KR100285585B1

KR100285585B1 - 씨(c)형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 단백질의 제조방법

Info

Publication number: KR100285585B1
Application number: KR1019930026611A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 김천형
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 2001-04-02
Also published as: KR940021733A; KR940021575A

Abstract

본 발명은 HCV의 비구조 5-1.2 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV의 비구조 5-1.2 단백질과 유비퀴틴의 융합단백질을 생산하는 발현벡터, 상기 발현벡터를 사용하여 HCV의 비구조 5-1.2 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 유비퀴틴에 융합된 HCV의 비구조 5-1.2 단백질에 관한 것이다.

Description

씨(C)형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 단백질의 제조방법

제1도는 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 유전자의 연결 전략 및 생성된 발현 벡터를 도시한 것이고,

제3-A도는 비구조 5-1.2 유전자의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3-B도는 비구조 5-1.2 유전자의 발현물을 C 형 간염 환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이며,

제4도의 A 는 403 단백질 및 비구조 5-1.2 단백질의 발현을 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 확인한 결과를 나타내며,

제4도의 B 는 403 및 비구조 5-1.2 유전자의 발현물을 C 형 간염 환자의 혈청으로 웨스턴 블로팅하여 비교한 결과를 나타낸다.

본 발명은 C 형 간염 바이러스 (이하 “HCV”라 함)의 비구조 5-1.2 단백질, 그의 생산을 위한 발현 벡터 및 상기 벡터를 사용한 HCV 비구조 5-1.2 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HCV 의 비구조 5-1.2 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV 의 비구조 5-1.2 단백질과 유비퀴틴의 융합단백질을 생산하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 사용하여 HCV의 비구조 5-1.2 단백질을 대량 생산하는 방법 및 이에 의해 생산된 유비퀴틴에 융합된 HCV의 비구조 5-1.2 단백질에 관한 것이다.

최근까지 바이러스성 간염은 A 형 간염바이러스(HAV), B 형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으나 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90%를 차지하는 비A비B형 간염 바이러스(NANBH)가 확인되었다. (Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-84L(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 간염환자가 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H.J., in A.J.Zuckerman(ed. ), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York(1988)), 이중 약 40-50% 가 만성간염으로 진전되고, 또 이중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다 (Dienstag, J.L., et at., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(1986)).

브래들리(Bradley) 등은 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스 (이하 HCV 라 함)의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고 (Bradley, D.W. et at., Gastroenterology, 88, 773-779(1985)), 츄(Choo)등은 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positive-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010-3011 개 의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q.L., et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q.L., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

C 형 간염 바이러스의 유전자 구조는 플라비바이러스(flavivirus) 및 페스티 바이러스(pestivirus)의 유전자 구조와 유사성을 가지며, 이들의 유연관계로 미루어 C 형 간염 바이러스의 다단백질(polyprotein)은 아미노 말단으로 부터 핵(core)-외피1(envelope-1)-외피2/비구조1(E2/NS1)-비구조2(NS2)-비구조3(NS3)-비구조4(NS4)-비구조5(NS5) 순서로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(Choo, Q.L., et al., Proe. Natl. Aca. Sci. USA 88, 2451-2455(1991); Takamizawa, A., et al., J. Virol. 65, 1105-1113(1991); Kato, N., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87, 6524-6728(1990)).

외피1 및 외피2/비구조1 단백질 (이하 외피2 단백질이라 함)은 생체외(in vitro) 실험을 통해 분자량이 각각 33,000, 72,000 달톤의 크기를 갖는 당단백질임이 밝혀졌고(Houghton, M., et aL., Hepatology 14, 381-388(1991); Hijkata, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)), 플라비바이러스의 백신으로 추정되는 비구조1 단백질 및 페스티바이러스의 백신으로 추정되는 gp53/55 단백질과 상당한 구조적 유사성을 가지고 있어 C 형 간염 바이러스의 백신개발 및 치료제 개발에 1차적 목표가 되어 왔다(Spete, R.R. et at., Virology 188, 877-830(1992)).

비구조3 단백질은 바이러스 단백질 분해효소로서 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들을 절단하여 각각의 비구조 단백질들을 생성하는 것으로 추정되고 있으며(Bajan, J.F,m Virology 171, 637-639(1989)), 비구조5 단백질은 지금까지 알려진 바이러스 리보핵산 중합효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하여 C 형 간염 바이러스의 리보핵산 중합효소(RNA polymerase)로 추정되고 있다(Mita, E., et al., Biochem Biophy. Res. Comm. 183, 925-930(1992)).

C 형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단방법은 초기에 미국 카이론사의 츄등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합단백질 SOD-C100-3를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역 측정법에 의해 수혈성 간염 환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Science 244, 362-384(1989)). 그러나 많은 환자의 경우 C100-3에 대한 항체가 C 형 간염 바이러스 감염 후 4 내지 6개월이 지난후에 생성되어 초기의 급성 간염 환자에게서는 정확한 진단이 불가능하다는 단점(Alber, H.J, et at., N. Engl. J. Med 321, 1494-1500(1989); Miyamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 983-987(1990)) 및 C 형 간염이외의 자가면역성 질환(autoimmune disease)등에 기인한 간염환자의 경우에서도 상당한 비율로 양성반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I.G., et. al., Lancet 335, 754-757(1990)).

최근에 C 형 간염 바이러스의 5′말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로 부터 발현시킨 핵 단백질을 사용한 진단방법의 경우 C100-3를 사용한 진단방법에 비해 약 6 내지 8 주 일찍 항체를 진단할 수 있음이 확인되어 기존의 C100-3 항원만을 사용한 제 1 세대 진단방법보다 조기진단이 가능하고 민감한 진단방법임이 보고 되었다(Harada, S. et al., J. Virol. 65, 3015(1991)). 미국의 UBI 사는 핵 구조 유전자로 부터 15 내지 65개 아미노산으로 구성된 합성폴리펩타이드를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 보고하였고(Wang, C.Y., EP 442394(199l)), 기존의 C100-3 항원에 핵 구조유전자 유래 C22 및 비구조 3 유전자 유래의 C33C를 첨가한 제 2 세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음을 보고하였다(Van der poel, C.L., et at. Laneet 337, 317-319(199l)).

본 발명자들은 한국형 C 형 간염 환자의 혈청으로 부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 고유한 한국형 HCV가 존재함을 규명한 바 있으며 또한 핵 유전자로 부터 KHCV UB Core14, 비구조3 유전자로 부터 KHCV UB897 단백질 및 비구조5 유전자로부터 KHCV 403 단백질을 재조합 효모 및 대장균으로 부터 발현시켜(선행 한국 특허출원 제 91-10942 호, 제 91-10943 호, 제 91-25505 호 및 제 92-10039 호 참조), 이들 단백질들의 면역특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 및 정제할 수 있는 방법을 개발하였다(선행 한국 특허출원 제 91-13594 호, 제 91-13595 호, 제 91-13597 호, 제 92-25506 호 및 제 92-10039 호 참조). 또한 이들 HCV 특이 항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역측정법(ELISA imnunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C 형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(선행 한국 특허출원 제 91-13601 호 참조).

그러나 상기한 HCV 항원들은 C 형 간염의 진단에는 유용하나 그 치료를 위해 만성간염 급성 간염 환자의 경과를 정확히 구분하기 위한 목적에 있어서는 만족스럽지 못하였다. 따라서 간염 초기에 나타나는 HCV 항체를 좀 더 빨리 인식할 수 있는 진단방법과 바이러스 RNA 및 바이러스 항원을 인식할 수 있 는 진단방법의 개발이 절실히 필요하다.

다른 한편으로, 순수분리된 HCV의 특이항원들을 이용하여 이들 항원들에 대한 단일 클론성항체 또는 다중 클론성 항체를 제조할 수 있으며 이 항체들을 C 형 간염환자의 혈청에서 HCV 항원을 검출하는데 사용함으로써 좀더 민감한 조기 진단에 크게 공헌 할 수 있고, 특히 이 항체들중 중화 항원결정기(neutralizing epitope)에 대한 특이성을 가지고 있는 항체들은 수동면역 치료법에 대해서도 크게 유용하다. 또한 단일클론성 항체는 항 이디오타입 항체를 증가시키는데 사용될 수 있는데 이는 HCV 항원의 면역원성 영역을 밝히는 것 뿐만아니라 C 형 간염의 치료 및 진단에도 유용하게 사용할 수 있다는 것이 공지되어 있다.

한편 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500 달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는것으로 보고되었다(Goldstein, et aL., Proc. Natl. Acad. Sci. 72,11(1975)). 지금까지 동물세포로 부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해 공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et at., Trends Biochem. Sci. 10, 343(1985)). 대장균내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포내에서 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 최근에는 효모에서 UBP 1 이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비퀴틴 융합 단백질로부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질 만을 얻을 수 있게 되었다.(Tobias, J.W. et al., J. Biological Chemistry 266, 12021-12028(1991)).

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 한국형 C 형 간염환자의 진단에 있어서, 기존의 미국형 및 일본형 HCV에 의해 코딩되는 단백질을 사용하는 것보다 감지도 및 특이도가 더 높은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신을 개발하고자 노력하던 중, 한국형 HCV의 전체 유전자중 비구조 5 유전자에서 상기한 KHCV 403 부분을 포함하는 아미노말단 1,200 염기쌍 부분이 한국형 C 형 간염 환자의 혈청과 면역학적 특이성을 가지고 반응하며 또한 상기한 KHCV 403 보다 더 높은 민감도를 보인다는 것을 확인하고 이를 유전공학적인 방법으로 재조합 대장균에서 발현시키는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신의 개발에 기여할 수 있는 HCV의 비구조 5-1.2 단백질이 유비퀴틴에 융합된 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 비구조 5-1.2 단백질의 유전자를 유비퀴틴 유전자와 결합된 상태로 포함하여 그의 발현시 HCV 의 비구조 5-1.2 단백질과 유비퀴틴의 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 이용하여 HCV의 비구 조 5-1.2 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저 한국형 C 형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 염기서열 정보(본 출원인이 선 출원한 대한민국 특허원 제 92-10039 호 참조)로부터 비구조 5-1.2 단백질을 코딩하는 비구조 5-1.2 유전자의 5′말단과 3′말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)용 시발체를 합성하였다. 이들 시발체는 유비퀴틴 유전자의 3′말단과 접합이 가능하도록 5′ 말단에 제한효소 인식부위가 존재하며, 이에 대응되는 시발체에는 종료 코오돈과 제한효소의 인식부위를 삽입하여 유비퀴틴의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 한다. 이들 시발체들을 이용하여 C 형 간염 바이러스의 cDNA인 KHCV-LBC1 를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 비구조 5-1.2 유전자를 증폭하며, 이 증폭된 유전자를 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 플라스미드 ptrpH-UB-KHCV(ATCC 68640, ATCC 68641, ATCC 68642)(본 출윈인이 선출원한 한국특허출원 제 91-13603 호 참조)의 KHCV 유전자와 치환하여 발현 벡터를 제조하였다.

상기의 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 세포로부터 발현된 비구조 5-1.2 단백질을 15% 폴리아크릴 아미드젤에서 전기영동한 후, 한국형 C 형 간염 환자의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린으로 웨스턴-블롯팅 하여 비구조 5-1.2 단백질이 한국형 C 형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 것을 확인 하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지 않는다.

하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소를 사용한 DNA의 절단.]

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충용액을 50㎕ 내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃ 에서 1 내지 2 시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃ 에서 15분간 열처리하고, 내열성인 제한 효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한 효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글랜드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화시키거나 핵산을 추출할때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스-HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 혼들어 혼합한 다음 원심분리(15,000xG, 5분)시켜 상충액을 새튜브로 옮긴다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로 포름과 이소부탄올 비율 24:1(v/v)으로 상층액을 추출하여 0.1 부피의 3M 소듐 아세테이트와 2.5 부피의 100% 에탄올을 가한다. 이를 -70℃에서 30 분간 또는 -20℃에서 약 2 시간이상 정치한 후 원심 분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[연결 반응(ligation)]

연결 효소로서 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M 디티오트레이톨, 10mM ATP, 0.5mg/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10 단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DHA의 연결에는 100 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃에 적어도 5 시간이상 또는 4℃ 에서 14시간 이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃에서 15 분간 가열하여 연결효소를 불활성화시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질전환]

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖의 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm 에서의 광학밀도(0.D.) 값이 0.25 내 지 0.5에 달할때까지 37℃ 에서 배양한다. 그후 원심분리(2,500xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척한다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하고 여기에 50㎖ 0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂, 용액을 가하여 얼음위에서 30 분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하여 동일용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCL₂) 5㎖에 균일하게 분산시켰다. 위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖에 연결 반응 용액 10㎕를 가하여 0℃ 에서 40분간 정치시킨후 42℃ 에서 1분동안 열처리 하였다. 이를 2.0㎖의 액체 LB 배지에 가하여 37℃ 에서 1시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. M13 벡터 DNA는 열처리한 후 100㎍의 JM105 세포, 15㎍의 100mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside), 25㎍의 4% X-Gal(5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactoside) 및 48℃로 미리 데워놓은 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토트립톤, 8.7% 박토 아가)틀 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 1.5% 박토아가)위에 도말하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴 아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 Cl8 컬럼인 SEP-PAK(Waters Inc., U.S.A.)에 부착시킨 후 아세토니트릴 : 물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6]

[중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎍의 10배 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-Cl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎍의 dNTP 혼합용액(dGTp, dATP, dTTp, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕ 의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총부피를 100㎕로 하였다.

여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 첨가하였다.

온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A )를 이용하였으며, 순환프로그램은 95℃에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다.

[실시예 1]

[한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 유전자의 증폭]

(단계 1)

기존에 클로닝된 한국형 C 형 간염 바이러스의 cDNA(KHCV-LBC1, 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 92-10039 호, ATCC 75008, 기탁일 1991년 5월 14일)의 일부인 비구조 5-1.2 유전자를 유비퀴틴이 결합된 trp 프로모터를 갖고 있는 대장균 발현벡터에 클로닝하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

이 시발체는 제한효소 SacII 인식 부위를 가지고 있으며 한국형 C 형 간염 바이러스의 cDNA 인 KHCV-LBC1 의 6649번째 염기부터 6669번째 염기를 포함하고 있다.

이 시발체는 KHCV-LBC1 의 7824번째 염기뒤에 해독을 종료시키는 종료코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 Sa1I 인식부위를 가지고 있다.

(단계 2)

반응튜브에 시발체 PNS5T2 2㎍, 시발체 PNS51.2SAL 2㎍를 넣고 주형으로 KHCV-LBCl 유전자를 50ng 넣은다음 10㎕의 10배 농도 중합효소완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTp), 2.5단위의 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6 에서와 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다(Saiki, R.K.et.aL., Science, 239:487(1988)).

(단계 3)

상기 단계 2 에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴 아미드 젤에서 분리한 결과 약 1.2Kb 염기쌍의 DNA가 증폭된 것을 확인하였으며 이를 동일조건의 폴리아크릴아미드젤로 분리 정제하였다. 이하 이 DNA 단편을 단편 NS5-1.2 로 명명하였다.

[실시예 2]

[대장균 발현 벡터의 제조]

본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허 출원 제 91-13603 호, ATCC 68642, 1991년 7월 1일자로 기탁) 2㎍을 제한효소 SacII와 제한효소 SaII으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 완전절단한 후 0.7% 아가로스젤에서 분리하여 약 2.7kb 단편을 분리정제하였다. 이하 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L로 명명하였다.

한편 실시예 1의 단계 3에서 얻은 DNA 단편 2㎍을 제한효소 SacII와 제한효소 SalI으로 NEB 완충용액 3의 조건하에서 참조예 1에서와 같이 완전절단 한 후 튜브에 절단된 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 10배 농도 연결반응용액, 10 단위의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시 간동안 반응시켰다. 반응이 끝난뒤 이를 사용하여 E.coli W3110(ATCC 37339)를 형질 전환시켜 단편 NS5-1.2를 함유한 ptrpH-UB-NS5-1.2를 포함하는 재조합 대장균을 얻었다. (제2도)

[실시예 3]

[비구조 5-1.2 유전자의 발현]

상기 실시예 2에서 얻은 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 유전자를 함유하고 있는 재조합 대장균 세포를 50㎍/㎖의 암피실린이 함유된 액체 루리아(Luria)배지 (6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12 시간동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖ 씩을 각기 300㎖의 M9 배지 (40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B1, 40㎍/㎖ 암피실린)로 옮겨서 37℃ 에서 약 4 시간동안 진탕배양하여 배양액의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌아크릴산(indoleacrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4 시간후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심 분리기(Beckman J2-21, JAl4 rotor)를 이용하여 11,000rpm 에서 25분간 원심분리하여 대장균 세포침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[비구조 5-1.2 단백질 발현의 확인 및 C 형 간염 환자 혈청과의 반응]

실시예 3의 세포침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227,680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기 영동하였고(제3-A도), 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., pore size 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 한국형 C 형 간염환자들의 혈청으로 부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종 농도 16㎍/㎖이 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 필터를 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS에 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, antihuman IgG-HRP, 0.01mg.ml, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충액을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과는 제3-B도에 나타내었다.

제3-A도 및 제3-B도에서 제 1 열은 본 발명의 벡터를 함유하지 않은 대장균을 나타내며 제2, 3열은 ptrpH-UB-NS5-102를 함유한 대장균을 나타낸다.

[실시예 5]

[403 단백질과 NS5-1.2 단백질의 혈청과의 반응성 실험]

실시예 3의 세포침전물 및 본 출원인의 선행 한국 특허 출원 제 91-13594호에서의 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재하에서 15% 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동하고(제4-A도), 이 젤을 상기 실시예 4에서와 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅하였다. 그 결과는 제4-B도에 나타내었다. 제4-A도 및 제4-B도에서 제 1 열은 403 단백질을, 제 2 열은 ptrpH-UB-NS5-1.2를 함유한 대장균의 침전물을 나타낸다.

제4도의 결과로 부터 403 단백질에 비해 NS5-1.2 단백질이 간염환자의 혈청에 대해 더 높은 민감도를 가짐을 알 수 있다.

본 발명을 통해 HCV의 특이항원인 비구조 5-1.2 단백질을 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있게 되었으며, 이를 이용하여 보다 정확한 C 형 간염 진단방법의 개발이 가능하며 특히 비구조 5-1.2 단백질을 항원으로 사용하여 HCV 항원에 대한 특이항체를 만들 수 있게 함으로써 HCV에 대한 백신의 개발에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

Claims

유비퀴틴에 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 단백질이 융합된 재조합 단백질.
제1항의 재조합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
제2항에 있어서, 한국형 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 단백질을 코딩하는 하기 뉴클레이오티드 서열을 포함하는 DNA.
제2항 또는 제3항의 DNA를 포함하는 발현벡터.
제4항에 있어서, ptrpH-UB-NS5-1.2인 발현벡터.
제4항 또는 제5항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제6항에 있어서, ptrpH-UB-NS5-1.2로 형질전환된 대장균.
제6항 또는 제7항의 대장균을 배양함을 포함하는 유비퀴틴에 융합된 C 형 간염 바이러스의 비구조 5-1.2 유전자 단백질의 제조 방법.