JPH04505964A - スクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスクリーニング方法に関する。特に本発明は、特定の抗原に結合する能 力についてスクリーニングする抗体の生産方法のためのスクリーニング方法に関 する。本発明はまた、該スクリーニング方法を実施するための方法および材料； 該スクリーニング方法を使って生産される抗体；そのような抗体を使った診断方 法およびキット：並びにスクリーニング方法を実施するために前記材料をアッセ イ対照として使ったキットにも関する。

本発明は、単に例として本明細書中に例示され、そのようなスクリーニング方法 を使用することによるヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）に対するモノクローナル抗 体の生産に限定するつもりではなく、記載の技術が多数の抗体産生系において有 効に使用され得ることは当業者にとって明白であろう。

発明の背景 診断試験において好結果に抗体を使用するためには、該抗体が免疫原と分析用に 調製した試験試料（即ち凍結保存、切片化および固定といったような組織の前処 理の後）とに共通であるエピトニブを認識しなければならない。従って、例えば 多数のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングするために選ばれる系は、それ が診断上有用な抗体の選択を助けるようなものでなければならない。

現在まで、特定の抗原、例えばＨＰＶに対する抗体の生産（調査目的のだめの） は、細菌発現系において発現されるタンパク質、合成オリゴペプチドの形のタン パク質または精製タンパク質のいずれかを免疫原として使用し、そして該免疫原 またはそれらの種々の組合せを再利用することにより免疫原に対して生産された ′抗体について（例えばハイブリドーマ上清を）スクリーニングすることにより 、達成されている（Ｂａｎｋｓ　Ｌ、ら１９８７．　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、 　６８．３０８１−３０８９　；　ＤｏｏｒｂａｒＪ、およびＧａｌｌｉｍｏｒ ｅ　Ｐ、ら１９８７．　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１．２７９３−２７９９）。

しかしながら、モノクローナル抗体の生産のためのそれらの既知のプロトコルは 、免疫細胞化学的診断試験において使用することになっているモノクローナル抗 体の生産には一般に不適当である。これは、それらのプロトコルにより生産され る抗体が必ずしもヒト感染細胞中の天然タンパク質と反応するとは限らないから である。より詳しくは、それらの抗体により認識されるエピトープは、臨床試験 品のサンプリング、固定および保存に必要である標準操作に耐性であるエピトー プであるとは限らないだろう。

本発明者らは、診断上有用である抗体を選択するために、スクリーニング材料を 臨床試料に厳密に似せることが望ましいことに気付いた。特にスクリーニング材 料は、診断アッセイ中に臨床試料により提示されるものと同じ形態の抗原を提示 しなければならない。

細胞スミアまたは組織切片といった臨床試料を抗体に基づく診断試験に使用する 前に、試料は通常１または複数の前処理段階にかけられる。それらの前処理段階 は、凍結保存、切片化および／または固定（例えばメタノールまたはホルムアル デヒド／塩溶液による）を含んで成ることができる。それらの操作のため、その ような前処理にかけられた臨床試料により発現される抗原は、生体内で発現され る抗原に比較した時、幾らか変形され得る。

従って本発明者らは、いずれのスクリーニング方法においても２つの主な点でス クリーニング材料が診断試料を模倣することが望ましいことに気付いた。第一に 、スクリーニング材料はできる限り天然な材料を生産し、プロセシングし、そし て提示することができなければならない。第二に、スクリーニング材料は、スク リーニング材料をスクリーニング方法において使用する前に、診断分析前に臨床 材料に通常適用されるものと同じ前処理にかけることができるようなものでなけ ればならない。

上述したように、本発明をヒト乳頭腫ウィルスに関して例示する。

ヒト乳頭腫ウィルスは小さい（約８ｋｂ）ＤＮＡウィルスであり、４０種以上が 皮膚または粘膜の上皮または繊維上皮の増殖を誘導すると報告されている（ｚｕ ｒ　Ｈａｕｓｅｎ、Ｈ，、１９７７゜Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７８．１−３０）。

特に、幾つかのＨＰＶ型のＤＮＡは、しばしばＨＰＶ　６ｂまたはＨＰＶｌｌ　 ＤＮＡを含む良性いぼ（尋常性いぼと性器いぼの両方）から（Ｇｉｓｓｍａｎｎ 　Ｌ、ら、１９８３．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０． 　５６０−５６３）、しばしばＨＰＶ　−１６，−１８，−３３またバー３５ゲ ノムを含む頚の侵食性偏平上皮癌（Ｄｕｒｓｔ　Ｍ、ら１９８３．　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

見つかっている。

子宮頚部スミアの細胞学的検査から、スミア試料を採取した女性の１０％までを 異゛常な細胞学を有するものに選定することが可能である。そのような女性は、 しばしば侵食性診断方法を伴う更なる身体検査に差し出される。それらの女性の 成る比率は重大でないＨＰＶに感染しており、そして他のものはより悪性のＨＰ Ｖ型に感染している。従って、スクリーニング法には、存在する場合にはＨＰＶ 惑染を同定し且つ悪性のＨＰＶ惑染と非悪性のＨＰＶ感染とを区別する診断試験 を含めることが宵月であろう。装置および練習費用を最小にするために、任意の 新規診断試験が現存の技術を利用しそして本スクリーニング操作に容易に入れる ことが有利であろう。更に、そのような試験による客観的答え（主観的評価より も）の提示は自動化を可能にし、これは結局、関係する患者にとってストレスが かかる待ち時間および費用の両方を減少させるのに役立つだろう。

現在まで、ＨＰＶ感染の検出に利用可能である、抗体に基づ（臨床的診断試験は 全くなかった。これは大部分は２つの問題点のためである。第一は、乳頭腫ウィ ルスの試験管内増殖のための寛容な組織培養系を確立することが今まで不可能で あった。第二に、臨床材料が入手困難であり、臨床病変中に通常はごく少量しか ウィルスタンパク質が存在せず、そして病変を引き起こすＨＰＶは一般に未知の 型のものである。それらの２つの原因は、モノクローナル抗体の大量生産におけ る免疫原とスクリーニング剤の両方としての用途に、型の決まった（即ち既知の ”）ＨＰＶの確かで且つ十分な源が入手不可能であることを意味する。

発明の要約 本発明は、特定の抗原に結合する能力を有する抗体の生産方法において使用する ためのスクリーニング法であって、所望の抗体に特異的な抗原を発現する組換え ウィルスベクターで感染された細胞を用いて前記抗体がスクリーニングされ、前 記細胞が臨床試料の調製と同様な方法で前処理されていることを特徴とするスク リーニング法を提供する。好ましくは、前記抗体は、適当な宿主生物中において 組換えＤＮＡから発現されたタンパク質または合成オリゴペプチドで免疫処置さ れている動物から得られ、ここで前記タンパク質またはオリゴペプチドはウィル スベクターによりコードされるエピトープと相同なエピトープを提示する。

エピトープに関係する用語「相同」とは、エピトープが実質的に同じアミノ酸配 列により表されることを示し、一方でそれらの異なる生産方式のため、それらは コンホメーションに関しては同一でないかもしれないと解釈される。本発明のス クリーニング方法は、相同エピトープの共通の構造的特徴を認識する抗体を同定 することを可能にし、従って調製した臨床試料により提示されるエピトープにお ける任意のフンホメーション変化により影響を受けにくい。該スクリーニング方 法の使用により得られた抗体は、既知の抗原性の調製臨床試料（例えば既知の型 のＨＰＶに感染したもの）に対して更にスクリーニングし、該抗体がその状態で エピトープを認識する必要な能力を有することを確かめることができる。

本発明は、ここで提゛供するスクリーニング方法において使用するためのスクリ ーニング材料も提供する。該スクリーニング材料は、所望の抗体に特異的な抗原 を発現する組換えウィルスベクターにより感染された細胞を含んで成り、該細胞 は臨床試料の調製と同様な方法で前処理されている。

本発明はまた、上記スクリーニング方法を使用して生産された抗体を提供する。

ａ）記載のスクリーニング方法を使用して生産された抗体およびｂ）組換えウィ ルスベクターにより感染された細胞を含んで成るスクリーニング材料の両方また は一方と共に、該抗体が特異的であるエピトープを提示するタンパク質の存在に ついて臨床試料をアッセイするのに必要な１または複数の試薬を含んで成り、モ して数組換えウィルスベクターが該タンパク質により提示されるものと相同なエ ピトープを発現することを特徴とする、診断キットも提供される。スクリーニン グ材料の細胞は、臨床試料の調製と同様にして前処理することができる。そのよ うなキラ・トでは、アッセイ対照として使用するためにスクリーニング材料を含 めてもよい。

本発明は、記載のスクリーニング方法の使用により生産された抗体を用いて、該 抗体がそれに特異的であるエピトープを提示するタンパク質の存在について臨床 試料をアッセイする診断方法も包含する。

該方法は、異なる株の免疫原間を識別することができる抗体の生産に使用するこ とができる。これは、免疫原の特定株に特異的であるｌまたは複数のエピトープ をコードするウィルス組換え体により感゛染された細胞を使って抗体をスクリー ニングすることにより、達成することができる。適当なウィルスベクターはワク シニアである。

開示される方法は、ｌ）ウィルス組換え体で感染された細胞が抗原の良好な供給 を提供することができ；２）抗原が哺乳動物細胞中で発現され、そして天然の感 染において見つかる抗原と本質的に同じ形態にプロセシングされ；そして３）感 染細胞がハイブリドーマスクリーニング操作に使用する前に試験試料組織に適用 するのと同じ前処理にかけられるので、特に育利である。これは、選択される抗 体がそれらの前処理に対して耐性であって従って分析用に調製した試験試料上に 存在すると期待されるエピトープを認識するであろうことを保証する。典型的に は、前処置は、感染細胞を遠心によりペレット化し、固定し、そして切片として 調製することを含んで成ることができる。固定操作は、典型的には、臨床試料が 子宮頚部スミアである場合にはメタノールにより、または臨床試料がバイオプシ ー材料である場合にはホルムアルデヒド／塩溶液によるだろう。

本発明により提供されるスクリーニング方法およびウィルス感染細胞スクリーニ ング材料は抗体の再スクリーニングのために用いることができるが、最初にそれ らを調製しそして選択してもよい。

既に指摘したような問題を提供する乳頭腫ウィルスの他に、本発明はより一般的 に適用することが可能である。特に天然形態で生産することが通常困難である抗 原に対する抗体に関して。

スクリーニングまたは正の対照としてウィルス感染細胞を使用する特定の利点は 、それらが既知のレベルで、例えば１細胞がｔｏ、　ｏｏｏに等しいレベルで、 抗原を提示するように調製することができることである。従って、特定のアッセ イに対する抗体の適切性、または正の対照を使ってアッセイにおける正のシグナ ルの強度を判断することができる。

図面の簡単な説明 図１は、融合β−ガラクトシダーゼ−ＨＰＬ１６−Ｌ１転写解読枠のための発現 プラスミドｐＨＸ２の作製を示す。

図２は、ｐＵｃ１８中での全長ＨＰＶ１６−Ｌ１転写解読枠の作製をポス３は、 ワクシニアウィルス４ｂプロモーターの調節下においてコード配列を発現させる ための挿入ベクターであるワクシニア発現プラスミドｐＲＫ１９の作製を示す（ Ｒｉｃｈａｒｄ　ＫｅｎｔＰｈＤ　Ｔｈｅｓｉｓ、　ケンブリッジ大学、も参照 のこと）。

図４は、ＨＰＶ１６−Ｌｌ遺伝子がワクシニアウィルス４ｂプロモーターにより 調節される、ｐＲＫ１９からの発現プラスミドｐＲＫＬ１の作製を示す（Ｂｒｏ ｗｎｅら１９８８．　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｖｏｌ、　６９．　’１２６３−１２７ ３も参照のこと）。

図５は、融合β−ガラクトシダーゼ−ＨＰＶ１６　Ｅ７転写解読枠のための発現 プラスミドｐＥｘＥ７の作製を示す。

図６は、ＨＰＶ１６　Ｅ７転写解読枠がワクシニアウィルス４ｂプロモーターの 調節下にあ−る発現プラスミドｐＲＫＥ７の作製を示す。

そして 図７は、本発明のスクリーニング方法の使用を概略的に示す。

発明の好ましい態様の詳細な説明 本発明がより容易に理解できるように、限定でなく例としてのみ、態様を記載す る。

ＨＰＶ−１６ＤＮＡのゲノムクローンを得た（完全ヌクレオチド配列の詳細につ いては、５ｅｅｄｏｒｆら１９８５．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４５．１８１を参 照のこと：これは参考として本明細書中に組み込まれる）。

ＨＰＶ−１６Ｌ１転写解読枠の一部分（アミノ酸２１１からＣ末端まで）をＨＰ Ｖ−１６ＤＮＡのゲノムクローンからＢａｍＨＩ／Ｓｔ）旧断片（塩基６１５３ −７４６４）としてクローニングし、そしてベクターｐＥｘ−１（Ｓｔａｎｌｅ ｙ　＆　Ｌｕｚｉｏ　１９８４．　ＥＭＢＯＪ、　３．１４２９　；これは参考 として本明細書中に組み込まれる）のＢａｍＨＩおよび５ａｌＩ部位に連結せし め、β−ガラクトシダーゼとＨＰＶ−１６ＬｌのＣ末端部分との融合転写解読枠 を生ぜしめた（図１）。得られたプラスミド（ｐＨＸ２）を大腸菌ＰＯＰ　２１ ３６中にトランスフェクトせしめ、そして熱誘導によりβ−ガラクトシダーゼ融 合タンパク質の生産を引き起こし、該融合タンパク質をゲル電気泳動により精製 した。

（ｂ）　ＨＰＶ−１６Ｌｌに対するモノクローナル抗体の生産不完全フロインド アジュバント中の１００μｇのβ−ガラクトシダーゼ−Ｌ１融合タンパク質（上 記（１ａ）で調製したもの）の１か月おきの３回の腹腔的注射によりマウスを免 疫処置した。最後の免疫処置の４日後、マウス牌細胞をミエローマＮＳＯ細胞と 融合せしめ、そして融合生成物を４８×直径１．５ａｎの組織培養ウェルに分配 した。

ＨＰＶ−１６Ｌ１転写解読枠を、ＨＰＶ−１６ゲノムクローンから誘導したＫｐ ｎｌ−３ｐｈｌ断片（塩基５３７７−７４６４）においてベクターｐＵｃ１８中 に導入した（図２）。次いでこの転写解読枠を部分ＥｃｏＲＩ消化から生じる２ ０７４　ｂｐ断片においてこのベクターから切り出し、この断片を、ワクシニア チミジンキナーゼコード配列が隣接したワクシニア後期プロモーター（４ｂ後期 遺伝子のプロモーター）を含むベクターであるｐＲＫ１９　（Ｒ，Ｋｅｎｔ、Ｐ ｈ、Ｄ。

Ｔｈｅｓｉｓ、ケンブリッジ、　１９８８；これは参考として本明細書中に組み 込まれ、下記に要約する）のＥｃｏＲ１部位に導入した。

得られたプラスミドｐＲＫＬ１　（図４）は、ワクシニア後期プロモーターの調 節下に完全ＨＰＶ−１６Ｌｌ遺伝子を含む。野性型ワクシニアウィルスにより感 染させたｅＶ−１細胞中にＩ）ＲＫＬｌをトランスフェクトせしめ、そして完全 なチミジンキナーゼ遺伝子を欠く組換えウィルスを５−ブロモデオキシウリジン 中での増殖により子孫から選択した。次いで組換えウィルスをＨＰＶ−１６ＤＮ Ａプローブどのハイブリダイゼーションにより同定し、そして制限酵素消化によ り更に特徴づけた。正しい方向で挿入されたＨＰＶ−１６ＬＬ遺伝子を含む組換 えウィルスを同定し、ＶＬＩＲＫ　と命名した。

上記の（１）と（２）に要約した手順は、Ｂｒｏｗｎｅら１９８８゜Ｊ、Ｇｅｎ 、Ｖｉｒｏｌ、６９．１２６３−１２７３　（これは参考として本明細書中に組 み込まれる）に詳細に記載されている。

４ｂ遺伝子プロモーターを含むプラスミドの作製段階は次の通りである（図３参 照）： （ａ）　４ｂ遺伝子コ一ド配列と２２８ヌクレオチドの５′配列（プロモーター と転写開始部位を含む）を、ワクシニアウィルス（ＷＲ株）のＨｉｎｄＩ［［Ａ 制限断片から誘導した２、３ｋｂのＸｂａ　Ｉ断片において単離した。この２． ３　ｋｂ　Ｘｂａｌ断片をＭ２Ｓ　ｍｐ１９のＸｂａ１部位にクローニングし、 そしてＸｈｏ　Ｉ開裂、Ｂａ１３１消化および再連結により４ｂコ一ド配列の大 部分を除去した。生じたＭ１３ｍｐ１９中の挿入断片は、２２８ヌクレオチドの 「上流」配列と３１ヌクレオチドの４ｂコ一ド配列を含んだ。

（ｂ）　Ｍ２Ｓ　ｍｐ１９中のクローニング部位が４ｂプロモーターと転写解読 枠のすぐ３′側にくるように、残りの４ｂコ一ド配列を部位特異的突然変異誘発 により削除した。この領域の配列は次のようになる。

Ｂａｍ　Ｓｍａ　Ｋｐｎ等 、　、　、　、　、　、　、　ＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧ ＧＴＡＣＣ，、、、、、。

ワクシニア４ｂブＤモーター配列　Ｍ２Ｓ　ｍｐ１９クローニング部位最後に、 ベクターか−らそれらの配列を取り出しくＥｃｏＲＩおよびＡｃｅ　Ｉ消化によ り）、そしてそれらをｐＧｓ２Ｑ　（Ｍａｃｋｅｔｔら。

１９８４、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４９．８５７を参照の こと：これは参考として本明細書中に組み込まれる）に類似したベクター中のワ クシニアチミジンキナーゼ遺伝子の本体中に挿入することにより、ｐＲＫ１９を 作製した。ｐＲＫ１９は図３に示した性質を有する。このプロモーターは好都合 に入手できるために使用したが、理論上いずれのワクシニア後期プロモーターで も使用することができた。「後期」ワクシニアプロモーターの特徴は、多数のグ ループ、例えばＲｏｓｅｌ　ら１９８６．　Ｊｏｕｒｎａｌて本明細書中に組み 込まれる）。ワクシニアウィルス組換え体において外来タンパク質の発現を駆動 させるためにそれらのプロモーター配列を使用した幾つかの例、例えばＢｅｒｔ ｈｏｌｅｔ書中に組み込まれる）がある。前記著者らにより記載されたベクター は、ＨＰＶコード配列を発現させるのにも適当であろう。４ｂ遺伝子プロモータ ーは他の「後期」プロモーターに典型的な特徴を有する。４ｂ遺伝子とそのプロ モーター領域は、ＲｏｓｅｌおよびＭｏ５ｓ　１９８５．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ ｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５６．８３０　（これは参考として本明細書中に組み込 まれる）により配列決定されている。

（ｉｉ）モノクローナル抗体反応性の評価のための、ホルマリン固定、バラフィ ンワーツクス包埋お７よび組織切片化用のペレットとしてのワクシニア感染細胞 の調製予め形成させた標的細胞（１０７以上）の単層を、組換えワクシニアウィ ルスまたは野性型ワクシニアウィルス（負の対照）で感染させ、感染を８〜１５ 時間進行させた。子ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）およびＶｅｒｏ細胞も また使用し、理論上は任意の感受性細胞系で十分であろう。感染多重度（Ｍｏｌ ）は、必要とする抗原陽性細胞の比率に依存する。５のＭＯＩは１００％十ｖｅ 細胞を生じる。０．１のＭＯＩは１０％＋ｖｅ細胞を生じ、そしてＰｏｌｓｓｏ ｎ分布により定義される＋ｖｅ細胞の比率を与えるように最初にＭＯＩを変える ことができる。スクリーニング材料として使用するためには、Ｍｏｌは高く、例 えば７０〜１００％であろう。

次いでテフロン製細胞スクラッパーを用いて細胞をかき取り、少量のＰＢＳ　（ Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ａ）中に収集した。細胞の懸濁液を卓上遠心話中で約２０ Ｏｒｐｍで１０分間回転させた。上溝液の除去後、ペレットを１．０ｍｌのＰＢ Ｓ中に再懸濁し、エッペンドルフ試験管に移した。細胞ペレット再懸濁液を遠心 話中で最高速度でＳ分間回転させた。上溝を除去し、１．０−の５％緩衝化ホル モ−ルー塩溶液で置換し、そして室温で５〜６０分間置い装おいた。固体ペレッ トが液体中に浮いているため、細い注射針を使ってそれを注意深く排除した。少 量のペレットを使って、当業者に公知であるような脱水およびパラフィンワック ス包埋のための常用のプロトコルを実施し、そしてそれを少量のバイオプシーと して処理した。免疫診断用の切片は、標準プロトコルを°使って切断した。

（ｉｉｉ）モノクローナル抗体反応性の評価のための細胞スミアとしてのワクシ ニア感染細胞の調製 予め形成させた標的細胞（１０７以上）の単層を、組換えワクシニアウィルスま たは野性型ワクシニアウィルス（負の対照）で感染させ、感染を８〜１５時間進 行させた。子ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）およびＶｅｒｏ細胞もまた使 用し、理論上は任意の感受性細胞系で十分であろう。感染多重度（ＭＯｒ）は、 必要とする抗原陽性細胞の比率に依存する。５のＭＯＩは１００％十ｖｅ細胞を 生じる。０．１のＭ（ＩＩは１０％＋ｖｅ細胞を生じ、そしてＰｏｌｓｓｏｎ分 布により定義される＋ｖｅ細胞の比率を与えるように最初にＭＯＩを変えること ができる。

テフロン製スクラッパーを用いて培養フラスコから細胞をかき取り、少量のＰＢ Ｓ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ａ）中に収集した。細胞の懸濁液を卓上遠心話中で 約２０００ｒｐｍで５〜１０分間回転させた。上溝液の除去後、洗浄を繰り返し た。最後に、細胞懸濁液を１０’細胞／ｍｊ！の濃度にするのに十分な量のＰＢ Ｓを添加し、そして細胞を再懸濁した。パスツールピペットを使って、１滴の細 胞懸濁液（１００μｍ）をスライドガラス上に載せた。

このスライドは、細胞の接着を確実にするために３−アミノプロピルトリエトキ シシラン（ＡＰＥＳ）で前処理されている。次いで常用の木製またはプラスチッ ク製スパチュラを使って（子宮頚部スミアを採取するために使用）または細菌学 用スワブもしくはループを使って、細胞液滴をスライド上に平らに塗抹した。こ のスミアを９０％（Ｖ／Ｖ）エチルアルコールにより即座に噴霧固定する゛か、 または９０％エチルアルコール中に５分間入れた。それらのスミアを免疫染色す る直前に、５％緩緩衝化シルモール塩溶液中５分間浸し、次いでＰＢＳで２回洗 浄した後、当業者に公知のような免疫染色プロトコルを実施した。本実施例では 、標的としてＢＨＫ−２１（ｖＬＩＲＫで感染された繊維芽細胞）を使った免疫 蛍光アッセイにより、培養上清をＨＰＶ−１６Ｌｌ特異抗体についてスクリーニ ングした。

（ｄ）スクリーニング 記載のようにして調製した、高ＭＯ＋を有する感染細胞を含んで成る切片（また は細胞スミア）を抗体スクリーニングにおける標的として使用した。該切片上で ハイブリドーマ培養上清を室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した 後、結合した免疫グロブリンを、フルオレセイン接合ウサギ抗マウスＩｇＧとの インキュベーションにより検出した。強い核の蛍光に基づいて陽性の培養物を同 定し、そしてこの培養物中の細胞を２回の限界希釈クローニングにかけた。得ら れたハイブリドーマをＣＡＭＶＴＲ−１と命名した。分泌された抗体は、ＶＬＩ ＲＫに感染した細胞の溶解物から約５５．０００の見かけＭｒのタンパク質を免 疫沈澱させることがわかった。このタンパク質は、野性型ウィルスで感染させた 細胞の溶解物からは沈澱されなかった。この見かけＭｒは、約５３．０００のＨ ＰＶ−１６、Ｌ１タンパク質の予想Ｍｒと一致した。該抗体は、ＶＬＩＲＫで感 染させそしてホルムアルデヒドまたはメタノールで固定した細胞の強い核染色（ 免疫蛍光法および／または免疫ペルオキシダーゼ染色法を使った）を与えること もわかった。

ハイブリドーマＣＡＭＶＩＰ−１により生産されたモノクローナル抗体が強い核 染色を与えるという事実は、ＶＬＩＲＫを感染させた細胞により発現されるエピ トープの発現が、臨床試料に日常適用されている操作によって破壊されなかった ことを示す。

組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞材料を、臨床試料に適用するような アッセイ前処理と同等の方法で処理されている標的抗原の入手源として使用する ことによって、要求される特異性を有する診断上有用な抗体の選択が可能になる 。次いで臨床試験品の免疫ペルオキシダーゼ染色により、それらの試験の有効性 を確かめた。抗体ＣＡＭＶＩＰ−１は、ＨＰＶ−１６について陽性であることが 知られている（核酸ハイブリダイゼーションにより評価）バイオプシー切片およ び子宮頚部スミア調製物の細胞核中のＨＰＶ抗原を検出したが、ＨＰＶ−６また はＨＰＶ−１１について陽性であることが知られている試験品においては検圧し なかった。

２、　ＨＰＶ−１６Ｅ７に対するモノクローナル抗体の生産同様なアプローチを 用いて、ＨＰＶ−１６のＥ７タンパク質に対するモノクローナル抗体を生産する 更に２つのハイブリドーマＣＡＭＶＩＰ−２，−３および−４を更に調製した。

ＨＰＶ−１６Ｅ７遺伝子のクローニングおよび発現の詳細は次のようである。

（ａ）β−ガラクトシダーゼ−Ｅ７／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（免 疫原）の調製 ＨＰＶ−１６ＤＮＡのゲノムクローン（５ｅｅｄｏｒｆら、前掲）をＰｓｔｌて 消化し、Ｅ７転写解読枠を含む得られた１７７６　ｂｐ断片（塩基７００３−８ ７５）をｐＬｌｃ１３のＰｓｔ１部位中にクローニングした。得られたプラスミ ドｐＪＳ３２°゛（図５参照）をＰｓｔｌとＮ５ｉｌで消化し、３１３　ｂｐ断 片（ヌクレオチド５６２−８７５）をｐＥｘ−１（Ｓｔａｎｌｅｙ　＆　Ｌｕｚ ｉｏ。

−セーＥ７：ｌ−ド配列を含ｂ　ｐＥＸＥ７を生ぜしめた。ＨＰＶ−１６Ｌｌ融 合タンパク質について記載したようにして、発現生成物を誘導しそして精製した （Ｂｒｏｗｎｅら、前掲）。

（ｂ）　ＨＰＶ−１６Ｅ７モノクローナル抗体の生産１（ｂ）欄においてＨＰＶ −１６Ｌｌ融合タンパク質について記載したようにして、β−ガラクトシダーゼ −Ｅ７融合タンパク質（上記の２（ａ）で調製）を用いてマウスを免疫処置した 。

プラスミドｐＳＪ２　（図５）をＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、Ｐｖｕ　ＩＩで部 分消化した。ｐＵＣ１３のＨｉｎｄＩＩＩ部位から始まりモしてＨＰＶ−１６の ｐｖｕ　ＩＩ部位（ヌクレオチド５５３）で終わる３３５　ｂｐ断片を精製し、 末端修復し、モしてＥ７遺伝子がワクシニア４ｂ後期プロモーニングした（図６ ）。ＣＶ−１細胞のトランスフェクションおよび組換えチミジンキナーゼ陰性ウ ィルスの単離は、Ｌｌ−組換え体の生産について記載したものと同様であった（ ｈｌａｃｋｅｔｔら、前掲）。

ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質を発現する組換えワクシニアウィルスヲ、ＨＰＶ− １６Ｌｌ　ｌ：−ツイテ１　（ｃＸｉｉ）および／または１（Ｃ）（ｉｉｉ）お よび１（ｄ）の欄に記載したようにして使用し、ＨＰＶ−１６Ｅ７に対する診断 上゛有用な抗体を生産させた。スクリーニングにおいて使用する細胞以外はホル マリン中で手短に（即ち１時間未満）固定した。

図７は、診断上有用な抗体の選択のためのスクリーニング方法の使用を概略的に 示す。特定の抗原をコードする遺伝子配列を含む組換えウィルスベクターを用い て真核細胞の試料を感染させる。適当なインキュベーション後、それらの感染細 胞は抗原を生産し、発現し、そして提示する。次いで細胞を収得し、細胞ペレッ トを形成させる。この細胞ペレットを小さい臨床生検材料として処理することが できる（または細胞スミアを調製するための細胞の源として使用することができ る）。切片を取り、診断分析前に臨床試料に通常適用するようにして処理し、更 には感染細胞から作った切片に適用するようにして処理する。それらの処理また は前処理段階は、提示される抗原の性質を変えることがある。それらの前処理段 階は臨床試料に適用されるので、天然に発現される抗原も同様に変えることがあ る。

臨床試験品中に存在すると予想されるであろう形態において抗原に結合する診断 上有用な抗体について調査することができる。抗原−抗体結合は、当業者に周知 の技術により、例えばフルオレセイン、酵素または放射能標識第二抗体を使って 検出される。

着目の抗原をコードする遺伝子配列を含む組換えウィルスベクターにより感染さ せた細胞を含むペレット切片または細胞スミアは、対照とじて有効に診断アッセ イキットに組み入れることができる。この用途では、組換えウィルスベクターで 感染させた細胞は、例えば３％以下の低いＭＯ＋を育するであろう。例えば、対 照は、感染細胞を含む細胞ペレットの切片を担持した電子顕微鏡用スライド等の 形態で提供することができる。該細胞は着目の抗原を提示することが知られてい るものであろう。従って、対照を試験試料と同様に処理すると、対照は着目の抗 原を提示することが知られているため、正の試験結果を生ずるであろう。そのよ うな対照が正の試験結果を生じない場合には、アッセイが不全であり、この試料 について得られたいずれの負の結果も必ずしも真に負であると言えないことを指 摘するだろう。上記に例示した方法は他の抗原および他のウィルスベクターの使 用にも一般に適用可能である。

−一、□ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年９月Ｊ７日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の抗原に結合する能力を有する抗体の生産方法において使用されるスク リーニング法であって、所望の抗体に特異的な抗原を発現する組換えウイルスベ クターで感染させた細胞を用いて前記抗体がスクリーニングされ、そして前記感 染細胞が前記抗原の存在についてアッセイすることになっている臨床試料の調製 に常用される１または複数の操作に最初にかけられることを特徴とするスクリー ニング法。
2. ２．前記ウイルスベクターがワクシニアである、請求項１のスクリーニング法。
3. ３．前記抗原がヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のエピトープを含んで成るポリペ プチドである、請求項１のスクリーニング法。
4. ４．前記エピトープがＨＰＶ−１６ＬＩタンパク質またはＨＰＶ−１６Ｅ７タン パク質中に含まれる、請求項３のスクリーニング法。
5. ５．前記抗体が、適当な宿主生物中で組換えＤＮＡから発現されたタンパク質ま たは合成オリゴペプチドで免疫処置された動物から得られ、前記タンパク質また はオリゴペプチドがウイルスベクターによりコードされるエピトープと相同のエ ピトープを提示する、請求項１のスクリーニング法。
6. ６．臨床試料の調製に常用される操作が、ペレット化、切片化、脱水および固定 のうちの１または複数を含んで成る、請求項１のスクリーニング法。
7. ７．前記スクリーニング法により選択された抗体が、抗原を含むことが知られて いる１または複数の調製した臨床試料に対して更にスクリーニングされる、請求 項１のスクリーニング法。
8. ８．請求項１のスクリーニング法とは異なることができる第一のスクリーニング 操作に抗体をかけることにより該抗体が最初に予備選択される、請求項１のスク リーニング法。
9. ９．前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング法により選択された抗体 を用いて、該抗体が特異的である抗原を提示するタンパク質の存在について臨床 試料をアッセイする診断方法。
10. １０．所望の抗体に特異的な抗原を発現する組換えウイルスベクターにより感染 された細胞を含んで成るスクリーニング材料であって、前記感染細胞が、前記抗 原の存在についてアッセイしょうとする臨床試料の調製に常用される１または複 数の操作にかけられている、スクリーニング材料。
11. １１．請求項１〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング法により選択される 抗体、その誘導体または機能的等価体。
12. １２．抗体が特異的である抗原の存在について臨床試料においてアッセイを実施 するのに必要な１または複数の試薬と共に、 ａ）請求項１１に記載の抗体、その誘導体または機能的等価体；ｂ）所望の抗体 に特異的である抗原を発現する組換えウイルスベクターにより感染させた細胞を 含んで成るスクリーニング材料、 の一方または両方を含んで成る診断キット。
13. １３．前記スクリーニング材料をアッセイのための正の対照として使用すること ができる、請求項１２に記載の診断キット。
14. １４．前記細胞が、前記抗原の存在についてアッセイしょうとする臨床試料の調 製に常用される１または複数の操作に予めかけられている前記スクリーニング材 料を含んで成る、請求項１２に記載の診断キット。
15. １５．前記操作がペレット化、切片化、脱水および固定のうちの１または複数を 含んで成る、請求項１４に記載の診断キット。
16. １６．（ｉ）特定の抗原に特異的な抗体；（ｉｉ）前記抗体を使って臨床試料中 の分析対象を検出するための試薬： （ｉｉｉ）前記抗原を発現する組換えウイルスベクターで感染させた細胞を含ん で成る正の対照の試験品；および（ｉｖ）前記抗体（ｉ）と試験品（ｉｉｉ）中 の抗原との結合を検出するための試薬、 を含んで成る診断キット。
17. １７．前記試薬（ｉｖ）が試薬（ｉｉ）中に含まれている、請求項１６に記載の 診断キット。
18. １８．前記試験品（ｉｉｉ）が臨床試料に適当であるものと同様な方法で処理さ れる、請求項１６に記載の診断キット。
19. １９．前記試験品（ｉｉｉ）が、細胞のペレット化、脱水、固定および切片化並 びに該切片の支持体上への提供の１または複数により調製される、請求項１８に 記載の診断キット。
20. ２０．前記試験品（ｉｉｉ）が、抗原の発現の既知レベルおよび／または抗原を 発現する細胞の既知の比率を有する、請求項１６に記載の診断キット。