの力価を測定する工程：
前項組換えウイルスを５日間培養した後、培養上清を例えばＴＣ１００等の昆虫細胞培養用メディウムを用いて１０倍に希釈した。その０．１ｍｌをとり、直径３．５ｃｍのプラスチックシャーレに培養した３×１０６個のＳｆ９細胞に接種した。２６．５℃、３０分間吸着後１％アガロースＭＥ（低融点アガロース）を含むＴＣ １００培養液２ｍｌを重層し２６．５℃で培養した。更に、培養開始後４日目に０．００５％のニュートラルレッドを含むメディウム１ｍｌを重層して出現したプラークを計測した。更に２代のプラーククローニングを行って組換えウイルスを純化した。３代目のプラークをパスツールピペットで分離し、１ｍｌのＴＣ１００メディウムに懸濁し、その０．１ｍｌを１０６個のＳｆ９細胞に接種した。吸着後ＴＣ１００培養液を用いて５日間培養し、その上清を種ウイルス（Ac(D13U14)）とした。

(7) 組換えバキュロウイルスを用いたＥ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の産生工程：
宿主細胞としては、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９及びＴｎ５細胞等が例示される。これらの昆虫細胞に対して前記組換えバキュロウイルスをＭＯＩ(Multiplicity of infection)10で感染させる。この時、組換えウイルス液を細胞に滴下させ、靜かに振とうさせながら約30分程度吸着させた。その後、例えば、TC100、ＥＸｃｅｌｌ ４００等の昆虫細胞用培地に１０％ＦＣＳ、２％ＢＴＢを添加し、２６．５℃、７２ｈｒ培養後発現蛋白質即ちＥ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の回収を行う。

(8) 発現蛋白質の同定方法：
組換えウイルス感染培養細胞及び培養上清を経時的に採取した。これらの採取した感染培養細胞及び培養上清に関して、SDS-PAGEで分離後蛋白質をクマシーブルー染色で検出し、予想される分子量の妥当性を検討した。また、SDS-PAGEで蛋白質を分離後ニトロセルロース膜に転写し、Ｅ型肝炎患者急性期及び回復期血清によるウエスターンブロッティング法で発現蛋白質を同定した。培養細胞では上記血清と反応後蛍光標識した抗ＩｇＧ抗体による蛍光抗体法で発現蛋白質を確認した。また、感染細胞の電子顕微鏡用超薄切片を作製し、血清と反応後金コロイド標識した抗ヒトＩｇＧ抗体によるイムノゴールド法で発現蛋白質を同定した。培養上清に関しては上清そのものを、或いは、ＰＥＧ６０００で沈殿濃縮したものをウラニル酢酸でネガティブ染色し、電子顕微鏡で検鏡し直接ウイルス様粒子を検出した。

目的のＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原の発現は昆虫細胞Tn5 cellを使用した。Ac(D13U14)をMOI:10でTn5 cellに接種し、26.5℃、30分間吸着後、Ex cell 405培養液を加えて培養した。

(9) 発現蛋白質即ちＥ型肝炎ウイルス抗原蛋白質の精製に関する工程：
Tn5 cell培養上清を1,000ｘｇで１０分間遠心して夾雑物を取り除き、更に、10,000ｘｇで、３０分間遠心してバキュロウイルスを取り除いた。１０％蔗糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌに前出の上清を重層してベックマンＳＷ２８ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心してウイルス様中空化粒子を沈査に回収した。１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁して１０％〜４０％蔗糖勾配に重層後ベックマンＳＷ４１ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心してウイルス様中空化粒子を２０％と１０％蔗糖液の中間に回収した。白乳色のバンドを回収しリン酸緩衝液で５倍希釈後、ベックマン ＳＷ５０．１ ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心後、ウイルス様粒子化抗原を回収した。

(10) 精製発現蛋白質の抗原性の確認工程：
精製ウイルス様中空粒子をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜へ転写後Ｅ型肝炎患者回復期血清を用いたウエスタンブロッティングを行った。精製ウイルス様中空化粒子抗原をＥ型肝炎患者回復期血清と混合し、３７℃で１時間反応後、ベックマンＳＷ５０．１ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心し、沈査を電子顕微鏡で検鏡してウイルス凝集像を検出した。

(11) Ｅ型肝炎ウイルス特異抗体の作出工程：
初回免疫：１ｍｇの精製中空粒子を含む１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と１ｍｌのFreund incompleteアジュバントを混合し、２ｋｇのNew Zealand Whiteウサギに皮下注射した。

ブースター：一ヶ月後に０．５ｍｇの中空粒子０．５ｍｌとFreund incompleteアジュバント０．５ｍｌを混合して皮下に一回目を、更に一週間後に同様に皮下に二回目を注射した。５日後に全採血し、血清を分離した。塩化セシウム中に於ける浮上密度は１．２９ｇ／ｃｍ３である。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１
Ｅ型肝炎ウイルスの全塩基配列決定の為のＰＣＲとクローニング
（１）Ｅ型肝炎ウイルスＲＮＡの抽出
１９８６年ミャンマーの首都ヤンゴンでＥ型肝炎の散発発生があり、患者１０名から糞便を得た。これらをプールして１０％浮遊液（リン酸緩衝液）を調製し、6000rpm １０分間、４℃の遠心法で部分精製後ポアサイズ０．２５ｕｍのミリポアフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過後、rhesus monkyに静脈注射した。その後、肝炎発生後、胆汁を採取し、ミリポアフィルターを用いて精製し、rhesus monkeyを用いて継代した。そして、ＲＮＡ抽出には６代継代後の胆汁を使用した。（Microviol Immunol 36:67-79(1992)）０．５ｍｌの胆汁に対して４００から８００μｌのRNAzol（Biotex Laboratories製）を加え、更にその１／５volumeのクロロホルムを加えて十分撹拌したのち10,500×ｇで２０分間遠心沈殿を行った。遠心後、上層部分を新しい遠心チューブに移し、等量のイソプロパノールを加え−２０℃で一晩エタノール沈殿を行った。

エタノール沈殿状態のサンプルを10,500×ｇ 、２０分の条件で遠心し、沈査を７５％エタノールを用いて一回洗浄した。次にペレットを真空乾燥させ、１００から２００μｌの分子生物学グレードの水(Sigma Chemical Co.Ltd., Dorset,United Kingdom)に再浮遊させた。５００μｌのサンプルに対して等量のphenol及びクロロホルムを加え、ｍＲＮＡ抽出をおこなった。

抽出済みのTotal RNAを用いてｍＲＮＡを抽出し、Oligotex-dT30(Super)でｍＲＮＡを分離精製した。

（２）ｃＤＮＡの調製及びＰＣＲによる増幅
分離精製したＲＮＡとoligo(dT)12-18プライマーを使用して、ＡＭＶ由来逆転写酵素（生化学工業社製）でｃＤＮＡを調製した。さらに、これらのRNA:DNA hybrideを鋳型としてプライマーＥＰ１／Ｐ５９，ＥＰ２／Ｐ４２，ＥＰ５／ＥＰ６，Ｄ２／Ｕ２，Ｐ１２４／Ｐ１２６の各プライマーセットによってそれぞれ２０６０，２５６６，２３８６，２０２８，１０４０ｂｐを増幅した。ＰＣＲの増幅条件は、９６℃ １．５分間、７２℃ ３分間を１サイクルとして４０回繰り返した。

（３）Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
上記条件においてＰＣＲによって増幅された遺伝子は、０．７％アガロースゲルを用いて分離後、増幅断片が単一で有ることをエチジウムブロマイド染色によって確認し、Bandprep（ファルマシア製）を用いて回収した。次に、回収した増幅断片の一部を用いて、クローニングベクターｐＣＲ２．１（ストラタジーン社製）にＴＡ法によってクローニングし、pHEV(1-6)(1-2060)，pHEV(138)(1458-3023)，pHEV(100-10)(2925-5310)，pHEV(D2U2)(5134-7161)，pHEV(7)(6161-7200)を得た。

Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子塩基配列の決定は、各領域に全体で５３個のシークエンシングプライマーを設定し、dye tarmination法によりサイクルシークエンシングキットＦＳ（パーキンエルマー社製）を用いてラベリング反応を行った。この際使用したＥ型肝炎ウイルス遺伝子のＤＮＡ濃度は０．２μｇ／μｌであり、シークエンシングプライマーの濃度は０．３ｐｍｏｌである。更に、反応終了後、セントリプレップスピンカラム（パーキンエルマー社）を用いて過剰量の蛍光色素を除外した。

この反応液を真空凍結乾燥機によって完全に乾燥させ、専用のサンプルバッファー（パーキンエルマー社製）２５μｌに浮遊させる。更に、攪拌後遠心沈殿させ９５℃で２分間の加熱操作を行い、急冷後オートシークエンサー（ABI Genetic analyzer 310）で解析した。以下に今回使用したシークエンシングプライマーを記載する。

5' → 3' DOWN PRIMER
１． EP1-AGGCAGACCACATATGTGGT (1-24)
２． P109-TTGTTTTCCGCCCCGAGGTT (191-210)
３． P73-TTCCCGCCGAAACTGGCATC (491-510)
４． P128-CGGTCTACCGAGGTCTATGT (874-893)
５． P58-ATATTTGGGACCGTCTTATG (980-999)
６． P95-CCAGGCTATATCCAAGGGGA (1191-1210)
７． EP10-GATCCACGGGTGTTGGTTTT (1360-1379)
８． EP2-TGGTCAGGAGTGCACCTGTTTCCT (1458-1481)
９． P84-CTTGACCATCGGGCGGTT (1902-1920)
１０． P137-CATTCGCTGACCGGTAACTT (2011-2030)
１１． EP3-CTTAGGTCTTATGTCTGAGCCTTC (2181-2204)
１２． P75-TACCAAAGGTACCCCGCCTC (2491-2510)
１３． EP5-CGTTGTTCAGTACCAGTTTACTGC (2925-2948)
１４． P112-CTTTGCTGCTTTTAACCCGC (3051-3070)
１５． P97-CTTGGCGACCCGAACCAGAT (3181-3200)
１６． P118-AGACCTGTCCCTGTT (3781-3795)
１７． P129-CGCAAGGCCGTGCTGTCCAC (3931-3950)
１８． P120-CATGGTCGAGAAGGGCC (4088-4105)
２０． P104-CAGGCCCCGAAGGAGTC (4534-4550)
２１． P99-CGCTCCCTGATGTTGTGCGCT (4820-4840)
２２． P138-TAACCTGATTGGTATGCTAC (5001-5020)
２３． EP11-ATGAATAACATGTCTTTTGCTGCGCC (5106-5131)
２４． P123-GCCTATGTTGCCCGCGCCAC (5188-5207)
２５． EP7-AGTGCCTGATGTCGACTCTCG (5509-5529)
２６． P116-CCCAAGTGAGCGCCTAC (5884-5900)
２７． P124-GCCGAGCTCACCACCACGGC (6161-6180)
２８． P21-GCGCCTTAAGATGAAGG (7089-7106)
3' → 5'REVERSE PRIMER
２９． P126-TTTTTTCAGGGAGCGCGGAA (7202-7181)
３０． HEVU2-CAACAGAAAGAAGGGGGGCACAAG (7161-7138)
３１． P94-CGGGACCAGCACCCAG (6933-6908)
３２． P140-GATGTATACAACTTAACAGT (6390-6371)
３３． EP8-TTACGGGTGAGCCATGTATGC (6002-5981)
３４． EP12-GTCATGGGCTGGAGCGACCGCGGTTA (5500-5475)
３５． EP6-TAGGGGATTGCGAAGGGCTGA (5310-5475)
３６． EP4-GCAAAAACATGAGGAGCAGCAACA (5189-5166)
３７． P127-GGAAATCCACCTTCAACTTC (4771-4751)
３８． P119-GCGGAAGTCATAACAGTG (4650-4633)
３９． P130-GAGAGAGTCGCGGACATCAG (4020-4001)
４０． P23-TGCGGCAGTGCACAATGTCTG (3913-3893)
４１． 98-GGCGCTGGTGACCAATTTCG (3670-3651)
４２． P106-GCGGGTTAAAAGCAGCAAAG (3070-3051)
４３． P61-GGCATTACGCAACTCACGCG (3036-3017)
４４． P42-TCACGCGTCGGGACCACGACA (3023-3003)
４５． P85-TGGGTTATGTTCCAACCTA (2619-2601)
４６． P76-GGCCGCGCCGTCGCGCATCAC (2550-2530)
４７． P114-CCGTCTGGTGGGTTATGGCC (2350-2331)
４８． P59-AGGCCAATGAGTCCCTCAGG (2060-2041)
４９． 96-TGACTGGCATCGAAGGAGAG (1820-1801)
５０． P57-GCCGCGAAGGTAGGTCATTAA (1065-1045)
５１． P132-CAGCATGGAAGGTCGACTTA (970-951)
５２． P122-CCAATTTCAAGACAACGGC (296-278)
５３． P105-AGAAAAGGCCTAACTACCAC (140-121)

その結果、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３の各遺伝子の塩基配列は既に報告されているＥ型肝炎ウイルス遺伝子の塩基配列と比較し、それぞれ以下の様な相同性を示していた。更に、アミノ酸配列での相同性に関しても同様に比較した。その結果、各領域の相同性は、以下の表中の様であった。なお、表１中、本発明により単離されたＨＥＶは「Burma/86(Li)」と表示されている。

(4) HEV(1-7200)の構築及び形質転換体の作製
実施例１−(3)中に記載のpHEV(1-6)(1-2060), pHEV(138)(1458-3023), pHEV(100-10)(2925-5310), pHEVD2U2(5134-7161), pHEV(7)(6161-7200)から(i)pHEV(1-6)(1-2060)を制限酵素EcoRIを用いて消化し、発現ベクターpGEM-3のEcoRI部位内に再クローニングした。(ii)このクローンを制限酵素ApaLI及びBamHIを用いて部分消化を行ない、前述のpGEM-3内にＨＥＶ遺伝子の1-1468の部分を残し他の領域はアガロースゲルで分離した。(iii)pHEV(138)(1458-3023)のクローンに対して(ii)同様に制限酵素ApaLI及びBamHIを用いて部分消化を行ないＨＥＶ遺伝子の1468-2960の領域をアガロースゲルを用いて分離精製した。(iv) (ii)(iii)の２つの領域を用いてライゲーション反応を行ない(i)で得られた発現ベクターpGEM-3内にＨＥＶ遺伝子の1-2960の領域をクローニングした。(v)さらにpHEV(100-10)(2925-5310)を制限酵素BamHIを用いて消化を行ないＨＥＶ遺伝子のうち2960-5310を含む領域を切り出しアガロースゲルを用いて精製単離した。この遺伝子断片(2960-5310)と(iv)で得られたクローン化ＤＮＡとを制限酵素BamHI部位同士でライゲーションを行ない、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子1-5310までを含むpGEM-3クローンを得た(HEV-ORF1)。(vi)pHEV(D2U2)(5134-7161)及びpHEV(7)(6161-7200)を制限酵素KpnIで消化し、pHEV(D2U2)(5134-7161)から単離した遺伝子断片とpHEV(7)(6161-7200)から得られた発現ベクターを含む遺伝子断片同士のライゲーションを行ないクローン化した(1-5310)。(vii)前述のクローンとpHEV(100-10)(2925-5310)を制限酵素NurIを用いて消化しＥ型肝炎ウイルス遺伝子の(3600-7200)までを含む領域をクローン化した(N-9クローン）。(viii)HEV-ORF1及びN-9の両クローンを制限酵素SfiI及びXbaIを用いて消化し、HEV-ORF1から得られたＨＥＶ遺伝子の(1-3966pGEM-3)とN-9より得られたＨＥＶ遺伝子の(3966-7200)を含む断片をそれぞれ単離精製した後ライゲーションした。

その結果、発現ベクターのpGEM-3のマルチクローニングサイト内にＥ型肝炎ウイルス全塩基配列を包含するHEV(1-7200)を得た。

これらのＥ型肝炎ウイルス全塩基配列を含むHEV(1-7200)クローンは、GIBCO BRL社製エレクトロポレーションシステムを用い、さらに大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を宿主として形質転換した。

上記方法により作製され、Ｅ型肝炎ウイルス全塩基配列を含むHEV(1-7200)クローンを有する大腸菌ＤＨ１０Ｂ株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はFERM P-16072である。

実施例２
バキュロウイルスを用いたＯＲＦ２ウイルス抗原蛋白質の発現
（１）組換え転移ベクターの作製
実施例１−（３）で得たpHEV(D2U2)(5134-7161)（上記プライマーＤ２及びＵ２を用いてＨＥＶ遺伝子全長（配列番号５）の5134〜7161ntの2028bpの増幅領域を組込んだもの）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩそれぞれ２０ユニットで、３７℃、２時間消化後、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い挿入遺伝子断片の分離精製を行った。更に、精製断片をアガロースゲルから切り出しBandprep（ファルマシア社製）によって目的のフラグメントを精製した。

同様にして、バキュロウイルストランスファーベクターpVL1393（ストラタジーン社製 ）５μｇを制限酵素ＳｍａＩ及びＸｂａＩ，或いはＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ ２０ユニット ３７℃ ２時間の条件で消化した。そして、０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動法によって分離精製した。更にまた、プラスミドベクターをゲルから切り出しBandprep（ファルマシア社製）によって精製した。

前述までに得られたＥ型肝炎ウイルスの全長ＯＲＦ２フラグメントはバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393/SmaI-XbaIsと５’欠損 ＯＲＦ２フラグメント（転写開始コドン ＋ 112aa-660aa，５’末端にＢａｍＨＩを３’末端にＸｂａＩを持つフラグメント）はバキュロウイルストランスファーベクターpVL1393/BamHI-XbaIとTAKARA ligation kit ver.2を用いて結合した。ligation反応の条件は、１５℃ ３０分間である。また、挿入遺伝子濃度は、１２５ｎｇであり、ベクターＤＮＡ濃度は、２５ｎｇであった。さらに、全反応液容量は、８μｌであった。

前項の反応液の全量を用いて、大腸菌Ｋ−１２株系の例えばＤＨ１０Ｂ等の株を用いてGIBCO BRL社製エレクトロポレーションシステムにより用いて形質転換を行った。

さらに、形質転換後、得られた形質転換体を適当に２０個程度選択し、ＬＢ培地を用いて液体培養を行う。それらの培養液から１．５ｍｌをサンプリングしてFlexiPrep kit（ファルマシア社製）によりPlasmid DNAの精製を行った。そして、それらのＤＮＡを用いて制限酵素によるマッピングを行い、目的のプラスミドpVL(D13U14)を取得した。

（２）組換えウイルスの作製
φ３５ｍｍのプラスティック製ディッシュ（住友ベークライト社製）を用いて、昆虫細胞Ｓｆ９細胞(Spodoptera frugiperda)は、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地（TC100あるいは Excell 400）で、３〜４日培養した。次いで、φ３５ｍｍディッシュ（住友ベークライト社製）を用いて、１×１０６個／ディッシュ、培地量約１．５ｍｌになる様に細胞を調整した。この状態で３０〜４０分間静置した後、無菌的に上記培地を除去し、１．５ｍｌの無血清培地例えば（Ex cell 400またはGrace's medium）に交換した。

ここにBaculoGold linearized Baculovirus DNA 0.5μｇ（Pharmingen Co Ltd)及び１μｇのpVL(D13U14)を８μｌの精製水に溶解し、２倍希釈した等量のリポフェクチン（Gibco BRL Co Ltd）と混合後、室温で１５分間放置した。このＤＮＡ混合物を上記無血清培地中に１滴ずつ静かに全体に滴下した。（Co-transfection）。そして、インキュベーター内に収納し、２６〜２６．５℃で３日間培養した。

Co-transfection後、約３日間経過した細胞培養上清約１ｍｌを１．５ｍｌ遠心チューブに回収し、それらの各２０μｌを用いて１０−１〜１０−３ のウイルス力価まで無血清培地によって希釈し各々の１００μｌを１×１０６個／ディッシュ（φ３５ｍｍ）に調整した細胞に接種し、約１時間静置して吸着させる。その後、組換えウイルス液を除去し、１％低融点寒天ゲル（Sea Plaque：宝酒造社製）２ｍｌを重層し、ゲルが凝固した後、更に、１ｍｌの培地を重層し、２６〜２６．５℃で３〜４日間培養する。更に、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ニュートラルレッド（１０ｍＭリン酸緩衝液）を１ｍｌ加え、プラークアッセイを行った。（J.gen.Virol;1977,36,361-364）ここで組換えウイルスである透明プラークを選択をした。

プラークアッセイによって得られた組換え体と思われるプラークをパスツールピペットによってゲル諸とも採取し、それらを細胞培養用培地４００μｌに浮遊し十分撹拌を行った。その後、アガロースゲルを3000rpm 5minの条件で遠心沈殿させた。この時得られた上清をプラークアッセイ時同様に、１０−１〜１０−３まで細胞培養用培地で希釈し、低融点寒天を用いてCo-transfection時同様にプラークアッセイを行いて組換えウイルスの精製を行った。

プラーク純化（plaque purification）によって得られた組換え体の感染力価を上昇させる為に更に昆虫細胞Sf9 cellに感染させた。この時も上記までと同様に、φ３５ｍｍディッシュに約１×１０６個／ディッシュの昆虫細胞Ｓｆ９細胞を用意し、約３０分間静置後、培地の大部分を除去し、そこに得られた組換えウイルスを約１００μｌ加え、約１５分間隔で穏やかに振とう混和を行う。この操作は合計４回、約１時間に渡って行った。

次に、昆虫細胞用培地を１．５ｍｌ加え、３〜４日間培養を行ってその上清を採取した。この時、得られた上清を用いて７５ｃｍ２培養フラスコ２本を用いて同様にSf9 cellを準備し、上清１ｍｌを接種し、３〜４日間の培養以後、得られた上清をＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質発現用高力価組換え体とした。

（３）Ｅ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲＦ２）の発現
φ３５ｍｍディッシュに昆虫細胞Ｔｎ５細胞（１×１０６ cells／ディッシュ）室温で３０分間静置して吸着させた培地の大部分を吸引除去した後、前項記載の高力価組換えウイルス（１×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）をＭＯＩ５〜１０になるように接種し、約１５分間隔で穏やかに振とうしながら計４回、一時間に渡り、この操作を続けた。

その後、昆虫細胞培養用培地を０．５〜１ｍｌ添加し、３〜４日間、２６〜２６．５℃で培養を行いＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲＦ２）の発現を行った。

発現蛋白質は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動後、クマシーブルーで染色後目的とする蛋白質の分子量及び発現蛋白質量を観察した。その結果、発現蛋白質は予想される分子量を持つ蛋白質であることが確認された。

抗原性の確認は、実験的にＥ型肝炎ウイルスを感染させたカニクイザルの回復期血清並びにＥ型肝炎患者血清を用いたウエスタンブロッティング及び蛍光抗体法で行った。その結果、発現蛋白質と特異的に反応するバンドの存在と蛍光発色が確認され、発現蛋白質がＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質である事を確認した。

精製ウイルス様中空化粒子をＥ型肝炎回復機期患者血清と混合し、３７℃で一時間反応後、ベックマンＳＷ５０．１ ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心し、沈査を４％Uranic acetateによる陰性染色後、電子顕微鏡で検鏡してウイルス凝集像を確認した。尚、倍率は約50,000倍で検鏡した。その結果、約２５ｎｍの中空円型のウイルス様粒子構造物であるいわゆる”Empty particle ”の凝集像を確認した。

（４）Ｅ型肝炎ウイルス発現蛋白質の精製と電子顕微鏡を用いたEmpty particleの確認
昆虫細胞Ｔｎ５細胞を用いて、表面積１５０ｃｍ２のプラスティック製細胞培養用ボトル５〜６本を用いて、大量にＥ型肝炎ウイルス構造蛋白質（ＯＲＦ２）を発現させ精製に供試した。Tn5 cell培養上清を1,000ｘｇで１０分間遠心沈殿させて夾雑物を除き、更に、10,000ｘｇで３０分間遠心してバキュロウイルスを除外した。１０％蔗糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌに重層してベックマンＳＷ２８ローターで100,000ｘｇ ３時間遠心し、ウイルス様中空化粒子抗原を沈査として回収した。１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁してそれぞれ２ｍｌの２０％及び１０％蔗糖液を重層したものにさらに、重層し、ベックマンＳＷ５０．１ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心してウイルス様中空化粒子を２０％と１０％蔗糖液の中間に回収した。さらに、乳白色のバンドを回収しリン酸緩衝液で５倍希釈し、ベックマンＳＷ５０．１ローターで100,000ｘｇ、３時間遠心沈殿を行い、ウイルス様中空化粒子（Empty particle）抗原を回収し図中に示した様に電子顕微鏡下に確認した。

実施例３
バキュロウイルス発現Ｅ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原を用いた抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の作製
（１）１ｍｇの精製中空化粒子抗原を含む１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と１ｍｌのFreund incompleteアジュバントを混合し、２ＫｇのNew Zealand Whiteウサギに皮下注射した。

（２）一ヶ月後に０．５ｍｇの中空化粒子抗原を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌとFreund incomplete アジュバント０．５ｍｌを混合して皮下に一回目の注射をした。更に、一週間後に、同様にして同じく皮下に二回目の注射を行った。この５日後に全採血し、血清成分を分離した。

（３）分離精製した血清は、バキュロウイルス発現抗原（Empty particle）を固相した平底ポリスチレンプレートを用いてＥＬＩＳＡでボックスタイトレーションを行い抗体力価を決定した。

実施例４
バキュロウイルス発現蛋白質（Empty particle）を用いた抗ＨＥＶ ＩｇＧ特異抗体の検出
（１）バキュロウイルス発現蛋白質（Empty particle）固相プレートの作製
実施例２−（３）に記載のバキュロウイルス発現蛋白質（Empty particle）を５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で各々０．１〜１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ダイナテック社製）に１００μｇ／ウエルで分注し、４℃で１晩静置した。次にマイクロプレートを最終濃度０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄後、最終濃度０．０５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルを加えて４℃で一晩静置し、バキュロウイルス発現抗原（Empty particle）固相マイクロプレートを作製した。

（２）Ｅ型肝炎患者血清 検体を用いた抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の検出
前述のバキュロウイルス発現抗原（Empty particle）固相マイクロプレート中のプレート保存液を除外し６回洗浄後、Ｅ型肝炎患者血清を０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１００倍に希釈し、その１００μｌを抗原固相マイクロプレートのウエルに加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。ついで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳで約20,000〜40,000倍に希釈した抗ヒトＩｇＧヤギパーオキシターゼ標識抗体（ＭＢＬ）を１００μｌ／ウエル加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミンを含む、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）に、０．０２％過酸化水素を加えた基質を１００μｌ／ウエル加えて室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計を用いて、波長４９２ｎｍで各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定した。（表２）。

＊ＯＲＦ２全長発現蛋白質によるウエスタンブロッティング

この結果より、Ｅ型肝炎ウイルスの０ＲＦ２の全長を発現させた抗原とＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原を用いたＩｇＧ抗体検出ウエスタンブロッティングの成績を比較したところ陽性一致率及び陰性一致率共に１００％の結果であった。

以上の結果より、バキュロウイルス発現蛋白質Enpty particleを用いた抗HEV-IgG特異抗体検出に於いて検出感度及び特異性共に文献上の他のアッセイとの比較よりも高いことから今回発現させた中空化粒子抗原の有効性が示唆される結果となった。

実施例５
バキュロウイルス発現蛋白質（Empty particle）を用いた抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体の検出
（１）抗バキュロウイルス発現蛋白質Empty particle抗体に対するパーオキシダーゼ標識
実施例２−（３）記載のバキュロウイルス発現蛋白質Empty particleの１０〜５００μｇ／ｍｌを１ｍｌとフロイントの完全アジュバント（Difco社製）１ｍｌを等量混合し、エマルジョンを作製して、モルモットに免疫した。次いで不完全アジュバント（Difco社製）１ｍｌを前術の抗原溶液と等量混合しエマルジョンを作製して２回追加免疫した。追加免疫した後、モルモットを全採血した。その血液から血清成分を分離し、硫安分画後、50mM Tris - HCl (pH7.6)で４℃、一晩透析した。次ぎに50mM Tris - HCl(pH7.6)で平衡化した。ＤＥＡＥ セファロースクロマトグラフィーにかけ、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングし、Ｏ．Ｄ．のピークを集めてＤＥＡＥ精製ＩｇＧ画分とした。

このＩｇＧ抗体画分を過ヨーソ酸改良法〔酵素免疫測定法 ，２：９１（１９８２）〕でパーオキシダーゼ標識した。即ちパーオキシターゼ４ｍｇ／ｍｌになる様に蒸留水で溶解した。ついで、０．１Ｍ過ヨーソ酸ナトリウム０．２ｍｌを加え、室温で約２０分間反応させ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で一晩透析した。透析後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を０．０２ｍｌ加え、ｐＨ９〜９．５にすると同時に前述したＩｇＧ抗体を８ｍｇ加えた。

室温で２時間反応させ、４ｍｇ／ｍｌ水酸化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃で２時間反応させた反応後、１０ｍＭリン酸バッファーを用いてセファクリルＳ−２００によるゲル濾過を行い、ＵＶ波長２８０ｎｍでモニタリングしてパーオキシダーゼ標識抗体画分を集めた。

（２）Ｅ型肝炎患者血清を用いた抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体の検出
抗ヒトＩｇＭモノクロナール抗体（ＭＩＬＳ社製）を５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で５００〜１０００倍に希釈し、ダイナテック社製ポリスチレン平型分割マイクロプレート（高結合タイプ）に１００μｌ／ウエル分注し、４℃、１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄後、０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ ２００μｌ／ウエル加えて４℃、一晩静置後、抗ヒトＩｇＭモノクロナール抗体固相マイクロプレートを用いて、抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体検出試薬を試作した。

次に、抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ特異抗体検出試薬のプレート中の保存液を除外した。ついで、Ｅ型肝炎患者血清を０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ ｍＭ ＰＢＳで２００倍に希釈し、前述の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウエルに加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳで０．０５〜５．０μｇ／ｍｌ濃度に希釈し、それを１００μｌ／ウエル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄した。０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳで２０００〜２００００倍に希釈した前述、実施例２−（３）のバキュロウイルス発現蛋白質Ｅｍｐｔｙ ｐａｒｔｉｃｌｅに対するパーオキシターゼ標識モルモット抗体を１００μｌ／ウエル加え、室温で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄した。洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌ ０−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、最終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウエル加えて室温で約３０分間反応させた。 反応後、１．５Ｎ硫酸を１００ μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で波長４９２ｎｍを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定した。（表３）

＊ＯＲＦ２全長発現蛋白質によるウエスタンブロッティング

この結果より、Ｅ型肝炎ウイルス ＯＲＦ２の全長とＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原をもちいた抗HEV-IgM特異抗体検出のウエスタンブロッティングの成績を比較したところ、陽性一致率及び陰性一致率ともに１００％であった。

以上の結果より、バキュロウイルス発現蛋白質（Empty particle）を用いた抗HEV-IgM特異抗体の検出には、検出感度及び特異性共に、文献等に示されているよりも、高いため、これらの中空化粒子抗原の有効性が示唆された。

実施例６
Ｅ型肝炎ウイルス抗原の検出
（１）Ｅ型肝炎ウイルス抗原に対する抗体固相マイクロプレートの作製
実施例３記載の抗Ｅ型肝炎ウイルスウサギ抗体を５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で０．１〜５．０μｌ／ｍｌに希釈した。希釈後、ポリスチレン平型マイクロプレート（ダイナテック社製）に１００μｌ／ウエル分注し、４℃で１８時間以上静置した。静置後、マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで３〜４回洗浄後、０．５％ＢＳＡと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳを２００μｌ／ウエル加えて４℃一晩静置し、抗体固相マイクロプレートを作製した。

（２）Ｅ型肝炎患者便材料を用いたＥ型肝炎ウイルス抗原の検出
次に、抗体固相プレートを用いて、Ｅ型肝炎患者便材料よりＥ型肝炎ウイルスの検出を行った。前記述の抗体固相マイクロプレートウエル中のプレート保存液を除き、ついで、Ｅ型肝炎患者便材料１０％ホモジネートを０．２％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含む１０ｍＭＰＢＳで２００倍に希釈し、前記述の抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体固相マイクロプレートに１００μｌ／ウエル加え、室温（１５〜２５℃）で約１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。

０．０５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳで２０００〜５０００倍に希釈したＥ型肝炎ウイルス中空化粒子抗原に対するパーオキシダーゼ標識モルモット抗体を１００μｌ／ウエル加え、室温で約一時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５ｍＭＰＢＳ２００μｌ／ウエルで６回洗浄した。

洗浄後、３．３ｍｇ／ｍｌ Ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ ５．０）に、終濃度０．０２％の過酸化水素水を加えた基質液を１００μｌ／ウエルを加えて、室温で約３０分間反応させた。反応後、１．５Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル加えて反応を停止させ、マイクロプレート用比色計で波長４９２ｎｍを用いて各ウエルのＯ．Ｄ．値を測定した。（表４）

この結果から、バキュロウイルス発現抗原で免疫した抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を用いたＥ型肝炎ウイルス抗原検出系は有用である事が分かった。

参考例１
ＰＣＲ法によるＥ型肝炎ウイルス遺伝子の検出
Ｅ型肝炎ウイルス感染患者血清中からＨＥＶ ＲＮＡをＲＮＡ抽出キットを用いて抽出した。

次に抽出したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成キットにより、ｃＤＮＡを合成した。合成済みのｃＤＮＡをPCR primerを用いて遺伝子の増幅を試みた。遺伝子増幅に際して選択した領域は、ＨＥＶ ＯＲＦ２の全領域をコードする１９８０ｂｐを含む領域である。

尚、以下にＥ型肝炎ウイルス遺伝子 ＯＲＦ２増幅用ＰＣＲプライマーの位置を示す。

First PCR Primer
HEV-D4 TGTAGAGAATGCTCAGCAAGGATAA (6391-6414)
HEV-U4 TAACTCCCGAGTTTTACCCACCTT (7103-7126)
Secondary PCR Primer
HEV-D5 CTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTA (6576-6600)
HEX-U3 TTAAGGCGCTGAAGCTCAGCGA (7077-7098)

比較例１ ＯＲＦ２全長の発現
実施例１及び２と同様にして、ＯＲＦ２の全長を切り出し、バキュロウイルスベクターに組込み、Ｔｎ５細胞で発現させた。細胞内には全長と考えられる72 KDa及びcleavage productと思われる58 kDaと50 kDaのタンパク質の産生が認められた。しかし、細胞培養上清中にはこれらのタンパク質の存在は認められなかった。また、細胞ライセートについても電子顕微鏡で何度も観察したが粒子は全く観察されなかった。さらに、培養上清についてＰＥＧ濃縮を行なったり、超遠心方によって培養上清をペレットにしてこれらを同様に電子顕微鏡で観察したが粒子は観察されなかった。これらの結果から、ＯＲＦ２全長を発現させた場合にはウイルス粒子は形成されないものと考えられる。

Claims (2)

1. 配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、Ｅ型肝炎ウイルスの抗原性を有するポリペプチドから成るＥ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子を産生するタンパク質をコードするＤＮＡを、バキュロウイルスベクターのバキュロウイルス遺伝子非必須領域内に挿入して組換えバキュロウイルスベクターを調製し、該組換えバキュロウイルスベクターを昆虫細胞Ｓｆ９に導入することで該組換えバキュロウィルスベクターの感染力価を上昇させた後に、該組換えバキュロウイルスベクターを昆虫細胞Ｔｎ５に導入することにより、該昆虫細胞中で前記中空粒子を構築させることを含む、Ｅ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子の作出方法。
2. 請求項１に記載する方法により得られる、Ｅ型肝炎ウイルスの直径約25nmの中空粒子。