KR20020033107A - Ｓｒｓｖ 검출 킷트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다음 (a)∼(k); (a) 배열번호 1에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (b) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (c) 배열번호 3에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (d) 배열 번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (e) 배열번호 5에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (f) 배열번호 6에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (g) 배열번호 7에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (h) 배열번호 8에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (i) 배열번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등, (j) 배열번호 10에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등 및 (k) 배열번호 11에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 모두 함유하는 것을 특징으로 하는 SRSV 검출킷트에 관한 것이다.
이 킷트를 이용하면, 간이하고도 확실하게 거의 모든 SRSV 관련 바이러스를 검출하고, 그의 혈청형 및 유전자형을 판별할 수 있다.
Description
SRSV는 1972년에 발견된 사람의 바이러스성 위장염의 원인 바이러스의 하나이며, 소아기의 급성 위장염이나 성인이나 나이든 아이에 식중독 같은 집단 발생을 일으키는 것이 알려져 있다. SRSV는 세포배양에 의해 바이러스를 증식시킬 수 없으며, 더욱이 감수성을 나타내는 동물 모델도 없기 때문에, SRSV 및 항SRSV 항체의 입수가 곤란하고, 당해 바이러스의 면역 혈청학적인 검출법의 개발이 늦어지고 있다.
이러한 상황하에서, 1993년에 SRSV의 하나인 노워크 (Norwalk) 바이러스의 유전자 클로닝이 성공하고, 전 게놈 염기배열이 해석되었으며(일본국 특개평 6-506823호 공보), 그 후 RNA 폴리메라제 영역의 일부를 증폭한 PCR법이 개발되고, 지금까지 14종류의 SRSV 관련 바이러스가 발견되어 있다. 또한, 이들의 RNA 폴리메라제 영역의 약 120아미노산에 대한 분석에 의해 SRSV는 노워크 바이러스주를 프로토타입으로 하는 유전자형 I과 스노우 마운틴(Snow Mountain) 바이러스주를 프로토타입으로 하는 유전자형 II의 크게 2개의 유전자(genogroup)로 분류할 수 있는 것으로 되어있다.
그러나, SRSV 관련 바이러스의 유전자 해석이 발전함에 따라, 동일 유전자형 내에서도 많은 다양성이 있는 것이 알려지고, 실제로 각 유전자의 프로토타입인 노워크 바이러스주 및 스노우 마운틴 바이러스주의 유전자에 대하여 프라이머를 이용한 RT-PCR법으로는 모든 SRSV를 검출할 수 없고, SRSV를 효율 좋게 증폭시키는 프라이머의 구축이나 RT-PCR법의 조건의 설정은 대단히 곤란한 것으로 밝혀졌다.
한편, 유전자 발현에 의해 노워크 바이러스주, 스노우 마운틴 바이러스주 등의 일부의 바이러스에 관하여는 항원이 제작되고, 항체의 취득 및 이를 이용한 ELISA에 의한 SRSV 검출법도 구축되어 있으나, SRSV의 다양성에 의해 위장염을 일으키는 모든 SRSV를 확실히 검출할 수 없었다.
또한, 일본국에서는 평성 9년에 SRSV가 식품 위생법에서의 식중독 원인인자로 지정되어 SRSV에 의한 식중독이 발생한 경우에는 그의 감염 루트의 특정이 필수로 되고, 감염자의 변 및 식품중의 SRSV를 간편하고, 또한 확실하게 검출 동정하는 방법이 요망되고 있다.
본 발명은 검체중의 소형 구형 바이러스(Small Round Structured Virus, 이하「SRSV」라고 한다)를 검출, 판별하기 위한 킷트에 관한 것이다.
도 1은 Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000).
도 2는 Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000).
도 3은 Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 4는 Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 5는 Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 6은 Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 7은 Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 8은 Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100000)
도 9는 Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 10은 Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
도 11은 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주 유래의 중공 바이러스 입자의 전자 현미경 사진이다(×100,000)
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
1. SRSV 관련 바이러스
본 발명의 SRSV 검출 킷트는 상기 (a)∼(k) 군의 11 종류의 특정의 아미노산 또는 이 아미노산에 대하여 80%이상의 상동성을 가지는 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 것이다. 이 중, (d) 군, (i) 군, (j)군 및 (k)군에 속하는 펩티드는 현재까지 진 뱅크에 등록되어 있는 모든 SRSV 관련 바이러스주(하기 표 1)와는 다른 신규 펩티드이고, 이들에 대한 항체를 포함하여 11종류의 항체를 함유한 킷트로 함으로서 SRSV 관련 바이러스를 빠짐없이 검출할 수 있다.
본 발명 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에는 펩티드로서 그들과 동등의 항원성을 갖는 한, 그의 아미노산 배열에 있어서 1 또는 복수개의 아미노산이 결실,치환 또는 부가된 변이체, 또는 당해 아미노산 배열을 코드하는 염기 배열에 있어서 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 변이체가 포함된다.
(a) 군에서 배열 번호 1로 나타낸 아미노산 배열을 가지는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염환자의 대변 유래의 Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP 주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산 배열에 대하여 80% 이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Desert Shield/90/SA주(진 뱅크 등록번호; U04469)유래의 것 등이 포함된다.
(b) 군에서 배열 번호 2로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염환자의 대변 유래 Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, KY-89/89J 주(진 뱅크 등록번호; L23828) 및 Norwalk/68/US주 (진 뱅크 등록번호: M8766l1)유래의 것 등이 포함된다.
(c) 군에서 배열 번호 3으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP 주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Southampton/91/UK주(진 뱅크 등록번호: L07418)유래의 것 등이 포함된다.
(d) 군에서 배열 번호 4로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Chiba 407/l987/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있다.
이러한 배열 번호 4로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드는 현재까지 진 뱅크에 등록되어 있는 모든 SRSV 관련 바이러스주(하기 표 1)와 구조 유전자(배열 번호 15)의 상동성이 75%미만이고, 지금까지 보고가 없는 신규한 배열을 갖는 펩티드이다.
(e) 군에서 배열 번호 5로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Bristol/93/UK주(진 뱅크 등록번호: X76716), Lordsdale/93/UK(진 뱅크 등록번호: X86557), Camberwell/94/AU주(진 뱅크 등록번호: U46500)유래의 것 등이 포함된다.
(f) 군에서 배열번호 6으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Mexico/89/MEX주(진 뱅크 등록번호: U22498), Auckland 주(진 뱅크 등록번호: U460391), Toronto/77/CA주(진 뱅크 등록번호: U02030), OTH-25/89/J(진 뱅크 등록번호: L23830)유래의 것 등이 포함된다.
(g) 군에서 배열 번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Snow Mountain/76/US주(진 뱅크 등록번호: U70059),Melksham/89/UK주(진 뱅크 등록번호: X81879)유래의 것을 들 수 있다.
(h) 군에서 배열 번호 8로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있고, 이 아미노산에 대하여 80%이하의 상동성을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, Hawaii/71/US주(진 뱅크 등록번호: U07611)유래의 것 등이 포함된다.
(i) 군에서 배열 번호 9로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있다.
이러한 배열 번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드는 현재까지 진 뱅크에 등록되어 있는 모든 SRSV 관련 바이러스주(하기 표 1)와 구조 유전자(배열 번호 20)의 상동성이 75%미만이고, 지금까지 보고가 없는 신규배열을 갖는 펩티드이다.
(j) 군에서 배열 번호 10으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있다.
이러한 배열 번호 10으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드는 현재까지 진 뱅크에 등록되어 있는 모든 SRSV 관련 바이러스주(하기 표 1)와 구조 유전자(배열 번호 21)의 상동성이 70%미만이고, 지금까지 보고되지 않은 신규 배열을 가지는 펩티드이다.
(k) 군에서 배열 번호 11로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드로서는 예를 들면, 일본국의 SRSV 감염 환자의 대변 유래 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주의 바이러스 구성 펩티드를 들 수 있다.
이러한 배열 번호 11로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드는 현재까지 진 뱅크에 등록되어 있는 모든 SRSV 관련 바이러스주(하기 표 1)와 구조 유전자(배열 번호 22)의 상동성이 70%미만이고, 지금까지 보고되지 않은 신규 배열을 갖는 펩티드이다.
이들 (a)∼(k) 군의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에는 상기 펩티드 외에 당해 펩티드중의 특정의 아미노산 배열을 가지며, 당해 펩티드와 동등의 항원성을가지는 부분 펩티드가 포함된다.
이들 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드는 그의 RNA 폴리메라제 영역의 약 120 아미노산에 대한 호모로지 해석에 의하면 2개의 유전자형으로 분류할 수 있다. 즉, (a)∼(d) 군의 펩티드가 속하는 I형과 (e)∼(k) 군의 펩티드가 속하는 II형으로 분류된다.
2. SRSV 관련 바이러스 구조 유전자의 클로닝
SRSV 감염 환자의 대변으로부터 세틸트리메틸암모늄브로마이드 법 등을 이용하여 바이러스 RNA를 추출하고, 올리고-dT프라이머 및 역전사효소에 의해 cDNA를 제작하고, 이것과 각 SRSV 관련 바이러스의 구조 유전자 영역을 증폭하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로서 구조 유전자 단편을 증폭한다.
이러한 구조 유전자 단편은 한번 대장균 클로닝 벡터를 이용하여 TA클로닝을 행하여 플라스미드에 삽입한다.
여기서 사용 가능한 클로닝 벡터로서는 대장균으로 대표되는 원핵 세포를 숙주로 하는 플라스미드 및 λ파아지 등으로 대표되는 박테리오파아지 유래의 벡터 등 공지의 것을 사용할 수 있고, 클로닝 벡터와 그의 숙주 세포를 적당하게 조합하여 사용하는 것이 바람직하다. 클로닝 벡터의 구체적인 예로서는 pBR322, pUC19, PCRII 등을 들 수 있다. 또한, 유전자의 삽입방법은 공지의 통상의 방법에 따르면 좋고, 이들 벡터의 구축에 있어서는 유전자 조작이 용이한 대장균 계를 사용하는 것이 바람직하다.
3. 구조 유전자의 발현 및 중공 바이러스 입자의 제작
상기에서 얻어진 (a)∼(k) 군의 각 바이러스 구조 유전자의 단편을 적당한 발현계를 이용하여 발현시키든지 또는 이 바이러스 구성 펩티드에서 유전자 공학적으로 제작된 중공 바이러스 입자를 사용함으로서 각 바이러스에 대한 항체를 얻을 수 있다. 이하에 대장균을 이용했던 경우의 발현과 중공 바이러스 입자의 제작에 관하여 설명한다.
(1) 대장균에 의한 발현
각 SRSV 관련 바이러스의 구조 유전자 영역을 삽입한 플라스미드를 구조 유전자 영역을 절단하지 않는 제한효소로 소화한 후, 구조 유전자 영역을 회수하고, 예를 들면, pGEX(GST 융합 단백 발현 벡터; 파마시아제), pTrc99A(대장균 발현 벡터; 파마시아제), pTrxFus(티오레도신 융합 단백 발현 벡터: 인비토로겐사제), pET(pT7RNA 프로모터를 이용한 발현 벡터; 노바겐사제), 말토오즈 결합 단백 발현 벡터 또는 β갈락토시다제의 융합 단백 발현 벡터 등에 삽입한다. 이 때, 삽입하는 구조 유전자 영역은 완전한 길이이어도 좋고, 부분적인 영역으로도 좋으며, 바람직하기로는 SRSV의 항원 에피토우프를 최저 한 개를 갖는 부분적인 영역인 쪽이 좋다. 이와 같이 하여 구조 유전자 영역을 삽입한 유전자 발현 벡터를 유전자 발현에 적합한 대장균, 예를 들면, BL21주, DH10B주, JM109주, XL1-Blue주 등으로 형질전환한다. 얻어진 형질전환체를 일반적인 배양액, 예를 들면 L-broth 등으로 배양함으로서 유전자 발현을 행할 수 있다. 발현에는 유전자 발현 유도제, 예를 들면,IPTG 등을 첨가하는 것이나, PL 프로모터를 이용한 경우, 열 쇼크를 주는 것이 바람직하다.
발현된 펩티드의 정제는 일반적인 대장균을 이용한 발현 단백의 정제법에 따르면 좋고, 예를 들면, 발현단백이 가용화하여 있으면 GST 칼럼 또는 말토오즈 결합 단백용 칼럼을 이용한 어피니티 정제를 행하면 좋으며, 발현단백이 불용화하여 있으면, Ni 킬레이트를 이용한 어피니티 정제를 하면 좋다.
(2) SRSV 중공 바이러스 입자의 작성
SRSV 관련 바이러스의 구조 유전자 영역을 삽입한 플라스미드를 구조 유전자 영역을 절단하지 않는 제한효소로 소화하고, 구조 유전자 영역을 회수하고, 예를 들면, pVL1 393 등의 바큘로바이러스 트랜스퍼 벡터에 삽입한다. 이러한 트랜스퍼 벡터와 직쇄상으로 증식 필수 유전자 영역을 결실시킨 바큘로바이러스 DNA과 함께 트랜스팩션하고, 곤충 세포내에서 상동 재조합을 일으킴으로서 목적으로 하는 재조합 바큘로바이러스를 제작할 수 있다.
얻어진 재조합 바큘로바이러스를 Sf9 세포, Tn5 세포 등의 곤충 세포에 감염시키고, 통상의 방법에 따라 적당한 생육 조건 하에서 배양함으로서 SRSV의 구조 단백을 발현시키고, 자기 집합시킴으로서 중공 바이러스 입자를 생산할 수 있다. 생화학적인 정제법, 예를 들면 원심분리 등을 이용하면 중공 바이러스 입자를 분리 정제할 수 있다. 중공 바이러스 입자가 형성되어 있는지의 여부는 우라닐 아세테이트로 네가티브 염색하고, 전자 현미경으로 검사함으로서 확인할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 중공 바이러스 입자는 내부에 유전자를 갖지 않기 때문에 감염성은 없으나, 구조가 바이러스 입자와 거의 동일하기 때문에, 바이러스 입자와 동등한 항원성을 갖는 것이다.
4. SRSV 관련에 대한 항체의 취득
얻어진 바이러스 구성 폴리펩티드 또는 중공 바이러스 입자를 동물에게 면역함으로서 항SRSV 관련 바이러스 항체를 조제할 수 있다. 또, 이러한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 어느 것이어도 좋다.
예를 들면, 중공 바이러스 입자를 이용한 경우의 면역 항체의 제작은 정제 된 각 SRSV 관련 바이러스의 중공 바이러스 입자를 통상의 방법에 따라서 토끼에게 면역하고, 분리 혈청으로부터 중공 바이러스에 대한 IgG 항체(항SRSV 항체)를 취득할 수 있다. 또, 항체의 분리, 정제에는 DEAE 세팔로오즈 크로마토그래피 등의 수단이 이용된다.
이렇게 하여 얻어진 (a)∼(k) 군으로 되는 11종류의 중공 바이러스 입자와 대응하는 항SRSV 항체를 이용하여 그의 교차 반응성을 측정하면, 후기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 SRSV 관련 바이러스간에서는 교차반응은 전혀 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명의 SRSV의 검출법에 의하면, SRSV의 11종류의 혈청형을 동시에 판별하는 것이 가능하다. 또, 이것은 동시에 유전자형 I과 유전자형 II의 판별이 가능한 것도 나타내고 있다.
5. SRSV 관련 바이러스의 검출
상기에서 얻어진 각 항SRSV 항체를 이용한 검체중의 SRSV의 검출은 통상 이용되는 항원항체반응을 이용한 면역학적 측정법, 예를 들면, 샌드위치법에 의한 래디오이뮤노앗세이나 효소면역측정법(ELISA) 등을 이용할 수 있으나, 특히 ELISA이 바람직하다. 즉, 11종류의 항SRSV 항체를 마이크로플레이트에 분주하여 SRSV스크리닝 플레이트를 제작하고, SRSV 감염환자의 대변에서 조제한 대변 유제의 희석액을 당해 플레이트의 웰에 가하여 반응시킨 후, 각 바이러스의 퍼옥시다제(POD)표지 항SRSV 항체를 가하고, 반응시킨다. 이어서 기질액(과산화수소를 함유하는 TMB)을 가하고, 반응시킨 후, 0.6N 황산을 가하여 반응을 정지시키고, ELISA 오토 리더로 웰의 흡광도(450nm/630nm)를 측정함으로서 SRSV를 검출할 수 있다.
여기서, 검체중의 SRSV의 검출만을 행하는 경우에는 11종류의 항SRSV 항체 전부를 혼합 고정화한 마이크로플레이트를 이용한 킷트로 하면 좋고, SRSV의 혈청형까지 판별하는 경우에는 11종류의 항SRSV 항체 모두를 각각 별개의 플레이트에 고정화한 마이크로플레이트를 이용한 킷트로 하면 좋다.
또한, 유전자의 판별은 (a)∼(d) 군의 펩티드에 대한 항체를 혼합 고정화한 마이크로플레이트(l형 플레이트) 또는 (e)∼(k) 군의 펩티드에 대한 항체를 혼합 고정화한 마이크로플레이트(II형 플레이트)를 이용한 킷트로 함으로서 가능하게 된다.
또, 본 발명의 각 항SRSV 항체를 라텍스나 마그네틱 비이드 등의 담체를 이용하여 고정화함으로서 검체중의 SRSV 관련 바이러스를 확실하게 포착할 수 있으며, 라텍스이면 원심조작, 마그네틱 비이드이면 자석으로 SRSV 포착 담체를 회수할 수 있고, 회수 후에 바이러스 RNA를 추출하여 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명의 SRSV 검출 킷트를 구체적으로 설명한다.
실시예 1 SRSV 관련 바이러스의 구조 유전자의 클로닝
(1) cDNA 합성
SRSV 환자의 대변(0.5∼1.0g)에 9㎖의 PBS와 1㎖의 다이후론(Daiflon)을 가하고, 호모지나이즈했다. 이어서, 3000rpm으로 20분간 원심하고, 그의 상청을 회수하고, 10% 변유제로 했다.
이 대변유제 l㎖를 이용하여 세틸트리메틸암모늄브로마이드법에 의해 SRSV의 RNA를 추출하고, 최종적으로 0.1% 디에틸피로카보네이트액 30㎕에 부유시켰다. 이 부유액을 이용하여 Oligo-dT(12-18) 프라이머 및 AMV(Avian Mycloblastosis Virus)(세이카가쿠고교사제) 유래 역전사효소에 의해 cDNA을 제작했었다.
(2) 구조 유전자 영역의 분리
(1)에서 제작한 cDNA와 아래에 나타낸 구조 유전자 영역을 증폭하는 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, PCR 후, 아가로오즈 겔 전기영동법에 의해 증폭시킨구조 유전자 단편을 분리하고, SuprecTM-01(TAKARA)을 이용하여 회수했다.
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP유전자: G1/F2(배열번호23), Oligo-dT(33) (배열번호 24)
Hu/NLV/Seto l24/1989/JP유전자: G1/F2(배열번호 23), G1/R0 (배열번호 25)
Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP유전자: G1/F2(배열번호 23), Oligo-dT(33) (배열번호 24)
Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP유전자: D5(배열번호 26), CV-U4(배열번호 27)
Hu/NLV/Narita 104/1997/JP유전자: 97k104/F1(배열번호 28), 97k104/R1 (배열번호 29)
Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP유전자: G2/F3(배열번호 30), MV-R1(배열번호 31)
Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP유전자: G2/F3 (배열번호 30), SMV-Rl (배열번호 32)
Hu/NLV/Chitta 1876/l996/JP유전자: G2/F3(배열번호 30), G2/R0(배열번호 33)
Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP유전자: 97k104/F1(배열번호 28), Oligo-dT(33)(배열번호 24)
Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP유전자: G2/F3(배열번호 30), O1igo-dT(33) (배열번호 24)
Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP유전자: GFCR7(배열번호 34), O1igo-dT (33)(배열번호 24)
(3)구조 유전자의 클로닝
회수한 구조 유전자 단편을 대장균 클로닝벡터 pCRII(INVITROGEN사제)로 TA클로닝을 행했다. 이들의 클로닝으로부터 바이러스의 구조 유전자를 삽입한 플러스미드 pCRII/ 645, pCRII/l24, pCRII/258, pCRII/Chiba, pCRII/104, pCRII/809, pCRI1/754, pCRII/76, pCRII/47, pCRII/7k, pCRII/10-25를 얻었다.
실시예 2 염기 배열의 결정
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주, Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, Hu/NLV/Chiba 407/l987/JP주, Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주, Hu/NLV/lchikawa 754/1998/JP주, Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP 및 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주의 구조 유전자의 염기 배열의 결정은 아래의 방법으로 행했다.
우선, 트랜스퍼 벡터인 pVL1393의 폴리헤드린 프로모터의 부근에 프라이머(제 1프라이머)를 설정하고, dye termination법에 의해 "사이클 시퀀싱 킷트 FS"(Cycle Sequencing Kit FS, Perkin-Elmer사제)를 이용하여 라벨링 반응을 행했다. 이 때, 사용한 트랜스퍼 벡터의 DNA농도는 0.4㎍/㎕이고, 시퀀싱 프라이머의 농도는 3.2pmol/㎕이다. 또한, 반응 종료후, 센트리프레프시핀 칼럼 (centriprepspin column, Perkin-Elmer사)을 이용하여 과잉량의 형광색소를 제거했다. 이 반응액을 진공건조기에 의해 완전하게 건조시키고, 전용 샘플 버퍼(Perkin-Elmer사제) 20㎕에 부유시킨다. 또한, 교반후, 원심 침전시키고, 95℃에서 2분간의 가열조작을 행하고, 급냉후, 오토시퀀서("ABI Genetic Analyzer 310")로 해석했다.
이어서, 제 1프라이머에 의해 결정된 염기배열을 이용하여 그의 염기 배열의 3'측에 새로운 시퀀스용의 프라이머(제 2프라이머)를 설정했다. 이 제 2프라이머를 이용하여 전술한 바와 같이 사이클 시퀀싱 킷트로 라벨링반응을 행했다. 반응 후, 전술한 바와 동일한 조작을 행하여 오토시퀀서로 염기배열을 해석했다. 이와 같이, 매회 결정한 염기배열의 3'측에 시퀀스용 프라이머를 설정하고, 염기배열의 결정을 행했다. 이를 반복하여 11종류의 SRSV 관련 바이러스 구조 유전자의 5'말단에서 3'말단까지 염기배열(배열번호 12∼배열번호 22)을 결정했다. 이 중, 배열번호 15(Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주), 배열번호 20(Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주), 배열번호 21(Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주) 및 배열번호 22(Hu/NLV/Osaka 0-25/1999/JP주)로 표시되는 염기배열은 지금까지 보고되어 있지 않는 신규 배열인 것이 확인됐다.
실시예 3 중공 바이러스 입자를 생산하는 재조합 바큘로바이러스의 제작(1)
(1) 트랜스퍼 벡터의 구축
실시예 1(3)에서 얻어진 구조 유전자 영역을 삽입한 플라스미드를 구조 유전자 영역을 절단하지 않는 제한효소로 소화하고, 아가로오즈겔 전기영동법에 의해분리한 후, 구조 유전자 영역을 SuprecTM-01(TAKARA)에 의해 회수했다. 이어서, 회수한 유전자 단편을 동일한 제한효소로 소화한 바큘로바이러스 트랜스퍼 벡터 pVL1393(INVITROGEN사제)에 삽입하고, 트랜스퍼 벡터를 제작했다.
(2) 재조합 바큘로바이러스의 제작
0.5㎍의 바큘로바이러스 DNA(Baculo-Gold)와 1㎍의(1)에서 얻은 트랜스퍼 벡터를 8㎕의 증류수에 용해하고, 2배 희석한 등량의 리포펙틴과 혼합하고, 실온에서 l5분간 방치한다. 곤충 세포용 배지 Ex-cell 1400에 현탁한 l×105개의 Sf9 세포를 26.5℃에서 30분간 플라스틱 샤레(직경 3.5cm)안에 흡착 후, 트랜스퍼 벡터와 Baculo-Gold 혼합액을 세포에 적하하고, 26.5℃에서 배양했다. 24시간후, 배양액을 10% 우태아 혈청 및 2% BTB(GIBCO BRL사제)를 함유하는 TC100(GIBCO BRL사제; 이하, TC100) 배지로 교환하고, 다시 배양을 계속했다.
(3) 재조합 바큘로바이러스의 순화
(2)에서 얻은 재조합 바큘로바이러스를 5일간 배양한 후, 배양상청을 TC100 등의 곤충 세포 배양용 메디아를 이용하여 10배로 희석했다. 그의 0.1㎖를 취해, 직경 3.5cm의 플라스틱 샤레에 배양한 3×106개의 Sf9 세포에 접종했다. 26.5℃, 60분간 흡착 후, 1% 아가로오즈 ME(저융점 아가로오즈)를 함유하는 TC100 배양액 2㎖를 중층하고, 26.5℃에서 배양했다. 다시, 배양 개시 후 4일째에 0.005%의뉴트랄 레드를 함유하는 TC100 1㎖를 중층하고, 26.5℃에서 배양했다. 다음날 출현한 플라아크를 마이크로팁으로 긁어모아, TC100 배지에 현탁했다.
(4) 재조합 바큘로바이러스의 씨드의 제작과 감염 역가의 측정
(3)에서 얻은 현탁액을 1×107개의 Sf9 세포에 접종하고, 26.5℃, 60분간 흡착 후, TC100을 가하고, 26.5℃에서 3에서 4일간 배양했다. 이 배양액을 2500rpm, 10분간, 4℃에서 원심하고, 배양상청을 회수했다. 이 회수한 배양상청을 1×107개의 Sf9 세포에게 접종하고, 26.5℃에서 60분간 흡착후, TC100을 가하고, 26.5℃에서 3∼4일간 배양했다.
이어서, 이 배양상청을 직경 3.5cm의 플라스틱 샤레에 배양한 3×107개의 Sf9 세포에 접종하고, 26.5℃에서 60분간 흡착 후, 1% 아가로오즈 ME(저융점 아가로오즈)를 함유하는 TC100 배양액 2㎖를 중층하고, 26.5℃에서 배양했다. 이어서, 배양 개시 후 4일째에 0.005%의 뉴트랄 레드를 함유하는 TC100을 1㎖ 중층하고, 26.5℃에서 배양했다. 다음날 출현한 플라아크를 계측하고, 재조합 바큘로바이러스의 감염 역가를 산출하고, 재조합 바큘로바이러스 씨드의 감염 역가로 했다.
실시예 4 중공 바이러스 입자의 제작
(1) 재조합 바큘로바이러스를 이용한 구조 단백의 발현
Sf9 곤충세포에 대하여 재조합 바큘로바이러스를 M.O.I. (Multiplicity ofinfection) 1∼10으로 감염시켰다. 이 때, 재조합 바이러스액을 세포에 적하하고, 조용하게 진탕시키면서, 약 60분 정도 흡착시켰다. 그런 다음, TC 100 곤충 세포용 배지를 첨가하고, 26.5℃에서 5∼6일간 배양했다.
(2) 발현 단백의 동정
재조합 바이러스 감염 배양상청을 경시적으로 채취하고, SDS-PAGE로 분리한 것을 쿠마시 블루 염색으로 검출하고, 예상되는 분자량에 따라 발현단백의 타당성을 확인했다. 또한, SDS-PAGE로 단백을 분리한 후, 니트로셀루로오즈 막에 전사하고, SRSV의 회복기 혈청에 의한 웨스턴 플롯팅법으로 발현단백을 동정했다.
(3) 중공 바이러스 입자의 정제와 회수
재조합 바큘로바이러스 씨드를 M.O.I. 1∼10으로 감염시키고, 약 60분 흡착 후, Ex-cell 400을 첨가하고, 26.5℃에서 3일간 배양했다. 이어서, 프로테아제 저해제, 예를 들면 펩스타틴 A 및 류펩틴을 배양액에 최종 농도 1 mM이 되도록 가하고, 다시 2∼3일간 배양을 계속했다.
배양 후, 2500 rpm, 10분간, 4℃에서 원심하고, 배양상청을 회수했다. 회수한 배양액을 10000 rpm으로 30분간 원심하고, 재조합 바큘로바이러스를 제거했다. 이 상청을 벡크만 SW28로터에서 25000 rpm, 4시간 원심하여 중공 바이러스 입자를 침전시켰다. 이어서, 상청을 버린 원심관을 거꾸로 하여, 완전히 상청을 제거하고, 그런 다음, 프로테아제 저해제를 첨가한 그레이스 버퍼 또는 PBS(-) 0.5㎖를 각 원심관에 가하고, 4℃에서 하룻밤 정치했다.
정치 후, 가하여 놓은 프로테아제 저해제 함유 그레이스 버퍼로 중공 바이러스 입자를 현탁시켜 회수했다. 이어서, 회수한 중공 바이러스 입자에 CsCl을 3.8g 가한 프로테아제 저해제 함유 그레이스 버퍼 또는 PBS(-)를 가하여 13㎖로 하고, 16℃, 35000rpm, 24∼48시간 초원심했다. 초원심후, 중공 바이러스 입자가 모아져 있는 청백 밴드를 회수하고, 프로테아제 저해제 함유 그레이스 버퍼를 이용하여 5배로 희석한 후, 벡크만 TL100.3로터에서 45000 rpm, 3시간 초원심하고, 중공 바이러스 입자를 침전시켰다.
침전시킨 중공 바이러스 입자를 프로테아제 저해제 함유 그레이스 버퍼 또는 PBS(-)로 가용화했다. 이어서, 10%∼50%의 자당을 함유하는 프로테아제 저해제 함유 그레이스 버퍼용액을 4PA 튜브로 만들고, 여기에 중공 바이러스 입자 가용화 액을 중층하고, 35000 rpm, 4시간, 4℃에서 자당 밀도 구배 원심을 행했다. 원심후, 중공 바이러스 입자의 청백 밴드를 26G 침이 부착된 1 ㎖ 시린지로 회수하여 정제 SRSV 중공 바이러스 입자로 하였다.
정제 SRSV 중공 바이러스 입자를 그레이스 버퍼로 적의 희석하고, Bradford 법에 의해 단백량을 측정했다.
정제 SRSV 중공 바이러스 입자는 우라닐아세테이트로 네가티브 염색하고, 전자 현미경으로 검사하여 중공 바이러스 입자를 형성하고 있는지 여부를 확인했다(도 2∼12).
실시예 5 중공 바이러스 입자를 이용한 면역항체 및 표지항체의 제작
(1) 중공 바이러스에 대한 면역 항체의 제작
Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주, Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주, Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주 Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주, Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주 및 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주로부터 얻어진 정제 SRSV 중공 바이러스 입자 500㎍을 함유하는 1㎖의 인산 완충액(pH 7.2)과 1㎖의 프로인드의 불완전 어쥬번트를 혼합하고, 3kg의 뉴질랜드 백색 토끼에게 통상의 방법에 따라서 면역했다. 3주간후, 0.25㎍의 SRSV 중공 바이러스 입자를 함유하는 인산 완충액(pH 7.2) 1㎖과 프로인드의 불완전 어쥬번트 1㎖를 혼합하여 면역했다(추가면역). 이어서, 3주간후 추가면역과 동일하게 면역을 행하고, 약 7∼10일 후에 모두 채혈하고, 혈청 성분을 분리했다.
분리 정제한 혈청을 황산암모늄 분획후, 50mM Tris-HCl(pH 7.6)으로 4℃, 하룻밤 투석했다. 이어서 50mM Tris-HCl(pH 7.6)으로 평형화한 DEAE세팔로오즈크로마토그래피에 걸고, UV 파장 280nm에서 모니터링하고, O.D.의 피크를 모으고, 중공 바이러스에 대한 DEAE 정제 IgG항체(항SRSV 항체)로 하였다.
(2) 표지항체의 제작
항SRSV 항체를 과요드산 개량법[효소면역 측정법, 2:91(1982)]으로 POD 표지했다. 즉, POD를 4mg/㎖로 되도록 증류수로 용해하고, 0.1M과 과요드산나트륨 0.2㎖를 가하고, 실온에서 약 20분간 반응시켰다. 이어서, 1mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.0)으로 하룻밤 투석했다. 투석후, 0.2M 탄산나트륨 완충액(pH 9.5) 0.02㎖를 가하고, pH 9.5로 함과 동시에 항SRSV 항체 8㎎을 가했다.
실온에서 약 2시간 반응시키고, 4 ㎎/㎖ 수산화붕소나트륨 0.1㎖를 가하고, 4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 반응 후, 10mM 인산 완충액을 이용하여 세파크릴 S-200에 의한 겔여과를 행하고, UV 파장 280nm에서 모니터링하여 POD 표지 항SRSV 항체 획분을 모았다.
(3) 항SRSV 항체 고상 플레이트의 제작
항SRSV 항체를 탄산완충액(pH 9.5)으로 각각 0.5∼10㎍/㎖ 농도에 희석하고, 폴리스티렌 평판 마이크로플레이트(눈크사제)에 100㎕/웰로 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 18시간 이상 정치한 마이크로플레이트를 최종 농도 0.05% Tween20을 함유하는 PBS 200㎕/웰로 3∼4회 세척 후, 최종 농도 0.5% 소혈청 알부민(BSA)과 0.05% Tween20을 함유하는 10mM PBS(pH 7.2) 200㎕/웰을 가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 항SRSV 항체 고상 마이크로플레이트를 제작했다.
실시예 6 교차 반응성
(1) 항원 검출 ELISA
각 정제 SRSV 중공 바이러스 입자를 각각 완충액(10mM PBS(pH 7.2)로 최종 농도 0.2% 소혈청 알부민(BSA)과 0.05% Tween 20을 함유하는 용액)으로4ng/㎖∼0.04ng/㎖까지 희석했다.
이어서, 희석한 중공 바이러스 입자(VLP)를 각각의 항SRSV 항체 고상 마이크로플레이트의 웰에 100㎕ 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 반응 후, 웰의 반응액을 흡인 제거하고, 최종농도 0.05% Tween 20을 함유하는 10mM PBS (pH 7.2)를 웰에 200㎕ 가하고, 동일하게 흡인 제거했다.
이 조작을 적어도 3회 행했다. 세척 후, 완충액으로 20000배로 희석한 각 혈청형의 POD표지 항SRSV 항체를 100㎕/웰 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 세척후, 과산화수소를 함유하는 TMB 용액을 100㎕/웰 가하고, 실온에서 30분간 반응 시켰다. 반응 후, 0.6N의 황산을 100㎕/웰 가하고, ELISA 오토리더로 웰의 흡광도(450nm/630nm)를 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
표중, 645는 Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, 124는 Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주, 258은 Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, 407은 Hu/NLV/Chiba 407/1087/JP주, 104는 Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, 809는 Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주, 754는 Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주, 1876은 Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, 47은 Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, 7k는 Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주, 10-25는 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주를 나타낸다.
이들로부터, 다른 유전자형 I과 II 사이에서 교차 반응성은 보이지 않음은 물론, 동일 유전자형에 있어서도 교차 반응은 보이지 않았고, 사용한 11종류의 바이러스주의 혈청형은 각각 다른 것이 확인되었다.
시험예1 SRSV의 유전형의 판별
유전자형 I에 속하는 SRSV(Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주, Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주)의 항SRSV 항체를 탄산 완충액(pH 9.5)으로 0.5∼10㎍/㎖ 농도로 희석 혼합하고, 폴리스티렌 평판 마이크로플레이트(눈크사제)에 l00㎕/웰로 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 18시간 이상 정치한 마이크로플레이트를 최종농도 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS 200㎕/웰로 3∼4회 세척 후, 최종농도 0.5% 소혈청 알부민(BSA)과 0.05% Tween 20을 함유하는 10mM PBS(pH 7.2)를 200㎕/웰에 가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 유전자형 I의 각 혈청형에 대한 항SRSV-IgG 항체를 혼합 고상한 마이크로플레이트를 제작했다.
이어서, 유전자형 II에 속하는 SRSV(Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주, Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주, Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주, Hu/ NLV/Osaka 10-25/1999/JP주)의 항SRSV 항체를 동일하게 고상하여 II형 플레이트를 제작했다.
SRSV 환자의 대변(0.5∼1.0g)에 9㎖의 PBS와 1㎖의 다이후론(Daiflon)을 가하고, 호모지나이즈했다. 이어서, 19000g로 20분간 원심하고, 그의 상청을 회수하고, 10% 변유제로 하고, 이 10% 변유제를 완충액으로 등량 희석하고, 그의 희석액을 I 및 II형 플레이트의 웰에 100㎕ 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 반응 후, 웰의 반응액을 흡인 제거하고, 최종 농도 0.05% Tween 20을 함유하는 10 mM PBS(pH 7.2)를 웰에 200㎕ 가하고, 동일하게 흡인 제거했다. 이 조작을 적어도 3회 행했다. 세척 후, 완충액으로 20000배로 희석한 각 혈청형의 POD 표지 항SRSV 항체를 100㎕/웰 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 세척 후, 과산화수소를 함유하는 TMB 용액을 100㎕/웰 가하고, 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 0.6N의 황산을 100㎕/웰 가하고, ELISA 오토리더로 웰의 흡광도(450nm/630nm)를 측정했다.
그 결과, 유전자형 I의 SRSV에 감염된 환자의 변검체 15예는 14예가 I형 플레이트에만 반응하고, II형 플레이트에 반응하지 않았다. 유전자형 II의 SRSV에 감염된 환자의 변검체 7예는 6예가 l형 플레이트에 반응하지 않고, II형 플레이트에만 반응하여 유전자형의 판별이 실제로 가능한 것임을 확인했다.
시험예 2 SRSV의 혈청형의 판별
SRSV (Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, Hu/NLV/seto 124/1989/JP주, Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주, Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주, Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주, Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, Hu/NLV/Mie 7k/ 1994/JP주 및 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주)의 각 항SRSV 항체를 각각 단독으로 탄산완충액(pH 9.5)으로 0.5∼10㎍/㎖ 농도에 희석하고, 폴리스티렌 평판 마이크로플레이트(눈크사제)에 100㎕/웰로 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 18시간 이상 정치한 마이크로플레이트를 최종농도 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS 200㎕/웰로 3∼4회 세척 후, 최종농도 0.5% 소혈청 알부민(BSA)과 0.05% Tween 20을 함유하는 10mM PBS(pH 7.2)를 200㎕/웰 가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하고, 항SRSV 항체 고상 마이크로플레이트(혈청형 별 플레이트)를 제작했다.
SRSV 환자의 변검체에 대하여, 시험예 1과 동일하게 ELISA를 행했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
이것으로부터, 본 발명의 SRSV 검출법에 의하면, 93%라는 높은 확률로 SRSV를 검출할 수 있고, 한편 그 혈청형을 판별할 수 있는 것이 명백해졌다.
또한, 본 발명의 킷트에 의해 이루어진 형별은 PCR 및 염기 배열의 해석에 의해 이루어진 형별과 일치했다(표 4).
또한, SRSV(Hu/NLV/Kashiwa 645/1999/JP주, Hu/NLV/Seto 124/1989/JP주, Hu/NLV/Funabashi 258/1996/JP주, Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP주, Hu/NLV/Narita 104/1997/JP주, Hu/NLV/Sanbu 809/1998/JP주, Hu/NLV/Ichikawa 754/1998/JP주, Hu/NLV/Chitta 1876/1996/JP주, Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP주, Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP주 및 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP주)의 각 항SRSV 항체를 탄산완충액(pH 9.5)으로 0.5∼10㎍/㎖ 농도에 희석하고, 이들을 모두 혼합하거나, 또는 혼합한 후, 희석한 것을 사용하여 동일하게 항SRSV 항체 고상 마이크로플레이트를 제작했다. SRSV에 감염된 환자의 변검체 22에 대하여, 시험예 1과 동일하게 ELISA를 행한 바, 20예에서 검체중의 SRSV를 검출할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 검체에서 지금까지 발견되어 있는 SRSV 관련 바이러스를 간편하게 검출할 수 있고, 그의 혈청형 및 유전자형을 확실하게 판별할 수있는 킷트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 실상을 감안하여 SRSV 관련 바이러스에 대하여 유전학적 및 면역학적으로 검토한 바, 새로 발견된 신규 바이러스 펩티드를 가한 11종의 SRSV 관련 바이러스 펩티드로부터 얻어진 항체를 조합하여 이용함으로서 검체중 대부분의 SRSV를 검출할 수 있고, SRSV의 혈청형 및 유전자형을 확실하게 판별할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 하기(a)∼(k);
(a) 배열 번호1에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(b) 배열 번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 8O%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(c) 배열 번호 3에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(d) 배열 번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(e) 배열 번호 5에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(f) 배열 번호 6에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(g) 배열 번호 7에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(h) 배열 번호 8에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(i) 배열 번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(j) 배열 번호 10에 나타낸 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(k) 배열 번호 11에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 모두 함유하는 것을 특징이라고 하는 SRSV 검출 킷트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 하기 SRSV 관련 바이러스 (a)∼(d);
(a) 배열 번호 1에 나타낸 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(b) 배열 번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(c) 배열 번호 3에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(d) 배열 번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나의 SRSV 관련 바이러스구성 펩티드에 대한 항체를 전부 함유하는 것을 특징으로 하는 SRSV유전자형 판별을 위한 SRSV 검출 킷트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 하기 SRSV 관련 바이러스(e)∼(k);
(e) 배열 번호 5에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(f) 배열 번호 6에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(g) 배열 번호 7에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(h) 배열 번호 8에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(i) 배열 번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(i) 배열 번호 10에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,
(k) 배열 번호 11에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 하나의 SRSV 관련 바이러스구성 펩티드에 대한 항체를 전부 함유하는 것을 특징이라고 하는 SRSV 유전자형 판별을 위한 SRSV 검출 킷트를 제공하는것이다.
또한, 본 발명은 배열 번호 15, 20, 21 및 22로 나타낸 염기 또는 이 염기 배열의 1 또는 수개의 염기가 결실, 또는 부가된 염기 배열을 가지는 SRSV 관련 바이러스주 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 SRSV 검출 킷트에 의하면, 간이하고, 확실하게 지금까지 발견된 거의 모든 SRSV 관련 바이러스를 검출하고, 그의 혈청형 및 유전자형을 판별할 수 있다. 따라서, SRSV에 의한 식중독이 발생한 경우의 감염 루트의 특정, 감염 확대의 방지 및 역학 조사 등에 유용하다.
Claims (10)
- 하기 (a)∼(k)로 이루어진 군에서 선택된 1개의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 모두 함유하는 것을 특징으로 하는 SRSV 검출 킷트:(a) 배열번호 1에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(b) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(c) 배열번호 3에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(d) 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(e) 배열번호 5에 나타낸 아미노산 배열을 가지는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(f) 배열번호 6에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(g) 배열번호 7에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(h) 배열번호 8에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(l) 배열번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(j) 배열번호 10에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(k) 배열 번호 11에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드.
- 제 1항에 있어서, 항체가 중공 바이러스 입자를 면역하여 제작된 것인 SRSV 검출 킷트.
- 제 1항에 있어서, SRSV의 혈청형을 판별하는 것인 SRSV 검출 킷트.
- 하기 (a)∼(d)로 이루어진 군에서 선택된 1개의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 모두 함유하는 것을 특징이라고 하는 SRSV유전자형 판별을 위한 SRSV 검출 킷트;(a) 배열번호 1에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(h) 배열번호 2에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(c) 배열번호 3에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(d) 배열번호 4에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드.
- 하기 (e)∼(k)로 이루어진 군에서 선택된 1개의 SRSV 관련 바이러스 구성 펩티드에 대한 항체를 모두 함유하는 것을 특징이라고 하는 SRSV유전자형 판별을 위한 SRSV 검출킷트;(e) 배열번호 5에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 가지는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(f) 배열번호 6에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(g) 배열번호 7에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(h) 배열번호 8에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(i) 배열번호 9에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(j) 배열번호 10에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드,(k) 배열번호 11에 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 이 아미노산 배열에 대하여 80%이상의 상동성을 갖는 펩티드 또는 그의 부분 펩티드.
- 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 항체를 담체에 고정화한 항체 고상 담체에서 SRSV를 포착하는 것인 킷트.
- 배열번호 15로 나타낸 염기 또는 이 염기 배열의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 가지는 Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP유전자.
- 배열번호 20으로 나타내는 염기 또는 이 염기 배열의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 가지는 Hu/NLV/Kashiwa 47/1997/JP유전자.
- 배열번호 21로 나타내는 염기 또는 이 염기배열의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 가지는 Hu/NLV/Mie 7k/1994/JP유전자.
- 배열번호 22로 나타내는 염기 또는 이 염기 배열의 1 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 가지는 Hu/NLV/Osaka 10-25/1999/JP유전자.
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