JP3558645B2 - 甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用及び患者血清中での抗−hTg自己抗体の検出用添加薬 - Google Patents
甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用及び患者血清中での抗−hTg自己抗体の検出用添加薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3558645B2 JP3558645B2 JP52463396A JP52463396A JP3558645B2 JP 3558645 B2 JP3558645 B2 JP 3558645B2 JP 52463396 A JP52463396 A JP 52463396A JP 52463396 A JP52463396 A JP 52463396A JP 3558645 B2 JP3558645 B2 JP 3558645B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- htg
- autoantibodies
- human
- thyroglobulin
- affinity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 title claims description 15
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 title claims description 11
- 239000000654 additive Substances 0.000 title 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 40
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims abstract description 37
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 20
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 19
- 102000047688 human TG Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000012733 comparative method Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 3
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 2
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 102100026559 Filamin-B Human genes 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 101000913551 Homo sapiens Filamin-B Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003911 Thyrotropin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 201000008496 endemic goiter Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- ZLVYMPOQNJTFSG-QMMMGPOBSA-N monoiodotyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](NI)CC1=CC=C(O)C=C1 ZLVYMPOQNJTFSG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
チログロブリンは甲状腺自己抗原の1種であり、そして各々約330kDの分子量を有する2種の同じグリコシル化されたサブユニットからなる高分子量蛋白質である(例えば、J.Furmaniak and B.Rees Smith in:Autoimmunity,1990,Vol.7,63−80頁参照)。チログロブリンは、甲状腺コロイドの主要成分であり、そして甲状腺ホルモン類であるトリヨードチロニン(T3)およびチロキシン(T4)の前駆体である。上記の甲状腺ホルモン類の合成の予備段階として、未結合の循環しているヨウ素およびヨウ化物がチロイドペルオキシダーゼ酵素(TPO)の触媒作用の下で、Tgのチロシル基またはヨードチロシン基の中に導入される。次に、甲状腺ホルモン類T3およびT4が、ヨウ素化されたチログロブリンから遊離され、これは血液中のT3またはT4の含有量に応答するホルモン調節機構により影響を受ける。
甲状腺自己免疫疾患の場合、特に甲状腺機能低下症をもたらす破壊的な橋本甲状腺炎の場合には、チロイドペルオキシダーゼに対する自己抗体の他に、かなりの量のチログロブリンに対する自己抗体も、患者の血液中で検出される(そのような抗体を以下では常に「抗−hTg自己抗体」と称する)。従って、そのような抗−hTg自己抗体の検出および定量的測定は、甲状腺疾患の臨床診断においてかなり重要である。
患者の血清中の抗−hTg抗体の測定は、免疫学的アッセイを含む種々の技術により可能である。このタイプの商業的に利用できるアッセイ(ヘニング試験(HENNINGtest(登録商標))抗−Tg)では、予め希釈した血清サンプルを、試験管の中で標識Tg(トレーサーとして)およびプロテインA懸濁液と共に、同時にインキュベートする。抗−hTg自己抗体がサンプル中に存在する場合には、それらはトレーサーとして加えられた抗原hTgと反応する。同時に、懸濁した固体相の粒子の形態で存在するプロテインAは、抗体のFcサブユニットと非特異的に結合し、そしてサンドイッチ複合体が生成する。それに対して結合された全ての分子を含む固体相懸濁液の粒子は、遠心分離により沈澱とされ、そして未結合のトレーサーを含有する上清は除去される。サンプル中の自己抗体の量が多くなればなるほど、結合されるトレーサーの量は多くなる。それ故、抗−hTg自己抗体の濃度は沈澱中で検出可能なトレーサーの量、例えば放射標識の場合には沈澱中で測定可能な放射活性に正比例する。
全種類のIgG抗体を、区別なく結合しうる非特異的結合相手であるプロテインAを使用することにより、そしてトレーサーとして標識化チログロブリンを同時に使用することにより、全ての抗−hTg自己抗体が上記のアッセイにおいて検出される。患者の血清は、臨床的に顕在化する甲状腺自己免疫疾患に直接的に関連しない抗−hTg自己抗体を含有しているかもしれないことが知られているため、直接的に結合され、且つ橋本甲状腺炎など臨床的に顕在化する甲状腺疾患の原因であるような抗−hTg自己抗体に選択的に応答するアッセイも、それ自体興味の対象であろう。さらに、上記の既知の方法が、遠心分離工程を必要とすることは、該方向のある種の欠点であるとみなされるであろう。しかしながら、競合アッセイおよびコーティングチューブ方法として作用する他の方法は、遠心分離工程なしで操作され(DYNOtest(登録商標)抗−TPO、この方法の原理に関してはDE 41 20 412 C1を参照のこと)、抗−hTg自己抗体の測定と平行して非常に頻繁に行われている抗−TPO自己抗体の測定用に利用可能である。しかしながら、異なる取り扱い段階を含む2種のアッセイの同時実施は、臨床研究のための実施においては、欠点となることが証明されている。従って、コーティングチューブ技術に従い操作され且つ競合アッセイであり、そして試験血清サンプル中で測定しようとする抗体の存在が、標識試薬(トレーサー)の試験管壁への結合の減少として現れるようなアッセイにより、抗−hTg自己抗体の測定を行えることも、それ自体望ましいであろう。
抗原hTPOのエピトープは、本質的には抗−TPO自己抗体の測定の場合には既知であり、そして競合測定用に適する1組のモノクローナル抗体を見いだすことが可能であるが(Jean Ruf,Marie−Elisabeth Toubert,Barbara Czarnocka,Josee−Martine Durand−Gorde,Mireille Ferrand and Pierre Carayon,in:Endocrinology,Vol.125,No.3,pages 1211−1218,1989参照)、現在では抗原が非常に大きくおよび/または免疫反応に含まれるそれらのエピトープに関する同定が不十分であるか或いは該エピトープが未知である場合には、匹敵する競合アッセイの開発は基本的問題に直面するはずである。そのような症例は、非常に多数あり、そしてグルタメートデカルボキシラーゼ(I型糖尿病)、アセチルコリン受容体(重症筋無力症)、いわゆる「ミエリン塩基性蛋白質」(多発性硬化症)、TSH受容体および特にチログロブリン(hTg)がそのような抗原の例として挙げられる。
抗−hTG自己抗体を測定するために、抗−TPO自己抗体の測定に関して上記方法に対応する競合アッセイを開発する試みがなされる場合には、チログロブリンに対して製造される抗原または抗体集団として作用するチログロブリンの特殊性に関する難点に遭遇する。最初に述べたように、ヒトチログロブリン(hTg)は、非常に多数の潜在的抗原決定因子(エピトープ)を有する非常に大きい蛋白質抗原であり、動物の直接免疫化により異種抗体を製造するためにヒトチログロブリンを使用すると、ヒトチログロブリンの多数の異なるエピトープに対して指向されることが見いだされているポリクローナル抗体の集団が得られる。しかしながら、最近数年間の研究は、自己免疫疾患中に生成する抗−hTg自己抗体は、明らかにチログロブリン表面上の限られた数のエピトープに対してのみ製造されることを示している(J.Furmaniak and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1990,Vol.7,pages 63−80;J.Ruf,Mireille Henry,Catherine De Micco,P.Carayon,in:Thyroglobulin and Thyroglobulin Autibodies in the Follow−up of Thyroid Cancer and Endemic Goiter(Hufner,M.,and Reiners,C.,Editors),pages 21−31,1987,G.T.Verlag Stuttgart,New York;C.T.J.Chan,P.G.H.Byfield,R.L.Himsworth and P.Shepherd,in:Clin.exp.Immunol.(1987)70,pages 516−523;S.M.McLachlan,U.Feldt−Rasmussen,E.T.Young,S.L.Middleton,M.Blichert−Toft,K.Siersboek−Nielsen,J.Date,D.Carr,F.Clark and B.Rees Smith,in:Clinical Endocrinology(1987),26,pages 335−346;Q.Dong,M.Ludgate and G.Vassart,in;Journal of Endocrinology(1989)122,pages 169−176;M.E.Devey,K.M.Bleasdale−Barr,S.M.McLachlan,J.Bradbury,F.Clark and E.T.Young,in:Clin.exp.Immunol.(1989),77,pages 191−195;N.Fukuma,S.M.McLachlan,V.B.Petersen,P.Kau,J.Bradbury,M.Devey,K.Bleasdale,P.Grabowski and B.Rees Smith,in:immunology 1989,67,pages 129−131;N.Fukuma,S.M.McLachlan,V.B.Petersen,K.Beever and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1990,Vol.6,pages 37−45;Shannon L.Gleason,Patricia Gearhardt,Noel R.Rose and Rudolf C.Kuppers,in:The Journal of Immunology,Vol,145,No.6,pages 1768−1775,1990;Herbert S.Bresler,C.Lynne Burek and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vo.54,pages 64−75,(1990):Herbert S.Bresler,C.Lynne Burek,William H.Hoffman and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol,54,pages 76−86,(1990);Mireille Henry,Yves Malthiery,Eric Zanelli and Bernadette Charvet,in:The Journal of Immunology,Vol.145,No.11,pages 3692−3698,1990;Shigeki Sakata,Toru Ogawa,Yasuyoshi Kimata,Hiroshi Takuno,Hiroshi Maekawa,Masafumi Matsuda,Osamu Tarutani and Kenji Okuda,in:Molecular and Cellular Endocrinology,79,(1991),pages 93−98;Gilles Dietrich,Martine Pierchaczyk,Bernard Pau and Michel D.Kagatchkine,in:Eur.J.Immunol.1991,21,pages 811−814;Yves Malthiery,Mireille Henry and Eric Zanelli,in:FEBS Letters,Vol.279,No.2,pages 190−192(1991);E.Schulz,G.Benker,H.Bethauser,L.Stempka and M.Hufner,in:J.Endocrinol.Invest 15,pages 25−30,1992;Asmae Alami Harchali,Paul Montagne,Marie L.Cuilliere,Majida Bouanani,Bernard Pau and Jean Duheille,in:Clin.Chem.Vol.38,No.9,pages 1859−1864(1992);B.Mallet,P.J.Lejeune,J.Ruf,M.Piechaczyk,C.Marriq and P.Carayon,in:Molecular and Cellular Endocrinology,88,(1992),pages 89−95;J.M.Hexham,J.Furmaniak,C.Pegg,D.R.Burton and B.Rees Smith,in:Autoimmunity,1992,Vol.12,pages 135−141;Rudolf C.Kuppers,Ingrid M.Outschoorn,Robert G.Hamilton,C.Lynne Burek and Noel R.Rose,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol.67,No.1,pages 68−77,1993;Peter J.Delves,Sandra M.McLachlan,Elizabeth Drewe,Nao Fukuma,Vaughan B.Petersen and Bernard Rees Smith,in;Journal of Autoimmunity(1993),1,pages77−91;Patrizio Caturegli,Stefano Mariotti,Rudolf C.Kuppers,C.Lynne Burek,Aldo Pinchera and Noel R.Rose,in:Autoimmunity,1994,Vol.18,pages 41−49)。問題の複雑さのために、完全なエピトープのマップ作製は現在までhTgに関しては成功しておらず、その状況は、自己免疫疾患中に生成した自己抗体が明らかにコンフォーマティブ抗体の中にあることが見いだされたという事実によりさらに困難となり、それにより動物由来のモノクローナル抗−hTg抗体を使用するエピトープのマップ作製時の試みをさらに困難にし、そして組み換え逐次抗体を使用する関連エピトープのマップ作製を妨げている(Q.Dong,M.Ludgate and G.Vassart,in:Journal of Endocrinology(1989)122,pages 169−176)。それ故、動物の血清中でhTgを用いた免疫化により得られるポリクローナル異種IgG集団は、自己免疫疾患において生ずる抗−hTg自己抗体集団には対応せず、従って競合免疫学的アッセイにおける使用にはあまり適してはいないか、または不適切であるのは明らかである。
他方では、抗−hTg自己抗体を測定するための競合アッセイにおいてモノクローナ抗−hTg抗体を使用する試みが、希望する結果、すなわち自己免疫疾患の病理学適過程に実際に関連する抗−hTg自己抗体の割合を測定するアッセイの開発をもたらさないことが見いだされている。モノクローナル抗−hTg抗体を使用する場合に不満足な結果となる理由は、抗−hTg自己抗体生成に含まれる個別のエピトープが、非常に大きいhTg分子上で互いに少ない程度で影響するため、患者の血清中に実際に存在するポリクローナル抗−hTg自己抗体の分画だけが、モノクローナル抗−hTg抗体を使用する競合アッセイで検出されるということ、並びにこれらの分画が全体的な病理学的過程を適切には示さないということである。
動物由来のモノクローナル抗−hTg抗体の代わりにモノクローナルまたは組み換えヒト抗−hTg抗体を使用する試み(GB−A−2 265 713)は原則的にこの問題を改善するものではない。
従って、既存の競合アッセイに基づく抗−hTg自己抗体の測定は信頼性がなく、十分な感度で実施することができないということが知られている。
従って本発明の目的は、そのような自己抗体が多数の関連エピトープを有する抗原に対して製造され、そしてポリクローナル抗体の集団として存在する時でもそのような自己抗体を高い精度および信頼性をもって測定できるような方法で、抗体の競合アッセイ、特に抗−hTg自己抗体測定用の競合アッセイを設定することである。
この目的は、請求の範囲第1項に記載された特異的結合試薬としてチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体を使用することにより、特に甲状腺自己免疫疾患に罹っているヒト患者の血清からのチログロブリンに対するアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG自己抗体を使用することにより、患者の血清中の抗−hTg自己抗体の測定において達成される。
ポリクローナル抗−hTg自己抗体の本発明に従う特に有利な使用方法は、従属請求の範囲第2項〜第7項に記載されている。
本発明はさらに請求の範囲第8項記載の患者の血清中の抗−hTg自己抗体の免疫学的測定用試薬キットにも関し、それは本質的にそのような試薬キットの一般的成分の他にアフィニティ精製された抗−hTg自己抗体(アフィニティ精製された抗−hTg IgG調製物)を含有することにより特徴づけられている。
請求の範囲第9項に記載されている非常にさらに一般的な態様に従うと、本発明は、一般的にはそのような抗体の発生により特徴づけられる疾患の臨床診断用のポリクローナルヒト抗体の使用にも関し、その理由としては、さらに以下でより詳細に説明されているように、抗−hTg自己抗体の決定から生ずる原則を他の用途にも適用することができ、そして患者の血清から得られるポリクローナルヒト抗体(hIgG)は免疫学的アッセイを実施するための商業用試薬キット中で特異的結合試薬としてすでに使用されていることを確認することが不可能であるからである。
本出願では、チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が「特異的結合試薬」として使用されると述べられているが、これは、それらが抗原と1つもしくは複数の抗体との間の特異的免疫学的反応を使用する免疫学的アッセイにおいて、反応物として使用されることを意味する。「特異的結合試薬」は「分析物用の結合剤」の意味で使用されるものではなく、その理由は測定しようとする抗体を「分析物」とみなす必要がないであろうし、本発明に従い使用されるチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が、抗原チログロブリンの結合部位のための競合剤として競合するからである。
本発明は、現在免疫学的アッセイ用の試薬キットの工業的製造分野において一般的な動物由来の抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗−hTg抗体)を使用する代わりに、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患に罹っていることが示されている患者の血清から直接得られるポリクローナルヒト自己抗体を使用する場合、患者の血清中で抗−hTg自己抗体を非常に高い信頼性でもって検出できるという知見に基づいている。本発明では、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患の典型的な症状を有する一人の患者の血清の形態で、そのようなポリクローナルヒト自己抗体を使用することが一般的に可能であるが、使用される出発血清が検出しようとする疾患に関連する人間において生成されるかもしれないできるだけ完全な全ての自己抗体の集団を確実に含有するようにするためには、複数のそのような患者の一緒にした(「プールされた」)血清をポリクローナルヒト自己抗体源として使用することが好ましい。さらに、抗−hTg自己抗体の測定の場合には、ポリクローナルヒト自己抗体は好適にはそのような血清中に存在する全てのhTg自己抗体が使用されるような方法では用いられず、その代わりに、ポリクローナルヒト自己抗体、hTg親和マトリックスを使用するアフィニティ精製後に、特異的結合試薬として使用される免疫グロブリン画分が本質的に抗−hTg自己抗体だけからなるような方法で好適に用いられる。
本出願がアフィニティ精製目的のためのまたは免疫学的アッセイにおける試薬としてのチログロブリンまたはヒトチログロブリンの使用に関する場合には、それが主として意味するものは例えば英国の会社であるサイパックの如き種々の製造業者から商業的に入手できる一般的なヒトチログロブリンである。しかしながら、非常に特異的なチログロブリン画分が甲状腺自己免疫疾患の自己抗体の生成中に平均を越える程度まで含まれるかもしれないことが最近示されている(Ali H.Saboori,Noel R.Rose,Rudolf C.Kuppers,Wayne G.Butscher,Herbert S.Bresler and C.Lynne Burek,in:Clinical Immunology and Immunopathology,Vol.72,No.1,pages 121−128,1994;A.Gardas,in:Autoimmunity,1991,pages 331−336)ため、本発明はアフィニティ精製のため、およびアッセイにおける試薬としても、完全チログロブリン調製物ではなく、自己免疫疾患に関して特に重要であるヒトチログロブリン画分だけ、例えば上記の文献中で蛋白質ピーク1として表示されておりそして大きく減少したヨウ素化度を有するチログロブリンに対応する蛋白質画分、または健康な人間と比べて橋本甲状腺炎に罹っている人間において大きな割合で発生することが示されているhTgの他の画分だけを、特に使用する。そのようなチログロブリン画分を完全チログロブリン調製物の代わりに使用することにより、アッセイの選択性および/または感度並びに特異性に関して別の利点を得ることもさらに可能となる。
本発明に従うヒト抗−hTg自己抗体の測定は2つの図面および2つの測定曲線並びに2つの使用例に関して以下でさらに詳細に説明される。
図面において、
図1は、標識された形態で使用されるhTg用の、固定化された特異的結合剤として作用するアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG画分を使用する抗−hTg自己抗体測定の第一の変法における方法の原理を示しており、図2は、固定化された形態で使用されるhTg用の特異的結合剤として標識された形態で使用されるアフィニティ精製されたポリクローナルヒトIgG画分を使用する抗−hTg自己抗体測定の第二の変法における方法の原理を示しており、図3は、実施例1に従うアッセイにおける抗−hTg自己抗体の測定に関する測定値の表で共に典型的な測定曲線を示しており、そして図4は、実施例2に従うアッセイにおける抗−hTg自己抗体の測定に関する測定値の表で典型的な測定曲線を示している。
特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−hTgの使用により、特異的結合試薬として加えられるポリクローナルヒト自己抗体が患者のサンプル中で検出しようとする自己抗体と競合するような競合免疫学的アッセイを実現することが可能である。
特に、一つの変法によると特にアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態のポリクローナルヒト抗−hTg抗体が固体担体相、特に試験管の壁と、結合し、そして標識ヒトチログロブリン、例えば放射性ヨウ素処理されたヒトチログロブリンが別の試薬として使用されるような方法でこのアッセイを実施することができる(図1参照)。抗−hTg自己抗体の不存在下では、特に検出しようとする甲状腺疾患の原因であるhTg自己抗体の不存在下では、標識チログロブリンは、完全に、またはブランク対照の百分率特性値まで結合される。検出しようとするタイプの抗−hTg自己抗体が患者のサンプル中に存在する場合には、この方法で特異的結合試薬として使用される抗体と患者の血清中の抗体との間の競合が生じ、後者は固体相に対する標識チログロブリンの結合減少で現れ、それは固体/液体分離後に固体相上で見られる標識の減少をもたらす。
原理的にそれ自体既知である方法の別の原理では(図2)、抗原すなわちヒトチログロブリン(またはその画分、上記参照)を固体相の上で固定化しそして標識ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体画分の形態のトレーサーを使用するような工程を行うこともできる。この場合にも、患者のサンプル中で測定しようとする自己抗体の存在が固体相に対する標識の結合減少をもたらす。
ヨウ素放射性同位体が、本発明の実施例においてトレーサー分子用のマーカーまたは標識として常に使用されるとしても、使用する標識の性質は厳密なものではなく、他の適当な標識をトレーサー調製用に選択および使用できることは当業者には明らかである。
固体相は、それ自体は既知である微量滴定板の壁または他の粗い分散性もしくは微細な分散性の固体相であってもよく、そして適当な固体相は主として特定用途に関する実際の考察を基にして選択することができる。
以下の試験が示すように、驚くべきことに、特異的結合試薬としてポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体を使用する競合アッセイにより、ヒトの血清中の抗−hTg自己抗体の信頼性のある測定が可能になるということが見いだされた。
特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用は、多分、抗−hTg自己抗体の病原性成長に関連する可能性のある、全てのエピトープ用の結合相手が、そのようなポリクローナル特異的結合試薬のhTg分子上に存在するという利点を有するであろう。しかしながら、このことは患者の血清中のそのような抗−hTg自己抗体のいかなる発生も検出可能な効果とすることを保証しており、この効果はもちろん患者の血清中の個別の自己抗体タイプの量および/または数につれて増加する。特異的結合試薬としてモノクローナル抗体を用いると、実際にはモノクローナル抗体と抗原との間の特異的結合は、患者の血清からのある種のタイプの自己抗体により妨害されず、かくしてそのような自己抗体は検出されないという可能性は、本発明の方法では予期されない。ある種の疾患に関する典型的なセットであり、且つ抗体集団として、ある種の病理学的症状と関連するフィンガープリント分布の性質を表す自己抗体を有する患者の血清を使用することにより、そのようなフィンガープリントパターンに関するありうる最適な特異性も得られ、そして非特異的な副作用は、適当な標準化により排除することができる。
ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が使用される時には、これらの抗体または関連抗原の固定化または標識化をしても、hTgの全ての関連エピトープを全ての関連する自己抗体タイプとの結合用に利用するのに十分な可能性があるため、集団の各々の個別の抗体タイプが全体的な測定結果に対して寄与し、その臨床的関連性は増加する。
しかしながら、本発明の前提条件は、また、現在まで使用されてきたような、動物の免疫化により得られた抗体を用いるか、または対応するモノクローナル抗体を用いる代わりに、疾患に罹っているヒトドナーの血清から得られる抗体を用いて操作する際に、重大問題が実際に存在しないという驚くべき発見である。例えば、驚くべきことに、橋本甲状腺炎患者の血清中に存在する抗−hTg自己抗体の量は、相対的に少量のドナー血清でも大量のコーティング試験管の調製のために十分であるような量であることが見いだされた。それ故、約25000回の個別測定用に十分な量である5mgのアフィニティ精製された抗−hTg自己抗体は、例えば1000U/mlの抗−Tg含有量(出願人のヘニング試験(登録商標)抗−Tgで測定された)を有する10mlの患者の血清を使用して得られる。さらに、十分で比較的少数の疾患に罹っている人間のプールされた血清が使用される時には、実質的に同一の結合性質を有する非常に適切なポリクローナルヒト自己抗体が、意図する使用のために得られ、そしてバッチ毎に観察されるかもしれない相対的な変動は一般的な較正工程により容易に考慮することができる。
従って、適切な入手性および/または再現性並びに特異的結合試薬の品質の不変性に関する条件は、ポリクローナルヒト抗体を使用するアッセイでは証明されていない。先入観にも等しいそのような条件は、現在商業用アッセイにおいて特異的結合相手として何故ヒトIgG画分が使用されないかの理由、並びに患者の血清中の抗体測定用の免疫学的アッセイのための商業的試薬キット製造用の特異的結合相手としてのポリクローナルヒトIgGキット画分の使用に関する提案を文献中で見付けられないかの理由を説明できるであろう。
特に、疾患に特異的な抗体集団の「フィンガープリントパターン」を検出可能であるという、上述の検出特異性に関する上記の事項から、本発明が基づく原理が、抗−hTg自己抗体の測定用だけでなく一般的に臨床的診断における抗体測定用、および特に外部抗原に対する抗体の測定用にも適していることは明らかである。このタイプの可能な用途は、例えば、疾患に罹っている一人の患者から得たIgG画分を、患者の血液中を循環する抗体の減少に基づいて、この特異的患者の症状における改良を監視するために使用するアッセイ用の特異的結合相手として使用することである。そのような場合では、医師に、患者から得たIgG画分で、医師自身によってコーティングされる試験管以外の全ての必要な試薬を含有している試薬キットを提供することができる。医師がそのような患者に対して特異的な試験管のある種のストックを準備したら、彼はその後に患者における抗体濃度の変化およびおそらく元の抗体の消失を監視することができる。
同様に、プールされており、そして必要に応じてアフィニティ精製により濃縮されている患者の血清からのある種の抗原に対するヒト抗体を使用して、試験システムを製造することもでき、それにより一般的であるが、臨床的にみて信頼性の高い方法で、この抗原により惹起される疾患に罹っている疑いのある患者の免疫状態を測定することが可能となる。適する抗原は、自己抗原だけでなく細菌もしくはウイルス由来の病原性抗原、またはアレルゲンとして作用する抗原も挙げられる。そのような試験システムは、抗原およびこれらの抗原に対して製造される抗体のタイプに関して、非常にわずかしかわからない時にも準備することができ、その理由は、これが適切な抗体生成での免疫系の反応を反映するならば、この試験システムは、ある程度まで対応する病理学的症状の存在または不存在を直接的に示すからである。
本発明を図面に示されている抗−hTg自己抗体に対する2つのアッセイタイプに関する2つの実施例を参照しながら、以下でさらに詳細に説明する。しかしながら、ここで、本発明の原理は、抗−hTPO自己抗体の測定の場合のように、モノクローナル抗体を使用する競合免疫学的アッセイが、大多数の症例において、本質的に正確な結果を与えるような他の症例においてもその価値を有するという点に注意を払うべきである。IgG画分の形態のポリクローナルヒト抗体を使用すると、これまでのように、前もってアフィニティ精製することなしに、匹敵する正確な結果を得ることができ、さらに血清が正確に測定されずに抗体を含まないとされる非常に希な場合でも正確な結果が得られ、その血清が検出しようとする自己抗体を実際には含有していたことを示した。
実施例
物質
全ての実施例において固体相として使用される管は、スターインサートを有する75×12mmのヌンク製のマクシソープ品質の管である。
記載されている緩衝溶液は、
緩衝液A:燐酸塩で緩衝された食塩水溶液(PBS)、0.1%ツィーン20
緩衝液B:10mM TRIS HCl、10mM NaCl、pH7.8
緩衝液C:20mM燐酸ナトリウム、pH7.0
緩衝液D:25mMクエン酸
緩衝液E:0.5M燐酸ナトリウム、pH8.0
緩衝液F:20mM燐酸ナトリウム、1%ウシ血清アルブミン(BSA、シグマ)、3%の結晶化が抑制されたソルビトールシロップ(カリオンFP、メルク)、pH7.5
血清サンプル:
橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺炎およびグルーヴズ病を示す患者からの血清サンプルをドイツの種々な病院から得た。それらを試薬の調製用または試験血清として使用した。対照サンプルとして使用する血清サンプルは感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の症状のなかった人間からの血清である。
比較方法として使用されたヘニング試験(登録商標)抗−Tgに従うアッセイは商業用アッセイであり、そしてベルリンのブラームス・ダイアグノスチカGmbHからの操作指示付きの試薬キットの形態で入手できる。
ヨウ素125−標識ヒトチログロブリンは、上記の商業用のヘニング試験(登録商標)抗−Tgから採取された。
試薬の調製用の橋本甲状腺炎のある患者の血清からの抗−hTg自己抗体のアフィニティ精製
a)親和マトリックスの調製
20mgのヒトチログロブリン(サイパック、英国)を7mlの緩衝液Cの中に溶解させ、そして100mlの過ヨウ素酸ナトリウム(フルカ)を加える。15分間にわたるインキュベート後に、溶液をNAP25カラム(ファルマシア)により脱塩しそして次に10mlのカルボリンク物質(ピアース、米国)と混合する。4℃における20時間にわたるインキュベート後に、この物質を10mlガラスカラム(バイオラド)の中に入れそして緩衝液Cで洗浄する。
b)橋本患者の血清からのヒト抗−Tg自己抗体のアフィニティ精製
10人の橋本甲状腺炎患者の各々から得られた1mlの血清を混合し(出願人のHENNINGtest(登録商標)抗−Tgを用いる測定に相当する最終的な抗−hTg含有量:5000U/ml)、そして120分間にわたり親和マトリックス上で蠕動ポンプを使用して1ml/分の流速で循環させる。カラム流出流の吸収を280nmにおいて連続的に測定する。カラムを次に50mlの緩衝液Cで洗浄する。
カラムを緩衝液Dで洗浄することにより、ヒト抗−hTg自己抗体を溶出する。ヒト抗−hTg自己抗体(溶離後の量:4ml)を4mlの緩衝液Eと混合し、そしてその後の使用のために必要となるまで4℃において貯蔵する。
実施例1:放射性ヨウ素で処理したチログロブリンをトレーサーとして使用する抗−hTg自己抗体の測定(方法HD−R)
a)橋本甲状腺炎の患者からのヒト抗体を用いる試験管の調製(「HD−R管」)
ヒト抗体を結合するために、抗−ヒト−IgGでコーティングされた管を最初に調製した。この目的のためには、ヤギ−抗−ヒト−IgG(注文番号3AG474、等級2、スカンチボディーズ、米国)を緩衝液Bの中で6.7μg/mlの最終濃度になるまで希釈した。300μlのこの溶液を、ピペットで試験管(ヌンクからのマキシソープ管)に入れ、そして室温において20時間にわたりインキュベートした。次に管の内容物をデカントし、そして管に緩衝液Fを完全に充填した。2時間にわたるインキュベート後に、管の内容物をデカントし、そして管を真空中で乾燥した。調製された管(「AHI管」)を4℃において保存した。
上記の如きアフィニティ精製されたヒト抗−hTg自己抗体を、緩衝液Aで2μg/mlの蛋白質濃度になるまで希釈し、そして100μlのこの溶液を抗−ヒト−IgGでコーティングされた管(AHI管)の各々にピペットで入れ、そして2時間にわたり室温において振とうしながら(320回転/分)インキュベートした。次に、緩衝液Aの中に、1mg/mlのヒトIgGを含有する溶液を、遊離している抗−ヒト−IgG結合部位を飽和させるためにピペットで入れ、そしてインキュベートをさらに2時間にわたり振とうしながら続ける。次に、管を各回毎に2mlのPBSで2回洗浄し、そしてその後の使用のために必要となるまで4℃で貯蔵する。
b)測定の実施
工程は下記のインキュベート方式に基づく:
1. サンプルの調製のために、対照群、並びに患者および標準者のヒト血清を緩衝液Aで1+20(1部の血清、20部の緩衝液)の比で希釈する。
2. 100μlのサンプルを橋本甲状腺炎患者の抗体でコーティングされた管(HD−R管)にピペットで入れる。
3. 100μlの放射性ヨウ素処理されたヒトTg(市販のHENNINGtest(登録商標)抗−Tgアッセイの成分)をピペットで入れる。
4. 2時間にわたり、室温で振とうしながらインキュベートする。
5. 液体相を除去し、そして各回毎に2mlのPBSで2回洗浄する。
6. 管に残っている放射活性を測定する。
c)結果
上記の条件下において、サンプル中の抗−チログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたチログロブリントレーサーは、橋本甲状腺炎患者からのIgGでコーティングされている管に73%の程度まで結合される。サンプル中の抗−Tg自己抗体の量の増加により、標識チログロブリンの結合は減少する。標準者の代表的測定値および代表的な測定曲線が、図3に示されている。
予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカからの比較方法であるヘニング試験(登録商標)抗−Tg中と全く同様に、41個の対照サンプルが上記の方法で陰性であると見いだされている(表1参照)。
橋本甲状腺炎、グルーヴズ病または免疫甲状腺炎の患者からの85個の血清を本発明に従う方法および比較方法であるヘニング試験(登録商標)抗−Tgで測定した。
潜在的に抗−hTg−陽性である測定サンプルの中で、本発明に従う方法で35個のサンプルが、そして比較方法では32個が陽性であると見いだされた。28個のサンプルは、両方の方法で陽性であると見いだされた。測定結果は表2に示されている。これらの結果は、患者の血清中のチログロブリンに対する自己抗体の測定に関してポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用が適することを示している。
実施例2:患者の血清からの標識化されたアフィニティ精製されたヒト抗−hTg自己抗体を使用する抗−hTg自己抗体の測定(方法Tg−R)
a)ヒト抗−hTg自己抗体の放射性ヨウ素処理
上記の通りにしてアフィニティ精製され、そして橋本病に罹っている患者の血清50μlの量のから得られたヒト抗−hTg自己抗体10μgを、50μlのpH7.4の50mM燐酸ナトリウム緩衝液および2μlの150μCiNa125Iと混合し、そして標識化反応を、古典的なクロルアミンT方法により行い、そして5μlのH2O中の2.5μgのクロルアミンTの添加により開始した。60秒間の反応時間後に、サンプルを300μlのpH7.4の50mM燐酸ナトリウム緩衝液で希釈し、そして上記の一般的な方法でNAP−10−カラム(ファルマシア)により脱塩する。得られた標識抗体を50mM燐酸ナトリウム緩衝液、0.1%ツィーン20、0.2%BSA、pH7.4で400,000cpm/mlの最終希釈度となるまで希釈する。この物質を4℃において貯蔵する。
b)工程
測定に関しては、工程は下記のインキュベートプロトコールに基づいている:
1. サンプル調製に関しては、対照群、患者および較正からのヒト血清を緩衝液Aで1+20に希釈する。
2. 100μlのサンプルをチログロブリンでコーティングされている試験管にピペットで入れる。
3. 以上の通りにして調製された100μlの放射性ヨウ素処理されたヒト抗−hTg抗体をピペットで入れる。
4. 2時間にわたり室温で振とうしながらインキュベートする。
5. 液体相を分離し、そしてこれらの管を各回毎に2mlのPBSで2回洗浄する。
6. 管に残っている放射活性を測定する。
c)結果
上記の条件下において、サンプル中の抗−hTgチログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたヒト抗−hTg抗体は、ヒトチログロブリンでコーティングされている管(Tg−R)に32%の程度まで結合される。サンプル中の抗−hTg抗体量の増加により、標識ヒト抗−hTg抗体の結合は減少する(代表的な測定曲線は図4に示されている)。
予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカGmbHからの比較方法であるヘニング試験(登録商標)抗−Tg中と同様に、10個の対照サンプルは上記の方法で陰性であると見いだされている(表1参照)。
橋本甲状腺炎、グルーヴズ病または免疫甲状腺炎の85人の患者からの血清の測定においては、16個のサンプルが、本発明の方法により陽性であると測定された。比較方法であるヘニング試験(登録商標)抗−Tgでは、17個のサンプルが陽性であると測定された。この検定変法の14個のサンプルは比較方法であるヘニング試験(登録商標)抗−Tgと一致した(表2参照)。
患者の血清から得られ、そして患者の血清中のチログロブリンに対する、対応する自己抗体の測定のための標識化された形態で存在する、ヒト抗−hTg抗体を使用することも可能であることがこのようにして見いだされた。
Claims (8)
- チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体(抗−hTg自己抗体)の、患者の生物学的流体のサンプル中のチログロブリンに対する自己抗体(抗−hTg自己抗体)の臨床検出用免疫学的アッセイにおける、特異的結合試薬としての使用。
- ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体を、患者の血清中の抗−hTg自己抗体の発生に関連する甲状腺自己免疫疾患に罹っている個々の患者または数人の患者からの血清調製物の形態で、またはそれからアフィニティ精製により得られた抗−hTg−IgG画分の形態で、使用することを特徴とする請求の範囲第1項記載の使用。
- 免疫学的アッセイが競合アッセイであり、該アッセイでは、サンプル中に存在する被測定抗−hTg自己抗体および特異的結合試薬として使用されるポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、アッセイの別の試薬として使用されるヒトチログロブリン(hTg)の結合部位に関して競合的であり、各場合とも上記の試薬の一方が標識化され、他方が固体相に結合されており、測定しようとするサンプル中に存在する抗−hTg自己抗体の存在が、固体相に対する標識化試薬の結合の減少に基づいて検出されることを特徴とする請求の範囲第1項または第2項記載の使用。
- ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、固体担体相と結合されているアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態で使用されること、並びに試験する患者のサンプル中の抗−hTg自己抗体の存在が、それ自体、加えられた標識化ヒトチログロブリンの、固体担体相への結合の減少として現れることを特徴とする請求の範囲第1項から第3項のいずれかに記載の使用。
- 試験管の壁が固体担体相として使用され、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物が、試験管の壁に、ヒトIgGに対する非特異的結合剤によって結合されることを特徴とする請求の範囲第4項記載の使用。
- ヒトチログロブリンでコーティングされた固体担体相が、さらなる試薬として使用されるようなアッセイにおいて、ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、標識の付着でマークされているアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物の形態で使用されることを特徴とする請求の範囲第1項から第3項のいずれかに記載の使用。
- ポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体が、測定しようとする自己抗体の発生が典型的である甲状腺自己免疫疾患に罹っている異なるドナー患者の血清を組み合わせることにより、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG画分の形態で得られ、アフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物は、hTg親和マトリックスに結合し、その後に適切な緩衝液でそこから溶離することで得られることを特徴とする請求の範囲第1項から第6項のいずれかに記載の使用。
- 希釈液および/または緩衝溶液、抗−Tg標準液および抗−Tgがゼロの標準液、並びに任意に対照血清を含む一般的成分の他に、さらに2つの成分として、ヒトチログロブリンおよびアフィニティ精製された抗−hTg−IgG調製物を含有するキットであって、ヒトチログロブリンまたは抗−hTg−IgG調製物のいずれかが標識化された形態で存在しており、上記2つの成分の他方の成分が、各場合とも試験管の内表面上のコーティングとして存在していることを特徴とする、患者の血清中での抗−hTg自己抗体の免疫学的測定のための臨床診断用の試薬キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19505266A DE19505266C1 (de) | 1995-02-16 | 1995-02-16 | Verwendung von polyklonalen humanen anti-hTg-Autoantikörpern als Reagenz für die klinische Diagnostik von Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen sowie Reagenziensatz für eine Bestimmung von anti-hTg-Autoantikörpern in Patientenseren |
DE19505266.8 | 1995-02-16 | ||
PCT/EP1996/000514 WO1996025668A1 (de) | 1995-02-16 | 1996-02-07 | Verwendung von polyklonalen humanen anti-htg-autoantikörpern als reagenz für die klinische diagnostik von schilddrüsen-autoimmunerkrankungen sowie reagenziensatz für eine bestimmung von anti-htg-autoantikörpern in patientenseren |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11500529A JPH11500529A (ja) | 1999-01-12 |
JP3558645B2 true JP3558645B2 (ja) | 2004-08-25 |
Family
ID=7754171
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP52463396A Expired - Lifetime JP3558645B2 (ja) | 1995-02-16 | 1996-02-07 | 甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用及び患者血清中での抗−hTg自己抗体の検出用添加薬 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5919632A (ja) |
EP (1) | EP0809805B2 (ja) |
JP (1) | JP3558645B2 (ja) |
AT (1) | ATE180894T1 (ja) |
DE (2) | DE19505266C1 (ja) |
WO (1) | WO1996025668A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9909661D0 (en) * | 1998-06-06 | 1999-06-23 | Rsr Ltd | Assays for TSH receptor autoantibodies |
IT1305309B1 (it) * | 1999-03-31 | 2001-05-04 | Consiglio Nazionale Ricerche | Procedimento per la purificazione di anticorpi anti-tireoglobulina eusi di detti anticorpi. |
CN1322748A (zh) * | 2000-05-09 | 2001-11-21 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人甲状腺球蛋白11和编码这种多肽的多核苷酸 |
ES2732276T3 (es) * | 2001-08-23 | 2019-11-21 | Rsr Ltd | Regiones del epítopo de un receptor de tirotropina (TSH), usos del mismo y anticuerpos para el mismo |
US20040101909A1 (en) * | 2002-08-20 | 2004-05-27 | Hema-Quebec, 2535 Boul. Laurier, Ste-Foy, Quebec, Canada G1V 4M3 | Purification of polyreactive autoantibodies and uses thereof |
US20090017477A1 (en) * | 2005-12-30 | 2009-01-15 | Harri Harma | Method for determination of concentration, charge or unit size of a substance |
RU2657834C1 (ru) * | 2017-04-20 | 2018-06-15 | Станислав Анатольевич Кедик | Тест-система на основе конъюгатов "полимерная микросфера-тиреоглобулин" для экспресс-диагностики аутоиммунных заболеваний щитовидной железы |
SG10201908826UA (en) * | 2018-10-22 | 2020-05-28 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Diagnosis of blistering autoimmune diseases |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4356164A (en) * | 1979-05-21 | 1982-10-26 | Govt. of the U.S., as represented by the Secretary, Dept. of Health & Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
DE3377401D1 (de) * | 1982-05-05 | 1988-08-25 | Univ Louisiana State | Non-a, non-b hepatitis antigen |
US4472508A (en) * | 1982-12-30 | 1984-09-18 | The Beth Israel Hospital Association | Test for detecting and measuring the graves' disease-specific immunoglobulins |
US4818688A (en) * | 1986-11-21 | 1989-04-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assays for antibody to hepatitis B core antigen |
PL162445B1 (pl) * | 1990-02-01 | 1993-12-31 | Inst Chemii Przemyslowej | Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania autoprzeciwciał tyreoglobuliny w surowicy krwi |
CA2086605A1 (en) * | 1991-05-10 | 1992-11-11 | Alain De Weck | Procedure for detecting and preparing anti-ige autoantibodies and use of these antibodies as active agents in diagnostic and therapeutic compositions |
DE4120412C1 (ja) * | 1991-06-20 | 1993-01-07 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin, De | |
GB2265713A (en) * | 1992-05-16 | 1993-10-06 | R S R Limited | Assay for autoantibodies against thyroglobulin or thyroid peroxidase |
-
1995
- 1995-02-16 DE DE19505266A patent/DE19505266C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-02-07 US US08/894,332 patent/US5919632A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-07 EP EP96901792A patent/EP0809805B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-07 AT AT96901792T patent/ATE180894T1/de active
- 1996-02-07 JP JP52463396A patent/JP3558645B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-07 DE DE59602091T patent/DE59602091D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-07 WO PCT/EP1996/000514 patent/WO1996025668A1/de active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5919632A (en) | 1999-07-06 |
WO1996025668A1 (de) | 1996-08-22 |
JPH11500529A (ja) | 1999-01-12 |
EP0809805A1 (de) | 1997-12-03 |
DE59602091D1 (de) | 1999-07-08 |
EP0809805B1 (de) | 1999-06-02 |
EP0809805B2 (de) | 2003-03-26 |
DE19505266C1 (de) | 1996-10-02 |
ATE180894T1 (de) | 1999-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4469787A (en) | Immunoassay involving soluble complex of second antibody and labeled binding protein | |
EP0162914B1 (en) | Novel immunoassays and kits for use therein | |
JP5711449B2 (ja) | 膵島細胞抗原分子及び又はインスリンに反応する自己抗体の検出 | |
EP0046786A1 (en) | The solid phase anti-c3 assay for detection of immune complexes | |
JPH0340341B2 (ja) | ||
EP0019620B1 (en) | Insolubilized methylated albumin conjugates for autoimmune disease fluoroimmunoassays | |
JPH0814579B2 (ja) | 特異的結合性物質の測定法及び試薬 | |
EP0173295A1 (en) | Assay for simultaneous detection of antigen and antibody in given serum | |
KR100296198B1 (ko) | 시이엔피-비(cenp-b)에피토프 | |
JP3558645B2 (ja) | 甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−hTg自己抗体の使用及び患者血清中での抗−hTg自己抗体の検出用添加薬 | |
JP3288041B2 (ja) | 抗rna抗体の検出方法 | |
US4722890A (en) | Quantitative assay for human terminal complement cascade activation | |
Karsh et al. | Quantitative determination of rheumatoid factor by an enzyme-labeled immunoassay | |
GB2030294A (en) | Composition for determination of human beta 2-microglobulin, process for its preparation and its use | |
EP0460097A1 (en) | Method and diagnostic test kit for detection of anti-cardiolipin | |
JPH11287801A (ja) | 免疫学的測定法および免疫学的測定用キット | |
Rush et al. | Solid-phase radioimmunoassay on polystyrene beads and its application to dopamine-β-hydroxylase | |
JP2888526B2 (ja) | 抗体のサンドイッチイムノアッセイ法 | |
EP0106615B1 (en) | Assay for the free portion of substances in biological fluids | |
Costa et al. | Detection of antibodies to histones in human systemic lupus erythematosus and in murine lupus-like syndromes using micro-ELISA | |
CA1218299A (en) | Antibodies against bacterial peptidoglycans, processes for preparing them and methods of quantitively measuring them | |
WO1992018535A1 (en) | Endometrial antigen, composition, test kit and method for endometrial antibody determination | |
EP0460102A1 (en) | Method and diagnostic test kit for detection of autoimmune antibody | |
Tsugawa et al. | An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate (cGMP) in human plasma and urine using monoclonal antibody | |
EP0291479A1 (en) | Immunoassay method for the diagnosis of chlamydia infection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040420 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040519 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090528 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090528 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100528 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100528 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110528 Year of fee payment: 7 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110528 Year of fee payment: 7 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120528 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130528 Year of fee payment: 9 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |