KR20120125627A - 칼리시바이러스 바이러스 유사 입자들 상에 표적화된 이종 항원 제공 - Google Patents

칼리시바이러스 바이러스 유사 입자들 상에 표적화된 이종 항원 제공 Download PDF

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KR20120125627A
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브라이언 스테드먼
로스 테일러
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리고사이트 파머슈티컬즈 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 칼리시바이러스 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 서열을 포함하는 입자 형성 키메릭 단백질을 제공한다. 특히, 본 발명은 내부 위치에서 융합된 이종 에피토프를 포함하는 처리된 칼리시바이러스 캡시드 단백질 서열들을 개시하며 변형된 캡시드 단백질들은 숙주 세포에서 발현될 때 바이러스 유사 입자들을 형성하는 능력을 보유한다. 또한 키메릭 단백질 및 백신 제제를 포함하는 바이러스 유사 입자들이 기술된다.

Description

칼리시바이러스 바이러스 유사 입자들 상에 표적화된 이종 항원 제공{TARGETED HETEROLOGOUS ANTIGEN PRESENTATION ON CALICIVIRUS VIRUS-LIKE PARTICLES}
본 출원은 전문이 참조로 본 발명에 포함된 2010년 1월21일에 출원된 미국 가출원 61/297,109의 우선권을 주장한다.
본 발명에 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다: 염기서열의 컴퓨터 판독가능한 포맷 사본(파일명: LIGO_023_01WO_SeqList_ST25.txt, 데이터 기록일: 2011, 1월21일, 파일 크기 20 킬로바이트)
본 발명은 바이러스학, 분자생물학 및 백신 개발의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 칼리시바이러스 캡시드 단백질들에 관한 것이며 이들은 이종 항원 에피토프들을 단백질 서열 속에 삽입하도록 변형될 수 있어서 이종 항원 에피토프들이 변형 캡시드 단백질들로부터 생성된 바이러스 유사 입자들의 표면상에 나타날 수 있다. 이런 변형 캡시드 단백질들 및 바이러스 유사 입자들은 백신 제제들에 유용하다.
많은 현재의 백신들은 병원체들에 대항하는 보호면역반응들을 유도하기 위해 약화된 미생물들을 사용한다. 비록 이런 형태의 백신들이 강한 면역반응들을 일으키지만, 유독성 미생물로의 복귀 가능성 때문에 감염의 잠재적 위험이 존재하며, 따라서 이런 백신들은 일부 환자 집단에서 금기될 수 있다. 그러나 재조합 항원들을 사용하는 다른 백신들은 감염의 위험을 피하나, 일반적으로 살아있는 약화된 백신들보다 더 약한 면역 반응들을 일으킨다. 재조합 항원들에 의한 이러한 약한 면역 반응들은 면역계에 대한 항원들의 비효과적인 제공 때문인 것으로 생각된다. 따라서, 자연적 감염 동안 발생하는 것과 같이 면역계에 대한 항원들의 제공을 더 잘 모방할 수 있는 백신 플랫폼들이 필요하다.
최근에, 바이러스 유사 입자들(VLPs) 또는 수도비리온들은 효과적인 면역반응을 유도하는 항원들을 제공하는데 사용되고 있다. VLPs 및 수도비리온들은 자연적으로 발생하는 감염 입자들과 구조적으로 닮았으나 복제를 위한 필수 바이러스 유전 정보를 포함하지 않는다. VLPs 또는 수도비리온들에 제공된 항원들에 대한 면역 반응들은 통상적으로 가용성 항원들에 대한 반응들보다 훨씬 더 크다. 비록 VLPs가 면역계에 항원들을 효과적으로 제공하기 위한 유용한 플랫폼인 것으로 보이나, VLPs의 효율적인 생산은 일부 바이러스들에 대해서는 성취하기 어려운 것으로 증명되었다. 게다가, 바이러스 캡시드 단백질 서열들의 조작 및 외래 항원 단백질들 또는 단편들의 바이러스 입자들 속으로의 합체는 종종 손상되지 않은 VLPs의 효율적인 생성을 제거하거나 감소시킨다.
따라서, 살아있는 약화된 백신들의 관련 위험들 없이 면역계에 효과적으로 항원들을 제공하는 살아갈 수 있고, 안전한 백신 플랫폼들을 개발하려는 지속적인 요구가 당업계에 존재한다. 게다가, 임의의 관심 항원 또는 다른 병원성 유기체들로부터의 여러 항원이 쉽게 합체될 수 있는 백신 플랫폼들이 바람직하다.
본 발명은 이종 항원 에피토프들이 칼리시바이러스의 캡시드 단백질 속에 삽입될 수 있어서 캡시드 단백질은 VLPs를 형성하는 능력을 보유하게 된다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 본 발명은 칼리시바이러스 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함하는 키메릭 단백질을 제공하며, 키메릭 단백질은 숙주 세포에서 발현될 때 VLPs를 형성할 수 있다. 한 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 P2 도메인 속에 삽입된다. 다른 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 P2 도메인의 하나 이상의 용매 노출 루프(solvent-exposed loops) 속에 삽입된다. 칼리시바이러스는, 예를 들어, 노로바이러스, 사포바이러스, 라고바이러스 또는 베시바이러스일 수 있다.
이종 항원 또는 이의 단편은 캡시드 서열로부터 어떠한 아미노산들도 결실하지 않고 칼리시바이러스 캡시드 서열의 아미노산 서열 속에 직접 삽입될 수 있다. 선택적으로, 이종 항원 또는 단편은 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 하나 이상의 잔기를 대체한다. 이종 항원은 바이러스, 박테리아 및 진핵 병원체와 같은 다양한 병원체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시태양들에서, 이종 항원은 종양 관련 항원 또는 알레르겐으로부터 유래될 수 있다. 이종 항원은 T-세포 또는 B-세포 자극 에피토프일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 키메릭 캡시드 단백질들뿐만 아니라 새로운 키메릭 캡시드 단백질들을 암호화하는 분리된 핵산들 및 벡터들을 포함하는 바이러스 유사 입자들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 키메릭 캡시드 단백질은 노로바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함한다. 노로바이러스는, 예를 들어, 유전자군 I 또는 유전자군 II 노로바이러스일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 키메릭 단백질들을 함유하는 바이러스 유사 입자들을 포함하는 백신 제제를 제공한다. 일부 실시태양에서, 백신 제제는 항원보강제를 더 포함한다. 백신 제제는 액체 제제 또는 마른 분말 제제일 수 있다. 본 발명에서 기술한 대로 백신 제제를 투여함으로써 외래 물질에 대한 면역반응을 유도하는 방법들은 또한 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명은 또한 키메릭 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 숙주 세포에서 본 발명에서 기술된 키메릭 단백질을 발현시키는 단계 및 바이러스 유사 입자들이 형성되는 조건들에서 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양들에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1.A. GI.1 노로바이러스 놀워크 VP1 서브유닛에서 용매 접근가능한 P2 도메인 루프. GI.1 노로바이러스 놀워크 VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1). P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되는 반면, 이런 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 잔기들은 밑줄이 그려지며 볼드체이다. B. 노로바이러스 GII.4 컨센서스(consensus) VP1 서브유닛에서 용매 접근가능한 P2 도메인 루프. 노로바이러스 GII.4 컨센서스 VP1 캡시드 단배질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 2). P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되는 반면, 이런 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 잔기들은 밑줄이 그려지며 볼드체이다.
도 2. 확인된 용매 접근가능한 P2 도메인 루프가 강조된 노로바이러스 GII.4 컨센서스 VP1 서브유닛의 구조 모델.
도 3. A. 주형으로서 놀워크 VP1 원자 구조를 사용하는 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛의 구조 모델. B. 주형으로서 SMSV VP1 원자 구조를 사용하는 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛의 구조 모델.
도 4. A. 주형으로서 놀워크 VP1 원자 구조를 사용하는 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛에서 용매 접근가능한 P2 도메인 루프. 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3). 놀워크 VP1 주형을 기초로, P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되는 반면, 이런 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 잔기들은 밑줄이 그려지며 볼드체이다. B. 주형으로서 SMSV VP1 원자 구조를 사용하는 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛에서 용매 접근가능한 P2 도메인 루프. 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 캡시드 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3). SMSV VP1 주형을 기초로, P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되는 반면, 이런 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 잔기들은 밑줄이 그려지며 볼드체이다.
도 5. 노로바이러스 놀워크(SEQ ID NO: 1) 및 베시바이러스 산 미구엘 바다사자(SMSV; SEQ ID NO: 4) VP1 캡시드 단백질 사이의 아미노산 서열 정렬. 별표들은 동일한 잔기들을 표시하며; 콜론은 보존성 치환을 표시하며; 마침표는 반 보존성 치환을 표시하며; 빈 공간은 비 보존성 치환을 표시한다.
도 6. 노로바이러스 GI.1 놀워크 VP1 서브유닛에서 외래 에피토프의 잔기 대체 및 삽입 위치들(강조됨).
도 7. 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 에피토프 삽입 및 부분 대체 위치들. 인플루엔자 헤마글루티닌 항원으로부터 유래된 9개 아미노산 에피토프(SEQ ID NO:5)는 표시된 아미노산 잔기들 뒤에 바로 삽입되거나 놀워크 VP1 단백질 서열에서 표시된 잔기들을 대체하였다.
도 8. 키메릭 놀워크 VLP 생산의 SDS-PAGE 분석. 인플루엔자 헤마글루티닌 항원으로부터 유래된 9개 아미노산 에피토프는 놀워크 VP1 단백질 서열에서 아미노산 잔기 362 또는 296 뒤에 바로 삽입되었다. 바이러스 유사 입자들은 변형된 VP1 서열들로부터 생성되었고 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 레인 1, 분자량 표준; 레인 2, 362 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 3, 362 원심분리 펠릿 분획; 레인 4, 362 삽입 여과물; 레인 5, 296 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 6, 296 원심분리 펠릿 분획; 및 레인 7, 296 삽입 여과물. 약 57 kDa에서 단백질 밴드들은 키메릭 놀워크 VP1 단백질을 나타낸다.
도 9. 키메릭 놀워크 VLP 생산의 웨스턴 블롯 분석. 헤마글루티닌(HA) 에피토프를 포함하는 키메릭 VLPs의 웨스턴 블롯은 안티-놀워크 항체(왼쪽 패널) 또는 안티-HA 항체(오른쪽 패널)로 탐지하였다. 레인 1, 분자량 표준; 레인 2, VP1 잔기 336에서 HA 에피토프 삽입을 가진 키메릭 VLPs; 레인 3, VP1 잔기 337-341의 HA 에피토프 대체를 가진 키메릭 VLPs; 및 레인 4, 야생형 놀워크 VP1. 약 57 kDa에서 단백질 밴드들은 키메릭 놀워크 VP1 단백질을 나타낸다.
도 10. 연속 흐름 원심분리(CFC)에 의한 키메릭 놀워크 VLPs의 정제. 별표는 손상되지 않은 키메릭 놀워크 VLPs를 나타낸다.
도 11. 크기 배제 크로마토그래피에 의한 키메릭 놀워크 VLPs의 분석. 220mn에서 적색 미량 흡수; 280nm에서 청색 미량 흡수.
도 12. 전자현미경에 의한 키메릭 노로바이러스 VLPs의 분석.
도 13. 연속 흐름 원심분리(CFC)에 의해 키메릭 놀워크 VLPs(29 잔기 RSV-F 단백질 에피토프를 포함)의 정제. 별표는 손상되지 않은 키메릭 놀워크 VLPs를 나타낸다.
도 14. 전자현미경에 의한 키메릭 노로바이러스 VLPs(29 잔기 RSV-F 단백질 에피토프를 포함)의 분석.
도 15. 6 마리 동물 중 2 마리가 안티RSV-F IgG 항체들에서 4배보다 더 큰 증가를 나타내는 혈청 희석의 함수로서 OD에서 배의 증가.
도 16. 두 개의 변형 표면 루프를 포함하는 키메릭 놀워크 VLP 생산의 SDS-PAGE 분석. RSV-F 항원으로부터 유래된 9개 아미노산 에피토프는 잔기 338 및 363에서 동시에 삽입되거나 잔기 337-341을 동시에 대체하며 잔기 363에 삽입되었다. 바이러스 유사 입자들은 변형된 VP1 서열들로부터 생성되며 SDS-PAGE로 분석하였다. 레인 1, 분자량 표준; 레인 2, 338 및 363 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 3, 338 및 363 삽입 원심분리 펠릿 분획; 레인 4, 338 및 363 삽입 여과물; 레인 5, 337-341 대체 및 363 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 6, 337-341 대체 및 363 삽입 원심분리 펠릿 분획; 및 레인 7, 337-341 대체 및 363 삽입 여과물. 약 57 kDa에서 단백질 밴드들은 키메릭 놀워크 VP1 단백질을 나타낸다.
도 17. HA 단백질 서열은 놀워크 VP1 단백질의 아미노산 338 및 339 사이에 삽입되거나 VP1의 아미노산 337-341을 대체하였다. HA-NVLP는 항원보강제 없이 0 및 7일에 복강내로 주사하였다. 혈청은 14일에 수집하였고 ELISA에 의해 항원 특이적 IgM의 존재에 대해 분석하였다. 개개의 결과들은 그룹 기하평균을 나타내는 수평 막대로 나타낸다.
도 18. 도 17의 생쥐는 37일에 AlOH/MPL로 제제화된 HA-NVLP의 추가 면역조치를 받았다. 혈청은 64일에 수집하였고 ELISA에 의한 HA-특이적 IgG의 존재에 대해 분석하였다. 개개의 결과들은 그룹 기하평균을 나타내는 수평 막대로 나타낸다.
본 발명은 이종 펩타이드들이 특히 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 용매 노출 영역들 속에 삽입될 수 있어서 캡시드 단백질은 VLPs를 형성하는 능력을 보유하게 된다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 하나 이상의 이종 항원들이 변형된 캡시드 단백질들로부터 형성된 VLPs의 표면상에서 효과적인 나타나도록 칼리시바이러스 캡시드 단백질을 처리하는 효율적인 전략들을 개발하였다. 따라서, 본 발명은 칼리시바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함하는 키메릭 단백질을 제공하며, 키메릭 단백질은 숙주 세포에서 발현될 때 VLPs를 형성할 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로, "키메릭 단백질"은 둘 이상의 유기체로부터의 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 의미한다. 둘 이상의 펩타이드는 이들의 아미노 또는 카복시 말단에 융합될 수 있다. 선택적으로, 펩타이드들의 하나 이상은 다른 펩타이드 내의 내부 위치에 융합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 키메릭 단백질들은 칼리시바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 또는 이의 일부를 포함한다. 칼리시바이러스 과(Calicivirus 또는 Caliciviridae)는 베시바이러스, 노로바이러스, 라고바이러스 및 사포바이러스 속을 포함한다. 본 발명의 키메릭 단백질들의 캡시드 단백질은 이런 4개의 속 중 임의의 것으로부터의 캡시드 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질은 산 미구엘 바다사자 바이러스인 베시바이러스로부터 유래된다. 한 실시태양에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO:4의 서열을 가진다.
특정 실시태양들에서, 캡시드 단백질은 노로바이러스로부터 유래된다. 노로바이러스 속은 5개 유전자군(GI, GII, GIII, GIV 및 GV)으로 나뉜다. GI, GII 및 GIV 노로바이러스는 인간들에서 감염성인 반면, GIII 노로바이러스는 주로 소 종들을 감염시킨다. GV는 생쥐로부터 최근에 분리되었다(Zheng et al. (2006) Virology, Vol 346: 312-323). 대표적인 GIII는 제나 및 뉴버리 균주인 반면 알파트론, 포트 라우데르달레 및 세인트 클라우드 균주는 대표적인 GIV이다. GI 및 GII 그룹은 유전적 분류를 기초로 하여 유전 클러스터 또는 유전자형으로 추가로 분리될 수 있다(Ando et al. (2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2):S336-S348; Lindell et al. (2005) J. Clin. Microbiol., Vol. 43(3): 1086-1092). 본 발명에 사용된 대로, 유전 클러스터라는 용어는 유전자형이란 용어와 교환적으로 사용된다. 유전자군 I 내에서, (원형 바이러스 균주 이름을 가진) 현재 알려진 8개 GI 클러스터가 있다: GI.1(Norwalk(NV-USA93)); GI.2(Southhampton(SOV-GBR93)); GI.3(Desert Shield(DSV-USA93)); GI.4(Cruise Ship virus/Chiba (Chiba-JPN00)); GI.5(318/Musgrove(Musgrov-GBR00)); GI.6(Hesse (Hesse-DEU98)); GI.7(Wnchest-GBR00); 및 GI.8 (Boxer-USA02). 유전자군 II 내에서, (원형 바이러스 균주 이름을 가진) 현재 알려진 19개 GII 클러스터가 있다: GII.1(Hawaii(Hawaii-USA94)); GII.2(Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95)); GII.3(Toronto(Toronto-CAN93)); GII.4(Bristol/Lordsdale(Bristol-GBR93)); GII.5(290/Hillingdon(Hilingd-GBR00)); GII.6(269/Seacroft (Seacrof-GBR00)); GII.7(273/Leeds (Leeds-GBR00)); GII.8(539/Amsterdam(Amstdam-NLD99)); GII.9(378(VABeach-USA01)), GII.10(Erfurt-DEU01); GII.11(SW9180JPN01); GII.12(Wortley-GBR00); GII.13(Faytvil-USA02); GII.14(M7-USA03); GII.15(J23-USA02); GII.16(Tiffin-USA03); GII.17(CSE1-USA03); GII.18(QW101/2003/US) 및 GII.19(QW170/2003/US). 한 실시태양에서, 캡시드 단백질은 유전자군 I 또는 유전자군 II 노로바이러스로부터 유래된다. 다른 실시태양에서, 캡시드 단백질은 유전자군 I, 유전자형 1(GI.1) 또는 유전자군 II, 유전자형 4(GII.4) 노로바이러스로부터 유래된다.
바람직하게는, 본 발명의 키메릭 단백질 속에 합체된 노로바이러스 캡시드 단백질은 오픈 리딩 프레임(ORF)2에 의해 암호화된 주요 캡시드 단백질인 VP1이다. 한 실시태양에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가진다. 새로운 키메릭 단백질들의 캡시드 단백질 성분은 공지된 노로바이러스 균주들 중 임의의 것의 주요 캡시드 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 등록: 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/West Chester/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502016; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502015; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Fayette/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502014; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502013; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502012; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Canton/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502011; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502010; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY50200; 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502008; 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/CS-841/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502007; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Hiram/2000/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502006; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502005; 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No. 6,572,862, WO 1994/05700, 및 WO 05/032457, 이의 전부는 전문이 참조로 본 발명에 포함된다. 또한 노로바이러스들의 서열 비교 및 유전 다양성 및 계통 발생 분석의 논의에 대해 Green et al . (2000) J. Infect. Dis., Vol. 181(Suppl. 2):S322-330; Wang et al . (1994) J. Virol., Vol. 68:5982-5990; Chen et al . (2004) J. Virol., Vol. 78: 6469-6479; Chakravarty et al . (2005) J. Virol., Vol. 79: 554-568; Hansman et al . (2006) J. Gen. Virol., Vol. 87:909-919; Bull et al . (2006) J. Clin. Micro., Vol. 44(2):327-333; Siebenga, et al . (2007) J. Virol., Vol. 81(18):9932-9941, 및 Fankhauser et al . (1998) J. Infect. Dis., Vol. 178:1571-1578 참조.
다른 실시태양에서, 키메릭 단백질들의 캡시드 단백질 성분은 노로바이러스의 둘 이상의 순환 균주로부터 유래된 복합 캡시드 단백질이다. 둘 이상의 순환 노로바이러스 균주들로부터의 아미노산 서열들을 포함하는 복합 캡시드 단백질 서열들은 2009년 8월10일에 출원된 국제출원번호 PCT/US2009/053249에 기술되며, 참조로 본 발명에 포함된다. 한 실시태양에서, 복합 캡시드 단백질은 유전자군 II.4 노로바이러스의 둘 이상의 순환 균주로부터 유래된다. 한 특정 실시태양에서, 복합 캡시드 단백질은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가진다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 단백질들은 사포바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함한다. 사포바이러스 속은 5개의 다른 유전자군(GI-GV)으로 추가로 분류될 수 있다. 캡시드 단백질은 5개 유전자군의 임의의 것에서 사포바이러스의 VP1 캡시드 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 캡시드 단백질은 사포 바이러스, London/29845 바이러스, Hu/Yokohama16-4/2007/JP 바이러스, 맨체스터 바이러스, Houston/86 바이러스, Houston/90 바이러스 및 파크빌레 바이러스의 캡시드 단백질로부터 유래된다. 한 특정 실시태양에서, 캡시드 단백질은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 가진다. 새로운 키메릭 단백질들의 캡시드 단백질 성분은 공지된 사포바이러스 균주들의 임의의 것의 주요 캡시드 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 진뱅크 등록: 사포바이러스 Mc10, 진뱅크 등록번호 No. NC.sub.--010624; 사포로 바이러스, 진뱅크 등록번호 No. U65427; 사포바이러스 Mc10, 진뱅크 등록번호 No. AY237420; 사포바이러스 SaKaeo-15/Thailand, 진뱅크 등록번호 No. AY646855; 사포로 바이러스, 진뱅크 등록번호 No. NC.sub.--006269; 사포바이러스 C12, 진뱅크 등록번호 No. NC.sub.--006554; 사포바이러스 C12, 진뱅크 등록번호 No. AY603425; 사포바이러스 Hu/Dresden/pJG-Sap01/DE, 진뱅크 등록번호 No. AY694184; 인간 칼리시바이러스 SLV/cruise ship/2000/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY289804; 인간 칼리시바이러스 SLV/Arg39, 진뱅크 등록번호 No. AY289803; 돼지 장 칼리시바이러스 균주 LL14, 진뱅크 등록번호 No. AY425671; 돼지 장 칼리시바이러스, 진뱅크 등록번호 No. NC.sub.--000940; 인간 칼리시바이러스 균주 Mc37, 진뱅크 등록번호 No. AY237415; 밍크 장 칼리시바이러스 균주 Canada 151A, 진뱅크 등록번호 No. AY144337; 인간 칼리시바이러스 SLV/Hou7-1181, 진뱅크 등록번호 No. AF435814; 인간 칼리시바이러스 SLV/Mex14917/2000, 진뱅크 등록번호 No. AF435813; 인간 칼리시바이러스 SLV/Mex340/1990, 진뱅크 등록번호 No. AF435812; 돼지 장 칼리시바이러스, 진뱅크 등록번호 No. AF182760; 사포로 바이러스-London/29845, 진뱅크 등록번호 No. U95645; 사포로 바이러스-맨체스터, 진뱅크 등록번호 No. X86560; 사포로 바이러스-Houston/86, 진뱅크 등록번호 No. U95643; 사포로 바이러스-Houston/90, 진뱅크 등록번호 No. U95644; 및 인간 칼리시바이러스 균주 HuCV/Potsdam/2000/DEU, 진뱅크 등록번호 No. AF294739; (본 출원의 출원일에 등록된) 것의 전부의 서열들은 참조로 본 발명에 포함된다. 또한 사포바이러스들의 서열 비교 및 유전 다양성 및 계통 발생 분석의 논의에 대해Schuffenecker et al. (2001) Arch Virol., Vol. 146(11):2115-2132; Zintz et al. (2005) Infect. Genet. Evol., Vol. 5:281-290; Farkas et al. (2004) Arch. Virol., Vol. 149:1309-1323 참조.
칼리시바이러스들의 주요 캡시드 단백질들은 별개의 도메인들로 구성된다: 껍질 또는 "S" 도메인 및 돌출 도메인 또는 "P" 도메인, 추가로 P1 및 P2 도메인으로 분리된다. 캡시드 모노머들의 "S" 도메인들은 합체되어 바이러스 코트(viral coat)의 껍질을 형성하는 반면, 줄기-유사 P1 도메인 및 구형 P2 도메인은 아치 유사 구조에서 껍질로부터 밖으로 돌출된다. 칼리시바이러스 구조의 특징 묘사를 위해 Prasad et al . (2000) Journal of Infectious Diseases, Vol. 181: S317-S321 참조. P2 구형 도메인은 바이러스 캡시드의 표면상에 위치하며 항원 결정요인을 포함하며 숙주 특이성을 탐지하는 것으로 생각된다(예를 들어, Crisci et al. (2009) Virology, Vol. 387: 303-312; Kumar et al. (2007) Journal of Virology, Vol. 81: 1119-1128; Katpally et al. (2008) Journal of Virology, Vol. 82: 2079-2088 참조). P1 도메인 및 P2 도메인의 일부들은 캡시드 구조를 안정화하기 위해 필요하다. 본 발명자들은 이종 항원들로부터의 아미노산 서열들이 캡시드 구조를 파괴하지 않고 삽입될 수 있는 P2 도메인의 특정한 용매-노출 루프 영역을 확인하였다(실시예 1 참조). 따라서, 한 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 본 발명의 키메릭 단백질들을 형성하기 위해 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 P2 도메인 속에 삽입된다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 칼리시바이러스 캡시드의 P2 도메인의 적어도 하나의 용매 노출 루프 속에 삽입된다. 본 발명에 사용된 대로, "용매 노출된" 또는 "용매 접근가능한"은 (소수성 코어, VLP 내부, 또는 단백질-단백질 계면 보다는) 캡시드 모노머의 외부 표면상에 위치한 아미노산 잔기들을 의미하며, 모노머가 결합된 VLP에서 이의 자연 형태로 접힌다. 본 발명의 발명자들은 칼리시바이러스 캡시드 단백질들에서 P2 도메인뿐만 아니라 용매 노출 루프 도메인을 확인하기 위해 본 발명에 기술된 대로 서열 정렬, 3D 구조 분석 및 3D 구조 모델링을 사용하였다(실시예 1 참조). 유사한 방법 및 Geno3D2 및 Swiss PDB 뷰어와 같은 소프트웨어 애플리케이션이 캡시드 단백질들에서 다른 적절한 용매 노출 루프 잔기들을 확인하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
특정 실시태양들에서, 이종 항원 또는 이의 단편이 삽입될 수 있는 노로바이러스 캡시드 단백질에서 적절한 용매 노출 루프들은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 293-300, SEQ ID NO: 1의 아미노산 305-313, SEQ ID NO: 1의 아미노산 335-342, SEQ ID NO: 1의 아미노산 348-351, SEQ ID NO: 1의 아미노산 362-368, SEQ ID NO: 1의 아미노산 380-386, SEQ ID NO: 1의 아미노산 397-405, SEQ ID NO: 2의 아미노산 293-300, SEQ ID NO: 2의 아미노산 306-317, SEQ ID NO: 2의 아미노산 338-346, SEQ ID NO: 2의 아미노산 354-357, SEQ ID NO: 2의 아미노산 366-375, 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 388-405을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 도 1A 및 1B의 밑줄 그려진 볼드체 영역 참조). 다른 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편이 삽입될 수 있는 사포바이러스 캡시드 단백질에서 적절한 용매 노출 루프들은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 296-315, SEQ ID NO: 3의 아미노산 327-334, SEQ ID NO: 3의 아미노산 355-363, SEQ ID NO: 3의 아미노산 374-377, SEQ ID NO: 3의 아미노산 388-394, SEQ ID NO: 3의 아미노산 404-410, SEQ ID NO: 3의 아미노산 414-429, SEQ ID NO: 3의 아미노산 281-297, SEQ ID NO: 3의 아미노산 304-307, SEQ ID NO: 3의 아미노산 313-317, SEQ ID NO: 3의 아미노산 327-339, SEQ ID NO: 3의 아미노산 349-354, SEQ ID NO: 3의 아미노산 365-389, SEQ ID NO: 3의 아미노산 396-402 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 421-424를 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 도 4A 및 4B의 밑줄 그려진 볼드체 영역 참조). 하나 이상의 이종 항원 또는 이의 단편은 용매 노출 루프에서 아미노산들의 하나 이상 또는 전부 속에 삽입되거나 이들을 대체할 수 있다.
하나 이상의 이종 항원 또는 이의 단편은 P2 도메인의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 용매 노출 루프와 같은 P2 도메인의 여러 용매 노출 루프 속에 삽입될 수 있다. 동일한 이종 항원 서열의 여러 복제물이 다양한 용매 노출 루프 속에 삽입될 수 있다. 추가로 또는 선택적으로, 다른 이종 항원 서열들은 복수의 유기체로부터의 펩타이드 서열들을 포함하는 키메릭 단백질, 하나 이상의 유기체들로부터의 복수의 단백질 또는 하나 이상의 단백질로부터의 복수의 영역을 형성하기 위해 다른 용매 노출 루프 속에 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 단백질들을 형성하기 위해서, 이종 항원들 또는 펩타이드들의 아미노산 서열들은 캡시드 아미노산 잔기들의 결실 없이 칼시바이러스 캡시드 서열 속으로 직접 삽입된다. 바람직하게는, 이종 아미노산 서열들은 P2 도메인의 용매 노출 루프 영역 내에서 직접 융합된다. 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 서열은 GI.1 놀워크 VP1 캡시드 서열(SEQ ID NO: 1) 속에 삽입된다. 놀워크 VP1 캡시드 서열 속으로 이종 항원 서열들의 바람직한 삽입 위치들은 SEQ ID NO: 1의 위치 295에 있는 아스파라긴 잔기, 위치 296에 있는 글리신 잔기, 위치 308에 있는 프롤린 잔기, 위치 336에 있는 글리신 잔기, 위치 338에 있는 세린 잔기, 위치 362에 있는 아스파라긴 잔기, 위치 363에 있는 글리신 잔기, 위치 382에 있는 프롤린 잔기, 위치 383에 있는 세린 잔기, 위치 399에 있는 아이소루신 잔기 또는 위치 402에 있는 알라닌 잔기 바로 다음의 삽입들을 포함한다.
다른 실시태양에서, 이종 항원들 또는 펩타이드들의 아미노산 서열들은 본 발명의 키메릭 단백질들에서 칼리시바이러스 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대체한다. 예를 들어, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 캡시드 단백질의 약 1개 내지 약 50개 아미노산, 약 2개 내지 약 40개 아미노산, 약 4개 내지 약 20개 아미노산, 약 8개 내지 약 15개 아미노산, 또는 약 10개 내지 약 30개 아미노산을 대체한다. 한 구체적인 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 캡시드 단백질의 약 5개 아미노산을 대체한다. 일부 실시태양에서, 적어도 하나의 이종 항원 서열은 놀워크 VP1 캡시드 서열(SEQ ID NO: 1)의 적어도 하나의 아미노산을 대체한다. 한 실시태양에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 337-341은 이종 아미노산 서열에 의해 대체된다. 다른 실시태양에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 294-298, 아미노산 307-311, 아미노산 362-366, 아미노산 381-385 또는 아미노산 401-405는 이종 아미노산 서열에 의해 대체된다. 일부 실시태양에서, 이종 아미노산 서열은 캡시드 단백질의 용매 노출 루프에서 모든 아미노산을 대체한다.
본 발명의 키메릭 단백질들은 선택적으로 링커 서열(예를 들어, 약 1개 내지 약 10개 아미노산 이상)을 통해, 캡시드 단백질 서열에 또는 내부에 융합된 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함한다. "이종 항원"은 캡시드 단백질이 유래되는 종들과 다른 종들로부터의 면역원성 단백질 또는 펩타이드를 의미한다.
일부 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 항원 에피토프를 포함한다. "항원 에피토프"는 면역계의 항체들 또는 세포들에 의해 인식되는 3차원 구조를 의미한다. 본 발명에 사용된 대로, 항원 에피토프는 T-세포 및 B-세포 에피토프뿐만 아니라 항체 결합 에피토프를 포함한다. 한 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 미모토프를 포함한다. 미모토프는 에피토프의 구조를 모방하는 선형 아미노산 서열이며 결과적으로 에피토프에 결합하는 항원들에 의해 인식된다. 다른 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 불연속적 에피토프를 나타내는 복합 선형 아미노산 서열 또는 불연속적 에피토프의 일부를 포함하는 선형 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 불연속적 에피토프의 일부를 포함하는 이종 항원 서열들은 인접한 용매 노출 루프 영역 속에 삽입될 수 있어서 삽입된 서열들은 불연속적 에피토프를 생성하기 위해 서로 접촉한다. 항원 에피토프들 및 미모토프들은 일반적인 병원성 물질들로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 본 발명에서 유용한 T-세포 에피토프들은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F 단백질에 대한 면역원성 T-세포 에피토프(Levely et al. (1991) Journal of Virology, Vol. 65: 3789-3796) 또는 RSV로부터의 핵단백질-특이적 세포독성 T-세포 에피토프(Venter et al. (2003) Journal of Virology, Vol. 77: 7319-7329)일 수 있다. 당업자는 단백질 마이크로어레이를 사용하는 에피토프 매핑, ELISPOT 분석법 및 ELISA 분석법, 파아지 디스플레이 분석, 및 항원/항체 복합체들의 구조 모델링을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계의 일상적인 방법들을 사용하는 본 발명의 키메릭 단백질들 속에 삽입하기 위한 다른 적절한 에피토프들을 확인할 수 있다.
특정 실시태양들에서, 여러 에피토프는 후속 스크리닝을 위한 하나 이상의 에피토프 라이브러리들을 제공하기 위해 본 발명의 키메릭 단백질들 속에 삽입될 수 있다.
다른 실시태양에서, 칼리시바이러스 캡시드 단백질에 삽입된 외래 서열은 특정 외래 항원에 대한 고 친화력 결합 부위를 포함한다. 이런 방법을 위해서, 고 친화력 결합 부위의 인식은 외래 항원의 고유 특성일 수 있거나 외래 항원이 고 친화력 결합 부위를 인식하는 단백질에 융합되는 구조체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 고 친화력 결합 부위는 파라토프 또는 외래 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 부위일 수 있거나 수용체와 같은 외래 항원과 상호작용하는 단백질의 결합 영역일 수 있다. 일부 실시태양에서, 고 친화력 결합 부위는 폴리프롤린 모티프(SH2 도메인들에 의해 인식), 루신 지퍼(루신 지퍼 모티프를 포함하는 결합 파트너에 의해 인식) 또는 에피토프(항체 단편의 항원 결합 부위에 의해 인식)와 같은 짧고, 선형인 결합 모티프일 수 있다. 이런 실시태양들에서, 외래 항원은 (VP1 서브유닛 속에 가공된) 짧고, 선형인 펩타이드 결합 모티프를 인식하는 결합 부위에 부착되며 외래 항원 결합 부위를 포함하는 키메릭 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자들에 비 공유결합적으로 결합된다.
이종 항원 또는 이의 단편은 임의의 길이, 더욱 구체적으로 길이가 약 5개 내지 약 70개 아미노산, 길이가 약 8개 내지 약 50개 아미노산, 길이가 약 10개 내지 약 40개 아미노산, 길이가 약 15개 내지 약 35개 아미노산 또는 길이가 약 20개 내지 약 30개 아미노산일 수 있다. 일부 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 길이가 약 5개 내지 약 20개 아미노산이다. 이종 항원 또는 이의 단편은 임의적 링커 서열을 통해 칼리시바이러스 캡시드 서열에 융합될 수 있다. 링커 서열은 약 1개 내지 약 10개 아미노산 이상일 수 있다.
이종 항원 또는 이의 단편은 바이러스들, 박테리아들 및 진핵 병원체들과 같은 다양한 병원성 물질들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 이종 항원은 바이러스로부터 유래된다. 이종 항원들이 유래될 수 있는 바이러스들은 레트로바이러스(Retroviridae)(예를 들어, HIV-1(또한 HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로 불림)와 같은 인간 면역결핍 바이러스; 및 HIV-LP와 같은 다른 분리주들; 피코마바이러스(Picomaviridae)(예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 장바이러스, 인간 콕사키바이러스, 리히노바이러스, 에코바이러스); 칼시바이러스(Calciviridae)(예를 들어, 놀워크 및 관련 바이러스를 포함하는, 위장관염을 일으키는 균주들; 토가바이러스(Togaviridae)(예를 들어, 마 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라바이러스(Flaviridae)(예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황색열 바이러스); 코로노바이러스(Coronoviridae)(예를 들어, 코로노바이러스); 랍도바이러스(Rhabdoviradae)(예를 들어, 수포성구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로바이러스(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)(예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 메타뉴모바이러스); 오르쏘믹소바이러스(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분야바이러스(Bunyaviridae)(예를 들어, 한탄 바이러스, 분야 바이러스, 필레보바이러스 및 나이로바이러스); 아레나바이러스(Arenaviridae)(바이러스성 출혈열); 레오바이러스(Reoviridae)(예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비마바이러스(Bimaviridae); 간염바이러스(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스); 파보바이러스(Parvovirida) (파보바이러스); 파포바바이러스(Papovaviridae) (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노바이러스(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스바이러스(Herpesviridae)(단순포진바이러스(HSV) 1 및 2, 바리셀라-조스터 바이러스, 거대세포바이러스(CMV), 헤르페스바이러스); 폭스바이러스(Poxviridae)(천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도바이러스(Iridoviridae)(예를 들어, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스(예를 들어, 해면상뇌증의 발병 물질, 델타 간염 물질(B형 간염 바이러스의 결손 위성(defective satellite)으로 생각됨), 비 A 및 비 B 간염의 물질(분류 1 = 내부로 전달됨; 분류 2 = 경구로 전달됨(즉, C형 간염); 및 아스트로바이러스(astroviruses)를 포함한다. 특정 실시태양에서, 바이러스는 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 및 메타뉴모 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스 F 단백질로부터 유래된 260LINDMPITN268 (SEQ ID NO: 6) 또는 250YMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV278 (SEQ ID NO: 7)와 같은 표적 서열들은 키메릭 칼리시바이러스 VLPs를 생성하는데 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, 바이러스는 칼리시바이러스이다. 예를 들어, 이종 항원은 본 발명에 기술된 칼리시바이러스의 균주들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
일부 실시태양에서, 이종 항원은 박테리아 병원체로부터 유래된다. 이종항원이 유래될 수 있는 박테리아는 병원성 파스튜렐라 종들(Pasteurella species) (예를 들어, 파스튜렐라성 폐렴(Pasteurella multocida)), 스타필로콕시 종들(Staphylococci species) (예를 들어, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)), 스트렙토코커스 종들(Streptococcus species)(예를 들어, 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토코커스), 연쇄상구균(Streptococcus agalactiae)(그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스(Streptococcus)(비리단스 그룹(viridans group)), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스(Streptococcus)(혐기성 종들), 폐구균(Streptococcus pneumoniae)), 나이세리아 종들(Neisseria species)(예를 들어, 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae)), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 대장균 종들(Escherichia species)(예를 들어, 장관 독 생성성 대장균(enterotoxigenic E. coli (ETEC), 장관 병원성 대장균(enteropathogenic E. coli (EPEC)), 장출혈성대장균(enterohemorrhagic E. coli (EHEC)), 및 장침입성 대장균(enteroinvasive E. coli (EIEC)), 백일해 종들(Bordetella species), 캠필로박터 종들(Campylobacter species), 레지오넬라 종들(Legionella species)(예를 들어, 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)), 수도모나스 종들(Pseudomonas species), 시겔라 종들(Shigella species), 비브리오 종들(Vibrio species), 여시니아 종들(Yersinia species), 살모넬라 종들(Salmonella species), 헤모필루스 종들(Haemophilus species)(예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)), 부르셀라 종들(Brucella species), 프란시셀라 종들(Francisella species), 박테로이드스 종들(Bacterioides species), 클로스트리디아 종들(Clostridia species)(예를 들어, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)), 마이코박테리아 종들(Mycobacteria species)(예를 들어, 마이코박테리움 튜버큐로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀루라레(M. intracellulare), 마이코박테리움 칸사이(M. kansaii), 마이코박테리움 고르도나에(M. gordonae), 헬리코박터 피로리스(Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 엔테로코커스(Enterococcus species), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 에리시펠로트릭스 리허시오파티아(Erysipelothrix rhusiopathiae), 엔테로박터 에어로지네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 푸소박테리아 뉴클레아튬(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실루스 모닐리포미스(Streptobacillus moniliformis) 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 및 악티노미세스 이스라엘리(Actinomyces israeli)를 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 병원성 곰팡이 및 기생충과 같은 진핵 병원체로부터 유래된다. 이종 항원이 유래될 수 있는 곰팡이는 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즈마 캡설라텀(Histoplasma capsulatum), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스페르지루스 푸미가타(Aspergillus fumigata), 아스페르지루스 플라버스(Aspergillus flavus) 및 스포로트릭스 스켄키(Sporothrix schenckii)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이종 항원이 유래될 수 있는 다른 진핵 병원체들은 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale) 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax); 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii); 트립파노소마 부루세이(Trypanosoma brucei), 트립파노소마 크루치(Trypanosoma cruzi); 스치스토소마 해마토비움(Schistosoma haematobium), 스치스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 스치스토소마 자포니컴(Schistosoma japonicum); 레이시마니아 도노바니(Leishmania donovani); 지아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis); 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum) 등과 같은 병원성 원생동물, 연충, 병원체를 포함한다.
본 발명의 특정 실시태양들에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 종양 관련 항원(TAA)으로부터 유래된다. 다양한 공지된 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원(TAA) 중 임의의 것이 본 발명의 키메릭 단백질에 포함될 하나 이상의 이종 항원들 또는 이의 단편들로 사용될 수 있다(Hirohashi, et al. (2009) Cancer Sci., Vol. 100(5):798-806). 본 발명의 키메릭 단백질에 사용될 수 있는 종양 관련 항원들(또는 이의 에피토프-함유 단편들)은 MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, 고분자량 흑색종 관련 항원 MAA, GD2, 태아성 암 항원(CEA), TAG-72, 난소 관련 항원 OV-TL3 및 MOV18, TUAN, 알파-페토프로틴(AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, 신장 종양 관련 항원 G250, EGP-40(또한 EpCAM로도 알려짐), S100(악성 흑색종 관련 항원), p53 및 p21ras를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기한 것 중 임의의 것을 포함하는 임의의 TAA(또는 이의 에피토프)의 합성 유사체가 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 이종 항원 또는 이의 단편은 알레르겐으로부터 유래된다. 하나 이상의 이종 항원 또는 이의 단편이 유래될 수 있는 알레르겐들은 환경 공기알레르겐; 돼지풀/건초열과 같은 식물 꽃가루; 잡초 꽃가루 알레르겐; 풀 꽃가루 알레르겐; 존슨 그래스; 나무 꽃가루 알레르겐; 독보리; 집먼지 진드기 알레르겐과 같은 거미류 알레르겐(예를 들어, Der p I, Der f I 등); 저장 진드기 알레르겐; 삼나무 꽃가루/건초열; 곰팡이 포자 알레르겐; 동물 알레르겐(예를 들어, 개, 기니피그, 햄스터, 게르빌루스 쥐, 생쥐, 쥐 등., 알레르겐); 음식 알레르겐(예를 들어, 갑각류의 알레르겐; 땅콩과 같은 견과류; 감귤류 과일); 곤충 알레르겐; 독액:(벌목, 땡벌, 꿀벌, 말벌, 장수말벌, 불개미); 바퀴벌레, 벼룩, 모기 등으로부터의 다른 환경 곤충 알레르겐; 연쇄구균 항원과 같은 박테리아 알레르겐; 장 항원과 같은 기생충 알레르겐; 바이러스 항원; 곰팡이 포자; 약물 알레르겐; 항생제; 페니실린 및 관련 화합물들; 다른 항생제; 호르몬(인슐린), 효소(스트렙토키나아제)와 같은 전 단백질; 밀가루와 같은 직업성 알레르겐(예를 들어, 제빵사 천식을 일으키는 알레르겐), 캐스터 빈, 커피빈; 벼룩 알레르겐; 및 비인간 동물들의 인간 단백질들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 천연, 동물 및 식물 알레르겐의 예들은 다음 속들에 특이적인 단백질들을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 개(Canis familiaris); 진드기(예를 들어, Dermatophagoides farinae); 고양이(Felis domesticus); 암브로시아(Ambrosia artemiisfolia); 호밀풀(예를 들어, Lolium perenne 또는 Lolium multiflorum); 삼나무(Cryptomeria japonica); 곰팡이 (Altemaria altemata); 오리나무; 물오리나무(Alnus gultinoas); 물박달나무(Betula verrucosa); 상수리나무(Quercus alba); 상록나무(Olea europa); 쑥(Artemisia vulgaris); 질경이(예를 들어, Plantago lanceolata); 개물통이(예를 들어, Parietaria officinalis 또는 Parietaria judaica); 독일바퀴(예를 들어, Blattella germanica); 꿀벌(예를 들어, Apis multiflorum); 노송나무(예를 들어, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica 및 Cupressus macrocarpa); 노간주나무(예를 들어, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis 및 Juniperus ashei); 측백나무(예를 들어, Thuya orientalis); 편백나무(예를 들어, Chamaecyparis obtusa); 미국바퀴(예를 들어, Periplaneta americana); 잔디(예를 들어, Agropyron repens); 호밀(예를 들어, Secale cereale); 밀(예를 들어, Triticum aestivum); 오리새(예를 들어, Dactylis glomerata); 김의털(예를 들어, Festuca elatior); 포아풀(예를 들어, Poapratensis 또는 Poa compressa); 보리(예를 들어, Avena sativa); 흰털새(예를 들어, Holcus lanatus); 향모(예를 들어, Anthoxanthum odoratum); 개나래새(예를 들어, Arrhenatherun elatius); 겨이삭(예를 들어, Agrostis alba); 큰조아재비(예를 들어, Phleum pratense); 갈풀(예를 들어, Phalaris arundinacea); 참새피(예를 들어, Paspalum notatum); 수수(예를 들어, Sorghum halepensis); 및 새귀리(예를 들어, Bromus inermis).
본 발명은 본 발명에 기술된 대로 키메릭 단백질을 암호화하는 분리된 핵산들 및 벡터들을 포함한다. 한 실시태양에서, 분리된 핵산은 P2 도메인을 가진 칼리시바이러스 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함하는 키메릭 단백질을 암호화하며, 상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 상기 P2 도메인 속에 삽입된다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 대로 키메릭 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 키메릭 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포일 수 있다.
본 발명의 키메릭 단백질들 및 이를 암호화하는 분리된 핵산들은 당업계에 공지된 일상적인 방법들에 의해 제조될 수 있다. 캡시드 단백질들은 이들이 자연적으로 발생하는 특정 칼리시바이러스로부터의 분리 및 정제에 의해 제조될 수 있거나 재조합 기술들에 의해 제조될 수 있다. 원하는 입자 형성 폴리펩타이드들에 대한 암호화 서열들이 분리되거나 합성된 후, 암호화 서열들은 발현을 위한 임의의 적절한 벡터 또는 레플리콘 속에 복제될 수 있다. 여러 복제/발현 벡터들은 당업자에게 공지되어 있고 적절한 복제/발현 벡터의 선택은 당업자의 이해력 내에 있다. 하나 이상의 이종 항원 서열들은 DNA 합성, PCR 돌연변이 및 제한 엔도뉴클레아제 소화 및 뒤이어 DNA 결찰을 포함하는 일상적인 기술들 및 분자 생물학적 방법들을 사용하여 칼리시바이러스 캡시드 단백질 서열 내의 지정된 위치들 속에 삽입될 수 있다.
복제, 돌연변이 등과 같은 본 발명에 사용가능한 분자 생물학 기술들을 기술하는 일반적인 책들은 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al ., Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,("Ausubel")을 포함한다. 이런 책들은 돌연변이, 벡터들의 사용, 프로모터 및 키메릭 캡시드 단백질들의 복제 및 발현과 관련된 여러 다른 관련 주제들을 기술한다.
본 발명의 키메릭 단백질들은 숙주 세포에서 발현될 때 바이러스 유사 입자들(VLPs)을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 대로 키메릭 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 포함한다. 본 발명자들은 이종 아미노산 서열들을 포함하기 위해 칼리시바이러스의 캡시드 단백질 서열들을 처리하면서 VLPs를 형성하는 캡시드 단백질의 능력을 보유하기 위한 독특한 전략을 발견하였다. 일부 실시태양들에서, 키메릭 단백질은 마이너 캡시드 단백질 VP2와 같은 칼리시바이러스로부터 하나 이상의 구조 단백질과 함께 발현된다. 추가 구조 단백질들은 키메릭 단백질이 유래되는 동일한 칼리시바이러스로부터 유래될 수 있거나 다른 칼리시바이러스로부터 유래될 수 있다.
특정 실시태양들에서, VLPs는 본 발명의 키메릭 단백질 및 칼리시바이러스로부터의 천연 캡시드 단백질을 포함한다. 단지 예로서, VLP는 키메릭 단백질 및 놀워크 VP1 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. VLP에서 키메릭 단백질 대 천연 캡시드 단백질의 비율은 VLP 형성을 증가시키도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 단백질 대 천연 캡시드 단백질의 비율은 VLP은 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1 또는 약 1:1일 수 있다. 키메릭 및 천연 캡시드 단백질들의 혼합물을 포함하는 VLPs는 개별적으로 캡시드 단백질들(즉, 키메릭 및 천연)의 각각을 발현하고, 단백질들을 정제하고 혼합된 VLPs를 형성하기 위해 원하는 비율로 두 정제된 캡시드 단백질을 혼합하여 생성될 수 있다. 선택적으로, 키메릭 및 천연 캡시드 단백질들은 두 개의 다른 프로모터로부터의 숙주 세포에서 함께 발현될 수 있다. 다른 강도의 프로모터들의 사용이 최종 VLPs에서 키메릭 단백질 대 천연 캡시드 단백질의 비율을 제어하게 한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 단백질들은 VLP 형성을 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 캡시드 아미노산 서열 및/또는 이종 항원 아미노산 서열의 용매 노출 루프 지역들은 키메릭 단백질의 구조를 제어하기 위해 하나 이상의 모티프를 포함하도록 가공될 수 있다. 이런 안정화 모티프들은 이온 상호작용(예를 들어 염 다리), 금속 배위(예를 들어 아연 핑거(zinc finger), 소수성 상호작용(예를 들어 루신 지퍼(leucine zipper) 또는 공유 상호작용(예를 들어 이황화 결합 형성)을 포함하는 메커니즘들을 통해 원하는 단백질 접촉들을 일으키도록 설계될 수 있다.
본 발명은 키메릭 VLP를 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 숙주 세포에서 본 발명의 키메릭 단백질을 발현하고 VLPs가 형성되는 조건에서 상기 숙주 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 본 발명에서 기술한 대로 키메릭 단백질 서열을 암호화하는 벡터는 적절한 숙주 세포를 변형하기 위해 사용된다. 적절한 재조합 발현 시스템은 박테리아(예를 들어, E. coli , Bacillus subtilis, 및 Streptococcus), 바큘로바이러스/곤충, 백시니아, 셈리키 삼림 바이러스(SFV), 알파바이러스(Sindbis, Venezuelan Equine Encephalitis (VEE)), 포유류(예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HEK-293 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 생쥐 흑색종(SB20) 및 원숭이 신장 세포(COS)), 효모(예를 들어, S. cerevisiae, S. pombe , Pichia pastori 및 다른 Pichia 발현 시스템), 식물 및 제노푸스 발현 시스템뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 발현 시스템들은 포유류 세포주, 박테리아, 곤충 세포 및 효모 발현 시스템이다. 세포 제거 전사 번역 시스템은 키메릭 VLPs의 생산을 위한 다른 방법을 나타낸다.
특정 실시태양들에서, 키메릭 VLPs는 이집트 숲모기(Aedes aegypti), 누에나방(Bombyx mori), 노랑초파리(Drosophila melanogaster), 도둑나방(Spodoptera frugiperda)(Sf9), 및 양배추금무늬나방(Trichoplusia ni)(예를 들어, High Five, TniPro)과 같은 곤충 세포들로 제조된다. 곤충 세포 배양액에서 VLPs를 생산하는 절차들은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 전문이 참조로 본 명세서에 포함된 미국특허 6,942,865 참조). 간략하게, 키메릭 캡시드 서열을 지니는 재조합 바큘로바이러스들은 표적 유전자를 암호화하는 합성 또는 복제 리딩 프레임들을 삽입함으로써 제조된다. 재조합 바큘로바이러스들은 곤충 배양액(예를 들어, Sf9, High Five 및 TniPro 세포들)을 감염시키는데 사용하고 키메릭 VLPs는 세포 배양액으로부터 분리될 수 있다. "키메릭 VLP"는 본 발명에 기술된 대로 키메릭 아미노산 서열을 가진 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 VLP이다.
VLPs가 세포 내로 형성되는 경우, 세포들은 세포들을 용해하면서 VLPs를 실질적으로 손상시키지 않는 화학적, 물리적 또는 기계적 수단들을 사용하여 파열된다. 이런 방법들은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990)에 기술된다.
그런 후에 입자들은 수크로오스 구배, PEG-침전, 펠렛팅 등(예를 들어, Kirnbauer et al. J. Virol. (1993) 67:6929-6936 참조)과 같은 밀도 구배 원심분리뿐만 아니라 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법들을 포함하는 표준 정제 기술들과 같이 이들의 무결성을 보존하는 방법들을 사용하여 분리(또는 실질적으로 정제)된다.
일부 실시태양에서, 키메릭 VLP는 키메릭 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터의 투여에 의해 생체 내에서 생산된다. 적절한 벡터들은 소수포성 구내염 바이러스(VSV) 벡터, 뇌염 바이러스(EEV) 벡터, 폭스바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 및 pFastBac1, pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVL와 같은 발현 플라스미드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 적절한 벡터들은 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명은 본 발명에 기술된 대로 하나 이상의 VLPs를 포함하는 백신 제제를 제공한다. 한 실시태양에서, 백신 제제는 키메릭 VLP를 포함하며, 상기 키메릭 VLP는 P2 도메인을 가진 칼리시바이러스 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 함유하는 키메릭 단백질을 포함하며, 상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 상기 P2 도메인 속에 삽입된다. 특정 실시태양에서, 키메릭 단백질에 있는 칼리시바이러스 캡시드 단백질은 노로바이러스 또는 사포바이러스 캡시드 단백질이다. 한 특정 실시태양에서, 키메릭 단백질은 노로바이러스 유전자군 I 또는 유전자군 II 노로바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 키메릭 단백질은 GI.1 또는 GII.4 노로바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 적어도 하나의 키메릭 VLP를 포함하는 백신 제제는 항원보강제를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 백신 제제는 항원보강제를 더 포함한다. 대부분의 항원보강제는 빠른 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 설계된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일 및 단백질로부터 유도된 백일해(Bordatella pertussis) 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 면역반응의 자극제를 함유한다. 적절한 항원보강제들은 구입할 수 있고, 예를 들어, 프레운드 불완전 항원보강제 및 완전 항원보강제(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.); 수산화알루미늄 겔(알룸) 또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄 염 및 칼슘, 철 또는 아연염을 포함하는 무기염; 아실화 티로신 아실화 과당의 불용성 현탁액 ; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구; 및 퀼 A이다.
또한 적절한 항원보강제는 톨-유사 수용체(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로좀(virosome), 코클레이트(cochleate), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 리포솜, 오일-인-워터 에멀젼, MF59 및 스쿠알렌을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양들에서, 항원보강제는 박테리아로 유도된 엑소톡신이다. 다른 실시태양에서, 3DMPL 또는 QS21과 같이 Th1 형태 반응을 자극하는 항원보강제들이 사용될 수 있다. 특정 실시예들에서, 항원보강제는 MPL과 수산화알루미늄의 조합이다.
특정 실시태양에서, 항원보강제는 모노포스포릴 지질 A(MPL)이다. MPL은 살모넬라로부터의 지질 A의 비독성 유도체이고, 백신 항원보강제로 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다(Evans et al . (2003) Expert Rev Vaccines, Vol. 2: 219-229). 임상전 설치류 연구에서, 비강 MPL은 전신, 체액 반응뿐만 아니라 분비 반응을 향상시키는 것으로 나타났다(Baldridge et al . (2000) Vaccine, Vol. 18: 2416-2425; Yang et al . (2002) Infect Immun., Vol. 70: 3557-3565). 120,000 이상의 환자들의 임상 연구에서 백신 항원보강제로서 안정하고 효과적인 것으로 증명되었다(Baldrick et al . (2002) Regul Toxicol Pharmacol, Vol. 35: 398-413). MPL은 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역성의 유도를 자극하고 따라서 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스, 및 기생충을 포함하는 매우 넓은 범위의 감염성 병원체에 대해 비특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다(Persing et al . (2002) Trends Microbiol, Vol. 10: S32-37). 백신 제제에 MPL을 포함하면 선천성 반응을 빠르게 유도하여, 바이러스 면역성 검사로부터 비특이적 면역반응을 유발하는 반면 백신의 항원 성분들에 의해 발생한 특이적 반응을 향상시킨다. 일부 실시태양들에서, MPL은 하나 이상의 다른 항원보강제들과 혼합될 수 있다. 예를 들어, MPL은 백신 제제의 근육 내 투여를 위한 적절한 항원보강제를 만들기 위해 수산화알루미늄과 혼합될 수 있다.
다른 실시태양들에서, 항원보강제는 스쿠알렌과 같은 천연 발생 오일이다. 스쿠알렌은 식물들로부터 생산된 트라이테르피노이드 탄화수소 오일(C30H50)이고 여러 식품들에 존재한다. 스쿠알렌은 사람들에 의해 풍부하게 생산되며, 이들에게 스쿠알렌은 콜레스테롤과 스테로이드 호르몬의 전구체로서 작용한다. 스쿠알렌은 간과 피부에서 합성되어 초저밀도 당단백질(VLDL) 및 저밀도 당단백질(LDL)에 의해 혈액으로 운반되고 피지샘에 의해 다량으로 분비된다.
스쿠알렌은 신체의 천연 성분이고 생분해성이기 때문에, 백신 항원보강제의 성분으로 사용되고 있다. 이런 스쿠알렌 항원보강제들 중 하나는 키론에 의해 개발된 MF59, 오일-인-워터 에멀젼이다. MF59는 다양한 임상전 및 임상 연구들에서 매우 다양한 백신 항원들에 대한 면역반응을 현저하게 증가시키는 것으로 나타났다. MF59는 인플루엔자 서브유닛 백신의 일부이고, 1997년 이후 여러 유럽국가에서 허가를 받았다. 이런 백신은 2억 이상의 복용량이 제공되었고, 우수한 안정성 프로파일을 갖는 것으로 나타났다. MF59 항원보강제를 가진 백신들의 안전성은 1일 내지 3일된 신생아를 포함하는 다양한 나이군에서 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 단순포진 바이러스, 인간면역결핍 바이러스, 요로 병원성 대장균으로부터의 재조합 항원들을 사용하는 다양한 탐사 임상 연구들에 의해 증명되었다.
"유효한 항원보강제의 양" 또는 "유효량의 항원보강제"라는 용어는 당업자가 잘 이해할 것이고, 투여된 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 하나 이상의 항원보강제의 양, 즉, 비강 세척에서 IgA 수준, 혈청 IgG 또는 IgM 수준 또는 B 및 T-세포 증식의 면에서 측정된 대로, 투여된 항원 조성물의 면역 반응을 증가시키는 양을 포함한다. 면역글로불린 수준의 적절하게 효과적인 증가는 어떠한 항원보강제도 없는 동일한 항원 조성물과 비교해서 5%이상, 바람직하게는 25%이상 및 특히 50%이상을 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 백신 제제는 숙주 점막폴리사카라이드의 부분 탈수의 단일 또는 결합 효과에 의한 증가된 유체 점도, 전달 물질의 물리적 특성을 기초로 하나 이에 제한되지 않는 또는 전달 물질 및 저장소 효과를 제공하는 노출 부위에서 숙주 조직들 사이의 이온 상호작용을 통해 항원 흡수를 증가시키는 작용을 하는 전달 물질을 더 포함할 수 있다. 선택적으로, 전달 물질은 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 항원의 지연 방출). 이런 전달 물질은 생체접착성 물질일 수 있다. 일부 실시태양에서, 생체접착제는 글리코사미노글리칸(예를 들어, 콘드로이틴 설페이트, 데르마탄 설페이트 콘드로이틴, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파린 설페이트, 하이알루로난), 탄화수소 폴리머(예를 들어, 펙틴, 알지네이트, 글리코겐, 아밀라제, 아밀로펙틴, 셀룰로오스, 키틴, 스타키로스, 우눌린, 덱스트린, 덱스트란), 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 피롤리돈, 폴리사카라이드(뮤신, 다른 점막폴리사카라이드 및 젤사이트(Gelsite)®, 알로에 식물로부터 추출한 천연 산성 폴리사카라이드를 포함), 폴리이온, 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스), 단백질(예를 들어, 렉틴, 섬모 단백질) 및 데옥시리보핵산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 점막접착제일 수 있다. 한 실시태양에서, 백신 제제는 키토산, 키토산 염, 키토산 염기 또는 천연 폴리사카라이드(예를 들어, Gelsite®)와 같은 폴리사카라이드를 포함한다.
갑각류의 껍질에 있는 키틴으로부터 유도된 양전하 직선형 폴리사카라이드인 키토산은 상피 세포들 및 이들의 덮개 점막층에 대한 생체접착제이다. 키토산에 의한 항원 제제는 비강 점막과의 접촉 시간을 증가시켜, 저장소 효과에 의해 흡수를 증가시킨다(Illum et al . (2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96; Illum et al. (2003) J Control Release, Vol. 87: 187-198; Davis et al . (1999) Pharm Sci Technol Today, Vol. 2: 450-456; Bacon et al . (2000) Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770; van der Lubben et al . (2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 52: 139-144; van der Lubben et al . (2001) Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201-207; Lim et al . (2001) AAPS Pharm Sci Tech, Vol. 2: 20). 키토산은 동물 모델과 인간에서 독감, 백일해 및 디프테리아를 포함하는 여러 백신들에 대한 비강 전달 시스템으로 검사하였다(Illum et al . (2001) Adv Drug Deliv Rev, Vol. 51: 81-96; Illum et al . (2003) J Control Release, Vol. 87: 187-198; Bacon et al . (2000) Infect Immun., Vol. 68: 5764-5770; Jabbal-Gill et al . (1998) Vaccine, Vol. 16: 2039-2046; Mills et al . (2003) A Infect Immun, Vol. 71: 726-732; McNeela et al . (2004) Vaccine, Vol. 22: 909-914). 이런 검사들에서, 키토산은 비경구 백신접종과 동일한 수준으로 전신 면역반응을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 현저한 항원-특이적 IgA 수준이 점막 분비액에서 측정되었다. 따라서, 키토산은 비강 백신 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 이의 물리적 특성들 때문에, 키토산은 분말로 제제화된 비강 백신으로 특히 적합하다(van der Lubben et al . (2001) Eur J Pharm Sci, Vol. 14: 201-207; Mikszta et al . (2005) J Infect Dis, Vol. 191: 278-288; Huang et al . (2004) Vaccine, Vol. 23: 794-801).
다른 것들 중에서, 본 발명의 일부 실시예들에서, 백신 제제들은 키토산, 키토산 염 또는 키토산 염기를 포함한다. 키토산의 분자량은 10kDa 내지 800kDa, 바람직하게는 100kDa 내지 700kDa 및 더욱 바람직하게는 200kDa 내지 600kDa일 수 있다. 조성물에서 키토산의 농도는 통상적으로 약 80%(w/w)까지, 예를 들어, 5%, 10%, 30%, 50%, 70% 또는 80%일 것이다. 키토산은 적어도 75% 탈아세틸화, 예를 들어, 80-90%, 더욱 바람직하게는 82-88% 탈아세틸화, 특히 83%, 84%, 85%, 86% 및 87% 탈아세틸화된 것이다.
백신 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 임의의 적합한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체는 백신 제제가 투여된 피험자에게 해로운 면역 반응의 생산을 자체로 유도하지 않고 지나친 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약학적 물질을 포함한다. 본 명세서에서 사용한 대로, "약학적으로 허용가능한"이란 용어는 포유류 및 더욱 구체적으로 인간에서 사용하기 위한 연방 정부 또는 주 정부의 규제기구에 의해 승인되거나 미국약전, 유럽 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 기록된 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 식염수, 버퍼 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 살균 등장액 버퍼 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 다른 부형제들의 철저한 검토는 레밍턴의 약학 사이언스(Mack Pub. Co. N.J. current edition)에 제공된다. 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 한 바람직한 실시태양에서, 제제는 인간에 대한 투여에 적합하며, 바람직하게는 제제는 살균되고, 비-미립자 및/또는 비-발열성이다. 원하는 경우, 백신 제제는 습윤제 또는 유화제 또는 pH 버퍼제의 최소량을 포함할 수 있다.
본 발명의 VLPs 또는 키메릭 단백질들은 백신 또는 항원 제제로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "백신"이란 용어는 상기한 대로 본 발명의 VLPs 또는 키메릭 단백질들을 함유하는 제제를 의미하고, 척추동물(예를 들어, 포유류)에게 투여될 수 있는 형태이고 감염을 예방 및/또는 완화 및/또는 감염의 적어도 하나의 증상을 감소 및/또는 다른 복용량의 VLPs 또는 키메릭 단백질의 효과를 향상시키기 위해 면역성을 유도하는데 충분한 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 실시태양에서, 백신 제제는 항원보강제를 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 백신 제제는 본 발명에 기술된 항원보강제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "항원 제제" 또는 "항원 조성물"이란 용어는 척추동물, 예를 들어, 포유류에게 투여될 때, 면역반응을 유도할 제제를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "면역반응"이란 용어는 체액 면역반응 및 세포-매개 면역반응 모두를 의미한다. 체액 면역반응은, 예를 들어, 감염성 물질을 중성화하고, 감염성 물질이 세포에 들어가는 것을 막고, 상기 감염성 물질의 복제를 막고 및/또는 숙주 세포가 감염되고 파괴되는 것을 보호하는 B 림프구에 의한 항체들의 생산의 자극을 포함한다. 세포-매개 면역반응은 감염을 예방하거나 완화하거나 이의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염성 물질에 대한 T-림프구 및/또는 매크로파아지와 같은 다른 세포에 의해 매개되는 면역반응을 의미한다. 특히, "보호 면역성" 또는 "보호면역반응"은 감염을 예방 또는 완화하거나 감염의 적어도 하나의 증상을 감소시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염 물질에 대한 면역성 또는 면역반응을 유도하는 것을 의미한다. 구체적으로, 백신의 투여에 의한 보호면역반응의 유도는 키메릭 단백질에 존재하는 이종 항원이 유래되는 병원성 유기체과 관련된 하나 이상의 증상의 존재를 제거 또는 감소 또는 이런 증상들의 지속 또는 심각성의 완화에 의해 명백하다. 백신 제제는 일반적으로 백신 설계에서 개시된다(("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 점막 또는 비경구(예를 들어, 근육내, 정맥내, 피하(subcutaneous), 내피, 피하(subdermal) 또는 경피)의 투여 경로로 피험자에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 이런 점막 투여는 위장관, 비강, 구강 또는 질 전달일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 한 실시태양에서, 백신 제제는 비강 스프레이, 비강 드롭 또는 건조 분말의 형태이다. 다른 실시태양에서, 백신 제제는 근육내 투여에 적합한 형태이다.
본 발명의 백신 제제들은 액체 제제 또는 건조 분말 제제일 수 있다. 조성물이 호흡기(예를 들어, 코) 점막에 전달하기 위한 것인 경우, 통상적으로 에어로졸 또는 비강 드롭과 같은 투여용 수용액 또는 선택적으로, 비강 내에서 빠른 침적을 위한 건조 분말로 제제화된다. 비강 드롭으로 투여하기 위한 조성물은 방부제, 점도 조절제, 긴장 조절제, 완충제 등과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 형태의 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 점도 조절제는 미세결정 셀룰로오스, 키토산, 전분, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 건조 분말로 투여하기 위한 조성물은 점막 접착제, 증량제 및 적절한 분말 흐름 및 크기 특성을 전달하기 위한 물질과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 증량제 및 분말 흐름 및 크기 물질은 만니톨, 수크로오스, 트레할로스 및 자일리톨을 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 백신 제제는 면역원으로 하나 이상의 키메릭 VLPs, MPL®과 같은 항원보강제, 스쿠알렌 또는 MF59®, 점막표면에 대한 접착력을 향상시키는 키토산 또는 GelSite®과 같은 생고분자 및 만니톨과 수크로오스와 같은 증량제를 포함한다.
예를 들어, 백신은 본 발명에 개시한 하나 이상의 키메릭 VLPs, MPL® 항원보강제, 키토산 점막접착제 및 적절한 흐름 특성을 제공하는 증량제로서 만니톨과 수크로오스를 함유하는 10mg의 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 상기 제제는 약 7.0mg(25 내지 90% w/w 범위) 키토산, 약 1.5mg 만니톨(0 내지 50% w/w 범위), 약 1.5mg 수크로오스(0 내지 50% w/w 범위), 약 25㎍ MPL®(0.1 내지 5% w/w 범위), 및 약 100㎍ 키메릭 VLP 항원(0.05 내지 5% w/w 범위)을 포함할 수 있다.
키메릭 VLPs/항원들은 약 0.01%(w/w) 내지 약 80%(w/w)의 농도로 존재할 수 있다. 한 실시태양에서, VLPs는 양쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해(콧구멍 당 10mg) 10mg 건조 분말 제제 당 약 5㎍, 약 15㎍, 약 25㎍, 약 50㎍, 약 100㎍, 약 200㎍, 약 500㎍ 및 1mg(0.05, 0.15, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 및 10.0% w/w) 또는 한쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해 20mg 건조 분말 제제 당 약 10㎍, 약 30㎍, 약 50㎍, 약 100㎍, 약 200㎍, 약 400㎍, 약 1mg 및 약 약 2mg(0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 10.0 및 20.0% w/w)의 복용량으로 제제화될 수 있다. 상기 제제는 각 투여하는 동안 콧구멍 하나 또는 콧구멍 두 개에 제공될 수 있다. 첫 번째 투여 1 내지 12 주 후 면역반응을 향상시키기 위해 추가 투여(booster administration)가 있을 수 있다. 백신과 항원 제제에서 VLP/항원의 각각의 함량은 1㎍ 내지 100mg, 바람직하게는 1-1000㎍, 더욱 바람직하게는 5-500㎍, 가장 통상적으로 10-200㎍의 범위일 수 있다. 각 복용시 투여된 전체 VLP/항원은 약 10㎍, 약 30㎍, 약 200㎍, 약 250㎍, 약 400㎍, 약 500㎍ 또는 약 1000㎍일 것이다. 전체 백신 복용량은 한쪽 콧구멍 속에 투여될 수 있거나 양쪽 콧구멍에 투여하기 위해 절반으로 나뉠 수 있다. 건조 분말 특성들은 입자들의 10% 미만이 지름이 10㎛ 미만이게 된다. 평균 입자 크기는 지름이 10 내지 500㎛이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 건조 분말 제제는 제제의 1회 이상의 복용량을 투여하기 위한 하나 이상의 장치와 결합될 수 있다. 이런 장치는 1회용 비강 투여 장치일 수 있다. 다른 실시태양에서, 1회 이상의 복용량은 단위 복용량이다.
일부 실시태양들에서, 항원 및 백신 제제는 피험자에게 연속적으로 투여하기 위한 액체로 제제화될 수 있다. 비강 투여를 위한 액체 제제는 키메릭 VLP/항원(들), 항원보강제, 및 키토산과 같은 전달 물질을 포함할 수 있다. 비경구(예를 들어, 피하, 내피 또는 근육내(i.m.))투여를 위한 액체 제제는 전달 물질(예를 들어, 키토산) 없이 키메릭 VLP/항원(들), 항원보강제 및 버퍼를 포함할 수 있다.
바람직하게는 항원 및 백신 조성물은 동결건조되어 사용될 때까지 무수 상태로 저장되며, 사용시점에 희석제로 재구성된다. 선택적으로, 조성물의 다른 성분들은 키트(어떤 성분 또는 모든 성분이 동결건조됨)에 개별적으로 저장될 수 있다. 성분들은 건조 제제를 위해 동결건조 형태로 존재하거나 액체 제제를 위해 재구성될 수 있고 사용하기 이전에 혼합되거나 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 건조 분말 투여의 경우, 백신 또는 항원 제제는 비강 전달 장치 또는 국소(예를 들어, 피부) 전달 패치 속에 미리 채워 사용시까지 저장될 수 있다. 바람직하게는, 이런 비강 전달 장치는 이의 내용물의 안정성을 보호하고 지킬 수 있다.
본 발명은 피험자에서 외래 물질에 대한 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 피험자에게 본 발명에서 기술한 백신 제제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 백신 제제는 키메릭 단백질을 포함하며 키메릭 단백질에 존재하는 이종 항원 또는 이의 단편은 외래 물질로부터의 단백질로부터 유도된다. 피험자는 외래 물질로부터의 감염에 걸리는 위험에 노출될 수 있고, 외래 물질로부터의 감염으로 고생할 수 있거나 외래 물질에 의해 유발된 재발성 감염에 걸릴 수 있다. 따라서, 본 발명은 외래 물질들로부터의 이종 항원들을 함유하는 본 발명에 기술된 키메릭 단백질을 포함하는 본 발명의 백신 또는 항원 제제를 투여함으로써 외래 물질들과 관련된 감염들을 예방 및 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 VLP를 포함하는 본 발명의 백신 또는 항원 제제는 항원보강제를 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 백신 또는 항원 제제는 본 발명에 기술된 항원보강제를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예들에서 개시한 특정 실시태양을 참조하여 더 상세하게 기술될 것이다. 실시예들은 본 발명을 설명하려는 목적이며 어떤 경우에도 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예들
실시예 1. 칼리시바이러스 VLPs에서 항원 삽입 위치들의 확인
노로바이러스 유사 입자들(VLPs)의 생물 반응기 생산 및 다운스트림 공정(downstream processing)은 잘 설명되어있고 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 생성을 입증하는 최초 개념 증명 연구들을 위해 사용되었다. GI.1 놀워크 VL1 서브유닛의 경우, 외래 에피토프들의 삽입에 적합한 표면 노출 루프 영역들의 확인(도 1A 참조)은 고해상도 x-레이 결정 구조(PDB 코드 1IHM)의 평가에 수행하였다. 복합체 GII.4 노로바이러스 캡시드 단백질(GII.4 컨센서스(consensus))의 유사한 평가는 프로그램 Geno3D2를 사용하는 원자 구조 모델의 생성 후에 수행하였다(도 1b 참조). 이 소프트웨어는 주형(GII.2 컨센서스의 경우에 G1.I 놀워크)으로서 이종 단백질들의 원자 구조를 사용하며 충분한 서열 유사성과 부족한 원자 구조 데이터의 임의의 칼리시바이러스 캡시드 단백질에 대한 구조 모델을 생성하는데 유사하게 사용될 전략을 제공한다.
노로바이러스 GI.1 놀워크 및 GII.4 컨센서스 VP1 서브유닛에서 P2 도메인 표면 노출 루프 영역들의 확인은 스위스 PDB 뷰어를 사용하여 잔기 접근성(residue accessibility)의 분석에 의해 수행하였다. 노로바이러스 캡시드 단백질들에 대한 P2 도메인 경계들은 미리 확인하였다(예를 들어, Prasad et al. (2000) Journal of Infectious Diseases, Vol. 181: S317-S321 참조). 동일한 소프트웨어를 사용하는 원자 구조들의 수동 검사는 P2 도메인 표면 루프들의 적절한 배정을 확인시켰다. 도 1은 GI.1 놀워크(1a; SEQ ID NO: 1) 및 GII.4 컨센서스(1b; SEQ ID NO: 2) VP1 서브유닛의 아미노산 서열들을 도시하며 P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되며 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 영역들은 밑줄이 그려지며 볼드체로 표시된다. 도 2는 확인된 용매 접근가능한 P2 도메인 루프가 강조된 노로바이러스 GII.4 컨센서스 구조 모델(90°회전)을 도시한다.
상기한 접근법들을 다른 칼리시바이러스들에 대해 확장하기 위해서, 용매 접근가능한 P2 도메인 루프들의 구조 모델링 및 확인을 사포바이러스 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛에 대해 추가로 실행하였다. 이런 특정 사포바이러스를 선택한 것은 이것이 인간 위장염의 원인 물질에 해당하기 때문이다. 칼리시바이러스 과의 경우, 놀워크(노로바이러스) 및 산 미구엘 바다사자(SMSV; 베시바이러스) VP1 캡시드 단백질들에 대한 원자구조들이 현재 이용할 수 있다. 도 3에 도시된 대로, 프로그램 Geno3D2를 사용하는 사포바이러스 캡시드 단백질의 평가는 구조 주형들로서 놀워크(도 3A) 및 SMSV(도 3B) VP1 서브유닛들로부터 유래된 원자 구조 모델들을 생성하였다.
사포바이러스 VP1 구조 모델들의 각각에 대한 P2 도메인 표면 노출 로프 영역들의 확인은 스위스 PDB 뷰어를 사용하여 잔기 접근성(residue accessibility)의 분석에 의해 수행하였다. 사포바이러스 캡시드 단백질에 대한 P2 도메인 경계들은 구조 모델링에 사용된 주형들과의 서열 배열에 의해 정하였다. 도 4는 Hu/Yokohama16-4/2007/JP VP1 서브유닛(SEQ ID NO: 3)의 아미노산 서열을 도시하며 P2 도메인 잔기들은 회색으로 어둡게 되며 도메인 내의 용매 접근가능한 루프 영역들은 밑줄이 그려지며 볼드체로 표시된다.
상기 분석은 모델 생성에 대한 주형으로 사용된 원자 구조에 따라 구조 모델들 및 확인된 표면 P2 도메인 루프들 모두에서 실질적인 차이들을 입증한다. 두 캡시드 단백질들이 칼리시바이러스 과에 속한다는 사실에도 불구하고, 비교적 낮은 전체 서열 동일성과 서열 배열의 큰 간격들의 관점에서 놀워크 및 SMSV VP1 서브유닛들 사이에 현저한 구조적 차이들이 예상된다(도 5; 회색으로 어둡게 된 P2 도메인 잔기들). 추가 칼리시바이러스 서브유닛들에 대한 원자 구조 모델들의 생성은 표적과 최대 서열 상동성을 나타내는 이용가능한 주형 구조를 사용하여 수행한다. 선택적으로, 추가 칼리시바이러스 서브유닛들에 대한 구조 모델들은 서열 상동성이 대략 동일한 경우에 여러 이용가능한 칼리시바이러스 VP1 구조들을 사용한다. 표적과 유사한 서열 상동성의 경우에 여러 구조 주형들의 사용은 적절한 에피토프 삽입 위치들의 성공적인 확인 가능성을 증가시키도록 설계된다.
실시예 2. 칼리시바이러스 VP1 오픈 리딩 프레임들에서 외래 에피토프들의 삽입
GI.1 놀워크 VP1 서브 유닛의 바람직한 위치들 속으로 외래 에피토프 삽입의 포괄적인 스크리닝을 위해 두 개의 구별된 전략을 사용하였다: 1) P2 도메인의 용매 접근가능한 루프들에서 다양한 잔기 위치들에서 단순 삽입; 및 2) P2 도메인의 용매 접근가능한 루프 잔기들의 대체.
9개 아미노산의 인서트(insert)를 필요로 하는 돌연변이를 돌연변이 프라이머로서 적절한 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한 반면, 더 큰 인서트를 가진 구조체들은 유전자 합성에 의해 생성하였다. 더 큰 인서트를 가진 키메릭 VLPs의 생성을 위한 대안적 전략은 적절한 에피토프 서열들을 암호화하는 합성 DNA 또는 PCR 생성물들을 연결하기 위해서 독특한 제한 위치들을 VP1 리딩 프레임의 원하는 영역들로 가공하는 단계를 포함한다. 유사한 전략들을 추가 칼리시바이러스 캡시드 단백질들에서 에피토프 삽입을 위해 수행한다.
제 1 생성 구조체들의 경우, 퀵체인지 라이트닝(QuickChange Lightning) 돌연변이 키트(Stratagene; La Jolla, CA)를 사용하여 놀워크 VP1 서브유닛에 모델 에피토프를 삽입하기 위해 PCR 돌연변이를 사용하였다. DNA 주형으로서 놀워크 VP1을 포함하는 셔틀 벡터를 사용하여 구조체들을 생성하고, 최종 키메릭 서열들은 PCR 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 그런 후에 재조합 바큘로바이러스의 생성을 가능하게 하도록 키메릭 VP1 리딩 프레임들을 전달 벡터 pVL1393 속으로 하위복제하였다. PCR 증폭이 하위복제를 위한 인서트를 생성하기 전에 사용된 경우에, 최종 리딩 프레임은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 이런 접근법은 여러 에피토프/인서트 위치 조합의 빠르고 효율적인 생성을 가능하게 한다. 더 많은 에피토프 삽입을 가진 키메릭 VP1 리딩 프레임들은 DNA 합성에 의해 생성하였고, 전달 벡터 pVL1393 속으로 후속 하위복제하여 재조합 바큘로바이러스의 생성을 가능하게 하였다. 도 6은 강조된 외래 항원으로 대체된 잔기들을 가진 놀워크 VP1 x-레이 구조(90°회전)를 도시한다. 도 6에 도시된 제 1 생성 구조체들은 9개 아미노산 모델 에피토프로 대체된 P2 도메인에서 5개 용매 노출 루프 잔기들을 나타낸다(실시예 3 참조). 제 1 생성 구조체들은 또한 도 6에서 강조된 루프들에서 선택 잔기들 사이에 모델 에피토프의 직접 삽입(즉, 임의의 VP1 잔기들의 결실 없이)을 포함하도록 생성되었다. 예를 들어, 놀워크 VP1 아미노산 서열에서 용매 노출 잔기들의 위치에 대해 실시예 1 및 도 1A 참조.
실시예 3. 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 생산
키메릭 놀워크 VP1 서브유닛을 암호화하는 재조합 바큘로바이러스의 생성은 전달 벡터(pVL1393-놀워크 VP1) 및 선형 바큘로바이러스 DNA의 점착성 Sf9 곤충 세포들 속으로의 공동-트렌스펙션, 뒤이어 높은 역가의 원료를 생성하기 위한 추가 바이러스 확장에 의해 수행하였다. 키메릭 VLPs의 생산을 위한 최초 개념 증명 스크린으로서, 인플루엔자 헤마글루티닌 항원으로부터 유래된 모델 에피토프(HA 에피토프 서열 - YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 5))를 놀워크 VP1 잔기 296, 336, 362, 383 또는 399 이후에 직접 삽입하였다. 또한 이런 모델 항원이 놀워크 VP1 잔기 337-341 또는 잔기 362-366을 대체하는 구조체들에 대해 발현 실험들을 실행하였다. 도 7은 직접 삽입을 포함하거나 모델 헤마글루티닌 에피토프에 의해 대체된 놀워크 VP1 잔기들을 도시한다.
키메릭 VLPs의 생산을 위해서, Sf9 곤충 세포들을 50mL 스피너-플라스크 배앵액에서 2x106 cells/ml로 성장시킨 후에 예상 감염 다중도(MOI) = 1.0으로 재조합 바큘로바이러스의 P1 원료로 감염시켰다. 감염 이후에, 배양액들을 저속 원심분리 및 천연 세포 용해의 결과로 VLPs가 세포 상층액 속으로 배출되는 감염 후 T=96 내지 120h에서 0.2㎛ 필터에 의한 후속 정화로 채취하였다. 도 8에 도시된 SDS-PAGE 분석은 VP1 잔기 296 또는 362 이후에 삽입된 모델 HA 항원을 포함하는 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 발현 연구들로부터의 결과를 나타낸다(레인 1, 분자량 표준; 레인 2, 362 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 3, 362 원심분리 펠릿 분획; 레인 4, 362 삽입 여과물; 레인 5, 296 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 6, 296 원심분리 펠릿 분획; 및 레인 7, 296 삽입 여과물). 362 삽입 키메라에 대한 원심분리 후 상층액(레인 2) 및 여과물(레인 4) 분획들에서 예상 분자량(~57kDa)에서 이동하는 눈에 띄는 놀워크 VP1 밴드는 고유 놀워크 VP1과 유사한 발현 패턴을 나타내며 외래 항원 삽입을 효과적으로 견디는 이런 용매 접근가능한 P2 루프의 능력을 입증한다. 도 8은 또한 놀워크 VP1 잔기 296(레인 5 및 7) 직후에 삽입된 모델 HA 에피토프를 포함하는 구조체들에 대한 상기 분획들에서 훨씬 낮은 VP1 발현 수준들을 도시한다. 이런 연구들에서, 296 삽입 구조체의 감소된 발현은 VP1 서브유닛의 일부에 대한 VLP 어셈블리의 결핍에 기인할 수 있는 세포 용해 이전에 VP1 서브유닛의 단백질 분해로부터 기인하며 표준 노출 루프의 단순 확인은 키메릭 VLPs의 효율적인 생산을 확실히 하는데 충분하지 않다는 것을 입증한다.
상기 전략을 사용하는 키메릭 VLPs를 생산하는 능력은 VP1 잔기 336 이후에 삽입되거나 잔기 337-341을 대체하는 모델 HA 에피토프를 포함하는 놀워크 VP1 서브유닛에 대해 도 9에서 확인된다. 웨스턴 블럿 분석은 예상 분자량(~57kDa)에서 이동하는 SDS-PAGE 밴드가 안티-놀워크 및 안티-HA 에피토프 단클론 항체들에 대해 특이적이고 적절한 반응성을 나타내는 것을 입증하는데 사용되었다(레인 1, 분자량 표준; 레인 2, VP1 잔기 336에서 에피토프 삽입을 가진 키메릭 VLPs; 레인 3, VP1 잔기 337-341의 에피토프 대체를 가진 키메릭 VLPs; 및 레인 4, 야생형 놀워크 VP1).
키메릭 놀워크 VLPs의 작은 용량 발현 및 정제를 위해서, Sf9 곤충 세포들을 Sf-900 II 배지(1L 쉐이크 플라스크 배양액)에서 2x106 cells/ml로 성장시킨 후에 MOI = 0.5에서 재조합 바큘로바이러스로 감염시켰다. VLP 발현(감염 후 96 내지 120h) 이후에, 저속 원심분리 및 0.2㎛ 필터를 사용하는 후속 정제로 배양액을 채취하였다. 결합된 VLPs는 특징적으로 높은 분자량(~10MDa)을 갖기 때문에, 재료는 수크로오스-구배 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 표면 화학에 의존하지 않는 방법들에 의해 쉽게 정제될 수 있다. 도 10은 연속 흐름 원심분리(CFC)에 의한 키메릭 놀워크 VLPs(336 삽입)의 정제를 도시하며, 정제 출발 재료는 TCF-32 로터를 사용하여 ~16h 동안 100,000 x g에서 원심분리함으로써 0-60% 선형 수크로오스 구배 상에서 분리하였다. 이런 분석은 출발 조절된 배지(CM)에서 키메릭 VLPs의 높은 수준의 생산 및 바이러스 유사 입자들에 대해 예상되는 수크로오스 밀도에서 밴드를 나타내는 키메릭 VP1 서브유닛의 눈에 띄는 피크를 입증한다.
실시예 4. 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 특징묘사
키메릭 칼리시바이러스 VP1 서브유닛에 대한 적절한 단백질 발현과 VLP 형성을 확실히 하기 위해서, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 고해상도 질량 스펙트럼, 크기 배제 크로마토그래피 및 전자현미경을 포함하는 여러 분석 방법이 생산 과정 전체에서 특징묘사를 위해 사용된다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석의 사용은 실시예 3에서 강조되며, 이런 방법들은 적절한 서브유닛 분자량 및 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 외래 항원의 존재를 입증하였다. 노로바이러스 VLPs(>10 MDa)의 높은 분자량은 미완성 정제 출발 재료에서도, 크기 배제 크로마토그래피에 의한 직접 분석을 허용한다. VLP 형성을 평가하는 이런 방법의 유용성은 도 11에서 입증되며, 놀워크 VP1-HA 키메라(336 삽입)를 위한 조절된 배지는 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 이 연구에서, 예상 잔류 시간(~8분)을 가진 피크의 존재는 키메릭 VLP의 적절한 형성을 입증하였다(적색 흔적-220nm에서 흡수(Y축에 도시됨) 및 청색 흔적-280nm에서 흡수).
합쳐진 연속 흐름 원심분리 분획에서 VLPs의 적절한 형성(실시예 3 참조)은 전자현미경에 의해 추가로 확인되었고, 이것은 VP1 잔기 336 이후에 삽입되거나 VP1 잔기 337-341을 대체하는 모델 HA 에피토프를 포함하는 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 ~32nm의 예상 입자들을 입증하였다(도 12).
실시예 5. 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 용량 증가 생물 반응기 생산 및 다운스트림 공정
키메릭 VLPs의 최초 용량 증가 생물 반응기 생산은 웨이브 생물 반응기 플랫폼(Wave bioreactor platform) 및 생물 반응기 용기로서 1회용 웨이브백(Wavebags)을 사용하여 실행한다. 이런 연구들은 감염 이전 세포 밀도, 감염 다중도 및 채취 전 감염 시간을 포함하는 기본 변수들의 최적화에 집중한다. 최초 최적화는 또한 다중 곤충 세포주/배지 조합 및 배지 보충의 선별을 포함한다. 이런 연구들은 확장성 생산(scalable production) 전략들을 개발하고 다운스트림 공정을 위한 재료를 공급하는 역할을 한다. >50mg/L로부터 변하는 생물 반응기 생산성은 웨이브 생물 반응기 시스템 및 여러 곤충 세포/혈청 제거 배지 조합을 사용하여 노로바이러스 VLPs에 대해 일상적으로 관찰하였다.
채취한 생물반응기 배양액으로부터의 키메릭 VLPs의 다운스트림 공정은 통상적인 크로마토그래피, 막 크로마토그래피 및 접선 흐름 여과(tangential flow filtration)를 포함하는 잘 정립된 확장성 방법들에 의해 수행한다. 크로마토그래피 스크리닝의 경우, 최초 파일럿 연구들은 결합/용출 조건을 최적화하고, 흐름 속도의 효과를 평가하고, 단계적 회복을 평가하고 숙주 세포 단백질/핵산에 대한 정제 인자들의 특징을 묘사하기 위해 작은 용량으로 수행한다.
실시예 6. 외래 에피토프들의 제공을 위한 추가 접근법
실시예 1에서 약술한 대로, 외래 에피토프들의 삽입을 위한 바람직한 위치들은 칼리시바이러스 VP1 원자 구조 모델의 평가에 의해 용매 접근가능한 P2 도메인 표면 루프들을 기초로 하였다. 에피토프 삽입을 위한 최적 위치들의 확인에 대한 보충적 접근법으로서, 상기 구조 분석은 허용 위치들의 확인에 도움을 주기 위해 아미노산 서열 및 생화학적 데이터와 결합된다. 아미노산 서열 데이터는 구조 분석에 의해 확인된 표면 루프 영역들 내에 해당하는 과가변성(hypervariable) P2 도메인 잔기들을 확인하기 위해 다중 배열들에 사용된다. 두 수단들에 의해 확인된 위치들은 외래 에피토프 서열들의 직접 삽입을 위해 최적으로 생각된다. 유사하게, 구조 분석에 의해 확인된 단일 표면 노출 루프 내에 해당하는 다중 과가변성 P2 잔기들을 가진 위치는 VP1 잔기들의 부분 대체에 최적으로 생각되며 VP1 결실 경계들을 확립하는데 안내를 제공할 것이다. 칼리시바이러스 도피 변종들(escape mutants) 및/또는 항체 에피토프들의 P2 도메인 잔기들의 확인과 같은 생화학적 데이터의 사용은 외래 에피토프들의 삽입을 위한 적절한 위치들을 강조하는데 추가로 역할을 한다.
실시예 2-4에 약술한 대로, 9개 아미노산의 외래 에피토프 삽입을 제 1 생성 키메릭 놀워크 VLPs의 생성을 위해 사용하였다. VLP 생산 및/또는 외래 에피토프 면역원성을 최적화하기 위해, 5-10 잔기, 11-20 잔기, 21-30 잔기, 31-40 잔기 또는 41-50 잔기의 서열들을 포함하는 다양한 길이의 삽입된 에피토프 서열들을 평가한다. 칼리시바이러스 잔기들의 결실은 외래 에피토프들의 삽입을 위한 중요한 인자를 나타낼 수 있기 때문에, 5-10 잔기, 11-20 잔기, 21-30 잔기, 31-40 잔기 또는 41-50 잔기의 서열들을 포함하는 다양한 길이의 VP1 결실들을 평가한다.
키메릭 VLPs의 재조합 발현은 다중 외래 항원들을 동시에 칼리시바이러스 P2 도메인의 둘 이상의 용매 허용가능한 루프들 속에 삽입하는 것을 필요로 할 수 있다. 여러 확인된 루프들은 비교적 가까운 공간 접근성으로 존재하기 때문에, 여러 루프들의 삽입은 불연속적 에피토프들을 형성하기 위한 삽입된 서열들의 직접 접촉이 존재하도록 처리될 수 있다.
키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 발현을 위해서, 표적 항원들은 불연속적 에피토프들을 나타내는 미모토프(minotope) 서열들 또는 복합 선형 서열들로부터 유래될 수 있다. 미모토프 서열들은 높은 친화력으로 중성화 항체들과 결합하나, 표적 항원에서 발견된 실제 아미노산 서열을 나타내지 않는 선형 펩타이드들이다. 이런 성질의 서열들은 문헌으로부터 유래되거나 파아지 디스플레이 분석 또는 조합 펩타이드 라이브러리와 같은 방법들에 의해 중성화 항체들을 매핑(mapping)하는 에피토프에 의해 결정된다. 불연속적 에피토프들을 나타내는 복합 선형 서열들은 문헌으로부터, 조합 방법들로부터 또는 항체:항원 복합체들의 구조 분석으로부터 유사하게 유래될 수 있다.
키메릭 VLP 생산의 효율을 증가시키기 위해서, 플랫폼은 칼리시바이러스 VP1 표면 루프 경계들에 잘 일치하도록 외래 에피토프 서열들의 입체 공간을 구조적으로 제안하도록 설계될 수 있다. 이런 목적은 공유 또는 비 공유 단백질-단백질 상호작용 모티프를 VP1 서브유닛의 표면 노출 루프 또는 외래 항원 서열 속으로 처리함으로써 수행된다.
상기한 접근법에 대한 변형은 VP1 서브유닛의 단지 한 하부분획이 P2 도메인의 용매 접근가능한 루프들 상의 외래 에피토프를 나타내는 키메릭 VLPs의 생성을 필요로 한다. 이런 전략은, 특히 비교적 큰 외래 에피토프들이 VP1 서브유닛에 삽입되는 경우에, 원하는 VLP 어셈블리를 유지하는데 중요한 것으로 입증될 수 있다. 이런 특성의 VLPs의 생성하기 위해서, 개개의 칼리시바이러스 VP1 서브유닛(고유 및 변형 둘 다)은 VLP 어셈블리에 적합한 매우 정제된 상태로 최초로 생산된다(즉, 완전히 변성된 모노머들, 고유 유사 2차/3차 구조를 포함하는 모노머들 또는 저급 VP1 어셈블리 상태). 그런 후에 키메릭 VLPs는 원하는 비율로 고유 및 변형 서브유닛을 혼합하고 효율적인 VLP 어셈블리를 촉진하는 조건들을 설정함으로써 생성된다. 선택적으로, 이런 특성의 VLPs는 고유 및 변형 서브유닛의 발현이 두 개의 다른 프로모터에 의해 제어되는 구조체들을 생성함으로써 배양액에서 직접 생산된다. 이런 접근법을 사용하면, 고유 VP1 서브유닛은 변형 서브유닛의 발현 수준을 초과하는 발현 수준에 도달하도록 비교적 강한 프로모터 아래에 놓인다. 키메릭 VLPs의 어셈블리는 VLP 표면의 하부분획상에 나타난 변형 VP1 서브유닛을 가진 세포에서 발생한다.
더욱 일반적인 디스플레이 플랫폼을 만들 수 있는 추가 변형은 원하는 외래 항원들을 용매 접근가능한 P2 도메인 표면들에 특이적이고, 높은 친화력의 결합을 촉진하는 표적 서열을 포함하는(예를 들어, 상보적 결합 모티프를 포함하는) 노로바이러스 VLPs의 생성을 필요로 한다. 이런 특성의 키메릭 VLPs를 생성하기 위해서, 노로바이러스 서브유닛 및 표적 항원은 개별적으로 발현되고 정제되며, 그런 후에 결합을 허용하는 조건하에서 혼합된다. 이런 접근법을 사용하여, 표적 항원은 완전히 결합된 VLPs 상의 VP1 서브유닛 또는 VLP 어셈블리 이전의 VP1 서브유닛에 결합된다. 최적 VLP 안정성 및 항원 제공을 제공하는 조건을 평가하기 위해서, 키메릭 VLPs는 VP1 서브유닛의 각 복제물 또는 단지 하나의 서브세트 상에 표적 서열을 발현시킴으로써 생성된다.
실시예 7. 키메릭 놀워크 VLPs에 의한 생쥐의 면역화
대략 10-12주 연령의 암컷 C57/BL6 생쥐를 30㎍ 고유 놀워크 VLPs 또는 실시예 3에 기술된 키메릭 놀워크 VLPs(예를 들어, 놀워크 VP1의 296, 336, 362, 383 또는 399 잔기 이후에 삽입된 HA 에피토프 또는 HA 에피토프에 의한 놀워크 VP1 잔기 337-341 또는 잔기 362-366의 대체) 중 하나로 복강으로 면역화한다. 명역화 후 21일에 생쥐를 사혈하고 혈청을 항원-특이적 ELISA에서 분석하여 고유 및 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 항체 역가를 결정한다. 결과들은 키메릭 VLPs가 안티 놀워크 및 안티 HA 항체들에 대해 상당한 역가를 생산한다는 것을 도시하는 것으로 예상된다.
실시예 8. 29 잔기, 의학적으로 관련된 외래 항원을 포함하는 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 생산, 특징묘사 및 면역원성
더 큰 의학적으로 관련된 외래 항원을 포함하는 키메릭 노로바이러스 VLPs를 생성하기 위해서, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV) F 단백질(중성화 항체 시나지스에 의해 인식되는 RSV F 에피토프 서열-YMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV (SEQ ID NO: 7))로부터 유래된 29 아미노산 서열을 놀워크 VP1 잔기 308, 338 또는 363 이후에 바로 삽입하였다. 또한, 놀워크 VP1 잔기 307-311, 337-341 또는 잔기 362-366을 대체하는 RSV F 에피토프를 포함하는 구조체들을 생성하였다. Sf9 곤충 세포들에서 재조합 바큘로바이러스의 생성 및 VLP 생산 이후에, 키메릭 VLPs를 정제하고, 특징을 묘사하고 면역원성에 대해 검사하였다. 도 13은 연속 흐름 원심분리(CFC)에 의한 키메릭 놀워크 VLPs(308 삽입)의 정제를 도시하며, 정제 출발 재료는 TCF-32 로터를 사용하여 ~16h 동안 100,000 x g에서 원심분리함으로써 0-60% 선형 수크로오스 구배 상에서 분리하였다. 이런 분석은 출발 조절된 배지(CM)에서 키메릭 VLPs의 높은 수준의 생산 및 바이러스 유사 입자들에 대해 예상되는 수크로오스 밀도에서 밴드를 나타내는 키메릭 VP1 서브유닛의 눈에 띄는 피크를 입증한다. 연속 흐름 원심분리에 의해 정제된 재료에서 VLPs의 형성은 투과전자현미경에 의해 확인하였다(도 14). 면역원성을 평가하기 위해서, CFC-정제 키메릭 VLPs를 20mM 히스티딘(pH - 6.5), 150mM NaCl에서 200㎍/mL로 제제화하였다. 6마리 Balb/c 생쥐를 연구 0일에 20㎍ 키메릭 VLPs(~1㎍ RSV 에피토프)로 면역화하였고 연구 21일에 추가 20㎍ 키메릭 VLP로 강화시켰다. 혈액을 연구 35일에 수집하였고 RSV-F 및 놀워크 단백질 특이적 ELISAs를 사용하여 전체 IgG 역가에 대해 분석하였다. 이런 연구에서, 키메릭 VLPs를 복용한 6마리 동물 중 2마리는 또한 안티 RSV-F IgG에서 4배보다 큰 증가를 나타내었다(도 15).
실시예 9. 다중 변형 표면 루프들을 포함하는 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 생산
다중 변형 루프를 포함하는 키메릭 노로바이러스 VLPs를 생성하기 위해서, RSV F 단백질(RSV F 에피토프 서열-LINDMPITN (SEQ ID NO: 6))의 9개 아미노산 서열을 동일 구조체 내의 두 개의 놀워크 VP1 표면 루프들에 첨가하였다. 이런 연구들에서, 동시에 잔기 338 및 363에 삽입된 또는 동시에 잔기 337-341을 대체하고 잔기 363에 삽입된 RSV F 에피토프를 포함하는 구조체를 생성하였다. 도 16에 도시된 SDS-PAGE 분석은 9개 잔기 RSV-F 항원을 포함하는 키메릭 놀워크 VLPs에 대한 발현 연구들로부터의 결과를 나타낸다(레인 1, 분자량 표준; 레인 2, 338 및 363 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 3, 338 및 363 삽입 원심분리 펠릿 분획; 레인 4, 338 및 363 삽입 여과물; 레인 5, 337-341 대체 및 363 삽입 원심분리 후 상층액; 레인 6, 337-341 대체 및 363 삽입 원심분리 펠릿 분획; 및 레인 7, 337-341 대체 및 363 삽입 여과물). 키메라의 각각에 대한 원심분리 후 상층액(레인 2 및 5) 및 여과물(레인 4 및 7) 분획들에서 예상 분자량(~57kDa)에서 이동하는 눈에 띄는 놀워크 VP1 밴드는 고유 놀워크 VP1과 유사한 발현 패턴을 나타내며 외래 항원 삽입을 효과적으로 견디는 이런 용매 접근가능한 P2 루프의 능력을 입증한다. 이런 키메라들의 경우 입자 형성은 SEC 데이터에 의해 표시되었고 이런 연구들은 실시예 6에 약술한 개념들을 뒷받침한다.
실시예 10. 헤마글루티닌 에피토프를 포함하는 키메릭 칼리시바이러스 VLPs의 면역원성
인플루엔자 헤마글루티닌 항원(HA 에피토프 서열-YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 5))으로부터 유래된 모델 에피토프를 VP1 상의 놀워크 VP1 잔기 아미노산 338-339 사이에 직접 삽입하였고 본 발명에서 "HA 삽입"으로 지정하였다. HA 에피토프가 VP1에서 놀워크 VP1 잔기 아미노산 337-341을 대체하고 본 발명에서 "HA 대체"로 지정된 추가 구조체를 만들었다. 면역화 이전에 각각의 구조체에 대해 전체 단백질 함량을 측정하였다. "HA-삽입" 구조체는 전체 단백질의 34㎍/ml를 포함하도록 정해졌고 "HA-대체" 구조체는 전체 단백질의 42㎍/ml를 포함하도록 정해졌다. 50 마이크로리터를 각각의 튜브로부터 제거하였고 0 및 7일에 복강으로 생쥐에게 주사하였다. 혈청을 14일에 수집하였으나 ELISA에 의해 측정가능한 항원 특이적 IgG는 탐지되지 않았다. 그러나, 낮은 수준의 HA 특이적 IgM이 거의 모든 생쥐에서 탐지되었다(도 17). 키메릭 VLPs의 HA 함량이 전체 단백질의 단지 1.7%이기 때문에, IgM 단독 반응에 대한 가능한 이유는 낮은 HA 농도이다("HA-삽입"에 대해 29ng HA 및 "HA 대체"에 대해 36ng HA). 항원보강제의 존재가 HA에 대한 면역반응을 강화시킬 것인지를 측정하기 위해서, AlOH/MPL 상에 흡착된 키메릭 VLPs를 37일에 미리 처리된 생쥐에 제공하였다. 혈청을 64일에 수집하였고 HA-특이적 IgG에 대해 분석하였다(도 18). 항원보강제의 첨가가 "HA-삽입"에 의해 면역화된 5마리 생쥐 중 4마리 및 "HA-대체"에 의해 면역화된 5마리 생쥐 중 2마리에서 일어나서 탐지가능한 HA-특이적 IgG 반응을 가졌다. 이런 연구에서 생쥐의 전부가 역사적 값들과 유사한 놀워크 특이적 IgG를 생산하였다. 결론으로, HA 에피토프가 제공되며 면역시스템에 대해 명백하다. 이런 연구에서 사용된 HA 항원의 낮은 농도에서, 항원보강제를 면역반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 선택적으로, HA 에피토프의 양을 증가시키면 면역반응을 증가시키는 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 개별 양태의 한 설명인 특정 실시태양들에 의해 범위가 제한되지 않으며 기능적으로 균등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명에서 도시되고 개시된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 일상적인 실험들을 사용하여 상기 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이런 변형과 균등물은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당할 것이다.
본 발명에서 언급한 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명에서 참조문헌의 인용 또는 언급은 이런 문헌이 본 발명에 대한 종래기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> LigoCyte Pharmaceuticals, Inc. Steadman, Bryan Taylor, Ross <120> TARGETED HETEROLOGOUS ANTIGEN PRESENTATION ON CALICIVIRUS VIRUS-LIKE PARTICLES <130> LIGO-023/01WO 306927-2136 <150> US 61/297,109 <151> 2010-01-21 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 530 <212> PRT <213> Norovirus Norwalk virus sp. <400> 1 Met Met Met Ala Ser Lys Asp Ala Thr Ser Ser Val Asp Gly Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Gly Gln Leu Val Pro Glu Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Ala 20 25 30 Met Asp Pro Val Ala Gly Ser Ser Thr Ala Val Ala Thr Ala Gly Gln 35 40 45 Val Asn Pro Ile Asp Pro Trp Ile Ile Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro 50 55 60 Gln Gly Glu Phe Thr Ile Ser Pro Asn Asn Thr Pro Gly Asp Val Leu 65 70 75 80 Phe Asp Leu Ser Leu Gly Pro His Leu Asn Pro Phe Leu Leu His Leu 85 90 95 Ser Gln Met Tyr Asn Gly Trp Val Gly Asn Met Arg Val Arg Ile Met 100 105 110 Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Val Ser Cys Ile 115 120 125 Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu 130 135 140 Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val 145 150 155 160 Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn 165 170 175 Gln Gln Thr Met Arg Leu Val Cys Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Thr 180 185 190 Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Phe Val Val Ala Gly Arg Val Met Thr 195 200 205 Cys Pro Ser Pro Asp Phe Asn Phe Leu Phe Leu Val Pro Pro Thr Val 210 215 220 Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser 245 250 255 Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu 260 265 270 Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro Val Ser Leu Ser His Val Ala 275 280 285 Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu 290 295 300 Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe 305 310 315 320 Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly 325 330 335 His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe 340 345 350 Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn 355 360 365 Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser Pro Pro Ser His Pro Ser Gly 370 375 380 Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr 385 390 395 400 Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu 405 410 415 Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn 420 425 430 Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr Ile Ser His Leu Ala Ser Glu 435 440 445 Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala Leu Leu His Tyr Val Asp Pro 450 455 460 Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe 465 470 475 480 Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro 485 490 495 Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln 500 505 510 Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser Ser Ala Arg Gly Arg Leu Gly Leu 515 520 525 Arg Arg 530 <210> 2 <211> 540 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Composite GII.4 Norovirus VP1 amino acid sequence <400> 2 Met Lys Met Ala Ser Ser Asp Ala Asn Pro Ser Asp Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu Pro Val 20 25 30 Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln Asn Val Ile 35 40 45 Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe 50 55 60 Thr Val Ser Pro Arg Asn Ala Pro Gly Glu Ile Leu Trp Ser Ala Pro 65 70 75 80 Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser His Leu Ala Arg Met Tyr 85 90 95 Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn 100 105 110 Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe 115 120 125 Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro Ser Gln Val Thr Met Phe Pro His Ile 130 135 140 Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp 145 150 155 160 Val Arg Asn Asn Phe Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Leu Ile Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly 180 185 190 Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro 195 200 205 Asp Phe Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Thr 210 215 220 Lys Pro Phe Thr Val Pro Ile Leu Thr Val Glu Glu Met Thr Asn Ser 225 230 235 240 Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Phe Thr Gly Pro Ser Gly Ala 245 250 255 Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr Asp Gly Val Leu 260 265 270 Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Pro Val Asn Ile Cys Thr Phe Arg Gly 275 280 285 Asp Val Thr His Ile Ala Gly Thr Gln Glu Tyr Thr Met Asn Leu Ala 290 295 300 Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu Ile Pro Ala Pro 305 310 315 320 Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly Val Leu Thr Gln 325 330 335 Thr Thr Arg Gly Asp Gly Ser Thr Arg Gly His Lys Ala Thr Val Ser 340 345 350 Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Val Gln Phe Ser 355 360 365 Thr Asp Thr Ser Asn Asp Phe Glu Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe Thr 370 375 380 Pro Val Gly Val Val Gln Asp Gly Ser Thr Thr His Gln Asn Glu Pro 385 390 395 400 Gln Gln Trp Val Leu Pro Asp Tyr Ser Gly Arg Asp Ser His Asn Val 405 410 415 His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu 420 425 430 Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asn 435 440 445 Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu 450 455 460 Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro 465 470 475 480 Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr 485 490 495 Val Thr Val Ala His Thr Gly Gln His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn 500 505 510 Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala 515 520 525 Pro Met Gly Asn Gly Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu 530 535 540 <210> 3 <211> 551 <212> PRT <213> Sapovirus sp. <400> 3 Met Glu Gly Asn Gly Leu Pro Gln Ala Gly Gln Gln Gln Ala Leu Asp 1 5 10 15 Val Pro Gly Thr Thr Gly Pro Thr Ser Ser Ala Val Val Val Ala Asn 20 25 30 Pro Asp Gln Pro Ser Ala Gln Ala Gln Arg Met Glu Leu Ala Val Ala 35 40 45 Thr Gly Ala Val Ser Ser Asn Val Pro Asp Ala Val Arg Gln Cys Phe 50 55 60 Ala Leu Leu Arg Thr Phe Pro Trp Asn Thr Arg Gln Ala Thr Gly Thr 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ser Ala Ala Leu Ser Pro Ala Leu Asn Pro Tyr Thr Ala 85 90 95 His Leu Ser Ala Met Trp Ala Gly Trp Gly Gly Ser Met Glu Ala Arg 100 105 110 Val Thr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Phe Ala Gly Lys Ile Ile Val Ala 115 120 125 Leu Leu Pro Pro Gly Leu Asp Pro Thr Arg Val Arg Asp Pro Gly Val 130 135 140 Leu Pro His Ala Gln Val Asp Ala Arg Ala Val Asp Pro Ile Thr Phe 145 150 155 160 Asn Ile Asn Asp Val Arg Ala Val Asp Tyr His Arg Thr Asp Gly Gln 165 170 175 Glu Ala Thr Ser Thr Leu Gly Phe Trp Val Leu Gln Pro Leu Ile Asn 180 185 190 Pro Phe Ser His Asp Ala Leu Ser Thr Ala Trp Val Ser Val Glu Thr 195 200 205 Arg Pro Gly Pro Asp Phe Asp Phe Cys Leu Leu Lys Pro Pro Gln Met 210 215 220 Glu Met Glu Asn Gly Leu Ser Pro Ser Thr Leu Leu Pro Arg His Leu 225 230 235 240 Gly Arg Ser Arg Gly Asn Arg Cys Gly Gly Phe Ile Val Gly Met Ala 245 250 255 Val Val Ala Met Ala His Gln Val Asn His His Phe Ser Thr Ala Ala 260 265 270 Thr Thr Tyr Gly Trp Ser Thr Leu Pro Leu Gly Pro Cys Ala Ala Lys 275 280 285 Ile Thr Ser Ser Leu Pro Gly Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Gly Phe Ala 290 295 300 Asp Val Asp Gly Ala Gly Glu Gly Pro Ile Met Pro Asn Ile Pro Asn 305 310 315 320 His Trp Pro Asp Ser Cys Ala Ser Ser Val Ile Ala Thr Trp Asp Ser 325 330 335 Ser Leu His Arg Pro Asn Leu Gly Ile Ser Gly Ser Ile Met Thr Phe 340 345 350 Asp Asn His Gly Asp Ala Asp Glu Ala Gln Ile Thr Gly Ala Met Ala 355 360 365 Ala Thr Val Asp Pro Ser Pro Ser Arg Arg Thr Gln Leu Gln Gly Ser 370 375 380 Phe Thr Ala Asn Thr Met Arg Ile Met Arg Thr Ser Gly Leu Asp Lys 385 390 395 400 Ile Gly Glu Val Asn Lys Asn Val Tyr Phe Ile Pro Ile Leu Leu Asp 405 410 415 Gly Ala Thr Gly Tyr Ile Asn Glu Lys Val Thr Asn Leu Ala Asp Ile 420 425 430 Asn Ile Ser Tyr Gly Pro Val Gly Ser Asn Asn Val Ile Leu Trp Arg 435 440 445 Glu Arg Val Phe Ser Ser His Pro Arg Pro Gly Ile Leu Tyr Ser Ser 450 455 460 Gln Leu Glu Ser Thr Ala Ser Ile Phe Gln Asp Gly Pro Val Asn Ile 465 470 475 480 Pro Asn Asn Tyr Met Ala Val Phe Asn Val Ser Asp Thr Gly Ala Asp 485 490 495 Phe Gln Ile Gly Ile Cys Pro Asp Gly Tyr Met Arg Thr Gly Ser Pro 500 505 510 Val Gly Thr Val Val Asp Leu Thr Pro Glu Cys Thr Phe Thr Phe Val 515 520 525 Gly Leu Phe Pro Phe Thr Ser Pro Leu Asn Gly Pro His Gly Thr Gly 530 535 540 Arg Gly Arg Ser Val Tyr Gln 545 550 <210> 4 <211> 558 <212> PRT <213> Vesivirus San Miguel sea lion sp. <400> 4 Ser Asp Gly Pro Gly Ser Ala Glu Ile Val Thr Glu Glu Gln Gly Thr 1 5 10 15 Val Val Gln Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Leu Ala Thr Leu 20 25 30 Ala Thr Ala Ser Thr Gly Lys Ser Val Glu Gln Glu Trp Met Thr Phe 35 40 45 Phe Ser Tyr His Thr Ser Ile Asn Trp Ser Thr Val Glu Ser Gln Gly 50 55 60 Lys Ile Leu Tyr Ser Gln Ala Leu Asn Pro Ser Ile Asn Pro Tyr Leu 65 70 75 80 Asp His Ile Ala Lys Leu Tyr Ser Thr Trp Ser Gly Gly Ile Asp Val 85 90 95 Arg Phe Thr Val Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala 100 105 110 Leu Leu Val Pro Pro Gly Val Glu Pro Ile Glu Ser Val Ser Met Leu 115 120 125 Gln Tyr Pro His Val Leu Phe Asp Ala Arg Gln Thr Glu Pro Val Ile 130 135 140 Phe Thr Ile Pro Asp Ile Arg Lys Thr Leu Phe His Ser Met Asp Glu 145 150 155 160 Thr Asp Thr Thr Lys Leu Val Ile Met Val Tyr Asn Glu Leu Ile Asn 165 170 175 Pro Tyr Glu Asn Gly Val Glu Asn Lys Thr Thr Cys Ser Ile Thr Val 180 185 190 Glu Thr Arg Pro Ser Ala Asp Phe Thr Phe Ala Leu Leu Lys Pro Pro 195 200 205 Gly Ser Leu Ile Lys His Gly Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Arg 210 215 220 Asn Ser Ala His Trp Met Gly Asn Arg Trp Trp Ser Thr Ile Ser Gly 225 230 235 240 Phe Ser Val Gln Pro Arg Val Phe Gln Ser Asn Arg His Phe Asp Phe 245 250 255 Asp Ser Thr Thr Thr Gly Trp Ser Thr Pro Tyr Tyr Val Pro Ile Glu 260 265 270 Ile Lys Ile Gln Gly Lys Val Gly Ser Asn Asn Lys Trp Phe His Val 275 280 285 Ile Asp Thr Asp Lys Ala Leu Val Pro Gly Ile Pro Asp Gly Trp Pro 290 295 300 Asp Thr Thr Ile Pro Asp Glu Thr Lys Ala Thr Asn Gly Asn Phe Ser 305 310 315 320 Tyr Gly Glu Ser Tyr Arg Ala Gly Ser Thr Thr Ile Lys Pro Asn Glu 325 330 335 Asn Ser Thr His Phe Lys Gly Thr Tyr Ile Cys Gly Thr Leu Ser Thr 340 345 350 Val Glu Ile Pro Glu Asn Asp Glu Gln Gln Ile Lys Thr Glu Ala Glu 355 360 365 Lys Lys Ser Gln Thr Met Tyr Val Val Thr Ala Asp Phe Lys Asp Thr 370 375 380 Ile Val Lys Pro Gln His Lys Ile Ser Pro Gln Lys Leu Val Val Tyr 385 390 395 400 Phe Asp Gly Pro Glu Lys Asp Leu Thr Met Ser Ala Thr Leu Ser Pro 405 410 415 Leu Gly Tyr Thr Leu Val Asp Glu Gln Pro Val Gly Ser Val Ser Ser 420 425 430 Arg Val Val Arg Ile Ala Thr Leu Pro Glu Ala Phe Thr Gln Gly Gly 435 440 445 Asn Tyr Pro Ile Phe Tyr Val Asn Lys Ile Lys Val Gly Tyr Phe Asp 450 455 460 Arg Ala Thr Thr Asn Cys Tyr Asn Ser Gln Ile Leu Met Thr Ser Gln 465 470 475 480 Arg Leu Ala Glu Gly Asn Tyr Asn Leu Pro Pro Asp Ser Leu Ala Val 485 490 495 Tyr Arg Ile Thr Asp Ser Ser Ser Gln Trp Phe Asp Ile Gly Ile Asn 500 505 510 His Asp Gly Phe Ser Tyr Val Gly Leu Ser Asp Leu Pro Asn Asp Leu 515 520 525 Ser Phe Pro Leu Thr Ser Thr Phe Met Gly Val Gln Leu Ala Arg Val 530 535 540 Lys Leu Ala Ser Lys Val Lys Ala His Thr Ile Thr Ala Lys 545 550 555 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> influenza hemagglutinin antigen epitope <400> 5 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Respiratory syncytial virus F protein antigenic epitope <400> 6 Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn 1 5 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Respiratory syncytial virus F protein antigenic epitope <400> 7 Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro 1 5 10 15 Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val 20 25

Claims (38)

  1. P2 도메인을 가진 칼리시바이러스 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편을 포함하는 키메릭 단백질로서, 상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 상기 P2 도메인 속에 삽입되며 상기 키메릭 단백질은 숙주 세포에서 발현될 때 바이러스 유사 입자들을 형성할 수 있는 키메릭 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편이 상기 P2 도메인의 적어도 하나의 용매 노출 루프 속에 삽입되는 키메릭 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 대체하는 키메릭 단백질.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 약 2개 내지 약 50개 아미노산을 대체하는 키메릭 단백질.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 약 4개 내지 약 20개 아미노산을 대체하는 키메릭 단백질.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 약 5개 아미노산을 대체하는 키메릭 단백질.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 칼리바이러스는 노로바이러스인 키메릭 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질은 VP1인 키메릭 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 가지는 키메릭 단백질.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 위치 295에 있는 아스파라긴 잔기, 위치 296에 있는 글리신 잔기, 위치 308에 있는 프롤린 잔기, 위치 336에 있는 글리신 잔기, 위치 338에 있는 세린 잔기, 위치 362에 있는 아스파라긴 잔기, 위치 363에 있는 글리신 잔기, 위치 382에 있는 프롤린 잔기, 위치 383에 있는 세린 잔기, 위치 399에 있는 아이소루신 잔기 또는 위치 402에 있는 알라닌 잔기 이후에 SEQ ID NO:1 속에 직접 삽입되는 키메릭 단백질.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 SEQ ID NO:1의 아미노산 294-298, 아미노산 307-311, 아미노산 337-341, 아미노산 362-366, 아미노산 381-385 또는 아미노산 401-405를 대체하는 키메릭 단백질.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질은 노로바이러스의 둘 이상의 순환하는 균주로부터 유래된 복합 캡시드 단백질인 키메릭 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 복합 캡시드 단백질은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 가지는 키메릭 단백질.
  14. 제 7 항에 있어서,
    상기 노로바이러스는 유전자군 I 또는 유전자군 II 노로바이러스인 키메릭 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 노로바이러스는 유전자군 I, 유전자형 I 노로바이러스 또는 유전자군 II, 유전자형 4 노로바이러스인 키메릭 단백질.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 길이가 약 5 내지 약 70 아미노산인 키메릭 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 항원 에피토프를 포함하는 키메릭 단백질.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 바이러스, 박테리아, 진핵 병원체, 종양 관련 항원 또는 알레르겐으로부터 유래되는 키메릭 단백질.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 및 메타뉴모바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는 키메릭 단백질.
  20. 제 1 항의 키메릭 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자.
  21. 제 20 항의 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신 제제.
  22. 제 21 항에 있어서
    항원보강제를 더 포함하는 백신 제제.
  23. 제 1 항의 키메릭 단백질을 암호화하는 분리 핵산.
  24. 제 23 항의 분리 핵산을 포함하는 벡터.
  25. 제 24 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  26. 제 25 항에 있어서,
    숙주 세포는 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포인 숙주 세포.
  27. 숙주 세포에 제 1 항의 키메릭 단백질을 발현하는 단계; 및
    바이러스 유사 입자들이 형성되는 조건에서 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하는 키메릭 바이러스 유사 입자의 제조 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 P2 도메인의 적어도 하나의 용매 노출 루프에 융합되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 적어도 하나의 아미노산을 대체하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 1개 내지 약 50개 아미노산을 대체하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 약 4개 내지 약 20개 아미노산을 대체하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 상기 캡시드 단백질의 약 5개 아미노산을 대체하는 방법.
  33. 제 27 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 길이가 약 5개 내지 약 70개 아미노산인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 항원 에피토프를 포함하는 방법.
  35. 제 27 항에 있어서,
    상기 칼리시바이러스는 노로바이러스인 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 노로바이러스는 유전자군 I 또는 유전자군 II 노로바이러스인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 노로바이러스는 유전자군 I, 유전자형 I 노로바이러스 또는 유전자군 II, 유전자형 4 노로바이러스인 방법.
  38. 제 21 항의 백신 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하여 외래 물질에 대한 면역반응을 유도하는 방법으로서, 적어도 하나의 이종 항원 또는 이의 단편은 외래 물질로부터의 단백질로부터 유래되는 것인 방법.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2664157C (en) 2006-09-29 2015-12-01 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Norovirus vaccine formulations
CA2683977C (en) * 2007-03-14 2017-04-25 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. A method of norovirus virus-like particle purification comprising ion exchange chromatography
CA2698397C (en) 2007-09-18 2018-03-27 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
US20100266636A1 (en) 2007-09-18 2010-10-21 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
CA2733589C (en) * 2008-08-08 2021-07-13 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Virus-like particles comprising composite capsid amino acid sequences for enhanced cross reactivity
AU2011207355B2 (en) * 2010-01-21 2015-04-02 Takeda Vaccines, Inc. Targeted heterologous antigen presentation on Calicivirus virus-like particles
CN105031637A (zh) 2011-07-11 2015-11-11 武田疫苗股份有限公司 胃肠外诺如病毒疫苗配制剂
JOP20130186B1 (ar) 2012-06-22 2021-08-17 Takeda Vaccines Montana Inc تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات
US9975923B2 (en) 2013-03-15 2018-05-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for norovirus blockade epitopes
EP2970395A4 (en) * 2013-03-15 2017-03-29 The University of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for norovirus blockade epitopes
JP2015015931A (ja) * 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
WO2015101666A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Fundación Biofísica Bizkaia VLPs, METHODS FOR THEIR OBTENTION AND APPLICATIONS THEREOF
US10744193B2 (en) 2015-03-30 2020-08-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic RSV polypeptides
JP6675185B2 (ja) * 2015-11-30 2020-04-01 宏 半田 免疫誘導剤およびその製造方法
CA3056812C (en) 2017-03-23 2022-11-29 Medicago Inc. Norovirus fusion proteins and vlps comprising norovirus fusion proteins
CN107988240A (zh) * 2017-12-20 2018-05-04 中国人民解放军南京军区南京总医院 鼠诺如病毒vp1蛋白病毒样颗粒表达、纯化及多克隆抗体制备

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6572862B1 (en) * 1989-11-08 2003-06-03 Baylor College Of Medicine Methods and reagents to detect and characterize Norwalk and related viruses
WO1994005700A2 (en) * 1992-09-07 1994-03-17 Baylor College Of Medicine Methods and reagents to detect and characterize norwalk and related viruses
KR100771402B1 (ko) 1999-06-22 2007-10-30 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 Ｓｒｓｖ 검출 킷트
US8277819B2 (en) * 2005-06-16 2012-10-02 Children's Hospital Medical Center Norovirus particle for use as an antiviral or vaccine
CA2664157C (en) * 2006-09-29 2015-12-01 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Norovirus vaccine formulations
WO2008040060A1 (en) * 2006-10-04 2008-04-10 The University Of Queensland Vlp based vaccine delivery system
US8486421B2 (en) * 2009-06-09 2013-07-16 Children's Hospital Medical Center Antigen-norovirus P-domain monomers and dimers, antigen-norovirus P-particle molecules, and methods for their making and use
AU2011207355B2 (en) * 2010-01-21 2015-04-02 Takeda Vaccines, Inc. Targeted heterologous antigen presentation on Calicivirus virus-like particles

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