KR100236769B1 - 씨형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질의 항원결정부위 및 외피 단백질의 항원결정부위가 융합된 재조합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HCV의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정부위를 각각 하나 이상 포함하는 융합된 제조합 단백질 및 이를 코딩하는 DNA, 이를 발현시키기 위한 발현 벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물, 상기 미생물을 배양하여 HCV의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정부위가 하나 이상 융합된 재조합 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

씨형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질의 항원결정부위 및 외피 단백질의 항원결정부위가 융합된 재조합 단백질

제1도는 C형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질의 항원 결정 부위 NS4E 및 외피 단백질의 항원결정 부위 E1G, E2A, E2E의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이고,

제2도는 비구조 4 단백질의 항원결정 부위 NS4E 및 외피 단백질의 항원결정 부위 E1G, E2E가 융합된 재조합 단백질 UBNS4E12-II 및 비구조 4 단백질의 항원결정 부위 NS4E 및 외피 단백질의 항원결정 부위 E1G, E2A, E2E가 융합된 재조합 단백질 UBNS4E1E2의 발현을 위한 각각의 발현 벡터 ptrpH UBNS4E12-II 및 ptrpH UBNS4E1E2의 제조과정을 도시한 것이고,

제3도의 A는 재조합 단백질 UBNS4E12-II의 발현을 SDS 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제3도의 B는 재조합 단백질 UBNS4E12-II를 C형 간염환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이고,

제4도의 A는 재조합 단백질 UBNS4E1E2의 발현을 SDS폴리아크릴 아미드 젤 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이며,

제4도의 B는 재조합 단백질 UBNS4E1E2를 C형 간염환자의 혈청으로 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 C형 간염 바이러스(이하 “HCV”라 함)의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정 부위가 융합된 재조합 단백질, 이를 코딩하는 DNA, 이의 발현을 위한 발현 벡터 및 상기 벡터를 사용한 HCV 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정 부위가 융합된 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

최근까지 바이러스성 간염은 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토 메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴바 바이러스(EBV)에 의해 발병되는 것으로 알려져 왔으나 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90%를 차지하는 비A비B형 간염 바이러스(NANBH)가 확인되었다(Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 이 비A비B형 간염 바이러스에 감염된 간염환자가 전 세계적으로 매년 약 백만명씩 생기는 것으로 추정되며(Alter, H.J., in A.J.Zuckerman(ed.), Viral Hepatitis and Liver Disease, 537-542, Alan R. Liss, New York (1988)), 이중 약 40-50%가 만성간염으로 진전되고, 또 이중 약 20% 정도가 간 경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J.L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(1986)).

브래들리(Bradley) 등은 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스(이하 HCV라 함)의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D.W. et al., Gastroenterology, 88, 773-779(1985)), 츄(Choo) 등은 이 바이러스가 양성가닥 리보핵산(positivie-stranded RNA) 바이러스로서 약 10,000개의 염기로 이루어져 있으며 약 3010-3011개의 아미노산으로 이루어진 다단백질 전구체를 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 가지는 것으로 보고하였다(Choo, Q.L., et al., Science 244, 359-362(1989); Choo, Q.L., et al., Proc. Natl, Acad Sci. USA 88, 2451-2455(1991)).

C형 간염 바이러스의 유전자 구조는 RNA 뉴클레오티드 서열 및 그로부터 유추된 아미노산 서열과 히드로패시 프로파일(hydropathy profile)의 분석을 통해 페스티바이러스와 플라비 바이러스가 속해 있는 플라비비리드(Flaviviridae)의 일종으로 알려져 있다(TAkeuchi K. te al., Gene 91, 287-91(1990); Choo Q.L. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 88(6), 2451-5(1991)). 하지가따(Hajikata) 등은 생체외 전이 실험(in vitro translation)을 통해 HCV의 구조 유전자로부터의 단백질 산물이 아미노 말단으로부터 p22-외피 1(gp35)-외피 2(gp70)의 순서로 이루어져 있음을 발표한 바있고(Hijikata M. et al., Proc. Nat. Aca. Sci. U.S.A. 88(13), 5547-51(1991)), 최근에 아라쉬(Arash) 등은 HCV의 전체 유전자를 백시니아 바이러스를 이용하여 포유동물세포(BHK-21)에서 발현시킨 결과 HCV의 폴리펩티드가 최소한 9개의 전달된 단백질, 즉 분자량 21KD의 핵 단백질, 31KD의 외피 1 및 70KD의 외피 2 단백질이 구조 유전자로부터 합성되어 나오고 그 외에 비구조 NS2(23KD), NS3(70KD), NS4A(8KD), NS4B(27KD), NS5A(58KD) 및 NS5B(68KD) 등의 비구조 단백질들이 합성됨을 확인하였다. 특히 외피 1과 외피 2는 N-당화되어 있으며 분자량 82-88 KD에 이르는 외피 2-NS2결합체(complex)가 만들어지며 외피 1 또한 디설파이드 결합을 통해 이 결합체에 연결되어 있음을 밝힌 바 있다(Arash, G. et al., Virol. 67(3), 1385-95(1993)).

외피 1 및 외피 2 / 비구조 1 단백질(이하 외피 2단밸질이라 함)은 생체외(in vitro) 실험을 통해 분자량이 각각 33,000, 72,000달톤의 크기를 갖는 당단백질임이 밝혀졌고(Houghton, M., et al., Hepatology 14, 381-388(1991); Hijikata, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5547-5551(1991)), 플라비 바이러스의 백신으로 추정되는 비구조 1 단백질 및 페스티 바이러스의 백신으로 추정되는 gp53/55 단백질과 상당한 구조적 유사성을 가지고 있어 C형 간염 바이러스의 백신개발 및 치료제 개발에 1차적 목표가 되어왔다(Spete, R.R. et al., Virology 188, 819-830(1992)).

특히 HCV 외피 2의 아미노 말단에는 사람 면역 결핍증 바이러스(human immunodeficiency virus 1)의 당단백질인 gp120에 존재하는 V3루프(loop)와 비슷한 특성을 갖는 것으로 추정되는 초변화 지역(hypervariable region)이 있는데 이 부위에서 아미노산 서열의 변화가 빈번한 돌연변이가 만들어지며 이러한 각 변종들마다 외피 2의 초변화 지역 내에 특이항원 결정부위를 가지고 있으며 각 변종들마다 특이 항체를 유도한다는 결과들이 보고되었다(Weiner A. J. et al., Proc, Nat. Acad. Sci. U.S.A 15, 89(8), 3468-72(1992), Hijikata M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 28, 175(1), 220-8(1991); Kato N. et al., J. Virol. 67(7), 3923-30(1993)).

이와 같은 HCV 외피 2의 초변화성은 환자의 면역체계에 의한 면역 선택(immune selection)의 결과로서 외피 2가 숙주 면역체계의 주목표 부위일 가능성을 시사해준다.

비구조 3 단백질은 바이러스 단백질 분해 효소로서 비구조 유전자가 코딩하는 비구조 단백질들을 절단하여 각각의 비구조 단백질들을 생성하는 것으로 추정되고 있으며(Bajan, J.F, m Virology 171, 637-639(1989)), 비구조 5 단백질은 지금까지 알려진 바이러스 리보핵산 중합효소의 아미노산 서열과 상당히 유사하여 C형 간염 바이러스의 리보핵산 중합효소(RNA polymerase)로 추정되고 있다(Mita, E., et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 183, 925-930(1992)).

C형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단방법은 초기에 미국 카이론사의 츄 등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합단백질 SOD-C100-3를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역 측정법에 의해 수혈성 간염환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Science 244, 362-384(1989)). 그러나 많은 환자의 경우 C100-3에 대한 항체가 C형 간염 바이러스 감염후 4 내지 6개월이 지난 후에 생성되어 초기의 급성 간염환자에게서는 정확한 진단이 불가능하다는 단점(Alber, H.J. et al., N. Engl. J. Med. 321, 1494-1500(1989); Miyamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 983-987(1990)) 및 C형 간염이외의 자가면역성 질환(autoimmune disease) 등에 기인한 간염 환자의 경우에서도 상당한 비율로 양성반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I.G., et. al., Lancet 335, 754-757(1990)).

최근에 C형 간염 바이러스의 5′말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 사용한 진단방법의 경우 C100-3를 사용한 진단방법에 비해 약 6 내지 8주 일찍 항체를 진단할 수 있음이 확인되어 기존의 C100-3 항원만을 사용한 제 1세대 진단방법보다 조기 진단이 가능하고 민감한 진단방법임이 보고 되었다(Harada, S. et al., J. Virol. 65, 3015(1991)). 미국의 UBI사는 핵 구조 유전자로부터 15 내지 65개 아미노산으로 구성된 합성폴리펩타이드를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 보고하였고(Wang, C.Y., EP 442394(1991)), 기존의 C100-3 항원에 핵 구조 유전자 유래 C22 및 비구조 3 유전자 유래의 C33C를 첨가한 제 2세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음을 보고하였다(Van der poel, C.L., et al. Lancet 337, 317-319(1991)).

더욱 특히 카이론사에서는 HCV의 핵-외피 1-외피 2-NS2 유전자를 백시니아 바이러스를 이용하여 헬라(Hela) 세포에서 발현 시킨 다음 외피 1 외피 2 NS2의 결합체를 친화 크로마토그래피 방법으로 정제하고 정제된 결합체를 침팬지에 주사한 결과 외피 1 및 외피 2에 대한 항체가 측정되는 시기 동안에는 보호 면역성이 나타난다는 결과를 1993년 5월 일본 동경에서 개최된 제3회 바이러스성 간염 간질환에 대한 국제 심포지움(International symposium on viral hepatitis and liver disease)에서 발표한 바 있다.

마쯔우라(Matsuura) 등은 곤충세포와 COS 세포에서 분자량 35KD의 외피 1 단백질을 발현시킨 바 있는데 일부 제한된 경우의 회복된 환자에 있어서 외피 1 단백질에 대한 항체가 나타나는 것을 확인하였다(Matsuura Y. et al., J. Virol 66(3), 1425-31(1992)). 또한, 슈(Hsu) 등은 재조합 배큘로 바이러스를 이용하여 분자량 30-35KD의 외피 1 단백질과 분자량 68-73KD의 외피 2 단백질이 합성되는 것을 확인하고 만성 C형 간염 환자의 혈청중 약 28%가 외피 1에 대한 항체를 가지고 있으며 약 10%가 외피 2에 대한 항체를 가지고 있음을 보고하였다(Hsu H.H. et al., Hepatology 17(5), 763-71(1993)).

백신개발에 있어 고려되어야 할 중요한 사항은 중화 항체(neutralizing antibody)를 만드는 항원이 입자(particle)의 형태로 생체 내에서 높은 면역성을 가지고 있어야 한다는 점에 있다. 즉, 현재 B형 간염 바이러스의 백신으로 사용되고 있는 pre-S2, S표면 항원들이 22nm크기의 입자로 된 경우에만 높은 면역성을 가지고 있음이 확인되었다(Tiollais P. et al., Nature 317, 489(1985); Mishiro S. et al., J. Immunol. 124, 1584-1592(1980)).

이러한 사실에 의거하여 티올라이스(Tiollais) 등은 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)의 당단백질인 gp120의 주 항원결합 부위 84개 아미노산을 B형 간염 바이러스의 pre-S2 표면 항원과 결합시켜 포유동물 세포에서 입자의 형태로 합성됨을 확인하였고 이들을 침팬지에 주사하였을 때 B형 간염 바이러스 표면 항원 및 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)의 주 항원 결합부위 84개 아미노산에 대한 높은 역가의 항체가 동시에 형성되었음을 보고한 바 있다(Michel M.L. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 85, 7957-7961(1988); Michel M.L. et al., J. Virol. 64(5), 2452-2455(1990)).

한편, 순수분리된 HCV 외피 단백질 및 기타 특이항원들을 이용하여 이들 항원들에 대한 단일 클론성 항체 또는 다중 클론성 항체를 제조할 수 있으며 이 항체들은 C형 간염 환자의 혈청에서 HCV 항원을 검출하는데 사용함으로써 좀 더 민감한 조기 진단에 크게 공헌할 수 있고, 특히 이 항체들 중 중화 항원 결정 부위(neutralizing epitope)에 대한 특이성을 가지고 있는 항체들은 수동 면역 치료법에 대해서도 크게 유용하다.

이상과 같은 보고들을 종합해 볼 때, HCV의 외피 단백질은 C형 간염에 대한 백신개발에 있어서 큰 중요성을 가지고 있으며 또한 백신은 외피 단백질 외에도 1개 또는 그 이상의 비구조 단백질의 항원 결정 부위를 복합 사용하는 것이 가능할 수도 있다. 또한 이들 단백질의 입자 형성 여부는 면역성이 높은 백신을 개발하는데 있어 필수적이다.

이러한 사실에 의거하여 본 출원인은 한국형 C형 간염환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV와는 상이한 고유한 한국형 HCV가 존재함을 규명한 바 있으며 또한 핵 유전자로부터 KHCV UB Core14, 비구조 3 유전자로부터 KHCV UB897 단백질 및 비구조 5 유전자로부터 KHCV 403 단백질을 재조합 효모 및 대장균으로부터 발현시켜(본 출원인의 선행 한국 특허출원 제 91-10942호, 제 91-10943호, 제 91-25505호 및 제 92-10039호 참조), 이들 단백질들의 면역 특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 및 정제할 수 있는 방법을 개발하고, 이를 특허출원한 바 있다(본 출원인의 선행 한국 특허 출원 제 91-13594호, 제 91-13595호, 제 91-13597호, 제 91-25506호 및 제 92-10039호 참조). 또한 이들 HCV 특이항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소 면역 측정법(ELISA immunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(본 출원인의 선행 한국 특허 출원 제 91-13601호 참조).

또한, 상기의 403단백질을 포함하는 비구조 5 유전자의 아미노 말단 1,200 염기쌍의(NS5 1.2) 단백질 산물이 HCV의 항체와 높은 특이도의 면역 반응을 보인다는 사실을 발견하고 이를 유비퀴틴(UB)과의 융합단백질(UBNS5-1.2)로서 재조합 대장균에서 발현시킨 바 있고(본 출원인의 선행 한국 특허출원 제 93-4165호 참조), 비구조 3 유전자로부터 유래된 KHCV 897 단백질의 경우 8개의 서로 다른 절편 유전자들을 대장균에서 발현시켜 C형 간염 환자 혈청과의 반응을 측정한 결과 항원결정 부위가 카르복실 말단 약 518개 염기쌍 내에 존재하고 있음을 밝혔다(본 출원인의 대한민국 특허 출원 93-6356호 참조).

한편 HCV 항원들의 항원 결정부위는 C형 간염 진단시약의 개발과 감염환자의 면역 반응 연구에 있어서 중요한 표지가 될 것으로 생각되어 이에 대한 연구가 계속 되어왔는데, C100 경우 많은 짧은 인공합성 펩타이드들을 이용하여 C형 간염환자의 혈청과 특이적으로 반응하는 항원 결정부위가 HCV 염기서열 1690-1731번 내에 존재하고 있음이 밝혀졌고(Bahl, C., et al. p65-66 제3회 국제 HCV 심포지움, Strasbourg, France, 1991), 핵 단백질의 경우 전체 유전자중 항원 결정 부위가 아미노말단 222개 염기쌍 내에 위치하고 있음이 밝혀진 바 있다(Nasoft, M. S. et al., Proc. Natl. Acad Sci, USA 88, 5462-5466(1991)).

또한, 본 발명자들도 한국형 HCV의 전체 유전자중 5422번-5547번에 해당하는 126개 염기쌍의 비구조 4 유전자 서열이 한국인 C형 간염 환자의 혈청과 면역학적 특이성을 가지고 반응하는 것을 확인하고 이를 유전공학적인 방법으로 재조합 대장균에서 유비퀴틴과의 융합단백질(UB NS4E)로서 발현시킨바 있으며(본 출원인의 선행 한국 특허출원 제93-4164호 참조), 외피 단백질의 경우 항원 결정부위가 외피 1 단백질의 카르복실 말단 HCV 뉴클레오티드 서열 1201번 - 1509번에 해당하는 309개 염기쌍(E1G), 외피 2 단백질의 아미노 말단 HCV 뉴클레오티드 서열 1510-1749번에 해당하는 240 염기쌍(E2A) 그리고 외피 2 단백질의 카르복실 말단 HCV 뉴클레오티드 서열 2281-2529번에 해당하는 249개 염기쌍(E2E) 내에 존재하고 있음을 밝히고 C형 간염 바이러스의 외피 1 및 외피 2 유전자로부터 유래된 항원 결정 부위들만을 융합시킨 다음 대장균에서 유비퀴틴 유전자와 융합시켜 UBE1E2 융합 단백질을 발현시킨 바 있다(본 출원인의 대한민국 특허출원 93-6494호 참조).

한편 유비퀴틴은 1975년에 발견된 분자량 5,500달톤의 단백질로서 진핵세포에서 전반적으로 발견되며 원핵세포에서는 그 유전자가 없는 것으로 보고되었다(Goldstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 72,11(1975)). 지금까지 동물세포로부터 밝혀진 유비퀴틴은 모두 동일한 것으로 밝혀졌으며, 유비퀴틴의 중요한 역할은 여러가지가 있으나 그중에서도 단백질 분해공정이 중요한 것으로 알려져 있다(Finley, et al., Trends Biochem. Sci. 10, 343(1985)). 대장균 내에서는 유비퀴틴 시스템의 결여로 세포 내에서 유비퀴틴 융합 단백질로 발현된 유전자 산물이 분해됨이 없이 융합단백질 그대로 세포 내에 축적된다. 이러한 융합 단백질 시스템은 특히 발현시키고자 하는 단백질이 세포 내에서 단백질 분해효소에 의해 분해가 용이하게 되는 경우에 융합된 유비퀴틴이 이를 보호하기 때문에 매우 유용하며, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 발현을 확인할 수 있고, 정제에도 유용하게 사용될 수 있다.

또한 최근에는 효모에서 UBP 1이라 명명된 유비퀴틴 절단효소가 분리 동정되어 대장균 유래 유비퀴틴 융합 단백질로부터 유비퀴틴이 제거된 목적 단백질만을 얻을 수 있게 되었다(Tobias, J.W. et al., J. Biological Chemistry 266, 12021-12028(1991)).

이러한 사실에 의거하여, 본 발명자들은 한국형 C형 간염환자의 진단에 있어서, 기존의 미국형 및 일본형 HCV에 의해 코딩되는 단백질을 사용하는 것보다 감지도 및 특이도가 더 높고 값싸게 공급할 수 있는 진단시약 및 백신을 개발하고자 노력하던 중, 한국형 HCV의 전체 유전자중 비구조 4 부분 유전자의 항원 결정부위 NS4E와 외피 유전자의 항원 결정 부위인 E1G 및 E2E 유전자를 결합시켜 이를 유전공학적인 방법으로 대장균에서 유비퀴틴과의 융합 단백질 UBNSE12-II로서 발현시키고 이 융합 단백질이 약 22nm의 입자 형태를 가짐을 확인하는데 성공하였다. 이 항원 결정부위 융합 단백질을 이용할 경우 기존의 여러 종류의 HCV 항원들을 서로 복합하여 사용하는 것에 비해 단일한 하나의 단백질만을 사용하기 때문에 보다 경제적인 진단키트의 제조가 가능하게 할 수 있으며 또한 기존의 서로 다른 HCV 항원들을 단순하게 융합시킨 경우에 비해 항원 결정 부위만을 융합시킨 것으로서 보다 민감하고 정확한 진단이 가능하게 되었다.

또한, C형 간염 진단시약의 개발에 있어서는 C형 간염 항체에 대한 특이성이 높은 항원 단백질을 이용하는 것이 바람직하며, 그외 항원 결정부위는 효율적이고 경제적인 진단시약 및 백신의 개발을 가능하게 하므로 더욱 바람직하다. 특히 2개 이상의 항원결정 부위를 융합시킨 항원결정 부위 융합 단백질이 경제성, 효율성 및 정확성 측면에서 더욱 바람직하다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국형 HCV에 대한 진단시약 및 백신의 개발에 기여할 수 있는 HCV의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 각각 하나 이상 포함하는 재조합 융합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 HCV의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 각각 하나 이상 포함하는 융합 단백질의 유전자를 포함하여 그의 발현시 상기 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 이용하여 HCV의 비구조 4단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원 결정부위를 각각 하나 이상 포함하는 융합단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 융합 단백질은 HCV의 비구조 4 단백질의 항원 결정부위, 외피 1 단백질의 항원 결정 부위 및 외피 2 단백질의 항원 결정 부위를 각각 하나 이상 포함하며, 이들의 순서는 제한되지 않는다.

상기 융합단백질 중, 상기 HCV 비구조 4 단백질의 항원 결정 부위로 NS4E(5422번-5547번), 외피 1 단백질의 항원결정 부위 E1G(1201번-1509번) 및 외피 2 단백질의 항원결정부위 E2E(2281번-2529번)를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 NS4E, E1G 및 E2E 외에 외피 2 단백질의 또다른 항원결정 부위인 E2A(1510번-1749번) 단백질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 융합 단백질은 단백질의 안정화, 발현의 확인 및 간편한 정제 등을 위해 특정 단백질을 추가로 융합시켜 재조합 융합 단백질로서 생산될 수 있으며 그러한 특정 단백질로서는 유비퀴틴이 바람직하다.

상기 특정 단백질 및/또는 각각의 항원 결정부위 단백질들이 융합된 융합단백질은 이들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 연결시켜 제조한 융합 유전자를 발현시킴으로써 제조할 수 있는데, 예를 들면, 융합시키고자 하는 단백질의 종류 및 순서에 따라 적절한 프라이머를 합성하여 상기 단백질을 코딩하는 유전자들을 주형으로 하여 PCR하는 과정을 반복함으로써 제조할 수 있다.

구체적으로, 유비퀴틴, E1G, E2E 및 NS4E를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하는 방법의 일례를 들면 다음과 같다. 우선, 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA 단편들에 대한 뉴클레오티드 서열 정보(본 출원인이 선 출원한 대한민국 특허원 제 92-10039호 참조)로부터 비구조 4 단백질의 항원결정부위 NS4E, 외피 1 단백질의 항원결정부위 E1G 및 외피 2 단백질의 항원결정 부위 E2E를 코딩하는 유전자를 서로 연결시키는데 우선 E1G 및 E2E가 융합된 E12단백질을 코딩하는 E2E 유전자의 5′말단과 E1G유전자의 3′말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)용 시발체를 합성한다. 이들 시발체는 항원 결정 부위인 E1G, E2E 유전자의 접합이 가능하도록 하고 비구조 4 부분 유전자의 3′말단의 21개 염기 부위가 존재하도록 하는 서열로 구성되며, 이에 대응되는 시발체에는 종료 코오돈과 제한효소의 인식 부위를 삽입하여 유비퀴틴의 시작 코오돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코오돈에서 단백질 합성이 완료되도록 함과 아울러 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 할 수 있다.

한편, 유비퀴틴, E1G, E2A, E2E 및 NS4E를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 융합유전자는 E1G, E2A 및 E2E가 융합된 E1E2 단백질을 코딩하는 E1E2 유전자의 5′말단과 3′말단에 대응하는 중합 효소 연쇄반응용 시발체를 합성하여 연결시켜 제조한다.

이러한 방법으로 서로 연결된 유전자는 적절한 벡터에 삽입시키며, 예를 들면 본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrpH-UBE1E2(한국 특허출원 제 93-6494호)를 주형으로 하여 시발체를 이용하여 중합 효소 연쇄반응으로 외피 1 유전자 및 외피 2 유전자의 항원 결정부위가 연결된 유전자를 증폭하며, 이 증폭된 유전자와 비구조 4 부분 유전자(한국 특허출원 제 93-4164호)를 주형으로 하여 중합 효소 연쇄반응으로 NS4E12-II 및 NS4E1E2 유전자를 증폭한 뒤 제한효소로 절단하여 얻은 유전자 단편을 본 출원인이 선출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제 92-10039호, ATCC 68642, 1991. 7. 1일자 기탁)의 CORE14 유전자와 치환하여 발현 벡터를 제조할 수 있다.

상기의 발현 벡터로 대장균 W3110(ATCC 37339)등 상기 발현벡터 내의 융합 유전자를 발현시킬 수 있는 적절한 숙주세포를 형질전환시킨 후 상기 유전자가 발현되는 조건에서 배양한 후 폴리아크릴아미드젤 전기 영동 또는 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린을 이용한 웨스턴-블롯팅함으로써 한국형 C형 간염 바이러스의 항체에 특이적으로 반응하는 융합단백질이 생성되는 것을 확인하는 등의 방법으로 HCV항원으로 사용할 수 있는 융합 단백질의 생성을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐이고, 발명의 범위를 제한하지 않는다. 하기 실시예에서 사용된 실험 방법 및 과정은 특별한 언급이 없는 한 다음의 참조예 1)-6)에 따라 실시하였다.

[참조예 1]

[제한효소를 사용한 DNA의 절단]

멸균된 1.5㎖ 에펜돌프 튜브에 제한 효소와 반응 완충용액을 50㎕ 내지 100㎕의 반응 부피가 되도록 넣고 37℃에서 1 내지 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 제한 효소를 불활성화하기 위해 65℃에서 15분간 열처리하고, 내열성인 제한효소에 대해서는 페놀 추출 및 에탄올 침전법을 사용하였다. 사용된 제한효소와 반응 완충용액은 뉴 잉글렌드 바이오랩사(New England Biolabs, MA, USA)로부터 구입하였다. 10배 반응 완충용액의 조성은 다음과 같다.

10배 NEB 완충용액 1 : 100mM 비스 트리스 프로판 - HC1, 100mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), pH 7.0

10배 NEB 완충용액 2 : 100mM 트리스 - HC1, 100mM MgCl₂, 500mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 3 : 100mM 트리스 - HC1, 100mM MgCl₂, 1000mM NaCl, 10mM DTT, pH 7.0

10배 NEB 완충용액 4 : 200mM 트리스 - 아세테이트, 100mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 포타슘 아세테이트, 10mM DTT, pH 7.0

[참조예 2]

[페놀 추출과 에탄올 침전]

페놀 추출은 제한효소 반응이 완료된 후 제한 효소를 불활성화 시키거나 핵산을 추출할 때 사용하였다. 페놀은 10mM 트리스 -HCl(pH8.0), 1mM EDTA 용액으로 포화시킨 후 사용하였다.

시료와 페놀을 1:1(v/v)의 비율로 섞은 후 강하게 흔들어 혼합한 다음 원심분리(15,000xG, 5분)시켜 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 동일 과정을 3회 반복한 후, 동일 부피의 클로로포름 용액(클로로포름과 이소부탄올 비율 24:1(v/v))로 상층액을 추출하여 0.1부피의 3M소듐 아세테이트와 2.5부피의 100% 에탄올을 가하였다. 이를 -70℃에서 30분간 또는 -20℃에서 약 2시간 이상 정치한 후 원심분리(15,000xG, 20분, 4℃)하여 핵산을 침전시켰다.

[참조예 3]

[연결 반응(ligation)]

연결 효소로서 T4 DNA 리가세(T4 DNA ligase, New England Biolabs, Inc.) 및 10배 연결 완충용액(0.5M 트리스-HCl, pH7.8, 0.1M MgCl₂, 0.2M 디티오트레이톨, 10mM ATP, 0.5mg@/㎖ BSA)을 사용하여 연결 반응을 수행하였다. 보통 20㎕ 부피에서 10 단위체의 연결 효소를 사용하고, 평활 말단(blunt ends)을 갖는 DNA의 연결에는 100 단위체의 연결효소를 사용하여, 16℃에서 적어도 5시간 이상 또는 4℃에서 14시간 이상 반응시켰고, 반응이 완료된 후 65℃에서 15분간 가열하여 연결효소를 불활성화 시켰다.

[참조예 4]

[대장균 형질 전환]

대장균 숙주 세포(대장균 HB101, W3110 또는 JM105)를 100㎖의 액체 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨)에 접종한 후 650nm에서의 광학밀도(O.D.) 값이 0.25 내지 0.5에 달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그후 원심분리(2,500xG, 10분)에 의해 세포를 분리한 후 50㎖의 0.1M MgCl₂를 가하여 세척하였다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하고 여기에 50㎖ 0.1m CaCl₂, 0.05M MgCl₂용액을 가하여 얼음 위에서 30분간 정치시켰다. 이를 다시 원심분리(2,500xG, 10분)하여 동일 용액(0.1M CaCl₂, 0.05M MgCl₂) 5㎖에 균일하게 분산시켰다.

위에서 사용한 모든 용액 및 용기는 0℃에서 냉각시켜 사용하였다. 상기에서 얻은 용액 0.2㎖에 연결 반응 용액 10㎕를 가하여 0℃에서 40분간 정치시킨 후 42℃에서 1분동안 열처리하였다. 이를 2.0㎖의 액체 LB 배지에 가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 상기 배양액을 50㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 고체 LB 배지상에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. M13 벡터 DNA는 열처리한 후 100㎕의 JM105 세포, 15㎕의 100mM IPTG, 25㎕의 4% X-Gal 및 48℃로 미리 데워놓은 3㎖의 2배 연성 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토 트립톤, 8.7% 박토 아가)를 가하여 잘 섞어준 후 2배 고체 YT 배지(1% NaCl, 1% 효모 추출물, 1.6% 박토트립톤, 1.5% 박토아가) 위에 도말하였다.

[참조예 5]

[올리고머의 합성]

올리고머는 자동화된 고체상 포스포아미다이트 케미스트리(solid phase phosphoamidite chemistry)를 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystems, Inc., model 380 B, U.S.A.)로 합성한 후 변성 폴리아크릴아미드 젤(2M 우레아, 12% 아크릴아미드, 50mM 트리스중의 비스(29:1 w/w), 50mM 붕산, 1mM EDTA-Na₂)을 이용한 전기 영동으로 분리하였다. 다음으로 이를 C18 컬럼인 SEP-PAK(waters Inc. U.S.A)에 부착시킨 후 아세토니트릴 : 물(50:50)을 용출제로 사용하여 순수 정제하고, 260mm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다.

[참조예 6]

[중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)]

주형 DNA(10ng 내지 100ng), 10㎍의 10배 Taq 중합효소 완충용액(10mM 트리스-C1 pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.1%(w/v) 젤라틴), 10㎕의 dNTP 혼합용액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 10mM), 시발체 2㎍, 0.5㎕의 AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)에 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 하였다. 여기에 용액의 증발을 막기 위하여 50㎕의 미네랄 오일을 가하여 온도 순환기(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.)를 이용하였으며, 순환 프로그램은 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분간의 순환을 반복하고 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응 시켰다.

[실시예 1]

[한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 및 외피 단백질의 항원 결정부위 유전자의 증폭]

[단계 1]

유비퀴틴이 결합된 trp 프로모터를 갖고 있는 대장균 발현 벡터에 클로닝하기 위하여 기존에 클로닝된 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA(KHCV-LBC1, 본 출원인의 대한민국 특허출원 제 92-10039호, ATCC 75008, 기탁일 1991년 5월 14일)의 염기서열 정보를 이용하여, 다음과 같은 시발체를 합성하였다:

시발체 PNS4ET2; 5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′

이 시발체는 제한효소 Sac II 인식부위를 가지고 있으며 한국형 C형 간염 바이러스의 cDNA인 KHCV-LBC1의 5422번째 염기로부터 5442번째 염기를 포함한다.

시발체 PNS4EGE2C3; 5′-CAGAAGGCGCTCGGGTTGCCAGGAGGAGGAGGTGGTACTCGGGGAGAG CGTTGT-3′.

이 시발체는 NS4E의 3′말단인 KHCV-LBC1의 5530번째 염기로부터 5547번째 염기를 포함하고 있으며 1개의 프롤린과 6개의 글리신 뒤에 E2E(외피 항원 결정 부위; 대한민국 특허출원 93-5663호 참조)의 5′말단인 KHCV-LBC1의 2281번째 염기로부터 2298번째 염기를 포함한다.

시발체 PE1GXHO 5′-AAAAAACTCGAGTTACCCTGTCACGTGGGTGGTTCC-3′.

이 시발체는 KHCV-LBC1의 1509번째 염기 뒤에 해독이 종료되도록 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 XhoI 인식부위를 갖고 있다.

[단계 2]

반응튜브에 시발체 PNS4EGE2C3 2㎍, 시발체 PE1GXHO 2㎍를 넣고 주형으로 ptrpH-UBE1E2(대한민국 특허출원 93-6494호) 플라스미드를 50ng 넣은 다음 10㎕의 10배 농도 중합완층 용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6과 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 중합효소 연쇄반응을 25회 실시하였다(Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487(1988)).

[단계 3]

상기 단계 2에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리한 결과 약 570 염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일 조건의 폴리아크릴아미드 젤로 분리정제하였다. 이 DNA 단편을 단편 GE2EGE1G로 명명하였다.

[단계 4]

반응 튜브에 시발체 PNS4ET2 2㎍, 시발체 PE1GXHO 2㎍를 넣고 주형으로 ptrpH-UBNS4E(대한민국 특허출원 93-4164호) 플라스미드 50ng과 단계 2에서 얻은 단편 GE2EGE1G 50ng을 넣은 다음 10㎕의 10배 농도 중합완충용액, 10㎕의 2mM dNTP(2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dTTP, 2mM dCTP), 2.5 단위 Taq 중합효소 및 증류수를 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 참조예 6과 같이 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 처리하는 PCR을 25회 실시하였다.

[단계 5]

상기 단계 4에서 얻은 PCR 산물을 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 분리한 결과 약 700 염기쌍의 DNA가 증폭되었으며 동일 조건의 폴리아크릴 아미드 젤로 분리 정제하였다. 이 DNA 단편을 단편 NS4E12-II로 명명하였다.

한편, 외피 단백질의 항원결정부위 E1G 및 E2E 외에 E2A가 또한 융합되는 단백질을 제조하기 위해 상기와 유사한 방법으로 상기 단계 1에서 시발체 PE1GXHO 대신에 하기 시발체를 합성하였다.

시발체 PE2AXHO; 5′AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3'.

이 시발체는 KHCV-LBC1의 1749번째 염기 뒤에 종료 코오돈을 가지고 있으며 동시에 제한효소 XhoI 인식부위를 갖는다.

상기 합성한 시발체 PE2AXHO를 시발체 PE1GXHO 대신 사용하여 상기 단계 2에서와 같이 중합효소 연쇄반응을 실시하여 약 800 염기쌍의 DNA를 증폭시켜 폴리아크릴아미드 젤로 분리정제하여 이를 단편 GENVEPI-III로 명명하였다. 그 다음, 상기 단계 4에서 시발체 PE1GXHO 대신 시발체 PE2AXHO를 사용하고 단편 GE2EGE1G 대신 단편 GENVEP-III을 사용하여 동일하게 실시하여 약 920 염기쌍의 DNA를 증폭시켜 폴리아크릴아미드 젤로 분리정제하여 단편 NS4E1E2로 명명하였다.

[실시예 2]

[대장균 발현 벡터의 제조]

본 출원인이 선 출원한 플라스미드 ptrpH-UB-CORE14(대한민국 특허출원 제 92-10039호, ATCC 68642, 1991. 7. 1일자 기탁) 2㎍을 제한효소 Sac II와 제한효소 Sal I으로 NEB 완충용액 3의 조건 하에서 참조예 1과 같이 완전절단한 후 0.7% 아가로스 젤에서 분리하여 약 2.7Kb 단편을 분리정제하였다. 이 단편을 ptrpH-UB-T2/L로 명명하였다.

한편 실시예 1의 단계 5에서 얻은 각각의 DNA 단편 NS4E12-II 및 NS4E1E2 각각 2㎍씩을 제한효소 Sac II와 제한효소 Xho I으로 NEB 완충용액 3의 조건 하에서 참조예 1과 같이 완전 절단반응을 한 후 튜브에 절단된 각각의 DNA 단편 100ng, 50ng의 단편 ptrpH-UB-T2/L, 2㎕의 10배 농도 접합 반응 용액, 10단위 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 반응물로 대장균 W3110(ATCC 37339)을 형질 전환시켜 각각 단편 NS4E12-II 및 NS4E1E2를 함유한 ptrpH-UBNS4E12-II 및 ptrpH-UBNS4E1E2를 각각 얻었다(제2도). 제2도에서 ( )로 표시한 부분은 ptrpH-UBNS4E1E2를 제조하기 위한 과정을 나타낸다.

[실시예 3]

[비구조 4 단백질 및 외피 단백질의 항원 결정부위 융합 유전자의 발현]

상기 실시예 2에서 얻은 재조합 대장균 세포 각각을 50㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 액체 루리아(Luria) 배지(6% 박토트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3㎖씩을 각기 300㎖의 M9 배지(40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8.5mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂, 0.4% 카사미노산, 10㎍/㎖ Vit. B1, 40㎍/㎖ 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm의 파장에서 약 0.3 정도가 될 때 인돌 아크릴산(indole acrylic acid, IAA)을 최종농도 50㎍/㎖이 되게 첨가하였다. IAA를 첨가한지 약 4시간 후에 세포배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포침전물을 수거하였다.

[실시예 4]

[비구조 4 단백질 및 외피 단백질의 항원 결정 부위 융합 단백질의 발현 확인 및 C형 간염환자 혈청과의 반응]

실시예 3의 세포 침전물들을 각각 램리의 방법(Laemmli, Nature 227, 680(1970))에 따라 SDS의 존재 하에서 15% 폴리아크릴아미드젤에서 전기영도(제3A 및 4A도) 하였고, 젤상에서 분리된 단백질을 토우빈의 방법(Towbin, et al., Proc, Natl, Acad. Sci. USA 76, 4750(1979))에 따라 니트로 셀룰로스 필터(Bio-Rad Lab., 구멍크기 0.22㎛, CA, USA)로 전달시켰다. 이 필터를 0.5% 트윈(Tween) 20이 함유된 PBS(10mM 인산, pH7.0, 0.15M 염화나트륨)에 넣고 상온에서 2시간 동안 약하게 흔들면서 폐쇄시켰다. 이후 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈을 함유한 PBS에 한국인 C형 간염 환자들의 혈청으로부터 분리한 면역 글로불린(IgG)을 최종농도 16㎍/㎖이 되게 희석시켜 첨가하고 상온에서 1시간동안 약하게 흔들면서 반응시킨 다음, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척하였다. 이 필터에 0.5% 젤라틴과 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS양 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지된 항 사람 면역 글로불린 G(Bio-Rad Lab, anti-human IgG-HRP, 0.01mg.@ml, CA, USA)를 1:500으로 희석시켜서 첨가하고 상온에서 1시간동안 흔들면서 반응시키고, 0.2% 트윈 20을 함유한 PBS로 5분씩 4회 세척한 다음 50mM 트리스 완충액(pH7.0)으로 2회 세척하였다. 400㎍/ml의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수가 함유된 50mM 트리스 완충용액을 가하여 필터를 발색시켰다. 그 결과는 제 3B 및 4B 도에 나타내었다.

제3도의 A 및 제3도의 B에서 1열은 표준 분자량 단백질을 나타내며, 2열은 플라스미드를 함유하지 않은 대장균을 나타내며, 3열은 ptrpH-UB-NS4E12-II 플라스미드를 함유한 대장균을 나타낸다.

제4도의 A 및 제4도의 B에서 제1열 및 제4열은 본 발명의 벡터를 함유하지 않은 대장균을 나타내며, 제2열 및 제5열은 ptrpH-UB NS4E1E2를 함유한 대장균을 나타내고, 제3열은 표준 분자량 단백질을 나타낸다.

본 발명을 통해 한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 및 외피 단백질의 항원결정부위 융합 단백질인 UBNS4E12-II 및 UBNS4E1E2 단백질을 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있게 되었으며, 이를 이용하여 보다 정확한 C형 간염 진단 방법의 개발이 가능하며 특히 한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 및 외피 단백질의 항원결정 부위 융합 단백질인 UBNS4E12-II 또는 UBNS4E1E2 단백질을 항원으로 사용하여 HCV 항원에 대한 특이항체를 만들 수 있게 함으로써 HCV에 대한 백신의 개발에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

Claims (14)

1. 한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정부위를 각각 하나 이상 포함하는 재조합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정 부위가 각각 하기의 아미노산 서열을 갖는 NS4E, E1G 및 E2E인 재조합 단백질:
3. 제2항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 갖는 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 항원결정 부위 E2A를 더 포함하는 재조합 단백질 :
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 유비퀴틴을 더 포함하는 재조합 단백질.
5. 제4항에 있어서, 아미노산 말단으로부터 유비퀴틴-NS4-E2E-E1G의 순서로 연결된 재조합 단백질.
6. 제4항에 있어서, 아미노산 말단으로부터 유비퀴틴-NS4-E2E-E1G-E2A의 순서로 연결된 재조합 단백질.
7. 제1항 내지 6항중 어느 한 항의 재조합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA.
8. 제7항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원 결정 부위의 재조합 단백질을 각각 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA:
9. 제8항에 있어서, 한국형 C형 간염 바이러스의 외피 2 단백질의 항원결정 부위 E2A를 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는 DNA:
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 발현벡터.
11. 제10항에 있어서, ptrpH UBNS4E12-II 또는 ptrpH UBNS4E1E2인 발현벡터.
12. 제10항 또는 제11항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
13. 제12항에 있어서, 발현벡터 ptrpH UBNS4E12-II 또는 ptrpH UBNS4E1E2로 형질전환된 대장균.
14. 제12항 또는 제13항의 대장균을 배양함을 포함하는, 한국형 C형 간염 바이러스의 비구조 4 단백질, 외피 1 단백질 및 외피 2 단백질의 항원결정 부위를 각각 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 제조하는 방법.