JPH0882592A - アレルギー反応誘発性ＩｇＥの特異的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アレルギー反応誘発性ＩｇＥのみを特異的
に、且つ迅速に測定することができる免疫学的測定法の
提供。 【構成】 固定化担体上で免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）
と高親和性ＩｇＥリセプター（ＦｃεＲＩ）のα鎖（Ｆ
ｃεＲＩα）又はその結合性断片とを反応せしめ、それ
により生ずる共鳴シグナル値の変化を表面プラズモン共
鳴分析装置により測定することを特徴とするアレルギー
反応誘発性ＩｇＥの特異的測定方法。 【効果】 アレルギー反応誘発性ＩｇＥのみを特異的
に、且つ迅速に測定することができるので、アレルギー
性疾患の迅速な診断のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は本来のアレルギー反応を
誘発する機能を有する免疫グロブリンＥ（以下、ＩｇＥ
と略記）を特異的に測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトのＩ型アレルギー反応は以下のよう
な作用機序で起こると考えられている。抗原物質が体内
に侵入するとそれに特異的なＩｇＥが生産されて蓄積
し、生産されたＩｇＥは好塩基球や肥満細胞の表面に存
在する高親和性ＩｇＥリセプター（以下、ＦｃεＲＩと
表記）に結合する。ＦｃεＲＩに結合しているＩｇＥ分
子に抗原物質が結合すると、ＦｃεＲＩの凝集を引き起
こし、それにともなって情報が細胞内に伝達され、細胞
内顆粒中に蓄積していた炎症惹起物質が放出され、アレ
ルギー症状を引き起こす。

【０００３】したがって、血中のＩｇＥ量を定量するこ
とはＩ型アレルギー疾患において、特にアトピー性疾患
においては重要な診断基準になる。ＩｇＥの量は上記の
アレルギー以外にも寄生虫感染、重症肝障害、湿疹、Ｉ
ｇＥミエローマでも上昇することが知られており、血中
ＩｇＥ量を定量することはこれらの疾患を判別すること
に役立つ。従来、抗体を組み合わせたＥＬＩＳＡ系やＲ
ＩＡ系により血中のＩｇＥ量を測定することが可能であ
り、例えば結合競合法、抗体（ポリクローナル、または
モノクローナル抗体、もしくはこれらの組み合わせ）を
用いたサンドイッチ法により行われている。

【０００４】しかしながら、ＩｇＥに対する抗体を利用
した前記の方法においては、血中に存在するＩｇＥがア
レルギーを誘発する機能を持つか否かを判定することは
できない。すなわち、抗原抗体反応を用いているかぎり
においては、血中のＩｇＥがアレルギー反応を引き起こ
すべく、肥満細胞上に存在するリセプターに結合する能
力を持たないものでも検出され、さらに分解を受けたも
の、変性されてしまったものであっても検出されてしま
う。すなわち生体内において機能しアレルギー反応を誘
発できるもの、機能を持たずアレルギー反応を誘発でき
ないものの両者を検出していることになる。

【０００５】

【関連技術】これを解決するために既に本発明者らによ
りＦｃεＲＩ分子のα鎖（以下、ＦｃεＲＩαと表記）
とＩｇＥの特異的結合反応を用いて、アレルギー反応を
誘発する能力を持ったＩｇＥ分子種を選択的に測定する
方法を確立した（特願平５−２１８９２０号に記載）。
しかしながら、ＦｃεＲＩαを用いた前記の方法におい
ては、ＦｃεＲＩαとＩｇＥ、あるいは、ＩｇＥとそれ
に対する抗体の反応時間が長く、それぞれの試薬を添加
したり洗浄したりする操作が必要であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は
生体内でアレルギー反応を誘発する能力を持ったＩｇＥ
を選択的、かつ、より迅速、簡便に測定する方法を提供
するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明者らは表面プラズモン共鳴分析装置（以
下、ＳＰＲと略記）を用いて、アレルギー反応を誘発す
る能力を持ったＩｇＥを選択的、かつ、より迅速、簡便
に測定する方法を確立した。従って本発明は、固定化担
体上で免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と高親和性ＩｇＥリ
セプター（ＦｃεＲＩ）のα鎖（ＦｃεＲＩα）又はそ
の結合性断片とを反応せしめ、それにより生ずる共鳴シ
グナル値の変化を表面プラズモン共鳴分析装置（ＳＰ
Ｒ）により測定することを特徴とするアレルギー反応誘
発性ＩｇＥの特異的測定方法を提供する。

【０００８】

【具体的な説明】ＳＰＲは生体分子間の相互作用を特別
な標識を用いることなく経時的に測定できる装置である
（Jonsson,U.(1991)BioTechniques 11,p620-627)。この
装置の構成は、生体分子を固定化できるセンサーチッ
プ、そのセンサーに微量の溶液を流す微小流路系とポン
プ、センサー表面への生体分子の結合で生ずる屈折率変
化を表面プラズモン共鳴の原理で検出する検出器、試料
を順に自動的にセンサーに注入するためのオートサンプ
ラーなどからなる。

【０００９】このＳＰＲを用いれば、センサーに受容体
たる分子を固定化し、あるいはあらかじめ受容体分子を
構成要素として内包しているセンサーを作製し、その受
容体に結合しうる物質を含んだ試料を注入してから数分
でその受容体に結合した物質の量を、あらかじめ作成し
ておいた標準曲線から求めることができる。その際、セ
ンサーへの非特異的吸着を防ぐためのブロッキング剤は
不要であり、試料注入後の洗浄操作も短時間である。ま
た、試料はオートサンプラーで自動的に注入することが
できるので、試料添加の煩雑さも無い。

【００１０】一方、ＦｃεＲＩαはアレルギー反応を誘
発する能力を持ったＩｇＥ分子種に選択的に結合するこ
とができるので、上記ＳＰＲのセンサーチップ表面上で
これらの間の結合反応を起こすことにより生ずる表面プ
ラズモン共鳴シグナル変化を測定することで、アレルギ
ー反応を誘発する能力を持ったＩｇＥ分子種を選択的に
定量することができると考えられ、上記の問題点を解決
することができる。

【００１１】本発明の第一の態様によれば、固定化担体
としてのＳＰＲセンサーチップにＦｃεＲＩα又はその
結合性断片を固定化し、あるいはＦｃεＲＩαまたはそ
の結合性断片を構成要素として内包しているセンサーを
作製し、このＳＰＲセンサーチップに被験試料を接触せ
しめることにより該被験試料中にアレルギー反応誘発性
ＩｇＥが存在すれば該ＩｇＥを前記固定化されたＦｃε
ＲＩα又はその結合性断片と特異的に結合せしめ、この
反応により生ずる共鳴シグナル値の増加をＳＰＲにより
測定する。

【００１２】ここで、アレルギー反応誘発性ＩｇＥとＦ
ｃεＲＩα又はその結合性断片とを特異的に結合せしめ
るとは、アレルギー反応誘発性ＩｇＥとアレルギー反応
非誘発性ＩｇＥが共存する場合でも実質的にアレルギー
反応誘発性ＩｇＥのみが選択的にＦｃεＲＩα又はその
結合性断片と結合することを意味する。

【００１３】本発明の第二の態様によれば、固定化担体
としてのＳＰＲセンサーチップにＦｃεＲＩα又はその
結合性断片を固定化し、あるいはＦｃεＲＩαまたはそ
の結合性断片を構成要素として内包しているセンサーを
作製し、このＳＰＲセンサーチップに被験試料を接触せ
しめることにより該被験試料中にアレルギー反応誘発性
ＩｇＥが存在すれば該ＩｇＥを前記固定化されたＦｃε
ＲＩα又はその結合性断片と結合せしめ、これにより該
ＩｇＥを、前記固定化されたＦｃεＲＩα又はその結合
性断片を介してＳＰＲセンサーチップに固定化し、次に
これに抗ＩｇＥ抗体を接触せしめることにより該固定化
されたＩｇＥに該抗ＩｇＥ抗体を結合せしめ、これによ
り生ずる共鳴シグナルの増加を測定する。

【００１４】これによれば、固定化されたＩｇＥを介し
て抗ＩｇＥ抗体がさらにＳＰＲセンサーチップに固定化
されるので、共鳴シグナル値を増強し、測定感度を上昇
させることができる。本発明の第三の態様によれば、固
定化担体としてのＳＰＲセンサーチップにまず抗ＩｇＥ
抗体を固定化し、あるいは抗ＩｇＥ抗体を構成要素とし
て内包しているセンサーを作製し、これに被験試料を接
触せしめることにより、該被験試料中にアレルギー反応
誘発性ＩｇＥもしくはアレルギー反応非誘発性ＩｇＥ、
又はその両者が含まれる場合にはそれらを前記固定化さ
れた抗ＩｇＥ抗体に結合させ、これにより試料中のアレ
ルギー反応誘発性及び／又は非誘発性ＩｇＥを、前記固
定化された抗ＩｇＥ抗体を介して該ＩｇＥをＳＰＲセン
サーチップに固定化し、次にこのＳＰＲセンサーチップ
にＦｃεＲＩα又はその結合性断片を接触せしめること
により、前記固定化されたＩｇＥの内アレルギー反応誘
発性ＩｇＥのみを特異的にＦｃεＲＩα又はその断片と
結合せしめ、これにより生ずる共鳴シグナル値の増加を
測定する。

【００１５】前記第二の態様においては、前記抗ＩｇＥ
抗体に共鳴シグナル値の増加を増幅する分子量の大きい
物質をさらに結合させることにより、又は事前に結合さ
せておくことにより、測定感度を上昇させることもでき
る。前記第三の態様においても同様に、前記ＦｃεＲＩ
α又はその結合性断片に共鳴シグナル値の増加を増幅す
る分子量の大きい物質をさらに結合させることにより又
は事前に結合させておくことにより、測定感度を上昇さ
せることもできる。

【００１６】ヒト高親和性ＩｇＥリセプター（ＦｃεＲ
Ｉと表記）は肥満細胞や好塩基球の細胞膜上に存在し、
ヒトＩｇＥに強く結合することができる蛋白質である。
その結合定数は１０¹⁰Ｍ¹ 程度と、強い結合を示す。Ｆ
ｃεＲＩは１個のα鎖、１個のβ鎖、２個のγ鎖からな
る四量体であるが、このうちＩｇＥとの結合に関与して
いるのはα鎖の細胞外領域である（Kinet,J.P.(1990),C
urr.Opinion Immunol.２,p499-505)。天然のα鎖には糖
鎖が結合しているが、ＩｇＥとの結合には糖鎖は関与し
ていないことがわかっている。

【００１７】従って、本発明においては、ＦｃεＲＩα
のみならず、その結合性断片を使用することもできる。
ここでＦｃεＲＩαの結合性断片とは、アレルギー反応
誘発性ＩｇＥと特異的に結合することができるＦｃεＲ
Ｉαの一部分を意味し、α鎖の細胞外領域中のアレルギ
ー反応誘発性ＩｇＥと特異的に結合する領域を含有する
断片である。

【００１８】既に、αサブユニットの細胞外領域だけ
（可溶性ＦｃεＲＩα断片と表記）をＩｇＥに対する結
合能を保持したまま遺伝子工学的に生産することに成功
している（Yagi,S.(1994),Eur.J.Biochem.220,p593-59
8) 。ここで用いる宿主としては、ＣＨＯ細胞、昆虫細
胞、酵母などが報告されている。また、生産された可溶
性ＦｃεＲＩα断片を標識し、ＥＬＩＳＡ法でヒトＩｇ
Ｅ濃度を測定する系の構築にも成功している（特願平５
−２１８９２０号に記載）。

【００１９】本発明において使用する抗ＩｇＥ抗体（Ｉ
ｇＥに対する抗体）はポリクローナル抗体でもモノクロ
ーナル抗体でもよく、これらの既知の抗体を任意に選択
して使用することができる。例えば抗ＩｇＥポリクロー
ナル抗体又は抗血清及びその製造方法はHarlow, E., La
ne. D.(1988) Antibodies:A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory) P53 〜137 に記載されてお
り、抗ＩｇＥモノクローナル抗体及びその製造方法はHa
rlow, E., Lane. D.(1988) Antibodies:A Laboratory M
anual (Cold Spring Harbor Laboratory) P139〜P243に
記載されている。

【００２０】共鳴シグナル値の増加を増幅するために、
抗ＩｇＥ抗体（第２の態様）又はＦｃεＲＩαもしくは
その結合性断片に結合させる分子量の高い物質として、
フェリンなどの高分子量タンパク質、流路系に影響しな
い（流路をふさがない）ビーズ状の微粒子等が用いられ
る。これらは蛋白質又はペプチドを修飾するために常用
される方法により抗ＩｇＥ抗体又はＦｃεＲＩαもしく
はその結合性断片に結合させることができる。このよう
な結合方法として、例えばビスイミデート類による方法
（文献：Peters, K., Richards, F.M.(1977) Annu. Re
v. Biochem., 46P524)、ジマレイミド類による方法（文
献：Kato, K. et al J. Immunol., 116P1554 ）等が用
いられる。

【００２１】ＳＰＲ装置による測定においては、固定化
担体としてのセンサーチップにリガンド、すなわち第一
及び第二の態様におけるＦｃεＲＩαもしくはその結合
性断片、又は第三の態様における抗ＩｇＥ抗体を固定化
する必要がある。固定化担体としてはカルボキシデキス
トラン層が用いられることが多い。固定化方法として
は、固定化するリガンドのアミノ基を介する方法（文
献：Johnsson B. et al Analytical Biochem. 198 , 26
8 〜277(1991))、チオール基を介する方法（文献：Phar
macia-Biosensor. AB BIA Core Methods Manual 199
1）、固相にあらかじめアビジン蛋白質を結合させてお
き、これにビオチン修飾したリガンドを流して結合させ
る方法（文献：Methods in Enzymol. 184 , O'Shanness
y D.J., et al, Analytical Biochem. 205, 132 〜136
(1992) など、種々の方法がある。

【００２２】本発明の方法の実施においては、固定化担
体としてのＳＰＲセンサーチップに被験試料、試薬溶液
等を接触せしめるが、この場合、ＳＰＲ装置の微小流路
系に所望の試料溶液又は試薬溶液を、所定の時間、例え
ば１〜１０分間、通常は３〜７分間、例えば約５分間流
せばよい。操作に当っては、センサーチップの表面を平
衡化するため、及び／又は先行工程で加えた溶液の未結
合成分を洗浄除去するため、センサーチップの表面を洗
浄後、好ましくは緩衝液により洗浄することが好まし
く、このための緩衝液としては、例えばＨＢＳ緩衝液
（１５０mM塩化ナトリウム、３．４mMエチレンジアミン
四酢酸、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１０mM ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液：pH７．４）ＰＢＳ緩衝液（１５０mM塩化ナ
トリウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、リン酸ナトリ
ウム緩衝液pH７．３）等が用いられる。洗浄は、これら
の洗浄液を１〜１０分間、例えば３〜７分間、ＳＰＲ装
置の流路に流せばよい。

【００２３】本発明の方法に用いられる試薬溶液、例え
ばＦｃεＲＩαもしくはその結合性断片、抗ＩｇＥ抗体
等も、上記のいずれかの緩衝液中の溶液として用いるの
が好ましい。これらの溶液中のＦｃεＲＩαもしくはそ
の結合性断片、又は抗ＩｇＥ抗体の濃度は、例えば５nM
〜５００nM、好ましくは５０nM〜３００nMである。操作
は、室温において行なうことができる。

【００２４】本発明のセンサーチップは、表面に物質が
結合すると、そこに屈折率変化を生じ、これを表面プラ
ズモン共鳴角の変化として検出することができる。この
センサーに、測定したい物質に相互作用する分子を結合
させれば、目的物質の量を測定できるセンサーになりう
る。例えば、アレルギー反応を誘発する能力を持ったＩ
ｇＥ分子種を選択的に定量することが目的の場合、Ｆｃ
εＲＩα又はその結合性断片、例えば可溶性断片をリガ
ンドとしてカルボキシデキストラン層に結合させればよ
い。

【００２５】このようにして作製された可溶性ＦｃεＲ
Ｉα断片固定化センサーにＩｇＥを含む試料を接触せし
めると、ＩｇＥがセンサー上の可溶性ＦｃεＲＩα断片
に結合し、屈折率変化を生じる。この変化を表面プラズ
モン共鳴シグナル変化として測定することで、センサー
表面に結合しているＩｇＥの量を、あらかじめ濃度のわ
かっているＩｇＥ標準試料で作成しておいた標準曲線か
ら求めることができる。

【００２６】また、繰り返し試料中のＩｇＥ濃度を測定
するには、センサーチップ上に結合しているＩｇＥ分子
を除去して、元の状態に再生する必要がある。この再生
操作は適当な変性剤を流すことによって行なうことがで
きるが、再生過程でセンサー上の可溶性ＦｃεＲＩα断
片が不活性化しない条件を用いる。例えば、ヒトＩｇＥ
は可溶性ＦｃεＲＩα断片からpH４．０の弱酸と１．５
Ｍのチオシアン酸ナトリウムで遊離させることができ
る。再生したセンサーは５０〜１００回の測定に供する
ことができる。

【００２７】

【作用及び効果】本発明の方法に従えば、アレルギー反
応を誘発する能力を持つＩｇＥを選択的にかつ迅速、簡
便に測定することができる。

【００２８】

【実施例】以下実施例により、本発明のさらに詳細な説
明を行なうが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。

【００２９】実施例１．表面プラズモン共鳴分析装置を
用いたＩｇＥの測定系 １．センサーチップＣＭ５への可溶性ＦｃεＲＩα断片
の固定化可溶性ＦｃεＲＩα断片へのジチオ基の導入 バキュロウイルス発現系で生産された可溶性ＦｃεＲＩ
α断片を精製し、０．２Ｍ ＭＥＳ緩衝液pH５．０に溶
解し、０．２mg／mlとした。これに１．１mgの２−（２
−ピリジニル）ジチオエタンアミン（ファルマシア社
製、以下、ＰＤＥＡと略記）を加えて溶解した。氷上で
冷却しながら、１０μｌの０．４Ｍ Ｎ−エチル−Ｎ′
−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、
ＥＤＣと略記）を加え混合する。氷上で７０分間静置し
た後、充填済み脱塩用カラムであるＮＡＰ１０カラム
（ファルマシア社製）を用いて溶媒を１０mM酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH４．０に置換し、ＰＤＥＡ処理可溶性Ｆｃ
εＲＩα断片の標品とした。

【００３０】センサーチップへの可溶性ＦｃεＲＩα断
片の固定化 センサーチップＣＭ５の活性化は以下のように行なっ
た。ＨＢＳ緩衝液（１５０mM塩化ナトリウム、３．４mM
エチレンジアミン四酢酸、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２
０、１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液pH７．４）で平衡化した
センサーチップ上に０．２Ｍ ＥＤＣ、０．０５Ｍ Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと略記）を
２分間流した。次に、４０mMシスタミン、１００mMほう
酸緩衝液pH８．５を３分間流し、続いて１００mMジチオ
エリスリトール（以下、ＤＴＥと略記）、１００mMほう
酸緩衝液pH８．５を３分間流し、活性化を行なった。

【００３１】この活性化されたセンサーチップＣＭ５に
上で調製したＰＤＥＡ処理可溶性ＦｃεＲＩα断片を流
し、固定化した。続いて２０mM ＰＤＥＡ、１Ｍ塩化ナ
トリウム、ギ酸ナトリウム緩衝液pH４．３を３分間流
し、過剰の反応基を不活性化した。

【００３２】２．標準ヒトＩｇＥ試料の測定 可溶性ＦｃεＲＩα断片を固定化したセンサーチップを
ＨＢＳ緩衝液で平衡化した。これに０．０１〜１００μ
ｇ／mlになるようにＨＢＳ緩衝液で希釈した精製ヒトＩ
ｇＥ（ヤマサ社製）を４分間流した。試料注入停止後、
ＨＢＳ緩衝液を２分間流した後の安定した状態で共鳴シ
グナル値の上昇を測定した。また、一度ヒトＩｇＥの結
合したセンサーチップは、以下の条件で再生し、次回の
測定に供した。

【００３３】再生は１０mM酢酸ナトリウム緩衝液pH４．
０を３分間流し、続いて１．５Ｍチオシアン酸ナトリウ
ムを含む２５mMトリス塩酸緩衝液pH７．５を３分間流し
た後、ＨＢＳ緩衝液で平衡化した。この経過を図１に示
す。図１から測定開始からセンサーの再生過程までを２
０分間以内に完了できることがわかる。また図１で測定
した共鳴シグナル値の上昇値を試料中のＩｇＥ濃度に対
してプロットしたものを図２に示す。図２によると、上
記条件で測定した場合は、０．２μｇ／ml以上の濃度の
ＩｇＥ試料の場合に共鳴シグナル値（RU）の有意な上昇
を検出し、その値は測定した上限である１００μｇ／ml
まで濃度依存的に上昇した。また、測定値の再現性も良
好であった。

【００３４】参考例１．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片を持つプラスミドの調製 ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を持つプラスミドＢＳ−
ＳＫ（＋）ｈｅｒαから、ＤＮＡ合成機（8700DNA Synt
hesizer,MilliGen／Biosearch)を用いて合成したプライ
マーＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応により目的とする可溶性
ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子断片を調製した。プライマー
としてはＮＴＶプライマーとＰＡＳプライマーを作製し
た。それぞれの配列は以下に示すものである。 ＮＴＶプライマー；５′−AAAAACTCGAGATGGCTCCTGCCATG
GAATCCCCTACT（配列番号：１） ＰＡＳプライマー；５′−AAAAAGGATCCTTAAGCTTTTATTAC
AGTAATGTTGA （配列番号：２）

【００３５】ＰＣＲ反応は次に示す条件で行なった。１
００μｌの反応液〔１ngプラスミドＢＳ−ＳＫ（＋）ｈ
ｅｒαＤＮＡ、１μＭ ＮＴＶプライマー、１μＭ Ｐ
ＡＳプライマー、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３）、５０mM ＫＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．０
０１％ ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２０
０μＭ ｄＣＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ
ｄＴＴＰ、２．５ＵAmpliTaq DNA polymerase(宝酒
造）〕を調製し、DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer C
etus社) を用いて、９４℃にて１分間、５０℃にて２分
間、７２℃にて３分間の反応を３０サイクル行なわせ
た。

【００３６】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ット(BIO101社) を用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ〕中
に回収した。そこに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mMＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０
mM ＭｇＣｌ₂ 〕を２μｌ加え、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ
をそれぞれ１μｌ加え３７℃において１時間反応させ
た。

【００３７】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＢａｍＨ
ＩおよびＸｈｏＩで切断したクローニングベクターｐＴ
３Ｔ７Ｕ１９Ｘ（特願平３−１０６６００号）１０ngと
ともにＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社）Ａ液３
０μｌおよびＢ液６μｌと混合し、１６℃、１時間反応
させ両ＤＮＡを連結させた。得られたＤＮＡ溶液１０μ
ｌを用いて大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene社) を
Ｈａｎａｈａｎの方法〔DNA cloning:A practical appr
oach (ed.D.M.Glover),vol.1,p109-,IRC press(1885)〕
に従って形質転換させ、Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプ
レートに蒔き、白色のコロニーを選択することによりア
ンピシリン耐性で、βガラクトシダーゼ欠損のコロニー
を選択した。

【００３８】選択したコロニーをＬ−ａｍｐ培地で培養
し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３を感染させることに
より組換え体ファージを調製した。調製した組換え体か
ら一本鎖ＤＮＡを調製し、調製したＤＮＡ約０．８μｇ
をDNA Sequencing System/Taq polymerase（アプライド
バイオシステム社）を用い、メーカーの推奨する条件に
従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Model 370A
(version 1.30、アプライドバイオシステム社) を用い
て分析し塩基配列を決定した。

【００３９】またアルカリ溶菌法により調製した組換え
体プラスミドＤＮＡ約１μｇをＭ１３ＲＰＩプライマー
（アプライドバイオシステム社）を用い、Cycling sequ
encing法（アプライドバイオシステム社テクニカルマニ
ュアル）によりメーカーの推奨する方法に従い反応さ
せ、反応産物をDNA sequencer Model 370A (version 1.
30、アプライドバイオシステム社）を用いて分析し塩基
配列を決定した。

【００４０】両者の方法により決定した配列のうち、構
造遺伝子部分が既に報告されているヒトＦｃεＲＩα鎖
遺伝子のものと異なっておらず、翻訳開始コドンの前に
ＮＴＶプライマーによって導入されたＸｈｏＩサイトが
あり、かつコードされているアミノ酸配列の２５番目の
バリンを第１位とした場合に第１７２位のアラニンをコ
ードするコドンの直後にＰＡＳプライマーによって導入
された翻訳終了コドンＴＡＡとＢａｍＨＩサイトがある
ことが確認された組換え体プラスミドｐＮＴＶ２を得
た。

【００４１】参考例２．ヒト可溶性ＦｃεＲＩα鎖遺伝
子断片の単離 ＫＵ８１２細胞（４×１０⁷ 細胞）からTotal RNA Sepa
rator Kit(Clontech社）を用い、メーカーの推奨する方
法に則り、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡからmRNA
Separator Kit (Clontech社) を用い、メーカーの推奨
する方法に従いｐｏｌｙＡ ＲＮＡを精製した。４０μ
ｇのｐｏｌｙＡ ＲＮＡを得ることが出来た。このうち
５μｇを用い、Time Saver cDNA 合成キット（ファルマ
シア社）を用い、メーカーの推奨する方法に従い、二本
鎖ｃＤＮＡを合成した。

【００４２】得られたｃＤＮＡ液（１５０μｌ）の内の
一部、１０μｌを用いて、前述のＮＴＶプライマー、Ｐ
ＡＳプライマーを用い、１００μｌの反応液（１μＭ
ＮＴＶプライマー、１μＭ ＰＡＳプライマー、１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM ＫＣｌ、
１．５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．００１％ ｇｅｌａｔｉ
ｎ、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣＴＰ、２
００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＴＴＰ、２．５Ｕ
AmpliTaq DNA polymerase 〔宝酒造〕）を調製し、DN
A Thermal Cyclerを用いて、９４℃にて１分間、５０℃
にて２分間、７２℃にて３分間の反応を３０サイクル行
なわせた。

【００４３】反応液の一部２０μｌを０．８％アガロー
スにアプライし電気泳動を行なった。分離した約０．６
kbのＤＮＡ断片をアガロースからＧｅｎｅＣｌｅａｎキ
ットを用いて１６μｌのＴＥ溶液〔１０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）、１mMＥＤＴＡ〕中に回収した。そ
こに１０Ｘの反応緩衝液〔１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、７０mM ＭｇＣｌ
₂ 〕を２μｌ加え、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩをそれぞれ１
μｌ加え３７℃において１時間反応させた。

【００４４】反応液を６５℃、１０分間処理することに
より酵素を熱失活させた後、その一部５μｌをＸｈｏ
Ｉ、ＢａｍＨＩで切断したクローニングベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）、１０ngとともにＤＮＡ
ライゲーションキット、Ａ液３０μｌ、Ｂ液６μｌと混
合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結させた。
得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いて大腸菌ＸＬｌ−ｂ
ｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に従って形質転換させ、
Ｘ−Ｇａｌを含むＬ−ａｍｐプレートに蒔き、白色のコ
ロニーを選択することによりアンピシリン耐性で、βガ
ラクトシダーゼ欠損のコロニーを選択した。

【００４５】コロニーから調製したプラスミドＤＮＡ
１．５μｇをDye primer cycling sequencing kit(アプ
ライドバイオシステム社）を用い、Ｍ１３ＲＰ１または
−２１Ｍ１３プライマーをもちいて、メーカーの推奨す
る条件に従い反応させ、反応産物をDNA sequencer Mode
l 373Aを用いて分析し挿入断片の塩基配列を決定した。
挿入された断片は報告の配列と同じ配列を持ち、翻訳開
始コドンＡＴＧの直前にＸｈｏＩサイトがあり、第２４
位のバリンを第１位とした場合に１７２位に存在するア
ラニンのコドンの直下に翻訳停止コドンとＢａｍＨＩサ
イトが挿入されていることが確認された。このようにし
て得られたプラスミドは、参考例１においてｐＮＴＶ２
の代わりに用いることが出来ることは明らかである。

【００４６】参考例３．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖の発
現プラスミドの作製 可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖遺伝子を持つプラスミドｐＮ
ＴＶ２ １μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１００mM ＮａＣｌ、７mM
ＭｇＣｌ₂ 、１２Ｕ ＸｈｏＩ、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕
で３７℃において１時間反応させた。反応終了後フェノ
ール／クロロホルムによりＤＮＡを抽出した後、エタノ
ール沈殿法により回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡブ
ランティングキット〔宝酒造〕を用いて、メーカーの推
奨する方法により平滑末端化した。反応液を０．８％ア
ガロース電気泳動にかけ、分離した約０．６kbの断片を
アガロース小片からＧｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて
１０μｌのＴＥ液中に回収した。

【００４７】一方バキュロウィルス発現ベクターである
ｐＡｃＹＭ１（Matsuura,Y. ら、J.Gen.Virol.68,p1233
-1255)１μｇを１０μｌの反応液中〔１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、７mM Ｍ
ｇＣｌ₂ 、１０Ｕ ＢａｍＨＩ〕で３７℃において１時
間反応させた。反応液を０．８％アガロース電気泳動に
かけ、分離した約１０kbの断片をアガロース小片からＧ
ｅｎｅＣｌｅａｎキットを用いて１０μｌのＴＥ液中に
回収した。

【００４８】この回収した断片を含む溶液２μｌと、ｐ
ＮＴＶ２から回収した断片を含む溶液３μｌとをそれぞ
れＤＮＡライゲーションキットＡ液２５μｌ、Ｂ液５μ
ｌと混合し、１６℃、１時間反応させ両ＤＮＡを連結さ
せた。得られたＤＮＡ溶液１０μｌを用いてそれぞれ大
腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅをＨａｎａｈａｎの方法に従って
形質転換させ、Ｌ−ａｍｐプレートに蒔き、アンピシリ
ン耐性のコロニーを選択した。コロニーのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素部位を調べそれぞれの断片が連結された
プラスミドを持つ形質転換体を選別することによりバキ
ュロウィルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−ＮＴＶ
を得た。

【００４９】参考例４．可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖発現
組換えウィルスの単離 夜盗蛾腸培養細胞であるＳｆ−９細胞株にバキュロウィ
ルス発現ベクターであるｐＡｃＹＭ１−ＮＴＶ、１０μ
ｇと天然型バキュロウィルスＤＮＡ１μｇを燐酸カルシ
ウム沈殿法により感染させた。感染の方法は松浦（実験
医学８刊、ｐ２８１−２８４，１９９０）の方法に従っ
た。感染後プラークアッセイ法によりポリヘドリンを合
成していないプラークを選択した。このプラークアッセ
イを３回行なうことにより組換えウィルスを単離した。

【００５０】単離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity
of infection)＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％
ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社) 中で７２時間培
養し、培養上清の一部をウェスターンブロッティング法
により分析することにより、可溶性ヒトＦｃεＲＩα鎖
発現組換えウィルスであるＡｃ−ＮＴＶを単離した。単
離したウィルスをＭＯＩ（multiplicity of infection)
＝１でＳｆ−９細胞に感染させ、１０％ＦＣＳを含むＧ
ｒａｃｅ培地(Gibco社) 中で７２時間培養し培養上清を
回収することにより、約１×１０⁸ pfu／mlの組換えウ
ィルスを回収した。

【００５１】参考例５．発現及び発現産物の精製 組み換えウィルスをＭＯＩ（multiplicity of infectio
n)＝５でＳｆ−９細胞（４×１０⁸ 細胞）に感染させ、
１０％ＦＣＳを含むＧｒａｃｅ培地(Gibco社)中４００m
lで７２時間培養し培養上清を回収した。回収した上清
中に硫安を飽和濃度６０％となるように加えた後、４℃
で２時間保温した。１００００rpm で３０分間遠心し、
沈殿物を回収した。回収した沈殿物をＴＢＳ（２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ〔pH７．５〕、１５０mMＮａＣｌ）に
溶解させた後、同溶液に対して４℃、１夜透析した。透
析後液を回収し、ＴＢＳで平衡化したセファクリルＳ２
００カラム（２．６cm×６０cm）にかけＴＢＳにて分離
した。分子量３万から４万付近に相当する分画を集め
た。

【００５２】抗ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体カラム
の作製を以下のように行なった。ＢｒＣＮ−ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ファルマシア社
製）を１mM塩酸中で室温で１５分間膨潤させた。１mM塩
酸を用いてグラスフィルター上で膨潤ゲルの洗浄と膨潤
を繰り返した後、カップリング緩衝液（０．５Ｍ塩化ナ
トリウム、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム pH８．３）で洗
浄した。

【００５３】直ちにこのゲル２mlを、カップリング緩衝
液に溶解した精製抗ＦｃεＲＩαモノクローナル抗体溶
液２ml（５mg／ml）に加え、室温で２時間穏やかに攪拌
した。上清を除き、０．２Ｍグリシン塩酸、pH８．０に
ゲルを懸濁し、室温で２時間穏やかに攪拌した。次にこ
れをカップリング緩衝液と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液pH４．０で繰り返し洗浄し、抗Ｆ
ｃεＲＩαモノクローナル抗体カラムを得た。

【００５４】ゲル濾過により得られた画分の抗ＦｃεＲ
Ｉαモノクローナル抗体カラムによる精製を以下のよう
に行なった。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリ
ス塩酸緩衝液pH７．６で平衡化した抗ＦｃεＲＩαモノ
クローナル抗体カラムに、培養上清をゲル濾過して得ら
れたＦｃεＲＩαを含む画分をかけ、平衡化に用いた緩
衝液にてカラムを充分に洗浄した。

【００５５】次に、３Ｍチオシアン酸ナトリウムと０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリス塩酸緩衝液pH
７．６でカラムからの溶出を行ない、溶出された画分を
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
pH７．６に対して直ちに透析し、可溶性ＦｃεＲＩα断
片精製標品を得た。

【００５６】参考例６．精製標品の純度検定 精製標品の純度検定をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法を用いて以下のように行なった。精製標品を
濃縮し、試料用緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム、
５％２−メルカプトエタノール、７％グリセロール、
０．００５％ブロムフェノールブルーを含む６２．５mM
トリス塩酸緩衝液pH６．８）に懸濁し、１００℃で５分
間煮沸した。

【００５７】この試料を分離ゲル濃度が１０−２０％の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用濃度勾配平
板ゲル（第一化学薬品株式会社製）を用いて電気泳動
し、銀染色キット（第一化学薬品株式会社製）でゲルを
染色して蛋白質の検出を行なった。その結果、分子量３
０ｋ〜３５ｋ付近に広がった単一のバンドが検出され
た。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAACTCGA GATGGCTCCT GCCATGGAAT CCCCTACT 38

【００５９】配列番号：2 配列の長さ：３7 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAAAAGGATC CTTAAGCTTT TATTACAGTA ATGTTGA 37

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例において得た各ＩｇＥ濃度におけ
る共鳴シグナル値変化のグラフの例である。図中の黒矢
印で示した時点での共鳴シグナル値を、その試料の測定
値とした。

【図２】図２は実施例１において得たＩｇＥ濃度と共鳴
シグナル値との関係を示すグラフである。

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【手続補正書】

【提出日】平成６年９月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 谷田 以誠 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 長谷川 明 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 羅 智靖 東京都文京区本郷２−１−１ 順天堂大学 医学部免疫学教室内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固定化担体上で免疫グロブリンＥ（Ｉｇ
   Ｅ）と高親和性ＩｇＥリセプター（ＦｃεＲＩ）のα鎖
   （ＦｃεＲＩα）又はその結合性断片とを反応せしめ、
   それによって生ずる共鳴シグナル値の変化を表面プラズ
   モン共鳴分析装置により測定することを特徴とする、ア
   レルギー反応誘発性ＩｇＥの特異的測定方法。