KR20220130723A - HBcAg의 검출을 위한 방법 및 항체 - Google Patents

HBcAg의 검출을 위한 방법 및 항체 Download PDF

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KR20220130723A
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지민 첸
준후이 시옹
지아치 리우
샤오주안 왕
쉥시앙 게
콴 유안
리우웨이 송
쑤동 선
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시아먼 이노디엑스 바이오테크 컴퍼니 리미티드
시아먼 유니버시티
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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 검출의 분야에서, 이중 항체 샌드위치 방법을 사용하는 수단에 의해 HBcAg를 검출하기 위한 방법, 및 HBcAg를 검출하기 위한 항체 및 키트가 개시되어 있으며; 또한, 조직 또는 세포 샘플에서 HBcAg의 면역학적 검출에서 사용될 수 있는 단클론 항체를 포함한다.

Description

HBcAg의 검출을 위한 방법 및 항체
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 검출의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이중-항체 샌드위치 방법 사용에 의한 HBcAg의 검출을 위한 방법뿐 아니라, 검출을 위해 사용되는 항체 및 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 조직 또는 세포 샘플의 HBcAg 면역학적 검출을 위해 사용될 수 있는 단클론 항체를 제공한다.
B형 간염 바이러스 감염, 특히 만성 HBV 감염은 전세계적인 가장 중요한 보건 문제 중 하나이다(Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500).
현재, HBV 혈청 마커(예컨대, HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, HBcAb의 B형 간염 혈청학 검사)가 현재 HBV 감염 및 지난 HBV 감염에 대한 일상적인 검출 표준으로서 광범위하게 사용된다. 그러나, 많은 수의 HBV 담체와 조합된 높은 돌연변이율은 HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb 및 HBcAb의 종래의 B형 간염 혈청학 검사에서 부정 오류의 높은 발생을 야기한다. 또한, HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb 및 HBcAb의 B형 간염 혈청학 검사는 바이러스 복제 및 감염성의 정도를 정량적으로 반영할 수 없으며, 보통 의심스럽고 설명하기 어려운 결과를 갖고, 또한 시험된 개체가 HBV로 감염되지 않는지 여부를 직접 결정할 수 없다.
HBV DNA는 HBV 복제의 직접적인 지표이고, 이의 얼룩점 검사(또는 PCR 검사)는 B형 간염 환자 및 HBV 담체에서 감염 및 감염성을 판단하기 위한 금본위제이다. PCR 검사 및 얼룩점 검사 둘 다는 HBV 감염 및 감염성의 직접적인 표지로서 사용될 수 있지만, 이들은 대규모 스크리닝 및 일상적 사용에 적합하지 않다.
HBV DNA와 고도로 관련될 수 있는 모든 혈청 마커 항원(HBV PreS1, HBcAg, HBxAg, DNAP, HBV PreS2 등) 중에서, HBcAg는 HBV DNA와 직접 관련된 항원인 것으로 항상 고려되어 왔으며, HBcAg의 검출은 복제 바이러스의 정량화 및 HBsAg-음성 HBV-감염된 환자 및 HBV 환자의 진단에서 고유한 유의미성을 갖는다. 현재, 시장에서 개발된 특이적 HBcAg 검출 시약은 없다. 보고되었거나 개발되었던 HBcAg 면역진단 시약은 보통 검출 전 샘플의 전처리(바이러스 용해, 막 파열 및 HBcAb 비활성화) 또는 HBcAg-HBcAb 면역 복합체의 검출을 채택하지만; 전자의 방법은 복합적인 절차를 갖고 임상 고객에 의해 받아들여지기 쉽지 않고, 혈액 공여체의 대규모 스크리닝 및 역학 조사에 적합하지 않은 한편, 후자의 방법은 검출 방법의 특수성으로 인해 이상적인 특이성 및 민감성을 달성하기 어렵다. 2006년에, 특허 "Method and diagnostic kit for combined detection of hepatitis B virus pre-S1 antigen and core antigen"에서 바이러스 입자가 HBcAg 검출을 위해 sAg 항체 사용 후, 막 파열, 바이러스의 용해 및 중심 입자에서 cAg의 검출에 의해 포집되었다는 것이 보고되었지만, 이의 민감성은 불만족스러웠다.
단순하고, 정확하고 고도로 민감한 HBcAg 발광성 검출 시약을 개발하는 것은 항바이러스 효능의 평가 및 HBV 환자의 예후에서 시급한 실질적 유의미성을 갖는다.
대규모 실험 조사 후, 본 발명자들은 예상외로 특히 이중-항체 샌드위치 방법에 의한 HBcAg의 검출에 적합한, 특정 에피토프에 결합하는 항체의 쌍을 발견하였다. 이를 기초로 하여, 본 발명자들은 새로운 HBcAg 정량적 검출 키트 및 검출 방법을 개발하였다. 검출 방법은 DNA 방법의 것과 유사한 민감성의 수준에 도달하고 신속 및 고-처리량 검출을 실현하며, 따라서 큰 임상 적용 가치를 갖는다.
키트
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
(i) 제1 항체, 제1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제1 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제1 항체는 HBcAg 단백질의 위치 150-183에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택됨); 및
(ii) 제2 항체, 제2 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제2 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제2 항체는 HBcAg 단백질의 위치 141-154에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택됨)
를 포함하는 키트를 제공한다.
본원에서, 표현 "HBcAg 단백질의 위치 150-183에 함유된 에피토프" 또는 유사한 표현은 에피토프가 HBcAg 단백질의 아미노산 150-183 내에 존재하거나 이와 중첩된다는 것을 의미한다. 다시 말해, HBcAg 단백질의 위치 150 내지 183에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 HBcAg 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 150 내지 183에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
특정 예시적 실시양태에서, HBcAg 단백질은 서열번호 17에 기재된 서열을 갖는다.
특정 실시양태에서, 제2 항체는 HBcAg 단백질의 위치 141-152에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제1 항체는
(i) 서열번호 3에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 4에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 5에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 7에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 8에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나;
(ii) 서열번호 1에 기재된 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 2에 기재된 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되거나;
(iii) 항체가 중국 표준주 수집 센터(China Center for Type Culture Collection)(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019303의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 18B2-2에 의해 생산된 단클론 항체인
항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제1 항체는
(a) (i) 서열번호 1에 기재된 서열; (ii) 서열번호 1에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 1에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
(b) (iv) 서열번호 2에 기재된 서열; (v) 서열번호 2에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 2에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함한다.
특정 실시양태에서, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환은 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 제1 항체는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제2 항체는
(i) 서열번호 11에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 12에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 13에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 14에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나;
(ii) 서열번호 9에 기재된 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 10에 기재된 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되거나;
(iii) 항체가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7에 의해 생산된 단클론 항체인
항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제2 항체는
(a) (i) 서열번호 9에 기재된 서열; (ii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
(b) (iv) 서열번호 10에 기재된 서열; (v) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함한다.
특정 실시양태에서, (ii) 또는 (v)에 기재된 바와 같은 치환은 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 제2 항체는 서열번호 9에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 10에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 마우스 중쇄 불변 영역 및 마우스 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 IgG, IgM, IgE, IgD 또는 IgA 항체이다. 특정 실시양태에서, 제1 항체 및/또는 제2 항체는 IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 이황화-연결된 Fv, scFv, 디아바디, 및 단일 도메인 항체(sdAb)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다.
일부 실시양태에서, 제2 항체는 검출가능한 표지를 보유한다.
다른 실시양태에서, 키트는 제2 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체를 추가로 포함하고, 제3 항체는 검출가능한 표지를 보유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 검출가능한 표지는 형광, 분광, 광화학적, 생화학적, 면역학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 물질일 수 있다. 이러한 표지는 면역학적 검출에 적합한 것(예를 들어, 효소-결합된 면역분석, 방사면역분석, 형광 면역분석, 화학발광 면역분석 등)이 특히 바람직하다. 이러한 표지는 당업계에 잘 알려져 있고, 비제한적으로, 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 우레아제, 글루코오스 옥시다아제 등), 방사성핵종(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(Texas red), 로다민, 퀀텀 닷 또는 시아닌 유도체(예를 들어, Cy7, Alexa 750)), 화학발광 물질(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물), 및 상기 표지에 의해 변형된 아비딘(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합하기 위한 비오틴을 포함한다. 본 발명에 의해 포함되는 표지는 당업계에 알려진 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 섬광 계산기를 사용하여 검출될 수 있고, 형광 표지는 방출된 빛을 검출하기 위한 광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 효소 표지는 일반적으로 효소에 기질을 제공하는 단계 및 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생산된 반응 생산물을 검출하는 단계에 의해 검출된다. 열량 표지는 착색 표지를 간단하게 시각화함으로써 검출된다. 화학발광 물질(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물)은 통상적으로 발광 물질에 촉발제 용액 및/또는 촉매를 제공함으로써 방출된 빛으로 검출된다. 비오틴은 통상적으로 비오틴에 상기 기재된 바와 같은 표지에 의해 변형된 아비딘(예를 들어, 스트렙타비딘)을 제공하는 단계 및 비오틴에 연결된 아비딘에 의해 운반된 표지를 검출하는 단계에 의해 검출된다. 특정 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 검출가능한 표지는 변화하는 길이를 갖는 링커를 통해 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 부착되어, 잠재적 입체 장애를 감소시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 검출가능한 표지는 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 화학발광 시약(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물), 형광 염료, 또는 비오틴으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 키트는 대응하는 검출가능한 표지의 검출을 가능하게 하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지가 효소일 때, 키트는 대응하는 효소에 대한 색소생산성 기질, 예컨대 꽃양배추 퍼옥시다아제에 대해 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸벤지딘(TMB), ABTS 또는 루미놀 화합물; 또는 알칼리 포스파타아제에 대해 p-니트로페닐 포스페이트(p-NPP) 또는 AMPPD를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지가 화학발광 시약(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물)일 때, 키트는 화학발광을 위한 사전-촉발제 용액 및/또는 촉발제 용액을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 키트는 고체 담체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 고체 담체는 웰 플레이트, 시험관, 중합체 물질(예를 들어, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드 또는 셀룰로오스)로 이루어지거나 이로 코팅된 비드(예를 들어, 라텍스 입자) 또는 막(예를 들어, 니트로셀룰로오스 막), 또는 작용기(예를 들어, 아미노, 카복실, 비오틴 또는 아비딘)로 사전-코팅된 자성 비드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 고체 담체는 자성 비드 또는 미량정량판(예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 키트는 고체 담체 상에 제1 항체를 코팅하기 위한 코팅 시약, 예컨대 코팅 버퍼(예를 들어, 카보네이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, Tris-HCL 버퍼, 또는 보레이트 버퍼)를 추가로 포함한다. 고체 담체 상에 단백질 또는 폴리펩티드를 코팅하기 위한 방법은 예를 들어, 물리 흡착, 아미노화되거나 카복실화된 표면을 통한 공유 결합, 또는 아비딘-비오틴 시스템, 폴리스티렌 사전-코팅된 표면, 단백질 A 또는 단백질 G 사전-코팅된 표면에 의해 매개된 결합을 포함하여 당업계에 잘 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 제1 항체는 고체 담체의 표면 상에 코팅된다.
특정 실시양태에서, 키트는 적어도 별도 용기 내 또는 단일 용기 단위의 별도 구획 내의 고체 담체 및 제1 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 키트는 제1 항체, 및 검출가능한 표지를 보유한 제2 항체를 포함한다. 특정 예시적 실시양태에서, 키트는 고체 담체의 표면 상에 코팅된 제1 항체, 및 검출가능한 표지를 보유한 제2 항체를 포함한다. 특정 예시적 실시양태에서, 키트는 1 종 이상의 제1 항체, 및 검출가능한 표지를 보유한 이차 항체을 포함한다. 특정 예시적 실시양태에서, 키트는 고체 담체의 표면 상에 코팅된 1 종 이상의 제1 항체, 및 검출가능한 표지를 보유한 이차 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 더 많은 종류의 제1 항체는 HBcAg 단백질의 위치 150-183에 함유된 상이한 에피토프를 인식한다.
특정 실시양태에서, 키트는 HBV 비리온 용해시키기 위한 용해제를 추가로 포함한다. 본원에서, HBV 비리온 용해시키기 위한 용해제는 데인 입자(Dane particle)를 용해(즉, 바이러스 막을 방해)하여, HBcAg 항원을 노출시킬 수 있는 임의의 약제를 지칭한다. 이러한 약제는 예를 들어, NP40, LDS 또는 SDS와 같은 계면활성제를 포함하여 통상의 기술자에게 알려져 있다.
특정 실시양태에서, 용해제는 LDS 또는 SDS를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 중화제를 추가로 포함하며, 중화제는 CHAPS를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용해제는 20% LDS 또는 20% SDS를 포함한다. 특정 실시양태에서, 용해제는 20% LDS 또는 20% SDS 및 나머지 물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중화제는 10% CHAPS를 포함한다. 특정 실시양태에서, 중화제는 10% CHAPS, 20 mM PBS를 포함한다. 특정 실시양태에서, 중화제는 10% CHAPS, 20 mM PBS, 및 나머지 물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키트는 표준(예를 들어, HBcAg의 상이한 알려진 양을 함유하는 일련의 샘플); 양성 대조군 샘플(예를 들어, HBcAg의 알려진 양을 함유하는 샘플); 음성 대조군 샘플(예를 들어, HBcAg가 없는 샘플); HBV 바이러스를 용해시키기 위한 용해제(및 선택적으로 중화제); 및 시험될 샘플을 수집하거나 저장하기 위한 장치(예를 들어, 혈액 수집 장치)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약 또는 장치를 추가로 포함한다.
항체의 제조
제1 양태에 기재된 제1 항체 및 제2 항체는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해, 예컨대 유전자 공학 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 화학적 합성 또는 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 생성된 DNA 분자는 발현 벡터 내로 삽입된 다음에 숙주 세포 내로 형질주입될 수 있다. 그 다음에, 형질주입된 숙주 세포는 본 발명의 항체를 발현하기 위한 특정 조건 하에 배양될 수 있다.
제1 양태에 기재된 항원-결합 단편은 온전한 항체 분자의 가수분해에 의해 얻어질 수 있다(Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985) 참고). 대안적으로, 이들 항원-결합 단편은 또한 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다(Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11:548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21:364-370 (2000)에서 검토됨). 예를 들어, Fab' 단편은 숙주 세포로부터 직접 얻어질 수 있고; Fab' 단편은 화학적으로 결합되어, F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). 또한, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포의 배양 배지로부터 직접 단리될 수도 있다. 이들 항원-결합 단편을 제조하기 위한 다른 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
따라서, 제2 양태에서, 본 발명은
(i) 제1 항체, 제1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제1 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제1 항체는 제1 양태에서와 같이 정의됨); 및
(ii) 제2 항체, 제2 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제2 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제2 항체는 제1 양태에서와 같이 정의됨)
를 포함하는 키트를 제공한다.
특정 실시양태에서, 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다.
특정 실시양태에서, 제1 항체를 발현하는 재조합 세포는 제1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포이고; 제2 항체를 발현하는 재조합 세포는 제2 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는, 비제한적으로, 원핵 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포, 및 진핵 세포, 예컨대 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO(예를 들어, CHO-K1, CHO-S, CHO DG44)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 항체를 발현하는 재조합 세포는 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019303의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 18B2-2이고; 제2 항체를 발현하는 재조합 세포는 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7이다.
검출 방법 및 용도
제3 양태에서, 본 발명은
(1) 샘플을 제1 항체와 접촉시켜, 항체-항원 복합체를 형성하는 단계로서, 제1 항체가 제1 양태에서와 같이 정의되는 단계;
(2) 항체-항원 복합체를 제2 항체와 접촉시켜, 항체-항원-항체 복합체를 형성하는 단계로서, 제2 항체가 제1 양태에서와 같이 정의되는 단계; 및
(3) 항체-항원-항체 복합체의 양을 결정하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 HBcAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
방법은 진단 목적, 또는 비-진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비-진단 목적을 위해 사용된다. 이러한 실시양태에서, 시험될 샘플은 HBcAg를 함유하는 것으로 알려져 있으며, 즉 샘플의 대상체는 본 발명의 방법에 의한 검출 전에 진단되었고; 따라서, 본 발명의 방법은 샘플의 진단을 돕는 것이 아니다. 따라서, 본 발명의 방법의 직접적인 목적은 샘플의 대상체의 진단 결과를 얻기 위한 것이 아니지만, 알려진 진단 정보로 샘플에 대한 추가의 정확한 정량적 검출을 수행하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 제2 항체는 검출가능한 표지를 보유한다. 특정 실시양태에서, 단계 (3)에 기재된 결정은 (3a) 검출가능한 표지의 양을 검출하는 단계; (3b) 단계 (3a)에서 얻어진 검출가능한 표지의 양을 HBcAg의 알려진 양과 검출가능한 표지의 양 사이의 관계의 표준 곡선과 비교하여, HBcAg의 함량을 얻는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단계 (3)에 기재된 결정은 (3a) 검출가능한 표지의 양(예를 들어, 발광 값)을 검출하는 단계; (3b) 단계 (3a)에서 얻어진 검출가능한 표지의 양(예를 들어, 발광 값)을 컷 오프(Cut off) 값과 비교하고, 비가 1 미만일 때, 샘플이 음성인 것으로 고려되고, 비가 1 이상일 때, 샘플이 HBcAg 양성인 것으로 고려되는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출가능한 표지가 아크리디늄 에스테르 화합물일 때, 컷 오프 값은 9000이다.
다른 실시양태에서, 제2 항체는 검출가능한 표지를 보유하지 않는다. 이러한 실시양태에서, 단계 (3)에 기재된 결정은 검출가능한 표지를 보유한 제3 항체를 사용하여, 항체-항원-항체 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제3 항체는 제2 항체에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 제2 항체의 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있음). 특정 실시양태에서, 단계 (3)에 기재된 결정은 (3a) 항체-항원-항체 복합체를 검출가능한 표지를 보유하는 제3 항체와 접촉시키는 단계; (3b) 검출가능한 표지의 양을 검출하는 단계; (3c) 단계 (3b)에서 얻어진 검출가능한 표지의 양을 HBcAg의 알려진 양과 검출가능한 표지의 양 사이의 관계의 표준 곡선과 비교하여, HBcAg의 함량을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 (3)에 기재된 결정은 (3a) 항체-항원-항체 복합체를 검출가능한 표지를 보유하는 제3 항체와 접촉시키는 단계; (3b) 검출가능한 표지의 양(예를 들어, 발광 값)을 검출하는 단계; (3c) 단계 (3b)에서 얻어진 검출가능한 표지의 양(예를 들어, 발광 값)을 컷 오프 값과 비교하고, 비가 1 미만일 때, 샘플이 음성인 것으로 고려되고, 비가 1 이상일 때, 샘플이 HBcAg 양성인 것으로 고려되는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출가능한 표지가 아크리디늄 에스테르 화합물일 때, 컷 오프 값은 9000이다.
특정 실시양태에서, 검출가능한 표지는 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 화학발광 시약(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물), 형광 염료, 또는 비오틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단계 (3)에서, 결정은 효소 면역분석 또는 화학발광 면역분석으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 단계 (1) 전에, 방법은 샘플을 처치하는 단계를 추가로 포함하고, 처치는 용해제를 샘플과 혼합하여, 바이러스를 용해시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 처치는 중화제로 용해 반응을 종료시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 용해제, 중화제는 제1 양태에서와 같이 정의된다.
특정 실시양태에서, 제1 항체는 고체 담체의 표면 상에 코팅된다. 특정 실시양태에서, 고체 담체는 자성 비드 또는 미량정량판(예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 세척 단계가 단계 (2) 및/또는 단계 (3) 전에 추가로 포함된다. 세척 단계는 미반응된 물질을 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 샘플은 전혈, 혈장, 및 혈청으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 샘플에서 HBcAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 검출 키트의 제조에서 제1 양태에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 키트는 제3 양태에 따른 방법에 의해 샘플에서 HBcAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하기 위해 사용된다.
2A7 mAb 및 이의 용도
조직 또는 세포 샘플의 HBcAg 면역학적 검출(예컨대, 면역조직화학 또는 면역형광)에 현재 사용되는 항-HBcAg 항체는 다클론 항체이다. 다클론 항체는 검출 민감성을 개선할 수 있지만, 보통 단점, 예컨대 높은 백그라운드 및 낮은 특이성, 및 면역조직화학적 결과의 표준화에서의 어려움을 갖는다. 그러나, 조직 또는 세포 샘플에서 HBcAg의 면역학적 검출을 위한 항-HBcAg 단클론 항체의 사용에 대한 보고는 없다.
본 발명자들은 예상외로 조직 또는 세포 샘플에서 HBcAg의 면역학적 검출에 적합한 단클론 항체를 발견하였으며, 단클론 항체에 기초한 검출 효과는 상업적 다클론 항체의 것과 유사한 수준에 도달할 수 있으며, 이는 주목할 만하고, 예상외이며 매우 호의적인 기술 효과이다.
따라서, 제4 양태에서, 본 발명은 또한
(i) 서열번호 11에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 12에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 13에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 14에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나;
(ii) 서열번호 9에 기재된 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 10에 기재된 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되거나;
(iii) 단클론 항체가 세포가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7에 의해 생산된 단클론 항체인,
HBcAg에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
특정 실시양태에서, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
(a) (i) 서열번호 9에 기재된 서열; (ii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
(b) (iv) 서열번호 10에 기재된 서열; (v) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
을 포함한다.
특정 실시양태에서, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환은 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 10에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, 단클론 항체는 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 IgG, IgM, IgE, IgD 또는 IgA 항체이다.
특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 이황화-연결된 Fv, scFv, 디아바디, 및 단일 도메인 항체(sdAb)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 단클론 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화된 항체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 샘플에서 HBcAg를 검출하기 위한 시약의 제조에서 제4 양태에 따른 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플(예를 들어, 조직 절편) 또는 세포 샘플이다.
특정 실시양태에서, 검출은 면역학적 검출이다. 특정 실시양태에서, 면역학적 검출은 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 면역형광(IF) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시양태에서, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 표지를 보유한다.
다른 실시양태에서, 샘플에서 HBcAg를 검출하기 위한 시약은 검출가능한 표지를 보유하는 이차 항체를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 이차 항체는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 불변 영역이 유래되는 종(예를 들어, 마우스)의 항체에 대해 특이적이다.
특정 실시양태에서, 이차 항체는 항-면역글로불린 항체, 예를 들어 항-IgG 항체이다.
특정 실시양태에서, 검출가능한 표지는 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 형광 염료, 또는 비오틴으로부터 선택된다.
특정 예시적 실시양태에서, 면역학적 검출이 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 또는 웨스턴 블롯으로부터 선택될 때, 검출가능한 마커는 효소로부터 선택된다.
특정 예시적 실시양태에서, 면역학적 검출이 면역형광(IF)으로부터 선택될 때, 검출가능한 표지는 형광 염료로부터 선택된다.
용어의 정의
본 발명에서, 달리 나타내지 않는 경우, 본원에 사용된 과학적 및 기술적 용어는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 사용된 바이러스학, 생화학, 및 면역학의 실험실 절차는 모두 대응하는 분야에서 광범위하게 사용하는 일상적 절차이다. 한편, 본 발명의 양호한 이해를 위해, 관련된 용어의 정의 및 설명이 아래에 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "HBcAg"는 뉴클레오캡시드 단백질로도 알려진 B형 간염 바이러스(HBV)의 중심 항원을 지칭하고, 이는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, NCBI GENBANK 데이터베이스 등록 번호: GU357842.1을 참고). HBcAg 단백질은 VLP 어셈블리에 포함되는 이의 N-말단에 어셈블리 영역, 및 이의 C-말단에 아르기닌-풍부 도메인(아르기닌 풍부 도메인(Arginine Rich Domain), ARD)을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, HBcAg의 아미노산 서열을 지칭할 때, 이는 서열번호 17에 기재된 서열을 사용하여 기재된다. 예를 들어, 표현 "HBcAg 의 아미노산 잔기 150-183"은 서열번호 17에 기재된 폴리펩티드의 위치 150-183의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 통상의 기술자는 돌연변이 또는 변이(비제한적으로, 상이한 유전자형 또는 하위유전자형의 HBcAg와 같은 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함함)가 이의 생물학적 기능에 영향을 주지 않으면서 HBcAg의 아미노산 서열에서 자연적으로 생성되거나 인공적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "HBcAg"는 예를 들어, 서열번호 17에 기재된 서열 및 이의 천연 또는 인공 변이체를 포함하는 모든 이러한 서열을 포함할 것이다. 또한, HBcAg의 서열 단편을 기재할 때, 이는 서열번호 17의 서열 단편뿐 아니라, 이의 천연 또는 인공 변이체에서 대응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, 표현 "HBcAg의 아미노산 잔기 150-183"은 서열번호 17의 아미노산 잔기 150-183, 및 이의 변이체(천연 또는 인공)에서 대응하는 단편을 포함한다. 본 발명에 따르면, 표현 "대응하는 서열 단편" 또는 "대응하는 단편"은 최적의 정렬, 즉 최고 비율 동일성을 얻기 위한 서열의 정렬을 위해 비교되는 서열의 동등한 위치에 위치한 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 큰 구형 입자로도 알려진 용어 "데인 입자"는 이중-층 구조를 갖는 온전한 감염성 B형 간염 바이러스 입자를 지칭한다. HBcAg는 보통 데인 입자의 중심에 존재한다. 따라서, HBcAg를 검출하기 위해, 통상적으로 첫번째로 데인 입자의 외부 껍질을 용해시켜, HBcAg가 노출되고 자유로워질 수 있는 것이 필요하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 2 개의 분자(즉, 결합 분자와 표적 분자) 사이의 비-무작위 결합 반응, 예컨대 항체와 그것이 지시되는 항원 사이의 반응을 지칭한다. 2 개의 분자 사이의 결합 친화되는 KD 값에 의해 기재될 수 있다. KD 값은 kd(특정 결합 분자-표적 분자 상호작용의 해리 속도; koff로도 알려짐) 대 ka(특정 결합 분자-표적 분자 상호작용의 결합 속도; kon으로도 알려짐)의 비, 또는 분자 농도(M)로서 표현된 kd/ka로부터 유래된 해리 상수이다. KD 값이 작을수록, 2 개의 분자 사이의 결합은 단단하고 친화도는 높다. 특정 실시양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항원에 대해 특이적인 항체)는 약 10-5 M 미만, 예컨대 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 친화도(KD)로 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. KD 값은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하는 BIACORE 기구에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역학적 분석"은 항원과 항체 사이의 특이적 상호작용/결합 친화도를 이용하는 분석을 지칭하며, 이는 일반적으로 샘플에서 특정 항원 또는 항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 면역학적 분석은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 효소 면역분석(EIA), 화학발광 면역분석(CLIA), 방사면역분석(RIA), 형광 면역분석(FIA), 웨스턴 블롯팅, 면역탁도계법, 표면 플라즈몬 공명법 등을 포함한다. 면역학적 분석의 상세한 설명에 대해, 예를 들어 Fundamental Immunology, Ch. 7 Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, N.Y. (1989)를 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 일반적으로 각각의 쌍이 하나의 경쇄(LC) 및 하나의 중쇄(HC)를 갖는 2 개 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 경쇄는 κ(카파) 및 λ(람다) 경쇄로서 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α, 또는 ε으로서 분류될 수 있고, 따라서 항체의 아이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 3 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 함유한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 면역글로불린과 숙주 조직 또는 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체계 제1 구성요소(C1q)를 포함한 인자의 결합 매개를 나타낸다. VH 및 VL 영역은 또한 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역이 배치되는 높은 가변성의 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭됨)으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다. 각각의 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 항원 결합 부위를 형성한다. 영역 또는 도메인에 대한 아미노산의 할당은 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917의 정의; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883에 의한 정의를 따를 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 결합을 담당하는 항체의 가변 영역에서의 아미노산 잔기를 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 3 개의 CDR을 함유한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 당업계에 아려진 다양한 넘버링 시스템에 따라, 예를 들어 Kabat 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), the Chothia 넘버링 시스템(Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883), 또는 IMGT 넘버링 시스템(Lefranc et al. al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003)에 따라 정의될 수 있다. 항체를 고려하여, 통상의 기술자는 각각의 넘버링 시스템에 의해 정의된 CDR을 용이하게 확인할 것이다. 또한, 상이한 넘버링 시스템 사이의 대응성은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003 참고).
본 발명에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 CDR은 당업계에 알려진 다양한 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 CDR은 바람직하게는 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 함유된 CDR은 바람직하게는 Kabat 넘버링 시스템에 의해 확인된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 상기 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 항체의 가변 영역에서의 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "항체"는 항체를 생산하는 임의의 특정 방법에 의해 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 재조합 항체, 단클론 항체 및 다클론 항체를 포함한다. 항체는 상이한 아이소타입의 것, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgAl, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 단편"은 전장 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 함유하고/하거나 항원에 특이적으로 결합하기 위해 전장 항체와 경쟁하는 전장 항체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 "항원 결합 부분"으로도 지칭된다. 일반적으로, Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989)를 참고하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 항체의 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 항원-결합 단편의 비-제한적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, scFv, 디아바디, 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 선형 항체, 나노바디(기술은 Domantis로부터 제공됨), 및 폴리펩티드에 특이적 항원-결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 조작된 항체 변이체는 Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136에서 검토된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 항체"는 2 개의 "전장 중쇄" 및 2 개의 "전장 경쇄"로 구성된 항체를 지칭한다. 이때, "전장 중쇄"는 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변 영역 CH1 도메인, 힌지 영역(HR), 중쇄 불변 영역 CH2 도메인, 중쇄 불변 영역 CH3 도메인으로 구성된 폴리펩티드 쇄를 지칭하고; 전장 항체가 IgE 아이소타입의 것일 때, 이는 선택적으로 중쇄 불변 영역 CH4 도메인을 포함한다. 바람직하게는, "전장 중쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 구성된 폴리펩티드 쇄이다. "전장 경쇄"는 N-말단에서 C-말단 방향으로 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 폴리펩티드 쇄이다. 2 개 쌍의 전장 항체 쇄는 CL과 CH1 사이의 이황화 결합 및 2 개의 전장 중쇄의 HR 사이의 이황화 결합에 의해 함께 연결된다. 본 발명의 전장 항체는 단일 종, 예컨대 인간으로부터 유래될 수 있으며; 이는 또한 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명의 전장 항체는 동일한 항원을 특이적으로 인식/결합하는 VH 및 VL 쌍에 의해 형성된 2 개의 항원-결합 부위를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fd"는 VH 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "dAb 단편"은 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고(Ward et al., Nature 341:544546 ( 1989)); 용어 "Fab 단편"은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 항체 단편을 지칭하고; 용어 "F(ab')2 단편"은 힌지 영역의 이황화 결합을 통해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭하고; 용어 "Fab' 단편"은 F(ab')2 단편에서 2 개의 중쇄 단편을 연결하는 이황화 결합을 환원시킴으로써 얻어진 단편을 지칭하며, 이는 온전한 경쇄 및 중쇄 Fd 단편으로 구성된다(VH 및 CH1 도메인으로 구성됨).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fv"는 항체의 하나의 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 항체 단편을 의미한다. Fv 단편은 일반적으로 완전한 항원-결합 부위를 형성할 수 있는 최소 항체 단편인 것으로 고려된다. 일반적으로 6 개의 CDR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여하는 것으로 여겨진다. 그러나, 하나의 가변 영역(예를 들어, 3 개의 항원-특이적 CDR만을 함유하는 Fd 단편)만이 온전한 결합 부위에 비해 아마도 낮은 친화도를 갖더라도, 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Fc"는 이황화 결합에 의해 항체의 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역을 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역과 연결함으로써 형성된 항체 단편을 지칭한다. 항체의 Fc 단편은 많은 상이한 기능을 갖지만, 항원 결합에 관여하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "scFv"는 VL 및 VH 도메인을 포함하고, VL 및 VH가 링커에 의해 연결되는 단일 폴리펩티드 쇄를 지칭한다(예를 들어, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 및 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Eds. Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) 참고). 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반 구조를 가질 수 있다. 적합한 선행 기술 링커는 반복된 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들어, 아미노산 서열(GGGGS)4 또는 이의 변이체를 갖는 링커가 사용될 수 있다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). 본 발명에 유용한 다른 링커는 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, described by Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol에 의해 기재되어 있다. 일부 경우에, 이황화 결합이 또한 scFv의 VH와 VL 사이에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 이의 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에 발현되지만, 사용된 링커가 지나치게 짧아, 동일한 쇄의 2 개의 도메인 사이에 쌍을 형성시켜, 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하고 2 개의 항원 결합 부위를 생성하게 한다(예를 들어, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), 및 Poljak RJ et al, Structure 2:1121-1123 (1994) 참고).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-도메인 항체(sdAb)"는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가지며, 이는 전장 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 함유하는 단일 단량체 가변 항체 도메인(예를 들어, 단일 중쇄 가변 영역)으로 구성된 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체는 또한 나노바디로도 알려져 있다.
상술한 항체 단편 각각은 전장 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 함유하고/하거나 항원에 특이적으로 결합하기 위해 전장 항체와 경쟁한다.
항체의 항원-결합 단편(예를 들어, 상기 기재된 항체 단편)은 통상의 기술자에게 알려진 종래의 기술(예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 단편화 방법)을 사용하여 주어진 항체(예를 들어, 본원에 제공된 항체)로부터 얻어질 수 있고, 항체의 항원-결합 단편은 온전한 항체에 대해 사용된 바와 동일한 방식에 의해 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에서, 달리 명확히 나타내지 않는 경우, 용어 "항체"가 지칭될 때, 이는 온전한 항체뿐 아니라, 항체의 항원-결합 단편도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 이의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부가 항체(특정 종으로부터 유래될 수 있거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있음)로부터 유래되는 한편, 이의 경쇄 및/또는 중쇄의 다른 일부가 다른 항체(동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나 동일하거나 상이한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속할 수 있음)로부터 유래되지만, 그럼에도 불구하고, 표적 항원에 대한 결합 활성을 여전히 함유하는 항체를 지칭한다(Cabilly et al.에 대한 USP 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)). 예를 들어, 용어 "키메라 항체"는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 제1 항체(예를 들어, 뮤린 항체)로부터 유래되고 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 제2 항체(예를 들어, 인간 항체)로부터 유래되는 항체(예를 들어, 인간-뮤린 키메라 항체)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된 항체"는 이의 아미노산 서열이 인간 항체의 서열에 대한 상동성을 증가시키도록 변형된, 유전적으로 조작된 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체의 CDR 영역의 전부 또는 일부는 비-인간 항체(공여체 항체)로부터 유래되고, 비-CDR 영역(예를 들어, 가변 FR 및/또는 불변 영역)의 전부 또는 일부는 인간 면역글로불린(수용체 항체)으로부터 유래된다. 인간화된 항체는 일반적으로, 비제한적으로, 항원 특이성, 친화도, 반응성 등을 포함한 공여체 항체의 예상되는 특성을 함유한다. 공여체 항체는 소망하는 특성(예를 들어, 항원 특이성, 친화도, 반응성 등)을 갖는 뮤린, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류(예를 들어, 시노몰구스 원숭이) 항체일 수 있다.
본 발명의 키메라 항체 또는 인간화된 항체는 상기 제조된 뮤린 단클론 항체의 서열을 기초로 하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 표적 뮤린 하이브리도마로부터 얻어질 수 있고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
키메라 항체를 제조하기 위해, 뮤린 면역글로불린 가변 영역은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 면역글로불린 불변 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, VH를 코딩하는 DNA는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결되어, 전장 중쇄 유전자를 얻을 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 이들 영역을 함유하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 일반적으로 바람직하게는 IgGl 또는 IgG4 불변 영역이다. 예를 들어, VL을 코딩하는 DNA는 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결되어, 전장 경쇄 유전자(및 Fab 경쇄 유전자)를 얻는다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고), 이들 영역을 함유하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 κ 또는 λ 불변 영역일 수 있지만, 일반적으로 바람직하게는 κ 불변 영역이다.
인간화된 항체를 제조하기 위해, 뮤린 CDR 영역이 당업계에 알려진 방법을 사용하여 인간 프레임워크 서열 내로 이식될 수 있다(Winter에 대한 미국 특허 제5,225,539호; Queen et al에 대한 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호; 및 Lo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004 참고).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있는 핵산 전달 비히클을 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있을 때, 벡터는 발현 벡터로 지칭된다. 벡터는 이에 의해 운반되는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 형질전환, 형질도입 또는 형질주입에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 비제한적으로, 플라스미드; 파지미드; 코스미드; 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래된 인공 염색체(PAC); 파지, 예컨대 λ 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용될 수 있는 동물 바이러스는, 비제한적으로, 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순포진바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이러스(예를 들어, SV40)를 포함한다. 벡터는, 비제한적으로, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소, 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는, 비제한적으로, 원핵 세포, 예컨대 대장균 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 균류 세포, 예컨대 효모 세포 또는 아스페르길루스(Aspergillus) 등, 곤충 세포, 예컨대 S2 드로소필라(S2 Drosophila) 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예컨대 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 포함하여, 벡터가 도입될 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성"은 2 개의 폴리펩티드 사이 또는 2 개의 핵산 사이의 일치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2 개의 서열이 특정 부위에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브-유닛을 가질 때(예를 들어, 2 개의 DNA 분자 각각이 특정 부위에서 아데닌을 갖거나, 2 개의 폴리펩티드 각각이 특정 부위에서 리신을 가질 때), 2 개의 분자는 상기 부위에서 동일하다. 2 개의 서열 사이의 비율 동일성은 비교를 위한 부위의 총 수에 대한 2 개의 서열에 의해 공유된 동일한 부위의 수 x 100의 함수이다. 예를 들어, 2 개의 서열의 10 개 부위 중 6 개가 일치되는 경우, 2 개의 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, CTGACT 및 CAGGTT의 DNA 서열은 50%(6 개 부위 중 3 개가 일치됨)의 동일성을 공유한다. 일반적으로, 2 개의 서열의 비교는 최대 동일성을 생산하는 방식으로 수행된다. 이러한 정렬은 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Needleman, et al.(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)의 방법을 기초로 한 Align 프로그램(DNAstar, Inc.)을 사용함으로써 수행될 수 있다. 2 개의 아미노산 서열 사이의 비율 동일성은 또한 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2 개의 아미노산 서열 사이의 동일성의 비율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지(available at http://www.gcg.com)에서 GAP 프로그램에 포함된 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드의 예상된 특성에 불리하게 영향을 주지 않거나 이를 변화시키지 않을 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 당업계에 알려진 표준 기술, 예컨대 부위-특이적 돌연변이생성 및 PCR-매개된 돌연변이생성에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 대응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예컨대, 유사한 크기, 형상, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함한 화학적 특성 등을 가짐) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 왔다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 대응하는 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 아미노산 보존적 치환을 확인하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997)을 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함됨).
본원에 포함된 20 개의 종래의 아미노산은 종래의 용법에 따라 쓰여진다. 예를 들어, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))을 참고하며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 본 발명에서, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 동일한 의미를 가지며 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명에서, 아미노산은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 1-글자 및 3-글자 약자로 나타내어진다. 예를 들어, 알라닌은 A 또는 Ala로 나타내어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는, 비제한적으로, 다양한 동물, 특히 포유동물, 예컨대 인간을 포함한다.
유익한 효과
본 발명은 특이적 항체를 기초로 한 HBcAg 검출을 위한 키트, 및 키트를 기초로 하여 수립된 이중-항체 샌드위치 방법을 제공한다. 선행 기술과 비교하여, 본 발명의 기술적 해법은 DNA 방법의 것과 유사한 검출 민감성을 달성할 수 있고, 신속 및 고-처리량 검출을 실현하며, 이는 큰 임상 적용 가치를 갖는다.
또한, 본 발명은 상업적 다클론 항체의 것과 유사한 검출 효과를 갖는, 다양한 조직 또는 세포 샘플에 대한 면역조직화학 및 면역형광과 같은 면역학적 검출의 분야에서 사용될 수 있는 항-HBcAg 단클론 항체를 또한 제공하며, 따라서 광범위한 적용 가능성을 갖는다.
본 발명의 실시양태는 도면 및 실시예를 참고하여 아래에 상세히 기재되지만, 통상의 기술자는 다음 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것보다는 본 발명을 예시하기 위해서만 사용된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 양태는 첨부된 도면 및 바람직한 실시양태의 다음 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명확해질 것이다.
도 1은 상이한 길이의 HBV 항원을 함유한 진핵 발현 플라스미드의 계통도를 나타낸다.
도 2는 일차 항체로서 2A7을 사용한 것에 의한 상이한 길이의 HBV 항원의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다.
도 3은 발명의 효소 면역분석에 의한 상이한 샘플에서의 HBcAg의 검출 결과를 나타낸다.
도 4는 발명의 화학발광 검출 방법과 PCR 검출의 결과 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 5는 HBcAg 면역형광 검출 항체로서 2A7을 사용한 것에 의한 세포 샘플의 면역형광 검출의 결과를 나타낸다.
도 6은 HBcAg 면역조직화학 검출 항체로서 2A7을 사용한 것에 의한 조직 절편의 면역조직화학 검출의 결과를 나타낸다.
서열 정보
본 발명에서 지칭되는 일부 서열의 정보가 아래 표에 기재되어 있다.
Figure pct00001
생물학적 물질의 수탁:
본 발명은 중국 표준주 수집 센터(CCTCC, Wuhan University, Wuhan, China)에 수탁된 다음 생물학적 물질에 관한 것이다:
1) CCTCC NO. C2019303의 수탁 번호, 및 2019년 11월 28일의 수탁 일자를 갖는 하이브리도마 세포주 18B2-2;
2) CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호, 및 2019년 11월 28일의 수탁 일자를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7.
실시예
본 발명은 이제 다음 실시예를 참고하여 기재될 것이며, 이는 본 발명을 예시하지만, 제한하지 않는 것으로 의도된다.
달리 나타내지 않는 경우, 본 발명에서 사용된 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석은 기본적으로 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 FM Ausubel et al., Refined Laboratory Manual for Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995를 지칭하고; 제한 효소를 제품 제조사에 의해 권고된 조건에 따라 사용하였다. 실시예에서 공급처가 나타나지 않은 시약은 전부 당업계의 종래의 시약 또는 상업적으로 이용가능한 시약이다. 통상의 기술자는 실시예가 본 발명을 예시의 방식으로 기재하고 보호되도록 추구되는 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 인식한다.
실시예 1: c183 항원의 제조
1.1 C183 클론(이의 서열을 서열번호 17에 기재하였음)을 구축하고, C183B 항원을 대장균 발현 시스템을 사용함으로써 제조하였다.
1.2 C183 항원의 정제
세균 액체를 수집하고 초음파처리하였으며, 초음파처리 액체를 12,000 rpm 및 10℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 그 다음에, 이를 65℃의 수조에서 20 분 동안 방치시키고, 상청액을 수집하였다.
샘플을 1×PB7.4에 대해 투석한 후, 중압 DEAE-FF 크로마토그래피(GE 배지)가 이어졌다.
돌파 피크 용액(표적 단백질)을 수집한 후, Capto Core700에 의한 정제가 이어졌다. 그 다음에, 제1 샘플 피크를 수집하였다.
실시예 2: 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 제조
2.1 마우스 면역화
2.1.1 면역원의 제조: 면역원은 대장균에서 재조합적으로 발현된 HBcAg(C183 항원) 단백질이었다. 재조합 항원을 0.4 mg/mL로 희석하고, 동등한 부피의 프로인드 보조제(Freund's adjuvant)와 혼합하여, 유중수 에멀션을 형성하였다(혼합물이 완전히 유화되었는지 여부를 판단하기 위한 방법: 혼합물의 작은 방울을 물의 표면 상에 떨어뜨리고, 혼합물이 모인 채 유지되고 분산되지 않은 경우, 이는 실질적으로 균질화된 것으로 고려하였음). 프로인드 완전 보조제를 초기 면역화를 위해 사용한 한편, 불완전 프로인드 보조제를 후속 부스터 면역화에 대해 사용하였으며, 융합 전 72 시간에 최종 부스터 면역화에 대해 보조제를 첨가히지 않았다.
2.1.2 마우스의 기본 면역화: 6-8 주령 BALB/c 암컷 마우스를 상기 면역원을 갖는 피하 다중-지점 주사에 의해, 500 μL/마우스/시간의 주사 용량으로 면역화하고, 후기 역가 결정을 위해 각각의 면역화 전에 200 μL의 눈 정맥 혈액을 수집하였다. 부스터 면역화가 2 주마다 주어졌다. 혈청 역가를 간접 ELISA에 의해 측정하였다. 마우스의 혈청 역가가 안정기에 도달하였을 때, 면역화를 중지하고 마우스를 융합 전에 2 개월 동안 휴지시켰다.
2.1.3 융합 전 72 시간의 부스터 면역화(최종 부스터): 마우스 비장 세포 및 마우스 골수종 세포의 융합 전 72 시간에, 비장의 부스터 면역화를 수행하였다. 이 부스터를 위한 면역원은 보조제를 함유하지 않았으며, 100 μL의 0.5 mg/mL 재조합 단백질을 주사하였다. 비장 면역화 전에, 마우스를 에테르로 마취시킨 다음에, 복부 피부를 개방하여, 비장을 노출시키고, 100 μL의 항원을 비장의 길이 방향을 따라 주사한 다음에, 복부 절개를 신속하게 봉합하였다.
2.2 융합 하이브리도마의 제조 및 스크리닝
융합 전 72 시간의 부스터 면역화 후, 마우스 비장을 채취하여, 세포 현탁액을 제조하고 마우스 골수종 세포 Sp2/0과 융합시켜, 하이브리도마 세포를 얻었다. 배양보조 세포를 이것 전에 제조하였다. 하이브리도마 세포의 배양 동안, 융합 후 많은 수의 골수종 세포 및 비장 세포가 1640-HAT 배지에서 차례로 사멸하였고, 단일 세포 또는 몇몇 산재된 세포는 생존하기 쉽지 않았으므로, 이들이 생존하도록 다른 세포를 첨가해야 한다. 첨가된 생존 세포를 배양보조 세포로 지칭하였다. 이 실험실에서, 마우스 복막 대식세포 또는 13 일령 마우스 흉선세포를 배양보조 세포로서 사용하였다.
2.2.1 마우스 대식세포의 제조: 이를 다음 단계에 따라 수행하였다: (i) 한마리의 6 주령 BALB/c 마우스를 목을 늘림으로써 사망시키고, 수돗물로 세정하고, 75% 에탄올 용액에 5 분 동안 담그고; 마우스를 복부가 상향을 대면하게 하여 매우 깨끗한 작업대 상에 위치시키고; 마우스의 복부 피부를 핀셋으로 들어올리고, 작은 절단부를 만들고, 피부를 큰 핀셋으로 상향 및 하향으로 찢어, 복부를 완전히 노출시키고; (ii) 복막을 멸균 안과 겸자로 들어올린 다음에, 적절한 양의 배양 배지를 5 mL 시린지로 복강 내에 주사하고, 마우스의 다리를 다른 멸균 눈 겸자로 약간 들어올리고, 배양 배지를 시린지를 사용하여 최종적으로 흡입하고 원심분리관 내에 위치시키고; (iii) 복막 세포액을 HAT 배지 또는 HT 배지에 용해시켜, 2×105/mL의 농도의 대식세포 배양보조 세포를 형성하고; (iv) 이를 웰 당 0.1 mL로 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, 항온처리기에서 배양하거나; 이를 또한 융합된 세포와 직접 혼합하고 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였다.
2.2.2 마우스 흉선세포의 제조: 이를 다음 단계에 따라 수행하였다: (i) 한마리의 13 일령 BALB/c 마우스를 목을 늘림으로써 희생시키고, 수돗물로 세정하고, 75% 에탄올 용액에 5 분 동안 담그고; 마우스를 복부가 상향을 대면하게 하여 매우 깨끗한 작업대 상에 위치시키고; (ii) 마우스 복부 피부를 겸자로 들어올리고, 복부 및 흉곽의 외부 피부를 절단하고; (iii) 흉강을 다른 쌍의 깨끗한 가위로 개방하고, 유백색 흉선을 핀셋으로 꺼내고, 200-메시 세포 체를 통해 균질화 및 여과시켜, 흉선 배양보조 세포액을 얻었다.
2.2.3 마우스 골수종 세포의 제조: 이를 다음 단계에 따라 수행하였다: (i) 마우스 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14(Sp2/0)는 배양하기 쉬웠으며 높은 융합 속도를 가졌으므로, 현재 가장 이상적인 융합 세포였지만, Sp2/0 하이브리도마 세포주는 NS-1에 비해 배양 조건에 더욱 민감하였고 과도한 희석(3×105/mL 미만의 밀도) 및 알칼리 pH(7.3 초과의 pH)의 조건에서 열악한 성장을 가졌고; (ii) 대수생장기의 세포를 융합을 위해 선택하고; (iii) 융합 전에, 골수종 세포를 배양 플라스크로부터 원심분리관으로 옮기고, RPMI-1640 배지로 3 회 세척하고(1000 rpm×5 분); 세포를 RPMI-1640 배지에서 재현탁하고 계수하였고; (iv) 일반적으로, 마우스 골수종 세포를 융합 전 5 일에 소생시켜야 했고, 35 cm2 Sp2/0 세포의 약 6 개 플라스크가 각각의 융합을 위해 필요하였다.
2.2.4 면역 비장세포의 제조: 이를 다음 단계에 따라 수행하였다: (i) 융합을 위해 BALB/C 마우스를 안구를 제거한 후 유혈에 의해 희생시키고, 수집된 혈액 샘플을 항혈청으로 제조하였으며, 이를 항체 검출을 위한 양성 대조군으로서 사용할 수 있었다. 마우스를 수돗물로 세정하고, 75% 에탄올 용액에 5 분 동안 담근 다음에, 우측 옆구리 위치로 매우 깨끗한 작업대에서 마우스 박리 보드 상에 위치시켰다. (ii) 복강을 무균성으로 개방하고, 비장을 꺼내고, 가위로 작은 조각으로 절단하고 200-메시 세포 스크린 상에 위치시킨 다음에, 그라인딩 봉(시린지의 내부 중심)으로 짜고 갈고, 동시에 피펫으로 RPMI-1640 배지를 적가하였다. (iii) 적절한 양의 RPMI-1640 배양 배지를 보충하고, 3-5 분 동안 방치시키고, 2/3의 상부 현탁액을 50 mL 플라스틱 원심분리관으로 옮기고; 상기 과정을 2-3 회 반복하였다. (iv) 세포를 RPMI-1640 배지로 3 회 세척하였다(1000 rpm × 10 분). (v) 세포를 RPMI-1640 배지에서 재현탁하고 계수하였다.
2.2.5 PEG-투약된 융합에 의한 하이브리도마의 제조: 이를 다음 단계에 따라 수행하였다: (1) 융합 전에, 1 mL의 PEG-1500, 10 mL의 RPMI-1640 무혈청 배지 및 200 mL의 완전 배지를 37℃로 예비-가열하고; (ii) 제조된 골수종 세포 및 비장 세포를 50 mL 원심분리관에서 혼합하고(1×108 비장 세포 + 1×107 골수종 세포, 약 10:1), 1500 rpm에서 8 분 동안 원심분리하고; 원심분리 후, 관의 바닥을 부드럽게 털어, 세포를 느슨하게 하여, 페이스트를 형성하고; (iii) 0.8 mL(1×108 비장 세포 + 0.8 mL PEG)를 1 mL 피펫으로 원심분리관 내에 첨가하고, 첨가하는 동안 부드럽게 교반하고, PEG를 평균적으로 60 초 이내에 첨가한 다음에, 37℃에서 예비-가열된 RPMI-1640의 완전 배지 10 mL를 부드러운 교반 하에 첨가하고; 최종적으로, RPMI-1640 배지를 40 mL로 보충하고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고; (iv) 상청액을 폐기하고, 소량의 HT 배지를 첨가하여, 세포를 신중하게 분산시키고, 세포를 제조된 HT 배지 내로 옮기고, 웰 당 0.1 mL로 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하고, CO2 항온처리기에서 배양하고; (v) 12 시간 후, 적절한 양의 HAT 완전 배지를 제조하고, 웰 당 0.1 mL로 각각의 웰에 적가하고; 5 일 후, HT 완전 배지를 사용하여, 웰에서 50% 내지 100% 세포 상청액을 교체하고; 약 9 내지 14 일 후, 상청액을 검출을 위해 수집하였다.
2.2.6 하이브리도마의 스크리닝: 간접 ELISA를 스크리닝을 위해 사용하고, 100 ng/mL 재조합 항원을 이용한 코팅을 웰 당 0.1 mL로 수행한 다음에, 50 uL의 상청액을 검출을 위해 첨가하고, 양성 클론 웰을 선택하였다.
2.2.7 하이브리도마 세포의 클로닝: 한계 희석법을 사용함으로써, 세포를 첫번째로 특정 농도에 따라 연속으로 희석한 다음에, 96-웰 세포 배양 플레이트의 각각의 웰 내로 접종하여, 하나의 세포만을 가능한 많이 웰에서 성장시켰으며; 하이브리도마의 양성 클론은 일반적으로 100% 양성이 되고 안정적인 클론으로서 확인될 때까지 2-3 회 클로닝시킬 필요가 있었다.
2.3 단클론 항체 복수의 생산
2-3 BALB/c 마우스에 복강 내로 0.5 mL의 액체 파라핀 오일을 주사하였다. 1 주 후, 대수생장기의 하이브리도마 세포를 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 하이브리도마 세포를 무혈청 배지로 현탁하고, 세포의 수를 (1-2)×106/mL로 조정하고, 0.5 mL의 세포를 복막내로 각각의 마우스에 주사하였다. 7-10 일 후, 마우스의 복부는 확실히 확장되었고, 마우스를 목을 늘림으로써 희생시키고, 수돗물로 세정하고, 75% 에탄올에 5 분 동안 담그고, 마우스의 다리를 복부가 상부를 대면하게 하여 마우스 박리 테이블 상에 주사 바늘로 고정하였다. 마우스의 복부 피부를 핀셋으로 들어올리고, 작은 개구를 절단에 의해 만든 다음에, 절개를 마우스의 양측 측면으로부터 등으로 절단함으로써 만들고, 피부를 큰 핀셋으로 위아래로 찢어, 복부를 완전히 노출시켰다. 복막을 멸균 안과 겸자로 들어올리고, 작은 틈을 복막의 중앙에 만든 다음에, 1 mL 피펫을 사용하여, 작은 틈을 통해 복강 내의 모든 복수를 꺼내었다. 수집된 복수를 혼합하고 원심분리관에서 3000 rpm에서 20 분 동안 원심분리할 수 있었다. 상청액을 원심분리 후 수집하였다.
2.4 단클론 항체 복수의 정제
정제된 단클론 항체를 암모늄 설페이트 침전 및 단백질 A 친화도 크로마토그래피(GE, USA로부터 구매함)에 의한 정제에 의해 얻었다.
다음 단클론 항체를 상기 방법에 의해 얻었다: 1B11, 2A7, 6E1, 14C6, 18B2-2, 14C7, 5H4, 1F9. 이들 중, 얻어진 하이브리도마 세포주 2A7 및 18B2-2를 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 상기 기재된 바와 같이 수탁하였다.
실시예 3: 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 시험관내(in vitro) 에피토프 확인
3.1 펩티드 합성
기준 서열로서 HBV 서열 GenBank ID: CAA59669.1을 사용하여, 31 개의 폴리펩티드를 합성하였다(Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd.에 위탁함). 이들 31 개의 폴리펩티드(s1 내지 s31)는 함께 HBcAg의 전장 183 개 아미노산을 커버하였다. S1 내지 S31의 폴리펩티드 정보를 아래 표 1에 나타내었으며, HBcAg의 전장 아미노산 서열을 GenBank: GU357842.1에 기재하였다.
Figure pct00002
3.2 폴리펩티드 S1 내지 S31을 이용한 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 반응성의 분석
3.2.1 반응 플레이트의 제조
폴리펩티드를 pH 9.6의 50 mM CB 버퍼(NaHCO3/Na2CO3 버퍼, 최종 농도 50 mM, pH 9.6)로 5 ㎍/mL의 최종 농도로 희석하고; 100 μL의 코팅액을 96-웰 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 코팅을 2-8℃에서 16-24 시간 동안 및 그 다음에, 37℃에서 2 시간 동안 수행하고; 세척을 PBST 세척액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20)으로 1 회 수행하고; 그 다음에, 200 μL의 차단액(pH 7.4를 갖는 20% 소혈청 및 1% 카세인을 함유한 20 mM Na2HPO4/NaH2PO4 완충액)을 각각의 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 차단을 위해 37℃에서 방치시키고; 차단액을 폐기하였다. 건조 후, 이를 추후 사용을 위해 2-8℃에서 알루미늄 포일 백(bag)에 저장하였다.
3.2.2 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 ELISA 검출
2.1에서 얻어진 항-HBcAg 마우스 단클론 항체를 정량적 ELISA 검출을 위해 20% 갓난 소혈청을 함유한 PBS 용액으로 1 ㎍/mL로 희석하였다.
샘플 반응: 폴리펩티드로 코팅한 36 개 ELISA 플레이트를 취하고, 각각의 웰에 100 μL의 희석된 샘플을 첨가하고, 항온처리기에 위치시켜, 37℃에서 30 분 동안 반응시켰다.
효소 표지 반응: 샘플 반응 단계가 완료된 후, ELISA 플레이트를 PBST 세척액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20)으로 5 회 세척하고, HRP-표지된 염소-항-마우스 IgG(GAM)의 100 μL 반응액을 각각의 웰에 첨가하고, 항온처리기에 위치시켜, 37℃에서 30 분 동안 반응시켰다.
발색 반응: 효소 표지 반응 단계가 완료된 후, ELISA 플레이트를 PBST 세척액(20 mM PB7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20)으로 5 회 세척하고, 50 μL의 TMB 발색제(Beijing Wantai Bio-pharmaceutical Co., Ltd.로부터 구매함)를 각각의 웰에 첨가하고, 항온처리기에 위치시켜, 37℃에서 15 분 동안 반응시켰다.
반응의 종료 및 판독 값의 측정: 발색 반응 단계가 완료된 후, 50 μL의 정지액(Beijing Wantai Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 구매함)을 ELISA 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 각각의 웰의 OD450/630 값을 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
36 종류의 폴리펩티드와 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 반응성의 판단: 판단을 반응 후 판독 값에 따라 수행하였다. 측정된 값/백그라운드 값의 비가 5 초과인 경우, 이를 양성으로서 판단하였다.
3.2.3 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 인식 특성의 분석
결과를 표 2에 나타내었다. 얻어진 항-HBcAg 마우스 단클론 항체의 인식 유형을 소위 sA, sB, sC, sD, sE의 5 개 그룹으로 나눌 수 있었으며(이들의 인식 특성에 따름), 이들 중 sA 그룹 항체에 의해 인식된 폴리펩티드는 S29/S30이었고, 이때 2A7, 14C6, 및 14C7이 sA 그룹에 속하였고; sB 그룹 항체에 의해 인식된 폴리펩티드는 S31이었고, 이때 1F9 및 18B2-2가 sB 그룹에 속하였고; sC 그룹 항체에 의해 인식된 폴리펩티드는 S1이었고; sD 그룹 항체에 의해 인식된 폴리펩티드는 s26, s27이었고; sE 그룹 항체에 의해 인식된 폴리펩티드는 s15 및 s16이었다.
Figure pct00003
대응하는 애피토프를 이용한 항체 2A7, 18B2-2의 검출 결과를 표 3에 나타내었으며, 이는 2A7의 에피토프가 141-152aa에 있었고, 18B2-2의 에피토프가 150-183aa에 있었다는 것을 나타내었다.
Figure pct00004
실시예 4: 생체내(in vivo) 에피토프 확인
4.1 진핵 플라스미드 구축
HBV 유전자의 HBcAg 서열 및 이의 N-말단에서 -29 내지 -1의 서열로 구성된 총 222 개 아미노산을 갖는 단편에서의 서열을 진핵 발현 벡터(EHRP 벡터, 시아먼 대학의 국립 감염병 진단 시약 연구 센터 및 백신 공학 기술 연구 센터로부터 얻어짐)에서 CMV 프로모터의 후방에 구축하였고, 이의 구조의 계통도를 도 1에 나타내었으며, 이때 C149 내지 C183은 각각 C-말단으로부터 수에 대응하는 아미노산 위치로 절단된 HBcAg 서열(+1 위치로부터 출발함)을 지칭하고, pca-C183은 -29 내지 183 단편을 지칭하고, pcb-C183은 -20 내지 183 단편을 지칭하고, pcc-C183은 -10 내지 183 단편을 지칭하였다.
4.2 진핵 발현 및 웨스턴 블롯 평가
293β5 세포를 6-웰 플레이트에 위치시키고, 세포 밀도가 부착 12 시간 후 약 80-90%에 도달하였을 때, 형질주입을 수행하고, 구축된 진핵 발현 플라스미드를 lipo3000 형질주입 시약을 사용하여 293β5 세포 내로 형질주입하였다. 배지(DMEM+10% Gibco FBS)를 이용한 교체를 형질주입 후 12 시간에 수행하고, 배양을 48 시간 동안 계속하였다. 세포 상청액을 폐기하고, 세포를 PBS로 1 회 세척하고, 300 μL의 세포 용해액을 각각의 웰에 첨가하고 4℃에서 1 시간 동안 방치시켜, 용해를 수행하였다. 용해물을 1.5 mL EP 관에 수집하고, 12000 rpm에서 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 1.5 mL EP 관에 수집하고, 용해된 샘플을 웨스턴 블롯 분석을 거쳤다(이차 항체는 염소-항-마우스-HRP였고, proteintec company로부터 구매함).
4.3 결과의 분석
단클론 항체를 생체내 진핵 발현에 의해 구축된 상이한 길이의 항원을 사용하여 평가하고, 결과를 도 2에 나타내었다. 결과는 2A7-21의 인식 부위가 141-152aa이었다는 것을 입증하였다.
실시예 5: 이중 항체-샌드위치 방법에서 자성 비드-코팅된 단클론 항체 및 아크리디늄 에스테르-표지된 단클론 항체의 스크리닝
이 실시예에서, 종래의 이중 항체-샌드위치 방법의 실험 조건을 채택하여, 자성 비드를 코팅하기 위한 단클론 항체 및 아크리디늄 에스테르를 이용한 표지를 위한 단클론 항체의 최적의 쌍을 스크리닝하였다.
5.1 HBcAg 자성 비드-코팅된 단클론 항체의 제조
자성 미립자 용액을 제조하였으며, 자성 미립자는 1.5-3 um의 입자 크기를 갖는 표면 상에 친수성 중합체 및 카복실기로 코팅된 자성 비드였다. 제조 방법은 다음과 같았다: 1:1:1의 질량비의 자성 미립자, EDC 및 NHS에 pH 5.0을 갖는 50 mM MES 용액을 첨가하여, 자성 미립자의 농도가 4 mg/mL가 되게 하였다. 그 다음에, 이를 25℃의 환경 온도에서 20 분 동안 활성화를 위해 수직 회전기 상에 로딩하였다. 항-HBcAg 단클론 항체 15 ㎍/자성 미립자 mg의 비의 활성화된 자성 미립자 및 항-HBcAg 단클론 항체를 표지를 위해 수직 회전기 상에 로딩하고, 반응을 25℃의 환경 온도에서 3 시간 동안 수행하였다. 반응 후 자성 미립자를 세척액으로 3 회 세척한 다음에, 글리신, 0.5% 소혈청 알부민 및 0.05% Triton X-100을 함유한 pH 7.4의 인산염 버퍼를 첨가하여, 자성 미립자가 4 mg/mL의 농도를 갖게 하고, 25℃의 반응 온도에서 2 시간 동안 종료를 위해 수직 회전기 상에 로딩하였다. 종료 후 자성 미립자를 세척액으로 3 회 세척하고, 0.5%(W/V) 소혈청 알부민, 0.5%(W/V) 카세인, 0.05%(W/V) Triton X-100, 및 보존제를 함유한 pH 7.4의 인산염 버퍼를 첨가하여, 자성 미립자가 4 mg/mL의 농도를 갖게 하고, 추후 사용을 위해 2-8℃에서 저장하였다.
aa150-183을 인식하는 단클론 항체(18B2-2, 1F9)를 상술한 방법에 따라 MS300 자성 비드로 코팅하여, 자성 미립자 용액을 제조하였다.
5.2 HBcAg 아크리디늄 에스테르-표지된 단클론 항체의 제조
아크리디늄 에스테르-표지된 항체 용액을 제조하였으며, 제조 방법은 다음과 같았다: 표지될 50 ug의 항-HBcAg 단클론 항체에 NaCl-함유 인산염 버퍼를 첨가하여, 300 μL의 부피에 도달시킨 다음에, 5 μL의 아크리디늄 에스테르 저장액을 첨가하고, 진탕하고 혼합하고, 반응을 암실에서 실온에서 30 분 동안 수행하고; 반응 후, NaCl 및 글리신을 함유한 200 μL의 인산염 버퍼를 첨가하고, 20 분 동안 수동으로 위아래로 뒤집음으로써 혼합하고, 반응을 실온에서 30 분 동안 암실에서 수행하고; 반응 후, 생산물을 투석 백으로 옮기고, pH 7.4의 20 mM PBS 버펴였던 투석물에 대해 2-8℃에서 암실에서 투석하고, PBS 버퍼를 총 3 회 동안 2 시간마다 교환하여, 비표지된 아크리디늄 에스테를 제거하고; 표지된 생산물에 실제 부피에 따라 10%(W/V) 소혈청 알부민을 첨가하여, 소혈청 알부민이 0.1%(V/V, 1:100)의 최종 농도를 가진 다음에, 동등한 부피의 글리세롤을 첨가하고, 수동으로 위아래로 뒤집음으로써 혼합하고, 추후 사용을 위해 암실에서 -15℃에서 저장하였다.
6 개의 HBcAg 단클론 항체(1B11, 2A7, 6E1, 14C6, 14C7, 5H4)를 상술한 방법에 의해 아크리디늄 에스테르로 표지하였다.
5.3 실험 방법
5.3.1 샘플:
HBV 바이러스 양성(PCR 검출) 임상 혈청 샘플을 제공하고, 20% NBS로 희석하여, 1*107, 1*106, 1*105, 1*104, 1*103의 상이한 DNA 로드에 도달하여, 검출을 위한 양성 샘플을 얻었고; HBV 바이러스 음성(PCR 검출) 임상 혈청 샘플을 또한 제공하였다.
5.3.2 로딩 샘플:
25 uL 샘플에 12.5 uL의 20% LDS를 첨가하고, 혼합한 다음에, 37℃에서 30 분 동안 항온처리하였다. 30 uL의 10% CHAPS를 첨가하고 혼합하여, 중화시킨 다음에, 50 uL의 자성 비드-코팅된 단클론 항체를 첨가하고 37℃에서 15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리가 완료된 후, 세척을 0.05~0.08% Tween 20을 함유한 인산염 버퍼로 수행한 다음에, 50 uL의 아크리디늄 에스테르-표지된 단클론 항체를 첨가하고, 진탕하고 혼합하고, 37℃에서 10 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세척을 0.05~0.08% Tween 20을 함유한 인산염 버퍼로 수행하고, 100~200 uL의 사전-촉발제 용액을 첨가하여, 사전-촉발을 수행하였다. 사전-촉발제 용액을 제거한 후, 100~200 uL의 촉발제 용액을 첨가하여, 촉발 및 검출을 수행하였다.
각각의 아크리디늄 에스테르-표지된 단클론 항체와 페어링된(paired) 각각의 자성 비드-코팅된 단클론 항체의 직교 검출을 상술한 방법에 의해 수행하고, P/N(양성 샘플의 평균 값 대 음성 샘플의 평균 값의 비)을 계산하였다. 결과를 아래 표에 나타내었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
표 4-1 및 4-2는 자성 비드를 코팅하기 위해 HBcAg aa150-183를 인식한(즉, HBcAg의 아르기닌 풍부 도메인(ARD)을 인식한) 항체를 사용하고 표지 항체로서 HBcAg의 1-149aa에서 상이한 에피토프를 인식한 단클론 항체를 사용함으로써 상이한 DNA 로드를 갖는 샘플의 검출 결과(P/N>3은 양성을 나타냄)를 나타내었다. 결과는 HBcAg 141-154aa 에피토프를 인식한 3 개의 항체(2A7, 14C6, 14C7)를 표지 항체로서 사용하였을 때, 상이한 HBV DNA 로드를 갖는 샘플의 검출 효과가 다른 항체 쌍의 것에 비해 상당히 양호하였다는 것을 나타내었다.
실시예 6: HBcAg를 검출하기 위한 효소 면역분석 및 검출 시약
단클론 항체 18B2-2를 인산염 버퍼(20 mmol/LPB, pH 7.4)로 희석하고 폴리비닐 클로라이드 플레이트 상에 코팅하고, 단클론 항체 2A7을 꽃양배추 퍼옥시다아제(Beijing Wantai Bio-pharmaceuticals, Co., Ltd.)로 표지하였다. 시험될 샘플은 1 ug/mL의 농도를 갖는 C183 항원 희석액, 1 ug/mL의 농도를 갖는 C149 항원(시아먼 대학의 국립 감염병 진단 시약 실험실 및 백신 공학 기술 연구 센터에 의해 개발됨) 희석액, 양성 샘플 1/2, 음성 샘플 1/2, 및 20% nbs를 포함하였다.
샘플을 실시예 5에서와 동일한 방법으로 처치하여, 바이러스를 용해시켰다. 이어서, 2A7-HRP(1/500 희석액)를 첨가하고 40 분 동안 항온처리하고, 플레이트를 5 회 세척하고, 색원체 용액 A 및 B(Beijing Wantai Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.) 각각 50 uL를 첨가하고 15 분 동안 항온처리하였다. 최종적으로, 정지액(2M H2SO4)을 첨가하고, 부드럽게 진탕하고 잘 혼합하고, 450-620의 파장에서의 값을 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 결과를 도 3에 나타내었으며, 발명의 효소 면역분석 검출 시약은 HBcAg를 특이적으로 검출할 수 있었으나, c149(즉, HBeAg)를 검출하지 않았으며, 이는 그것이 양호한 특이성을 가졌다는 것을 나타내었다.
실시예 7: HBcAg를 검출하기 위한 화학발광 검출 방법 및 시약
7.1 검출 키트의 제조
7.1.1 자성 비드-코팅된 단클론 항체의 제조
자성 미립자는 1.5-3 um의 입자 크기를 갖는 표면 상에 친수성 중합체 및 카복실기로 코팅된 자성 비드였다. 이의 제조 방법은 다음과 같았다: 1:1:1의 질량비의 자성 미립자, EDC 및 NHS에 pH 5.0의 50 mM MES 용액을 첨가하여, 자성 미립자가 4 mg/mL의 농도를 갖게 한 다음에, 25℃의 환경 온도에서 20 분 동안 활성화를 위해 수직 회전기 상에 로딩하였다. HBcAg 단클론 항체 15 ug/자성 미립자 mg의 비의 활성화된 자성 미립자 및 18B2-2 단클론 항체를 표지를 위해 수직 회전기 상에 로딩하고, 반응을 25℃의 환경 온도에서 3 시간 동안 수행하였다. 반응된 자성 미립자를 세척액으로 3 회 세척하고, 글리신, 0.5% 소혈청 알부민 및 0.05% Triton X-100을 함유한 pH 7.4의 인산염 버퍼를 첨가하여, 자성 입자가 4 mg/mL의 농도를 갖게 하고, 25℃의 반응 환경 온도에서 2 시간 동안 종료를 수행하기 위해 수직 회전기 상에 로딩하였다. 종료 후 자성 입자를 세척액으로 3 회 세척하고, 0.5%(W/V) 소혈청 알부민, 0.5%(W/V) 카세인, 0.05%(W/V) Triton X-100, 및 보존제를 함유한 pH 7.4의 인산염 버퍼를 첨가하여, 자성 미립자가 4 mg/mL의 농도를 갖게 하고, 추후 사용을 위해 2-8℃에서 저장하였다.
7.1.2 아크리디늄 에스테르-표지된 단클론 항체의 제조
제조 방법은 다음과 같았다: 표지될 50 ug의 2A7 단클론 항체에 NaCl을 함유한 인산염 버퍼를 첨가하여, 300 μL의 부피에 도달시킨 다음에, 5 μL의 아크리디늄 에스테르 저장액을 첨가하고, 진탕하고 잘 혼합하고, 반응을 실온에서 30 분 동안 암실에서 수행하였다. 반응 후, NaCl 및 글리신을 함유한 200 μL의 인산염 버퍼를 첨가하고, 20 분 동안 수동으로 위아래로 뒤집음으로써 혼합하고, 반응을 실온에서 30 분 동안 암실에서 수행하였다. 반응 후, 생산물을 투석 백으로 옮기고, pH 7.4의 20 mM PBS 버펴였던 투석물에 대해 2-8℃에서 암실에서 투석하고, PBS 버퍼를 총 3 회 동안 2 시간마다 교환하여, 비표지된 아크리디늄 에스테를 제거하였다. 표지된 생산물에 실제 부피에 따라 10%(W/V) 소혈청 알부민을 첨가하여, 소혈청 알부민이 0.1%(V/V, 1:100)의 최종 농도를 가졌고, 동등한 부피의 글리세롤을 첨가하고, 수동으로 위아래로 뒤집음으로써 혼합하고 추후 사용을 위해 암실에서 -15℃에서 저장하였다.
7.2 검출 방법
1. 제조: 7.1에서 얻어진 키트를 방치시키고 실온(18-30℃)에서 15-30 분 동안 평형시켰다.
2. 액체 제조: 50 mL의 농축된 세척액(20X)을 추후 사용을 위해 증류수 또는 탈이온수로 1000 mL로 희석하였다.
3. 첨가 샘플: 시험될 25 uL의 샘플을 각각 대응하는 웰에 첨가하였다.
4. 용해: 실시예 5에 기재된 바와 동일한 방법을 채택하여, 바이러스를 용해시켰다.
5. 반응: 50 uL의 자성 비드-코팅된 단클론 항체 18B2-2를 샘플 웰에 첨가하고; 잘 혼합한 후, 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하고, 37±1℃에서 15 분 동안 항온처리하였다. 15~20 분 동안 항온처리 후, 세척을 0.05~0.08% Tween 20을 함유한 인산염 버퍼로 수행한 다음에, 50 uL의 아크리디늄 에스테르-표지된 항체 2A7을 첨가하고, 10~15 분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 세척을 0.05~0.08% Tween 20을 함유한 인산염 버퍼로 수행한 다음에, 100~200 uL의 사전-촉발제 용액을 첨가하여, 사전-촉발을 수행하였다. 그 다음에, 사전-촉발제 용액을 제거하고, 100~200 uL의 촉발제 용액을 첨가하여, 촉발 및 검출을 수행하였다.
결과 판단
임계: 컷 오프(C.O.) = 9000
결과 판단: (S=각각의 웰의 발광 값)
음성 결과: (S/C.O.<1): 음성은 샘플의 발광 값이 컷 오프 값 미만일 때 결정되었으며, 이는 HBV 중심 항원이 샘플에서 검출되지 않았다는 것을 의미하였다.
양성 결과: (S/C.O.≥1): 양성은 샘플의 발광 값이 컷 오프 값 이상일 때 결정되었으며, 이는 HBV 중심 항원이 샘플에서 검출되었다는 것을 의미하였다.
실시예 8: HBcAg 검출 키트의 특이성 및 민감성 분석
8.1 중심 항원 검출 키트의 특이성 분석
8.1.1 키트의 제조
HBV 중심 항원을 검출하기 위한 발광 진단 키트(발광 검출 시약 방법)을 실시예 7에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조하였다.
8.1.2 샘플의 검출
B형 간염 혈청학 검사의 HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb 및 HBcAb5의 모든 항목에서 음성 결과를 갖는, 2019년 4월부터 현재까지 수집된 총 80 개의 샘플을 -20℃에서 저온보존하였다.
8.1.3 검출 항목
혈청 샘플 각각을 B형 간염 바이러스 중심 항원에 대해 화학발광 검출을 거쳤으며, 방법은 실시예 7에 나타나 있다.
8.1.4 검출 결과
모든 샘플을 검출한 후, 결과를 키트의 특이성에 대해 분석하였다. 각각의 샘플의 검출 결과를 아래 표에 나타내었다.
Figure pct00007
Figure pct00008
8.1.5 결과 및 분석
S/C.O.<1은 HBV 중심 항원이 샘플에서 검출되지 않았다는 것을 나타내었고, 특이성이 양호하였다는 것을 표 7에서의 결과로부터 볼 수 있었다.
8.2 중심 항원 검출 키트의 민감성 분석
8.2.1 키트의 제조
HBV 중심 항원을 검출하기 위한 발광 진단 키트(발광 검출 시약 방법에 의함)를 실시예 7에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조하였다.
8.2.2 샘플의 검출
8.2.2.1. B형 간염 바이러스 핵산 정량적 PCR 검출 시약에 의해 검출된 1.60E+08 카피/mL의 DNA 로드를 갖는 하나의 신선한 혈청 샘플을 3-배 구배로 11 개 지점에서 20% NBS로 선형 희석을 거치고, 20% NBS를 음성 대조군으로서 사용하고; 검출을 실시예 8에 기재된 방법에 따라 수행하고, 기준 곡선을 제조하였다.
8.2.2.2. C183B 항원을 20% NBS로 1 ug/mL로 희석하고, 3-배 구배로 11 개 지점에서 희석을 거치고, C183B 항원이 없는 20% NBS를 음성 대조군으로서 사용하고; 검출을 실시예 8에 기재된 방법에 따라 수행하고, 상기 기준 곡선을 사용하여, 각각의 지점에서 항원 검출에 대응하는 값을 전환시켰다. 결과를 아래 표에 나타내었다.
Figure pct00009
8.2.2.3. 결과 및 분석
표 8의 데이터에서, 1 초과의 S/C.O는 양성을 나타낸 한편, 1 미만은 음성을 나타내었다. 결과는 c183의 항원 검출 민감성이 0.05 ng/mL이었고, 샘플 검출 민감성이 약 104 카피/mL(DNA 로드)이었다는 것을 나타내었다.
실시예 9: HBcAg 검출 키트 및 PCR 검출 방법의 비교
9.1 키트의 제조
9.1.1 HBV 중심 항원을 검출하기 위한 발광 진단 키트(발광 검출 시약 방법에 의함)를 실시예 7에 기재된 방법에 따라 제조하였다.
9.1.2 B형 간염 바이러스 핵산 정량적 PCR 검출 시약을 Shenzhen Piji Bioengineering Co., Ltd로부터 구매하였다.
9.2 검출 샘플
2019년 4월부터 현재까지 수집된 총 82 개의 B형 간염 바이러스-감염된 혈청 샘플을 -20℃에서 저온보존하였다.
9.3 검출 항목
B형 간염 바이러스 핵산의 정량적 PCR 검출을 각각의 혈청 샘플에 대해 수행하였다.
B형 간염 바이러스 중심 항원의 화학발광 검출을 각각의 혈청 샘플에 대해 수행하였다.
9.4 검출 결과
HBV 중심 항원 검출과 HBV 바이러스 핵산 검출 사이의 상관관계를 모든 항목의 검출 결과를 비교함으로써 분석하였다. 결과를 아래 표에 나타내었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
9.5 결과의 분석
표 9에서, S/C.O.>1은 중심 항원이 샘플에서 검출되었다는 것을 나타내었고, S/C.O.<1은 중심 항원이 샘플에서 검출되지 않았다는 것을 나타내었다. 상관관계 분석을 PCR 방법에 의해 얻어진 HBcAg 검출의 결과와 DNA 로드 결과 사이에서 수행하였으며; 구체적으로, 각각의 샘플의 바이러스 함량 및 발광 강도의 로그를 취하고 선형 상관관계 분석을 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, R2은 0.8368이었고, 이 결과는 발명의 HBcAg 검출 방법의 검출 수행이 양호하였고, 샘플의 DNA 로드를 평가하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.
실시예 10: 다른 면역학적 분석에서 2A7 단클론 항체의 사용
10.1 HBcAg 면역형광 검출 항체로서 2A7의 사용
HepG2(국립 감염병 진단 시약 실험실 및 백신 공학 기술 연구 센터, 시아먼 대학으로부터 얻어짐) 및 HBV 1.1-배 게놈과 안정적으로 통합된 HepG2-N10 세포(국립 감염병 진단 시약 실험실 및 백신 공학 기술 연구 센터, 시아먼 대학으로부터 얻어짐)를 웰 당 60,000 개 세포로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포 부착을 위한 12 시간 후, 배지를 제거하고, 세척을 20 mM PBS로 1 회 수행하였다. 4% 파라포름알데히드로 15 분 동안 고정한 후, 세포를 0.02% Triton x-100으로 10 분 동안 투과화시키고, 2% BSA로 1 시간 동안 차단하였다. 그 다음에, 1:1000의 희석비의 2% BSA에 의해 희석된 2A7 단클론 항체(1 mg/mL)를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고, PBS로 4 회 세척하였다. 형광 이차 항체, 염소-항-마우스-Alexa488(Beyotime, Cat. No: A0428)을 첨가하고 항온처리를 실온에서 40 분 동안 수행하였다. PBS로 4 회 세척한 후, DAPI 염색을 핵에 대해 수행하였다. 실험이 완료된 후, 세포를 Opera phenix 레이저 공초점 고-함량 이미징 시스템으로 63x 물 대물렌즈로 사진촬영하였다.
결과를 도 5에 나타내었고, 2A7은 HBV 게놈과 통합된 HepG2-N10 세포에 대해 세포질에서 명백한 면역 반응을 가졌지만, HBV 게놈과 통합되지 않은 세포에 결합하지 않았으며, 이는 양호한 특이성을 나타내었다. 상기 결과는 2A7이 정확한 검출을 위한 HBcAg의 면역형광 항체로서 사용될 수 있었다는 것을 나타내었다.
10.2 HBcAg 면역조직화학 검출을 위한 단클론 항체로서 2A7의 사용
현재, HBcAg 면역조직화학 검출에 사용되는 항-HBcAg 항체는 다클론 항체이지만, 다클론 항체는 보통 높은 백그라운드 및 낮은 특이성을 갖고, 이들을 사용하는 면역조직화학 결과는 표준화하기 쉽지 않다. 면역조직화학 검출을 위한 항-HBcAg 단클론 항체의 사용에 대한 보고는 없다. 이 실험에서, 면역조직화학 검출 항체로서 2A7 단클론 항체의 성능을 조사하였다.
HBV 트랜스제닉 마우스 HBV-TG(국립 감염병 진단 시약 실험실 및 백신 공학 기술 연구 센터, 시아먼 대학으로부터 얻어짐) 및 정상 C57BL/6 마우스(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.로부터 얻어짐)의 간 조직 파라핀 절편을 탈랍, 재수화, 항원 회수, 세척, 차단을 거친 다음에, 1 시간 동안 실온에서의 반응을 위해 항-HBc 상업적 다클론 항체 및 2A7 단클론 항체를 첨가하였다. 세척 후, 이차 항체를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 세척 후, 발색 용액을 첨가하여, 염색을 수행한 후, 염산 분화, 대조염색, 및 마운팅(mounting)이 이어졌다.
결과를 도 6에 나타내었다. 상업적 다클론 항체와 유사하게, 2A7 단클론 항체는 HBV 트랜스제닉 마우스의 조직 파라핀 절편을 정확하게 검출할 수 있었고, 정상 마우스의 조직 파라핀 절편에 결합하지 않았으며, 이는 2A7이 정확한 검출을 위해 HBcAg의 면역조직화학 항체로서 사용될 수도 있었다는 것을 나타내었다.
본 발명의 구체적 실시양태가 상세히 기재되어 있지만, 통상의 기술자는 다양한 변형 및 변화가 공개된 모든 교시의 측면에서 구체화될 수 있으며, 이들 변화가 모두 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 의해 주어진다.
SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN INNODX BIOTECH CO., LTD XIAMEN UNIVERSITY <120> Method and antibody for detection of HBcAg <130> IEC200405PCT <150> CN202010059190.X <151> 2020-01-19 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 VH <400> 1 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Pro Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Asp His Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 VL <400> 2 Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu 85 90 95 Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 HCDR1 <400> 3 Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr Pro 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 HCDR2 <400> 4 Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 HCDR3 <400> 5 Asp His Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 LCDR1 <400> 6 Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 LCDR2 <400> 7 Leu Met Ser 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 18B2-2 LCDR3 <400> 8 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 VH <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Met Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ile Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 VL <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Lys Gln Lys Thr Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Tyr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 HCDR1 <400> 11 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 HCDR2 <400> 12 Ile Asn Pro Ile Asn Gly Arg Thr 1 5 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 HCDR3 <400> 13 Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Phe 1 5 10 15 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 LCDR1 <400> 14 Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 LCDR2 <400> 15 Tyr Thr Ser 1 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 2A7 LCDR3 <400> 16 Gln Gln Tyr Gly Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 17 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C183 <400> 17 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S1 <400> 18 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S2 <400> 19 Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S3 <400> 20 Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S4 <400> 21 Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S5 <400> 22 Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S6 <400> 23 Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S7 <400> 24 Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S8 <400> 25 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S9 <400> 26 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S10 <400> 27 Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S11 <400> 28 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S12 <400> 29 Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S13 <400> 30 Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S14 <400> 31 Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S15 <400> 32 Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S16 <400> 33 Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S17 <400> 34 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S18 <400> 35 Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S19 <400> 36 Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S20 <400> 37 Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S21 <400> 38 Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S22 <400> 39 Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S23 <400> 40 Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S24 <400> 41 Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S25 <400> 42 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S26 <400> 43 Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S27 <400> 44 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S28 <400> 45 Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg 1 5 10 15 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S29 <400> 46 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S30 <400> 47 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> S31 <400> 48 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser 20 25 30 Gln Cys

Claims (26)

  1. (i) HBcAg 단백질의 위치 150-183에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 제1 항체; 및
    (ii) HBcAg 단백질의 위치 141-154에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는 제2 항체
    를 포함하는 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    제2 항체가 HBcAg 단백질의 위치 141-152에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택되는, 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 항체가
    (i) 서열번호 3에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 4에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 5에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 6에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 7에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 8에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는
    (ii) 서열번호 1에 기재된 VH에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 2에 기재된 VL에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, VH에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 VL에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는
    (iii) 항체가 중국 표준주 수집 센터(China Center for Type Culture Collection)(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019303의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 18B2-2에 의해 생산된 단클론 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    으로부터 선택되는, 키트.
  4. 제3항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이
    (a) (i) 서열번호 1에 기재된 서열; (ii) 서열번호 1에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 1에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) (iv) 서열번호 2에 기재된 서열; (v) 서열번호 2에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 2에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하고;
    바람직하게는, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환이 보존적 치환이고;
    바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함하는,
    키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항체가
    (i) 서열번호 11에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 12에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 13에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 14에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는
    (ii) 서열번호 9에 기재된 VH에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 10에 기재된 VL에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, VH에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 VL에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 또는
    (iii) 항체가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7에 의해 생산된 단클론 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편
    으로부터 선택되는, 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이
    (a) (i) 서열번호 9에 기재된 서열; (ii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) (iv) 서열번호 10에 기재된 서열; (v) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하고;
    바람직하게는, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환이 보존적 치환이고;
    바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 9에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 10에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함하는,
    키트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항체 및/또는 제2 항체가 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 항체 및/또는 제2 항체가 뮤린 중쇄 불변 영역 및 뮤린 경쇄 불변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 제1 항체 및/또는 제2 항체가 IgG, IgM, IgE, IgD 또는 IgA 항체인,
    키트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 이황화-연결된 Fv, scFv, 디아바디(diabody) 및 단일 도메인 항체(sdAb)로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 항체가 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체인, 키트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항체가 검출가능한 표지를 보유하거나, 키트가 제2 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 제3 항체를 추가로 포함하고, 제3 항체가 검출가능한 표지를 보유하고;
    바람직하게는, 검출가능한 표지가 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 화학발광 시약(예를 들어, 아크리디늄 에스테르 화합물), 형광 염료 또는 비오틴으로부터 선택되는,
    키트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    키트가 고체 담체를 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 고체 담체가 자성 비드 또는 미량정량판(예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 제1 항체가 고체 담체의 표면 상에 코팅되는,
    키트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    표준(예를 들어, HBcAg의 상이한 알려진 양을 함유하는 일련의 샘플); 양성 대조군 샘플(예를 들어, HBcAg의 알려진 양을 함유하는 샘플); 음성 대조군 샘플(예를 들어, HBcAg를 함유하지 않는 샘플); HBV 바이러스를 용해시키기 위해 사용되는 용해제; 및 시험될 샘플의 수집 또는 저장을 위한 장치(예를 들어, 혈액 수집 장치)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 시약 또는 장치를 추가로 포함하는, 키트.
  12. (i) 제1 항체, 제1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제1 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제1 항체는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같음); 및
    (ii) 제2 항체, 제2 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 제2 항체를 발현하는 재조합 세포(이때, 제2 항체는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같음)
    를 포함하는 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    제1 항체를 발현하는 재조합 세포가 제1 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포이고,
    제2 항체를 발현하는 재조합 세포가 제2 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포인,
    키트.
  14. 제12항에 있어서,
    제1 항체를 발현하는 재조합 세포가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019303의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 18B2-2이고;
    제2 항체를 발현하는 재조합 세포가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7인,
    키트.
  15. (1) 샘플을 제1 항체와 접촉시켜, 항체-항원 복합체를 형성하는 단계로서, 제1 항체가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단계;
    (2) 항체-항원 복합체를 제2 항체와 접촉시켜, 항체-항원-항체 복합체를 형성하는 단계로서, 제2 항체가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단계; 및
    (3) 항체-항원-항체 복합체의 양을 결정하는 단계
    를 포함하는, 샘플에서 HBcAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    제2 항체가 검출가능한 표지를 보유하거나; 단계 (3)에 기재된 바와 같은 결정이 검출가능한 표지를 갖는 제3 항체를 사용하는 것을 포함하고;
    바람직하게는, 검출가능한 표지가 효소(예컨대, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 화학발광 시약(예컨대, 아크리디늄 에스테르 화합물), 형광 염료 또는 비오틴으로부터 선택되는 것인,
    방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    단계 (3)에서, 결정이 효소 면역분석 또는 화학발광 면역분석으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항체가 고체 담체의 표면 상에 코팅되고;
    바람직하게는, 고체 담체가 자성 비드 또는 미량정량판(예를 들어, 마이크로웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트)으로부터 선택되는 것인,
    방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플이 전혈, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (1) 전에, 샘플을 처치하는 단계를 추가로 포함하고, 처치가 용해제를 샘플과 혼합하여, 바이러스를 용해시키는 단계를 포함하고/하거나;
    단계 (2) 및/또는 단계 (3) 전에, 세척 단계를 추가로 포함하는 것인,
    방법.
  21. 샘플에서 HBcAg 단백질의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 검출 키트의 제조에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
  22. (i) 서열번호 11에 기재된 서열을 갖는 HCDR1, 서열번호 12에 기재된 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 13에 기재된 서열을 갖는 HCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 14에 기재된 서열을 갖는 LCDR1, 서열번호 15에 기재된 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 16에 기재된 서열을 갖는 LCDR3의 3 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나;
    (ii) 서열번호 9에 기재된 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는 서열번호 10에 기재된 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역에 함유된 3 개의 CDR이 Kabat, Chothia 또는 IMGT 넘버링 시스템에 의해 정의되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나;
    (iii) 항체가 세포가 중국 표준주 수집 센터(CCTCC)에 수탁되고 CCTCC NO. C2019302의 수탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주 2A7에 의해 생산된 단클론 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편인,
    HBcAg에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제22항에 있어서,
    (a) (i) 서열번호 9에 기재된 서열; (ii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (iii) 서열번호 9에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및/또는
    (b) (iv) 서열번호 10에 기재된 서열; (v) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 하나 또는 몇몇의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가)를 갖는 서열; 또는 (vi) 서열번호 10에 기재된 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하고;
    바람직하게는, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환이 보존적 치환이고;
    바람직하게는, 서열번호 9에 기재된 서열을 갖는 VH 및 서열번호 10에 기재된 서열을 갖는 VL을 포함하는,
    단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    단클론 항체가 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고;
    바람직하게는, 단클론 항체가 IgG, IgM, IgE, IgD 또는 IgA 항체인,
    단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 이황화-연결된 Fv, scFv, 디아바디(diabody) 및 단일 도메인 항체(sdAb)로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; 단클론 항체가 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체인, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 샘플에서 HBcAg를 검출하기 위한 시약의 제조에서 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도로서,
    바람직하게는, 샘플이 조직 샘플(예를 들어, 조직 절편) 또는 세포 샘플이고;
    바람직하게는, 검출이 면역학적 검출이고; 바람직하게는, 면역학적 검출이 면역조직화학(IHC), 면역세포화학(ICC), 면역형광(IF) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 검출가능한 표지를 보유하거나, 시약이 검출가능한 표지를 보유하는 이차 항체를 추가로 포함하고;
    바람직하게는, 검출가능한 표지가 효소(예를 들어, 꽃양배추 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제), 형광 염료 또는 비오틴으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 이차 항체가 항-면역글로불린 항체인,
    용도.
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