JP5711449B2

JP5711449B2 - 膵島細胞抗原分子及び又はインスリンに反応する自己抗体の検出

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Publication number: JP5711449B2
Application number: JP2009153633A
Authority: JP
Inventors: スミス，バーナード，リース; ファーマニアック，ジャドウィガ; パウエル，マイケル
Original assignee: アールエスアールリミテッド
Priority date: 2001-11-28
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2015-04-30
Anticipated expiration: 2022-11-26
Also published as: US10481156B2; US10488410B2; ES2320427T3; US8129132B2; WO2003048772A2; US20160356771A1; GB0128583D0; US9435797B2; CN100439920C; DE60231639D1; AU2002343076A1; EP1448993B1; JP2005512056A; US20120225955A1; JP2009265109A; US20050019837A1; ATE426166T1; EP1448993A2; DK1448993T3; CN1585900A

Description

本発明は、膵島細胞抗原分子及び又はインスリンに反応する自己抗体の検出に有用な方法及びキット、例えば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、一型糖尿病）の発症又は存在を示す自己抗体の検出に有用な方法及びキットに関する。

一型糖尿病は、ヒトに影響を及ぼす非常に一般的な自己免疫疾患の一つであり、ヨーロッパ及び北アメリカでは２００万人を越える個人が、この疾患にかかっている（M A Atkinson, G S Eisenbarth. 一型糖尿病：疾患の病因及び治療に関する新たな観点, The Lancet, 2001 358: 221-229）。一型糖尿病の発生率は、世界全体で一年間に２．５％増加しており、この疾患の発生率は、２０１０年には１９９８年のものより４０％高くなると予測されている（M A Atkinson, G S Eisenbarth. 一型糖尿病：疾患の病因及び治療に関する新たな観点, The Lancet, 2001 358: 221-229）。

膵臓β細胞抗原に対する自己抗体は、広く認められた一型糖尿病の血清学的標識であり、これに含まれるのは、免疫蛍光試験（ＩＣＡ）において島細胞に反応する自己抗体と、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、特に、その６５ｋＤａアイソフォーム、ＧＡＤ₆₅）に対する自己抗体と、タンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２又はＩＣＡ５１２と呼ぶ場合がある）に対する自己抗体と、インスリンに対する自己抗体とである。ＧＡＤ₆₅自己抗体とＩＡ−２自己抗体とは、ＩＣＡ反応の構成要素である（M A Atkinson, G S Eisenbarth. 一型糖尿病：疾患の病因及び治療に関する新たな観点, The Lancet, 2001 358: 221-229）。ＧＡＤ₆₅、ＩＡ−２、及びインスリンに対する三種類の自己抗体の少なくとも一つは、血清の診断において、一型糖尿病の患者の約９０％で存在する（M A Atkinson, G S Eisenbarth. 一型糖尿病：疾患の病因及び治療に関する新たな観点, The Lancet, 2001 358: 221-229）。膵臓β細胞に対する自己免疫の血清学的標識である上記の自己抗体の測定は、糖尿病予防の試験に関与する患者をモニタする際にも有用である（M A Atkinson, G S Eisenbarth. 一型糖尿病：疾患の病因及び治療に関する新たな観点, The Lancet, 2001 358: 221-229）。

現在、ＧＡＤ₆₅自己抗体は、³⁵Ｓ、³Ｈ、又は¹²⁵Ｉにより放射性標識されたＧＡＤ₆₅を利用する免疫沈降アッセイ（ＩＰＡ）を使用して測定されている。³⁵Ｓ又は³Ｈにより標識されたＧＡＤ₆₅は、ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいて製造されてきた（C E Grubin, T Daniels, B Toivola, M Landdin-Olsson, W A Hagopian, L Li, A E Karlsen, E Boel, B Michelsen, A Lernmark. 小児期ＩＤＤＭにおけるアイソフォーム特異的グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の診断精度を決定する新しいラジオリガンド結合アッセイ, Diabetologia, 1994 37: 344-350、J S Petersen, K R Hejnaes, A Moody, A E Karlsen, M O Marshall, M Hoier-Madsen, E Boel, B K Michelsen, T Dyrberg. 単純なラジオリガンドアッセイを使用した糖尿病及びその他の自己免疫疾患におけるＧＡＤ₆₅抗体の検出, Diabetes, 1994 43: 459-467、及びA Falorni, E Ortqvist, B Persson, A Lernmark. ³⁵Ｓ又は³Ｈ組み換えヒトリガンドを使用するグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ₆₅）及びＧＡＤ₆₅自己抗体に関するラジオイムノアッセイ, Journal of Immunological Methods, 1995 186: 88-89）。天然ＧＡＤ₆₅、例えば、脳組織から分離されたラット又はブタＧＡＤ₆₅（M J Rowley, I R Mackay, Q-Y Chen, W J Knowles, P Z Zimmet. グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体は糖尿病の主要な型を識別する, Diabetes, 1992 41:548:551、及びM Ohta, H Obayashi, K Takahashi, Y Kitagawa, K Nakano, S Matsuo, M Ohishi, N itoh, K Hayashi, K Ohta. 糖尿病患者におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に関する単純な固相ラジオイムノアッセイ, J Clin Biochem Nutr, 1996 20: 139-148）、或いは、例えば、昆虫細胞、酵母、又は哺乳類細胞において発現する、組み換えヒトＧＡＤ₆₅（F Luhder, K-P Woltanski, L Mauch, H Haubruck, K-D Kohnert, I Rjasanowski, D Michaelis, M Ziegler. ラジオイムノアッセイによるグルタミン酸デカルボキシラーゼの６５−ｋＤアイソフォームに対する自己抗体の検出, European Journal of Endocrinology, 1994 130: 575-80、M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Ress Smith, J Furmaniak. Clinica Chimica Acta, 1996 256: 175-188、及びT Matsuda, M Yano, No Abiru, H Takino, S Akazawa, S Nagataki, K Yasukawa. 骨髄腫細胞における組み換えヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の発現及びＧＡＤに対する自己抗体の酵素に関連する酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）, J Biochem, 1997 121: 20-24）は、¹²⁵Ｉにより標識され、ＩＰＡにおいて使用されてきた。ＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２の組み換え融合タンパク質も、結合自己抗体試験に関して、ＩＰＡにおいて使用されてきた（A Zaialov, M Ankelo, A Westerlund-Karlsson, M Knip, J Illonen, A Hinkkanen. 糖尿病に関連するＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２に対する自己抗体の分析における新しい融合タンパク質, Journal of Immunological Methods, 2000 246: 91-96、及びM Rickert, J Seissler, W Dangel, H Lorenz, W Richter. インスリン依存型糖尿病におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼの６５−ｋＤａアイソフォーム及び島抗原−２の結合分析に関する融合タンパク質, Clinical Chemistry, 2001 47(5):926-934）。

しかしながら、³⁵Ｓ−ＧＡＤ₆₅に基づく現在利用可能なＩＰＡは、技術的な要求が厳しく、標準化が困難であり、比較的費用がかかり、キット形式に適合化されていない。ヒト組み換え¹²⁵Ｉ−ＧＡＤ₆₅に基づくアッセイは、³⁵Ｓ−ＧＡＤ₆₅に基づくアッセイと等しい感度及び特異性を有するが、優れた再現性、技術的な単純さ、低いコストという付加的な利点を示しており、キットとして容易に適合化されている。しかしながら、残念なことに、ラット又はブタ脳組織から分離された¹²⁵Ｉ−ＧＡＤ₆₅に基づくアッセイは、ＧＡＤ₆₇アイソフォームによる汚染のため、特異性が低いという難点を有する。

ＧＡＤ₆₅自己抗体は、様々なタイプのＥＬＩＳＡによっても測定されてきた（A M Gronowski, E C C Wong, T R Wilhite, D L Martin, C H Smith, C A Parvin, M Landt. ｖａｒｅｌｉｓａＥＬＩＳＡによるグルタミン酸脱炭素酵素自己抗体の検出, Clinical Chemistry, 1995 41(10): 1532-1534、及びH D Mehta, B S Vold, S Minkin, E F Ullman. ＤＥＬＩＳＡ：ＧＡＤ₆₅自己抗体のための高感度非同位体アッセイ、インスリン依存型糖尿病に関する重要な危険事前評価標識, Clinical Chemistry, 1996 42(2): 263-269）。

しかしながら、ＥＬＩＳＡによってＧＡＤ₆₅自己抗体を測定するために現在利用可能な試験は、上記のＩＰＡと比較して感度及び特異性に乏しく、能力の調査においてＩＰＡに十分に匹敵するものではない（R S Schmidli, P G Colman, E Bonifacio, Participating Laboratories. グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体に関する５２のアッセイの疾患感度及び特異性、第二回国際ＧＡＤＡｂワークショップ, Diabetes, 1995 44: 636-640）。

しかしながら、本発明は、これまで一型糖尿病の発症又は存在を示す自己抗体のスクリーニングにおいて利用される方法及びキットに関連していた問題を軽減し、膵島細胞抗原分子及び又はインスリンに反応する自己抗体の検出における一般的な適用性を有する。特に、本発明では、上記のような従来技術の手法と比較する時、改良された特異性及び感度を有する方法及びキットを利用する。

本発明では、膵島細胞抗原分子及びインスリン、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングする方法が提供され、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるステップと、
（ｃ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第二のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固定化手段を提供し、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に対して、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｇ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｄ）において形成され、（ｅ）に従って固定化された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

本発明による検体の自己抗体をスクリーニングする方法は、こうした自己抗体を高い特異性及び感度で検出する方法を提供することにおいて特に有利である。

本発明で求められるような、検体の自己抗体との反応が可能である一つ以上の抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、その融合分子は、任意の膵島細胞抗原分子及びインスリン、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いはその融合分子から選択することが可能であり、特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、及び特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ＫＤａ及び６７ＫＤａアイソフォーム、ＧＡＤ₆₅及びＧＡＤ₆₇）、タンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、及びインスリン、或いは、一つ以上のその変異体（例えば、ＩＡ−２ベータ等）、類似体、誘導体、又は断片、或いは、上の二つ以上を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。特に、本発明の好適な実施形態では、一つ以上の上記の膵島細胞抗原分子又はインスリンが利用され、これは特に、上記の膵島細胞抗原分子であり、好ましくは、一つ以上のＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、又はＩＡ−２である。また、一つ以上の上記の膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を利用することが好適な場合があり、これは特に、上記の膵島細胞抗原分子の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片であり、好ましくは、一つ以上のＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、又はＩＡ−２の変異体、類似体、誘導体、又は断片である。本発明の更なる代替の好適な実施形態では、一つ以上の融合分子を利用することが好適な場合があり、これは、上記の膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む。

したがって、本明細書で使用するＧＡＤという用語は、特にＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含め、ＧＡＤの全てのアイソフォームを包含し、本発明の特定の実施形態では、ＧＡＤ₆₅を利用することが好適な場合があり、本発明の他の実施形態では、ＧＡＤ₆₇を利用することが好適な場合があると理解されることになる。更に上記から、本発明は、その範囲内に、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇或いは一つ以上のその断片（その結合領域等）を含むことが可能な融合分子を含むことが可能であると理解されることになる。例えば、本発明の範囲内で使用される融合分子は、ＧＡＤ₆₇に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅、或いは、ＧＡＤ₆₇の一つ以上の結合領域に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅の一つ以上の結合領域を含むことができる。更に、本発明の範囲内で使用される融合分子は、ＩＡ−２ベータ或いは一つ以上のその結合領域に直接的又は間接的に融合したＩＡ−２或いは一つ以上のその結合領域を含むことができると理解されることにもなる。本発明は、更に、ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に関しても可能となる。

特に、本発明で求められるような検体の自己抗体との反応が可能な、一つ以上の抗原分子、或いはその変異体、類似体、誘導体、又は断片は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（特に、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇）及びタンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。

したがって、本発明の好適な態様において、ほぼ上で説明したようなスクリーニングの方法は、ＧＡＤ及び又はＩＡ−２、及びＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含む一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、及び又はＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用できるものに対する検体の自己抗体を検出するステップにおいて使用される。本発明において融合抗原分子が利用される場合には、適切な融合分子は、ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に直接的又は間接的に融合した、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことが可能であり、また、適切な融合分子は、ＧＡＤ₆₇に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅、或いは、ＧＡＤ₆₇の一つ以上の結合領域に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅の一つ以上の結合領域を含むことが可能であり、また、適切な融合分子は、ＩＡ−２ベータ或いは一つ以上のその結合領域に直接的又は間接的に融合したＩＡ−２或いは一つ以上のその結合領域を含むことが可能である。

好ましくは、本発明による方法は、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、インスリンと、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、本発明による方法のステップ（ｅ）による固体支持体に固定化された、抗原分子の一つ以上の第一のソース、及び、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、インスリンと、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、本発明による方法のステップ（ｆ）による標識手段が設けられた、抗原分子の一つ以上の第二のソース、を提供するステップを含む。

更に好ましくは、本発明による方法は、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるもの（例えば、ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に直接的又は間接的に融合した、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものを含む融合分子）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｅ）による固体支持体に固定化された、抗原分子の一つ以上の第一のソースと、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるもの（ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に直接的又は間接的に融合した、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものを含む融合分子等）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｆ）による標識手段が設けられた、抗原分子の第二のソースと、を提供するステップを含む。本発明による方法で、ＧＡＤに対する自己検体を検出する必要がある際には、前記方法は、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子（ＧＡＤ₆₇に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅、或いは、ＧＡＤ₆₇の一つ以上の結合領域に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅の一つ以上の結合領域で、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものを含む融合分子等）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｅ）による固体支持体に固定化された、ＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一のソース、及び、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるもの（ＧＡＤ₆₇に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅、或いは、ＧＡＤ₆₇の一つ以上の結合領域に直接的又は間接的に融合したＧＡＤ₆₅の一つ以上の結合領域で、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものを含む融合分子）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｆ）による標識手段が設けられた、ＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第二のソース、を提供するステップを含むことが好適な場合がある。また、本発明による方法で、ＩＡ−２に対する自己検体を検出する必要がある際には、前記方法は、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものと、ＩＡ−２、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるもの（ＩＡ−２ベータ或いは一つ以上のその結合領域に直接的又は間接的に融合したＩＡ−２或いは一つ以上のその結合領域等）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｅ）による固体支持体に固定化された、ＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一のソースと、ＩＡ−２と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるもの（ＩＡ−２ベータ或いは一つ以上のその結合領域に直接的又は間接的に融合したＩＡ−２或いは一つ以上のその結合領域等）とから選択され、本発明による方法のステップ（ｆ）による標識手段が設けられた、ＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第二のソースと、を提供するステップを含むことが好適な場合がある。本発明による更なる代替では、本発明による方法でＧＡＤ及びＩＡ−２の両方に対する自己免疫を検出する必要がある場合、前記方法は、（ｉ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＧＡＤ抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、ステップ（ｅ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、ステップ（ｆ）による標識手段が設けられたものと、（ｉｉ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＩＡ−２抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＩＡ−２抗原分子が、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、ステップ（ｅ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、ステップ（ｆ）による標識手段が設けられたものと、を提供するステップを含む。

したがって、本発明の好適な実施形態は、膵島細胞抗原分子或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングする方法を適切に含むことが可能であり、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるステップと、
（ｃ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固定化手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に対して、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｇ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｄ）において形成され、（ｅ）に従って固定化された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

また、本発明の好適な実施形態は、ＧＡＤ或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片のみに反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするステップを適切に含むことが可能であり、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されたＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースを提供するステップにして、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、ステップ（ｄ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、ステップ（ｅ）による標識手段が設けられるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、固定化手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｃ）において形成された複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＧＡＤ抗原分子を、ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｃ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子に対して、ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において形成され、（ｄ）に従って固定化された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

また、本発明の好適な実施形態は、ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするステップを適切に含むことが可能であり、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）ＩＡ−２と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されたＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースを提供するステップにして、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、ステップ（ｄ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、ステップ（ｅ）による標識手段が設けられるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で提供されたＩＡ−２前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記ＩＡ−２抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、固定化手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｃ）において形成された複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＩＡ−２抗原分子を、ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｃ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＩＡ−２抗原分子に対して、ステップ（ｃ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において形成され、（ｄ）に従って固定化された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

また、本発明の好適な実施形態は、ＧＡＤ及びＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にそれぞれ反応する第一及び第二の検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするステップを適切に含むことが可能であり、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＧＡＤ抗原分子の第一及び第二のソースを提供するステップにして、前記ＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、ステップ（ｅ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、ステップ（ｆ）による標識手段が設けられるステップと、
（ｃ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＩＡ−２抗原分子の第一及び第二のソースを提供するステップにして、前記ＩＡ−２抗原分子が、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、ステップ（ｅ）による固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、ステップ（ｆ）による標識手段が設けられるステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子］又は［前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固定化手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子を、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子に対して、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｇ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｄ）において形成され、（ｅ）に従って固定化された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

本発明による方法では、第一及び第二のソースの抗原分子は、ほぼ上で説明したような前記一つ以上の複合体内に存在する時、両方とも、一つ以上の共通の抗原分子を含むことが好適な場合がある。例えば、前記第一及び第二のソースの抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含むことが可能であり、また、第一及び第二のソースの抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時、ＩＡ−２を含むことが可能である。

また、第一又は第二のソースのいずれか一方の抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された抗原分子を含み、他方の抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である上記の一方の抗原分子の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことが好適な場合がある。例えば、第一又は第二のソースの抗原分子の一方が、一つ以上の複合体内に存在する時に、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含む場合、他方の抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時に、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことができる。更なる例では、第一又は第二のソースの抗原分子の一方が、一つ以上の複合体内に存在する時に、ＩＡ−２を含む場合、他方の抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時に、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるＩＡ−２の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことができる。

本発明の更なる代替実施形態では、第一及び第二のソースの両方の抗原分子が、一つ以上の複合体内に存在する時、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、共通の抗原分子の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む状態にすることができる。例えば、第一及び第二のソースの両方の抗原分子は、一つ以上の複合体内に存在する時、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことができる。更なる例では、第一及び第二のソースの両方の抗原分子が、前記一つ以上の複合体内に存在する時、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、ＩＡ−２の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む状態にすることができる。上記から理解できるように、両方の抗原分子が、本発明の方法に従って形成された複合体内に存在する時、共通の抗原分子に由来する変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む場合、こうした変異体、類似体、誘導体、又は断片は、同じもの又は異なるものにすることができる（例えば、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の異なる変異体を変異体１及び２がそれぞれ表すことが可能な場合の変異体１及び変異体２、或いは、別個の、又は重複する可能性がある、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇のエピトープ等、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の異なる断片を断片１及び２がそれぞれ表すことが可能な場合の変異体１及び変異体２）。

本発明による方法において融合分子が利用される場合には、こうした融合分子は別個の抗原分子（例えば、ＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２）を含むことができるが、本発明に従って形成された複合体において、第一及び第二のソースによってそれぞれ提供される、検体の自己抗体に関する抗原融合分子の結合領域は、共通の抗原分子に存在するか、或いはこれに由来することになると理解される。本発明による一つ以上の融合分子を利用して形成することが可能な複合体の例は、（ｉ）［ＧＡＤ−ＩＡ−２_imm］−［検体の自己抗体］−［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］を含み、ここで、抗体がＧＡＤ自己抗体を含む場合には、前記自己抗体は、［ＧＡＤ−ＩＡ−２_imm］及び［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］に存在するＧＡＤの結合領域と相互作用し、又は、抗体がＩＡ−２自己抗体を含む場合には、前記自己抗体は、［ＧＡＤ−ＩＡ−２_imm］及び［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］に存在するＩＡ−２の結合領域と相互作用し、或いは（ｉｉ）［ＧＡＤ（断片）_imm］−［検体の自己抗体］−［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］を含み、ここで、ＧＡＤ検体自己抗体は、［ＧＡＤ（断片）_imm］及び［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］に存在するＧＡＤの結合領域と相互作用し、或いは（ｉｉｉ）［ＩＡ−２（断片）_imm］−［検体の自己抗体］−［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］を含み、ここで、ＩＡ−２検体自己抗体は、［ＩＡ−２（断片）_imm］及び［ＧＡＤ−ＩＡ−２_label］に存在するＩＡ−２の結合領域と相互作用し、ここでＧＡＤはＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を表すことが可能である。

検出可能な標識手段は、酵素標識と、同位体標識と、化学発光標識と、蛍光標識と、色素と、その他とで構成されるグループから適切に選択することが可能であり、通常は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチン、又はその他で構成されるグループから選択することが可能であり、特に、ビオチンを含むことができる。モニタリングには、こうした検出可能な標識手段の（ほぼ上で説明したような一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子に取り付けた時の）それに関する一つ以上の基質との反応（アビジン又はストレプトアビジン接合体、例えば、ストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体又はその他等）を関与させることが可能であり、これにより、結果として生じた接合体は、光学濃度又はその他の測定値によって、適切に検出することができる。

検出可能な標識手段は、ほぼ上で説明したような、一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子に、直接的に提供することができる。追加又は代替として、検出可能な標識手段は、ほぼ上で説明したような、一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子に、間接的に提供することが可能であり、これは通常、ほぼ上で説明したような、一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子と結合することが可能な一つ以上の抗体又はその他の結合剤に、検出可能な標識手段を提供することで行われる。

本発明による自己抗体に関するスクリーニングの方法は、通常、（ｉ）被検体からの体液試料内に存在するこうした自己抗体と、（ｉｉ）本発明によって提供される、ほぼ上で説明したような、一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子との反応を直接的にモニタするステップを含み、これは通常、この技術において知られている非競合的なサンドイッチ型のアッセイ手法を利用することで行われる。

本発明の好適な実施形態によれば、ほぼ上で説明したような、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子は、固体支持体に固定化され、ほぼ上で説明したような、一つ以上の第二のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子には、検出可能な標識手段が設けられ、これにおいて、好ましくは、一つ以上の第二のソースの抗原分子は、既知のＥＬＩＳＡ手法での使用において従来通りである溶液相で提供される。

好ましくは、本発明による方法において、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものは、スクリーニングされる体液試料に接触する前に、固体支持体に固定化される。こうした固定化された、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものは、その後、一つ以上の第二のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものと体液試料との接触と同時に、或いは連続して、スクリーニング中の体液試料と接触させる。特に好ましくは、固定化された、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものは、抗原分子が固体支持体に固定化された［抗原分子］−［検体の自己抗体］を含む中間複合体が形成できるようにスクリーニング中の体液試料に接触させ、こうして形成された固定化中間複合体は、その後、溶液相において存在する、一つ以上の第二のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものと接触させ、第一のソースの抗原分子を介して固定支持体に固定化された［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む、これまでに説明した複合体が形成できるようにする。

したがって、本発明は、膵島細胞抗原分子及びインスリン、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、
（ａ）前記被検体からの前記体液試料を提供するステップと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択され、前記一つ以上の第一のソースの抗原分子が、固体支持体に固定化されるステップと、
（ｃ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第二のソースを提供するステップにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択され、前記一つ以上の第二のソースの抗原分子が、溶液相において提供されるステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させるステップにして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の固定化された複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来し、これにおいて、前記複合体が、前記第一のソースの前記抗原分子を介して、固体支持体に固定化されるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供するステップにして、これにより、ステップ（ｄ）において形成された複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に対して、ステップ（ｄ）の前に、又は同時に、又は後に、こうした直接的又は間接的に検出可能な標識手段を設けるステップと、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｄ）において形成された複合体の存在を検出するステップと、を含む。

本発明で求められるような、検体の自己抗体との反応が可能である一つ以上の抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、その融合分子は、任意の膵島細胞抗原分子及びインスリン、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いはその融合分子から選択することが可能であり、特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、及び特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ＫＤａ及び６７ＫＤａアイソフォーム、ＧＡＤ₆₅及びＧＡＤ₆₇）、タンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、及びインスリン、或いは、一つ以上のその変異体（例えば、ＩＡ−２ベータ等）、類似体、誘導体、又は断片、或いは、上の二つ以上を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。特に、本発明で求められるような、検体の自己抗体と反応が可能である一つ以上の抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、及び特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ＫＤａ及び６７ＫＤａアイソフォーム、ＧＡＤ₆₅及びＧＡＤ₆₇）、及びタンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、或いは、一つ以上のその変異体（例えば、ＩＡ−２ベータ等）、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。

しかしながら、その他の接触手法が可能であり、例えば、本発明によれば、一つ以上の第一の抗原ソースの抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子を、上記のような接触ステップの前に、最初に固定化するのではなく、ほぼ上で説明したような固体支持体を、一つ以上の第一の抗原ソースの抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子に関するバインダに最初に接触させ、その後、このように処理された固体支持体を、一つ以上の第一及び第二のソースの上記抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子と、スクリーニング中の体液試料とに接触させることが可能である。

本発明で利用される固体支持体と条件とに関して、この支持体と条件とは、一般に、既知のイムノアッセイ手法において利用される支持体及び条件と基本的には相違しない。本発明に従って使用する固体支持体は、既知のＥＬＩＳＡ手法で現在利用されるようなＥＬＩＳＡプレートを備えることが可能であり、或いは、チューブ、粒子、磁気ビーズ、ニトロセルロース、又はその他といった、本発明での使用に適した他の任意の支持体を利用してもよい。

本発明では、膵島細胞抗原分子及びインスリン、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットが提供され、前記キットは、
（ａ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるものと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第二のソースにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるものと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来するものと、
（ｄ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を、前記第一のソースの抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化する手段と、
（ｅ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に、前記第二のソースの前記抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において定められ、（ｄ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備える。

本発明による検体の自己抗体をスクリーニングするキットは、こうした自己抗体の特異性及び感度の高い検出を可能にすることにおいて特に有利である。

本発明で求められるような、検体の自己抗体との反応が可能である一つ以上の抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、その融合分子は、任意の膵島細胞抗原分子及びインスリン、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いはその融合分子から選択することが可能であり、特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、及び特に、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ＫＤａ及び６７ＫＤａアイソフォーム、ＧＡＤ₆₅及びＧＡＤ₆₇）、タンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、及びインスリン、或いは、一つ以上のその変異体（例えば、ＩＡ−２ベータ等）、類似体、誘導体、又は断片、或いは、上の二つ以上を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。特に、本発明で求められるような検体の自己抗体との反応が可能な、一つ以上の抗原分子、或いはその変異体、類似体、誘導体、又は断片は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（特に、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇）及びタンパク質チロシンホスファターゼ状島細胞抗原（ＩＡ−２）、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものによって構成されるグループから適切に選択することができる。本発明によるキットにおいて使用される抗原分子及び適切な融合分子の様々な実施形態は、本発明による方法を参照してほぼ上で更に詳細に説明した通りである。

したがって、本発明の好適な態様において、ほぼ上で説明したようなスクリーニング用キットは、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇及び又はＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、及び又はＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む一つ以上の抗原分子とに対する検体の自己抗体を検出するステップにおいて使用される。本発明によるキットにおいて融合抗原分子が利用される場合には、適切な融合分子は、本発明による方法を参照してほぼ上で更に詳細に説明したような、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含むことができる。

好ましくは、本発明によるキットは、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、インスリンと、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化された、抗原分子の一つ以上の第一のソース、及び、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、インスリンと、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられた、抗原分子の一つ以上の第二のソース、を備える。

更に好ましくは、本発明によるキットは、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化された、抗原分子の一つ以上の第一のソース、及び、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられた、一つ以上の抗原分子の第二のソース、を備える。本発明によるキットは、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化された、ＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一のソース、及び、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものとから選択され、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられた、ＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第二のソース、を備えることが好適な場合がある。また、本発明によるキットは、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものと、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、（ｅ）において定められるような固体支持体に固定化された、ＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一のソース、及び、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものと、ＩＡ−２、及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、（e）において定められるような標識手段が設けられた、ＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第二のソース、を備えることが好適な場合がある。本発明による更なる代替では、本発明によるキットは、（ｉ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＧＡＤ抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられたものと、（ｉｉ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＩＡ−２抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＩＡ−２抗原分子が、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられたものと、を備える。

したがって、本発明の好適な実施形態は、膵島細胞抗原分子或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットを適切に含むことが可能であり、前記キットは、
（ａ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースにして、前記抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるものと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースにして、前記抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されるものと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来するものと、
（ｄ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を、前記第一のソースの抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化する手段と、
（ｅ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に、前記第二のソースの前記抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において定められ、（ｄ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備える。

また、本発明の好適な実施形態は、ＧＡＤ或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片のみに反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットを適切に含むことが可能であり、前記キットは、
（ａ）ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されたＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、（ｃ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、（ｄ）において定められるような標識手段が設けられるものと、
（ｂ）（ａ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるものと、
（ｃ）（ｂ）において定められるような複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＧＡＤ抗原分子を、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化する手段と、
（ｄ）（ｂ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子に、前記第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｅ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｂ）において定められ、（ｃ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備える。

また、本発明の好適な実施形態は、ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に反応する検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットを適切に含むことが可能であり、前記キットは、
（ａ）ＩＡ−２と、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択されたＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、（ｃ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、（ｄ）において定められるような標識手段が設けられるものと、
（ｂ）（ａ）で提供された前記ＩＡ−２抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記ＩＡ−２抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるものと、
（ｃ）（ｂ）において定められるような複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＩＡ−２抗原分子を、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化する手段と、
（ｄ）（ｂ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＩＡ−２抗原分子に、前記第二のソースの前記ＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｅ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｂ）において定められ、（ｃ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備える。

また、本発明の好適な実施形態は、ＧＡＤ及びＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片にそれぞれ反応する第一及び第二の検体の自己免疫に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットを適切に含むことが可能であり、前記キットは、
（ａ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＧＡＤ抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ₆₅と、ＧＡＤ₆₇と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、ＩＡ−２、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられるものと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互反応可能なＩＡ−２抗原分子の第一及び第二のソースにして、前記ＩＡ−２抗原分子が、ＩＡ−２と、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片と、ＩＡ−２、ＧＡＤ₆₅、ＧＡＤ₆₇、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子とから選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つが、ＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片を含み、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、（ｄ）において定められるような固体支持体に固定化され、前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、（ｅ）において定められるような標識手段が設けられるものと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子］又は［前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子］を含む一つ以上の複合体を形成可能となるものと、
（ｄ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子を、前記第一のソースのＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、固体支持体に固定化する手段と、
（ｅ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子に、前記第二のソースの前記ＧＡＤ又はＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において定められ、（ｄ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備える。

本発明によるキットでは、第一及び第二のソースの抗原分子は、一つ以上の共通の抗原分子を含むことが好適な場合がある。例えば、前記第一及び第二のソースの抗原分子は、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含むことが可能であり、また、第一及び第二のソースの抗原分子は、両方ともＩＡ−２を含むことが可能である。

また、第一又は第二のソースのいずれかの抗原分子は、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択され、他方のソースの抗原分子は、第一又は第二のソースのいずれかの上記抗原分子の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片にして、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるものを含むことが好適な場合がある。
例えば、第一又は第二のソースのいずれかの抗原分子が、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇を含む場合、他方のソースの抗原分子は、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む。更なる例では、第一又は第二のソースのいずれかの抗原分子が、ＩＡ−２を含む場合、他方のソースの抗原分子は、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるＩＡ−２の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む。

本発明の更なる代替実施形態では、第一及び第二のソースの両方の抗原分子が、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、共通の抗原分子の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む状態にすることができる。例えば、第一及び第二のソース両方の抗原分子は、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含むことができる。更なる例では、第一及び第二のソース両方の抗原分子が、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、ＩＡ−２の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む状態にすることができる。上記から理解できるように、第一及び第二のソースの抗原分子が、共通の抗原分子に由来する変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む場合、それぞれのソースによって提供されるこうした変異体、類似体、誘導体、又は断片は、同じもの又は異なるものにすることができる（例えば、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の異なる変異体を変異体１及び２がそれぞれ表すことが可能な場合、抗原分子の第一のソースによって提供される変異体１及び抗原分子の第二のソースによって提供される変異体２、或いは、別個の、又は重複する可能性がある、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇のエピトープ等、ＧＡＤ₆₅又はＧＡＤ₆₇の異なる断片を断片１及び２がそれぞれ表すことが可能な場合、抗原分子の第一のソースによって提供される変異体１及び抗原分子の第二のソースによって提供される変異体２）。

検出可能な標識手段は、酵素標識と、同位体標識と、化学発光標識と、蛍光標識と、色素と、その他とで構成されるグループから適切に選択することが可能であり、通常は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ビオチン、又はその他で構成されるグループから選択することが可能であり、特に、ビオチンを含むことができる。こうした検出可能な標識手段は（ほぼ上で説明したような一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子に取り付けた時）、それに関する一つ以上の基質と適切に反応させることが可能であり（アビジン又はストレプトアビジン接合体、例えば、ストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体又はその他等）、これにより、結果として生じた接合体は、光学濃度又はその他の測定値によって、適切に検出することができる。

本発明による自己抗体に関するスクリーニング用キットは、通常、（ｉ）被検体からの体液試料内に存在するこうした自己抗体と、（ｉｉ）本発明によって提供される、ほぼ上で説明したような、一つ以上の抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子との反応を直接的にモニタする手段を更に備え、これは通常、この技術において知られている非競合的なサンドイッチ型のアッセイ手法を利用することで行われる。

好ましくは、本発明によるキットは、固定化手段を備え、これにより、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものは、スクリーニングされる体液試料に接触する前に、固体支持体に固定化される。本発明によるキットは、接触手段を適切に備え、これにより、このように固定化された、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものは、一つ以上の第二のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものと体液試料との接触と同時に、或いは連続して、スクリーニング中の体液試料と接触させることができる。

特に好ましくは、接触手段が提供され、これにより、固定化された、一つ以上の第一のソースの抗原分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものを、抗原分子が固体支持体に固定化された［抗原分子］−［検体の自己抗体］を含む中間複合体が形成できるようにスクリーニング中の体液試料に接触させ、こうして形成された固定化中間複合体は、その後、溶液相において存在する、一つ以上の第二のソースの分子、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは一つ以上のその融合分子にして、検体の自己抗体が前記体液試料に存在する時に相互作用可能であるものと接触させ、前記第一のソースの抗原分子を介して固定支持体に固定化された［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む、これまでに説明した複合体を形成できるようにする。

したがって、本発明は、膵島細胞抗原分子及びインスリン、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットを提供し、前記キットは、
（ａ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第一のソースにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択され、これにおいて、前記一つ以上の第一のソースの前記抗原分子が、固体支持体に固定化されるものと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の一つ以上の第二のソースにして、前記抗原分子が、膵島細胞抗原分子と、インスリンと、前記膵島細胞抗原分子又はインスリンの一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片と、膵島細胞抗原分子、インスリン、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子と、から選択され、前記一つ以上の第二のソースの抗原分子が溶液相において提供され、これに対して（ｄ）において定められるような標識手段が設けられるものと、
（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、同時又は連続的に接触させる手段にして、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む一つ以上の固定化された複合体を形成可能となり、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、これにおいて、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来し、前記固定化複合体が、前記複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を介して、固体支持体に固定化されるものと、
（ｄ）（ｃ）において定められるような複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に、前記第二のソースの前記抗原分子とスクリーニング中の前記体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｅ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において定められるような複合体の存在を検出する手段と、を備える。

しかしながら、本発明によるキットには、その他の接触手段が存在してもよく、例えば、本発明によれば、一つ以上の第一の抗原ソースの抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子を、上記のような接触ステップの前に、最初に固定化する手段を提供するのではなく、ほぼ上で説明したような固体支持体を、一つ以上の第一の抗原ソースの抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子に関するバインダに最初に接触させる手段を提供し、その後、このように処理された固体支持体を、一つ以上の第一及び第二のソースの上記抗原分子、或いは、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、或いは、一つ以上のその融合分子と、スクリーニング中の体液試料とに接触させる手段をキットが備えるようにすることが可能である。

本発明によるキットにおいて利用される固体支持体と条件とに関して、この支持体と条件とは、一般に、既知のイムノアッセイ手法において利用される支持体及び条件と基本的には相違しない。本発明によるキットにおいて使用する固体支持体は、既知のＥＬＩＳＡ手法で現在利用されるようなＥＬＩＳＡプレートを備えることが可能であり、或いは、チューブ、粒子、磁気ビーズ、ニトロセルロース、又はその他といった、本発明での使用に適した他の任意の支持体を利用してもよい。

本発明によって提供される方法による、或いは、本発明によって提供されるキットを利用することによる、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する検体の自己抗原の検出は、こうした検体の自己抗体の存在に関連する多数の疾病状態の診断に有用である場合がある。特に、本発明は、以下の疾病状態のいずれか−一型糖尿病及び又はスティフマン症候群、二型糖尿病、一つ以上の自己免疫性甲状腺疾患、セリアック病、一つ以上の結合組織病、副腎自己免疫、或いは二種類以上の自己免疫疾患の組み合わせ−を患っていることが疑われる、その影響を受けやすい、或いは有している、動物被検体からの体液試料をスクリーニングするステップにおいて利用可能であり、本発明は、更に、動物被検体における上記疾病状態のいずれかを診断する方法を提供する。

これまでの説明から理解できるように、本発明は、動物被検体から取得した体液試料において、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応し、上記の疾病状態の発症又は存在を示す、検体の自己抗体を検出するアッセイ方法及びキットを提供する。体液試料におけるこうした自己抗体（又は、少なくとも、試料におけるこうした自己抗体のレベル）の検出は、試料を取得した被検体における、こうした疾病状態の発症又は存在の可能性を示し、したがって、こうした疾病状態の発症又は存在の可能性の診断を可能にすることができる。

したがって、本発明では、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する自己抗体の存在に関連する疾病状態の発症又は存在の可能性を、こうした疾病状態を有することが疑われる、或いはこうした疾病状態の影響を受けやすい動物被検体（特に、ヒト被検体）において診断する方法が更に提供され、前記方法は、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応し、こうした疾病状態の発症又は存在の可能性を示す自己抗体を、ほぼ上で説明したような被検体からの体液試料において検出するステップを含み、これにより、検出された自己抗体は、こうした疾病状態の発症又は存在の可能性の診断を提供することができる。

したがって、本発明では、動物被検体（特に、ヒト被検体）において膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する自己抗体の存在に関連する疾病状態の発症を遅延させる、又は予防する方法、或いは、こうした疾病状態を有する、又はこうした疾病状態から回復している動物被検体（特に、ヒト被検体）を治療する方法が更に提供され、前記方法は、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応し、こうした疾病状態の発症又は存在を示す自己抗体を、ほぼ上で説明したような被検体からの体液試料において最初に検出し、これにより、被検体におけるこうした疾病状態の発症又は存在の可能性の診断を提供するステップと、前記被検体に対して、こうした疾病状態の発症を遅らせること、こうした疾病状態を未然に防ぐこと、予防すること、及び又は治療することにおいて有効な少なくとも一つの治療的に有効な量の治療剤を投与するステップとを含む。

したがって、本発明では、動物被検体（特に、ヒト被検体）において膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する自己抗体の存在に関連する疾病状態の発症を遅延させる又は予防することの有効性を評価する方法、或いは、こうした疾病状態を有する、又はこうした疾病状態から回復している動物被検体（特に、ヒト被検体）を治療することの有効性を評価する方法が提供され、前記方法は、被検体に対して、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する自己抗体の存在に関連する、こうした疾病状態の発症を遅らせること、こうした疾病状態を未然に防ぐこと、予防すること、及び又は治療することにおいて有効な少なくとも一つの治療的に有効な量の治療剤を投与するステップと、被検体から取得した体液試料において、こうした疾病状態の発症又は存在を示す自己抗体を検出し、前記試料内での前記自己抗体の存在の表示を提供できるようにし、これにより、被検体を治療すること或いは被検体におけるこうした疾病状態の発症を遅延させること又は予防することの有効性の表示を提供するステップとを含む。

本発明では、ほぼ上で説明したようなキットが、膵島細胞抗原分子及びインスリンから選択された一つ以上の抗原分子に反応する自己抗体の存在に関連する疾病状態の治療において有効な少なくとも一つの治療的に有効な量の治療剤と組み合わせて、更に提供される。

本発明によってスクリーニングされる体液の試料は、通常、血液試料、或いは、特に血清試料又は血漿試料といった、その他の流体の血液部分であるが、前記試料は、原則的には、唾液又は尿又は可溶性組織抽出物といった、別の生物学的流体にすることができる。

「抗原」又は「抗原分子」という用語は、本明細書での使用において、本明細書で説明する抗体が相互作用可能であり、抗体と結合して特定の抗体抗原複合体を形成できる化合物を意味する。抗原又は抗原分子は、天然又は合成物質にすることが可能であり、これに対する修飾は、好ましくは、特定の抗体に対する結合特性に悪影響を及ぼさないようなものとする。

前記のように、本発明は、本明細書で説明するように抗原分子の「変異体」、「類似体」、「誘導体」、及び「断片」の使用をカバーしており、「変異体」、「類似体」、「誘導体」、及び「断片」という用語は、本明細書での使用において、特に特定の抗体に関する結合特性について、基本的に自然発生抗原分子と同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドとして特徴付けることができる。適切な場合、変異体、類似体、誘導体、及び断片と、本明細書で説明したような変異体、類似体、及び誘導体とは、アミノ酸の一次構造の配座を有し、この中では、自然発生抗原分子のいくつか又は少数（５乃至１０、１乃至５、又は１乃至３等）のアミノ酸残基が、任意の組み合わせで、置換、削除、又は付加される。この中で特に好適なものは、自然発生抗原分子の生物活性又は機能を変更しない、或いは大幅に変更しない、サイレント置換、付加、及び欠失である。下で更に詳細に説明するように、同類置換が好適となる場合がある。

更に詳しくは、本発明による使用に適した抗原分子の変異体、類似体、又は誘導体は、一つ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）によって置換されたもの、或いは、一つ以上のアミノ酸残基が置換基又はその他を含むものにすることができる。こうした変異体、類似体、及び誘導体は、本明細書の教示内容から当業者の範囲内にあると考えられる。

最も代表的なものとして、変異体、類似体、又は誘導体は、同類アミノ酸置換によって基準（本明細書で自然発生抗原分子と呼ばれるもの等）から変化したものである。こうした置換は、ポリペプチド内の一定のアミノ酸を、同様の性質の別のアミノ酸により置換するものである。通常、同類置換と考えられるものは、脂肪族アミノ酸Ａ、Ｖ、Ｌ、及びＩ間と、水酸残基Ｓ及びＴ間と、酸性残基Ｄ及びＥ間と、アミド残基Ｎ及びＱ間と、塩基残基Ｋ及びＲ間と、芳香族残基Ｆ及びＹ間とにおける、一対一の交換である。

更に詳しくは、「断片」という用語は、本明細書で使用において、本明細書で自然発生アミノ酸と呼ばれるもの及びその変異体又は誘導体のアミノ酸配列と、全てではなく一部が
完全に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、こうした断片は、「自立状態」、即ち、他のアミノ酸又はポリペプチドの一部ではない又はこれらに融合していない状態にすることが可能であり、或いは、より大きなポリペプチド内に含まれ、その一部又は領域を形成することが可能である。本発明のコンテクストにおいて、本発明による使用に特に好適な断片は、本明細書で抗原分子と呼ばれるものの一つ以上のエピトープにすることが可能であり、上記のように、こうしたエピトープ断片は、「自立状態」の形態で使用することが可能であり、或いは、これらが一部又は領域を形成する、足場ポリペプチド等のより大きなポリペプチド内で使用することができる。本発明による、ほぼ分離状態又は自立状態の形態にあるこうしたエピトープ断片の使用は、全長の抗原の使用と比較した時にほぼ分離状態又は自立状態のエピトープ断片で安定性が向上する点において、及び又は、全長の抗原の使用と比較して、ほぼ分離状態又は自立状態のエピトープ断片の使用には特異性の向上が伴う点において、有利となる場合がある。

図１ａは、ＯＤ４５０ｎｍで得られたＧＡＤ₆₅の代表的なキャリブレーション曲線を示す。図１ｂは、測定可能となったＯＤ４０５ｎｍのキャリブレーション曲線を示す。

次に、本発明について、本発明の範囲をいかなる形でも制限しない以下の例により、更に例示する。

実施例
ＧＡＤ₆₅コーティングＥＬＩＳＡプレートの調製
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Ress Smith, J Furmaniak. Clinica Chemica Acta, 1996 256: 175-188）での評価において純度９５％を越えるヒト組み換えＧＡＤ₆₅を、１．５９ｇ／ＬのＮａ₂ＣＯ₃と、２．９４ｇ／ＬのＮａＨＣＯ₃と、０．１ｇ／ＬのＮａＮ₃と、０．０１ｇ／Ｌのフェノールレッドと、５ｍｇ／ＬのＢＳＡ（ｐＨ９．２）を含むコーティング緩衝液において１５０μｇ／Ｌに希釈し、結果として生じた溶液１５０μＬを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮｕｎｃＦ８ＭａｘｉＳｏｒｐの商標で入手）に加えた。次に、このプレートを、４℃で一晩培養し、ウェルの中身を吸引し、１０ｇ／ＬのＢＳＡと、１ｇ／ＬのＮａＮ₃と、１１．６９ｇ／ＬのＮａＣｌと、１８．１７ｇ／Ｌのトリスと、１０ｍＬ／Ｌのポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０の商標で入手可能（ｐＨ８．３））とを含む高濃度塩緩衝液（ＨＳＢ）により三度洗浄した。３ｇ／ＬのＢＳＡと、９ｇ／ＬのＮａＣｌと、２０ｇ／Ｌのスクロースと、０．２ｇ／ＬのＮａＮ₃とを含むポストコート緩衝液を、ウェルに追加し（ウェル当たり２５０μＬ）、室温で３０分間培養した。その後、このポストコート緩衝液を吸引し、プレートを真空化で乾燥させ、シリカゲルと共に密封バッグ内において４℃で使用まで保管した。

ビオチンによるＧＡＤ₆₅の標識
ＰＢＳ（１．１５ｇ／ＬのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．２ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、８ｇ／ＬのＮａＣｌ）内のヒト組み換えＧＡＤ₆₅を、市販のビオチン化試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋの商標でＰｅｒｂｉｏＳｃｉｅｎｃｅから入手可能なスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン）と、２４パートのビオチン化試薬に対して１パートのＧＡＤ₆₅のモル比で、３０分間室温で反応させた。この反応は、４℃でのＰＢＳに対する透析により停止させ、結果的に生じた物質を、−７０℃で、少量のアリコートで保管した。

上の手法により結果的に生じたビオチン標識ＧＡＤ₆₅（ＧＡＤ₆₅−Ｂｉ）を、２０ｇ／ＬのＢＳＡにおいて、３ｍｇ／Ｌまで希釈し、０．２２μｍフィルタにより濾過し、バイアル当たり１ｍＬのアリコートとし、フリーズドライ後、−２０℃で保管した。使用のためには、７．５ｍＬのＨＳＢをバイアルに追加し、ＧＡＤ₆₅−Ｂｉの最終濃度を４００μｇ／Ｌとした。

ＧＡＤ₆₅自己抗体アッセイ用のキャリブレータの調製
ＧＡＤ₆₅に対する三つのヒト単クローン抗体のＩｇＧ調製物（M J Powell, N Hayakawa, M Masuda, J Sanders, M Evans, LDKE Premawardhana, J Furmaniak, B Rees Smith. 臨床的糖尿病のない患者からのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ₆₅）に対する三つのヒト単クローン抗体の分離及び特徴付け. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2001 17(S1): 021）を、ＨＳＢにおいて希釈し、ＯＤ４５０ｎｍでの吸光度を４．０乃至０．１とした。これらの単クローン抗体は、一型糖尿病の患者からの血清において確認されるＧＡＤ₆₅自己抗体を代表するものとして知られている（M J Powell, N Hayakawa, M Masuda, J Sanders, M Evans, LDKE Premawardhana, J Furmaniak, B Rees Smith. 臨床的糖尿病のない患者からのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ₆₅）に対する三つのヒト単クローン抗体の分離及び特徴付け. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2001 17(S1): 021）。

ＧＡＤ₆₅自己抗体の検出
上の手法に従って調製したＧＡＤ₆₅によりコーティングされたプレートを室温にし、テストドナーから取得した２５μＬの未希釈血清試料、或いは上の手法に従って調製されたキャリブレータを、二つのプレートウェルを一組として追加し、２００ｒｐｍで振盪しながら室温で一時間培養した。次に、この試料を吸引し、ウェルをバッファ（８．７ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．４ｇ／Ｌのトリス、０．５ｍＬ／ＬのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）により三度洗浄し、その後、上の手法に従って調製したＨＳＢ（４００μｇ）において希釈したＧＡＤ₆₅−Ｂｉを１００μＬ追加し、２００ｒｐｍで振盪しながら室温で一時間培養した。培養後、ウェルの中身を吸引し、ウェルをバッファ（８．７ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．４ｇ／Ｌのトリス、０．５ｍＬ／ＬのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）により三度洗浄した。その後、１μｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体１００μＬを追加し、２００ｒｐｍで振盪しながら室温で２０分間培養した。吸引後、ウェルをバッファ（８．７ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．４ｇ／Ｌのトリス、０．５ｍＬ／ＬのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）により一度洗浄した。次に、１００μＬのテトラメチルベンジジンを追加し、暗所で２０分間培養し、その後、０．５ｍｏｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄を５０μＬ追加した。次に、ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダにおいて４５０ｎｍで測定し、或いは、ＯＤ４５０ｎｍ＞４．０となる試料の場合は、更に４０５ｎｍで吸光度を測定した。

上の手順は、ＩＡ−２自己抗体と、ＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２自己抗体の結合検出とにも適用した（特に、ビオチンにより標識したＩＡ−２であるＩＡ−２−Ｂｉの調製を伴う）。キャリブレーション曲線の生成に関するＩＡ−２の基準調製物は、多クローンＩＡ−２自己抗体から調製した。

結果
ＯＤ４５０ｎｍで得られたＧＡＤ₆₅の代表的なキャリブレーション曲線は、図１ａに表示されている。０ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ乃至５１２ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬで任意に割り当てたＧＡＤ₆₅自己抗体ＥＬＩＳＡ単位の七つのキャリブレータを含めた。これらのキャリブレータのＯＤ４５０ｎｍ値は、キャリブレータ０、１．０、２．０、８．０、３２、１２８、及び５１２に関して、それぞれ、０．０３３、０．１６８、０．３１０、１．０２０、３．１８７、＞４．０、及び＞４．０となった。ＯＤ４０５ｎｍ値は、図１ｂに示すように、キャリブレータ０、１．０、２．０、８．０、３２、１２８、及び５１２に関して、それぞれ、０．００８、０．０４８、０．０９０、０．２９０、０．９２９、１．３８５、及び１．６２０となった。結果として、ＯＤ４５０ｎｍ値が４．０より大きくなる試料は、図１ｂに示すように、ＯＤ４０５ｎｍのキャリブレーション曲線の範囲内で測定可能となった。健康な血液ドナーからのｎ＝２５の血清に関して、４５０ｎｍでの吸光度の平均値±標準偏差は、０．０４±０．０１５となった。

本発明によるＧＡＤ₆₅自己抗体測定の結果は、表１及び２に表示されている。一型糖尿病であるｎ＝１８の患者と、グレーブス病であるｎ＝１４の患者とからの血清におけるＧＡＤ₆₅自己抗体の結果は、表１に表示されている。本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法を利用した時、１８の糖尿病血清は全てＧＡＤ₆₅自己抗体に関して陽性だったが（１．０ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬを超えるレベル）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）では、これらの患者のうち１３のみが陽性となった。ＲＩＡにおいて陰性となった五つの試料は、ＯＤ４５０ｎｍでの本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法において、０．１１７乃至０．９８０（１．３乃至１０．７ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）の低レベルのＧＡＤ₆₅自己抗体を示した。ＲＩＡにおいて低レベルの試料（１．０乃至７．５ＲＩＡ単位／ｍＬ）の場合、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法におけるＯＤ４５０ｎｍ値は、０．２９０乃至１．０６０（１２．０乃至１０５．８ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）となった。ＲＩＡにおいて高レベルのＧＡＤ₆₅自己抗体（２６．８乃至１１８．８ＲＩＡ単位／ｍＬ）を伴う試料の場合、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法におけるＯＤ４５０ｎｍ値は、非常に高く、＞４．０（＞１２８ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）となったため、この試料におけるＧＡＤ₆₅自己抗体レベルとキャリブレーション曲線との間の関係は、４０５ｎｍでの測定後に計算された。ＥＬＩＳＡを実行する前の非標識ＧＡＤ₆₅（最終濃度０．０００５乃至０．０１μｇ／ｍＬ）を伴う試験血清の前保温では、ＯＤ４５０ｎｍ値での用量依存性の減少が生じた。こうした実験では、本発明によるＧＡＤ₆₅自己抗体ＥＬＩＳＡに基づく手法の特異性が確認された。

グレーブス病であるの患者からのｎ＝１４の血清の場合は、全試料のＯＤ４５０ｎｍ値が、０．０５を下回り（本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法において＜１ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）、これらの全試料は、ＲＩＡにおいて、ＧＡＤ₆₅自己抗体に関して陰性となった（＜１ＲＩＡ単位／ｍＬ）。

本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法とＲＩＡとにおけるＧＡＤ₆₅自己抗体の最低検出限界の比較は、表２に表示されている。島細胞自己抗体に関するＷＨＯ基準調製物［ＮＩＢＳＣ９７／５５０］のＲＩＡ希釈では、２５０乃至３１．２５ＷＨＯ単位／ｍＬで、検出可能なレベルのＧＡＤ₆₅自己抗体が確認された。しかしながら、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法において、ＧＡＤ₆₅自己抗体は、２５０乃至３．９１ＷＨＯ単位／ｍＬのＷＨＯ標準希釈のケースにおいて検出可能となった。更に、（高レベルのＧＡＤ₆₅自己抗体を伴う患者からの）血清試料Ｚの希釈プロフィールの例が、表２に表示されている。ＲＩＡの場合、ＧＡＤ₆₅自己抗体は、試料Ｚにおいて、１／８乃至１／８１９２の希釈の範囲で検出可能となった。本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法の場合、ＧＡＤ₆₅自己抗体は、１／８乃至１／３２７６８の希釈の範囲で検出可能となった。結果として、ＷＨＯ標準と患者の血清との終点希釈分析は、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法において、ＲＩＡと比較して四倍乃至八倍高い希釈を検出可能であることを示唆した。

本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法でのＩＡ−２自己抗体の測定結果の例は、表３に表示されている。一組のＩＡ−２自己抗体キャリブレータ（０、１．０、２．０、４．０、８．０、１６、３２、６４、１２８ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）に関する代表的なＯＤ４５０ｎｍ値は、０．０５４乃至＞４．０であり、ＯＤ４０５の値は、０．００８乃至１．８７４である。ＲＩＡにおいて、２．０乃至３８．９ＲＩＡ単位／ｍＬのＩＡ−２自己抗体レベルを有するｎ＝１０の一型糖尿病患者からの血清は、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法において、全て陽性となった。これらの試料は、０．２０９乃至＞４．０（２．６乃至＞３２ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）のＯＤ４５０ｎｍ値を示した。ＷＨＯ標準は、ＩＡ−２自己抗体のＲＩＡにおいて２５０ＷＨＯ単位／ｍＬ及び１２５ＷＨＯ単位／ｍＬにおいて検出可能だったが、しかしながら、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法では、更なる希釈（６２．５ＷＨＯ単位／ｍＬ及び３１．２５ＷＨＯ単位／ｍＬ）が検出可能となった。健康な血液ドナーからのｎ＝１０の血清（ＲＩＡにおいてＩＡ−２に関して全て陰性）の場合のＯＤ４５０ｎｍ値は、０．０３０乃至０．０７１（＜１ＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ）となった。

ＧＡＤ₆₅自己抗体とＩＡ−２自己抗体とに関する結合アッセイの結果は、表４及び５に表示されている。表４は、ＩＡ−２−Ｂｉ、又はＧＡＤ₆₅−Ｂｉ、又はＩＡ−２−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−Ｂｉがアッセイにおいて使用された時の本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法でのＧＡＤ₆₅自己抗体とＩＡ−２自己抗体と結合測定の結果を示している。ＩＡ−２自己抗体キャリブレータの場合において、ＧＡＤ₆₅−Ｂｉが使用された時には、本発明によるＥＬＩＳＡに基づく手法では信号が検出されなかったが、ＩＡ−２−Ｂｉ又はＩＡ−２−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−Ｂｉが使用された時には、ＯＤ４５０ｎｍの用量依存性の増加が観察された。ＩＡ−２−Ｂｉ単独でのＯＤ４５０ｎｍ信号は、基本的にＩＡ−２−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−Ｂｉでの信号と同じだった。ＧＡＤ₆₅自己抗体キャリブレータの場合において、ＩＡ−２−Ｂｉがアッセイで使用された時には、信号が検出されなかったが、ＧＡＤ₆₅−Ｂｉ及びＩＡ−２−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−Ｂｉでは、ＯＤ４５０ｎｍの用量依存性の増加が観察された。ＧＡＤ₆₅−Ｂｉ単独の場合と、ＩＡ−２−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−ＢｉプラスＧＡＤ₆₅−Ｂｉの場合とのＯＤ４５０ｎｍ信号は同等だった。異なる希釈の血清試料Ｚにおける両方の自己抗体の測定値は、ＩＡ−２自己抗体又はＧＡＤ₆₅自己抗体の単独での結果と有効な一致を示した。個別の健康な血液ドナーからの血清、或いは健康な血液ドナープールの血清は、どのビオチン化抗原を使用したかに関係なく、０．００６乃至０．０４６の非常に低いＯＤ４５０ｎｍ値となった。この実験は、ＩＡ−２自己抗体及びＧＡＤ₆₅自己抗体を測定する結合アッセイにおいて、結果が特異的であり、試験試料中の二種類の自己抗体の存在を反映することを示している。

ＩＡ−２自己抗体及びＧＡＤ₆₅自己抗体の結合測定の更に詳細な結果は、表５に表示されている。このアッセイでは、一型糖尿病の患者からの血清を試験した。ＩＡ−２自己抗体及びＧＡＤ₆₅自己抗体を、これらの血清においてＲＩＡにより評価し、血清１乃至３は、ＩＡ−２自己抗体及びＧＡＤ₆₅自己抗体の両方に関して陽性となり、血清４乃至６は、ＧＡＤ₆₅自己抗体では陰性だが、ＩＡ−２自己抗体では陽性となり、血清７乃至９は、ＧＡＤ₆₅自己抗体では陽性だが、ＩＡ−２自己抗体では陰性となり、血清１０乃至１２は、ＩＡ−２又はＧＡＤ₆₅自己抗体の両方に関して陰性となった。表５に示すように、結合アッセイにおいては、一方又は他方又は両方の抗体が、血清試料中で検出された。更に、ＲＩＡでは境界線のレベル（０．９ＲＩＡ単位／ｍＬ）のＩＡ−２自己抗体を有した血清６の場合、本発明による結合したＥＬＩＳＡに基づく手法での信号は、明らかに陽性だった。

様々な患者下位集団に関する、本発明によるＧＡＤ₆₅自己抗体、ＩＡ−２自己抗体、及び結合したＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２自己抗体とのＥＬＩＳＡによる結果の追加的な例は、それぞれ表６、７、及び８に表示されている。

結論
上の結果は、本発明による非放射性の手法により、試験試料中のＧＡＤ₆₅自己抗体の測定が可能となることを示している。この本発明による非放射性の手法は、ＩＡ−２自己抗体を別個又は同時に測定するために利用することもできる。この測定は、特異的であり、確立された放射性の基準方法によるＧＡＤ₆₅自己抗体及びＩＡ−２自己抗体測定の結果と一致する（M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Rees Smith, J Furmaniak, Clinica Chimica Acta, 1996 256: 175-188、及びM Masuda, M Powell, S Chen, C Beer, P Fichna, B Rees Smith, J Furmaniak. インスリン依存性糖尿病におけるＩＡ−２に対する自己抗体。新しい免疫沈降アッセイによる測定, Clinica Chimica Acta, 2000 291: 53-66）。更に、本発明による非放射性の手法でのＧＡＤ₆₅自己抗体及びＩＡ−２自己抗体の測定は、ＲＩＡによる結果と比較して、少なくとも同等の感度を有する（表１、２、及び３）。

本発明による手法は、診断及びスクリーニングの目的での使用に都合のよい、ＧＡＤ₆₅自己抗体又はＩＡ−２自己抗体を高感度で測定する非放射性アッセイを提供する。本発明によるＧＡＤ₆₅及びＩＡ−２自己抗体の結合アッセイは、大きな個体群のスクリーニングプログラムでの使用に関して、特に有利となる可能性がある。

表１
¹²⁵Ｉ標識ＧＡＤ₆₅に基づく、本発明によるＥＬＩＳＡとラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）とにおける患者血清中のＧＡＤ₆₅自己抗体

脚注：１ＲＩＡ単位／ｍＬを上回るＧＡＤＡｂレベルは、ＲＩＡによって陽性とみなした。一型ＤＭ＝一型糖尿病。グレーブス＝グレーブス病。

表２
ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡにおけるＧＡＤ₆₅ Ａｂ測定の感度の比較

脚注：１ＲＩＡ単位／ｍＬを上回るＧＡＤＡｂレベルは、ＲＩＡにおいて陽性とみなした。^*ＷＨＯ単位／ｍＬ

表３
¹²⁵Ｉ標識ＩＡ−２／ＩＣＡ５１２に基づく、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡにおけるＩＡ−２
／ＩＣＡ５１２自己抗体の測定

脚注：１ＲＩＡ単位／ｍＬを上回るＩＡ−２／ＩＣＡ５１２Ａｂレベルは、ＲＩＡにおいて陽性とみなした。一型ＤＭ＝一型糖尿病。^*ＷＨＯ単位／ｍＬ

表４
ＥＬＩＳＡにおける結合ＧＡＤ₆₅ Ａｂ及びＩＡ−２／ＩＣＡ５１２Ａｂ測定

表５
ＥＬＩＳＡにおける結合ＧＡＤ₆₅ Ａｂ及びＩＡ−２／ＩＣＡ５１２Ａｂ測定

脚注：１ＲＩＡ単位／ｍＬを上回るＧＡＤ₆₅ Ａｂレベルは、ＲＩＡにおいて陽性とみなした。１ＲＩＡ単位／ｍＬを上回るＩＡ−２／ＩＣＡ５１２Ａｂレベルは、ＲＩＡにおいて陽性とみなした。一型ＤＭ＝一型糖尿病。

表６
¹²⁵Ｉ標識ＧＡＤ₆₅に基づく、ＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により
、様々な患者グループで測定されたＧＡＤ₆₅ Ａｂ

¹ ＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料の値は、１１単位／ｍＬ及び＞５００単位／ｍＬだった（全ての単位／ｍＬは、ＷＨＯ９７／５５０）。吸着実験は、特定のＧＡＤ₆₅ Ａｂの存在を示唆した。同じ試料は、ＲＩＡにおいて、それぞれ陰性及び２５００単位／ｍＬとなった。

² ＧＡＤ₆₅ ＡｂＲＩＡにおいて陽性の試料の値は、３３、１００及び２５００単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＥＬＩＳＡにおいて、それぞれ陰性、陰性、及び＞５００単位／ｍＬとなった。

³ 値の範囲：５．２乃至５００を上回る単位／ｍＬ
⁴ 値の範囲：陰性乃至３８００単位／ｍＬ
⁵ ＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料の値は、４０単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＲＩＡにおいて、陰性となった。

⁶ ＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料の値は、３０６及び５００単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＲＩＡにおいて、それぞれ３５４単位／ｍＬ及び１７００単位／ｍＬとなった。

⁷ ＧＡＤ₆₅ ＡｂＲＩＡにおいて陽性の試料の値は、７８、３５４及び１７００単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＥＬＩＳＡにおいて、それぞれ陰性、３０６、及び５００単位／ｍＬとなった。

⁸ ＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料の値は、２４単位／ｍＬで、この試料はＲＩＡにおいて陰性となった。

⁹ 同じ試料が、ＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡ及びＲＩＡにおいて、それぞれ１５単位／ｍＬ及び３０単位／ｍＬで陽性となった。

表７
¹²⁵Ｉ標識ＩＡ−２／ＩＣＡ５１２に基づく、ＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイ（
ＲＩＡ）により、様々な患者グループで測定されたＩＡ−２Ａｂ

¹ ＩＡ−２ＡｂＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料の値は、４４単位／ｍＬ及び１７９単位／ｍＬだった（単位／ｍＬは、ＷＨＯ９７／５５０）。吸着実験は、これらの試料において特定のＩＡ−２Ａｂの存在を示唆した。同じ試料は、ＲＩＡにおいて陰性となった。

² ＲＩＡでのＩＡ−２Ａｂ陽性試料の値は、１５０単位／ｍＬ及び２８８単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＥＬＩＳＡにおいて陰性となった。

³ 値の範囲：１３２乃至＞４０００単位／ｍＬ
⁴ 値の範囲：１７８乃至４５０８単位／ｍＬ
⁵ ＩＡ−２Ａｂ陽性試料の値は、１０１単位／ｍＬだった。同じ試料は、ＲＩＡにおいて陰性となった。

表８
様々な患者グループにおけるＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡ、ＩＡ−２ＡｂＥＬＩ
ＳＡ、及び結合ＧＡＤ₆₅ Ａｂ＋ＩＡ−２ＡｂＥＬＩＳＡの結果

¹ ＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料のＧＡＤ₆₅ Ａｂの値は、７．３乃至＞５００単位／ｍＬの範囲となった（単位／ｍＬは、ＷＨＯ９７／５５０）。

² ＥＬＩＳＡにおいて陽性の試料のＩＡ−２Ａｂの値は、３４乃至３６１３単位／ｍＬの範囲となった（単位／ｍＬは、ＷＨＯ９７／５５０）。

³ 全ての結合ＥＬＩＳＡの結果は、次のように計算された指数として表現した：

２．０以上の値は陽性である。

１８血清は、ＧＡＤ₆₅ Ａｂに関して陽性で、ＩＡ−２Ａｂに関して陰性であり、１８件全てが結合ＥＬＩＳＡにおいて陽性となった。

４血清は、ＩＡ−２Ａｂに関して陽性で、ＧＡＤ₆₅ Ａｂに関して陰性で、４件全てが結合ＥＬＩＳＡにおいて陽性となった。

１０血清は、ＧＡＤ₆₅ Ａｂ及びＩＡ−２Ａｂに関して陽性であり、１０件全てが結合ＥＬＩＳＡにおいて陽性となった。

１血清は、ＧＡＤ₆₅ Ａｂ及びＩＡ−２Ａｂに関して陰性だったが、結合ＥＬＩＳＡにおいて陽性となった。

２血清は、三種類全てのアッセイで陰性となった。

⁴ この一陽性試料では、ＧＡＤ₆₅ Ａｂレベルが１０単位／ｍＬとなり、ＩＡ−２Ａｂは陰性となった。

⁵ この一陽性試料では、ＧＡＤ₆₅ Ａｂが陰性となり、ＩＡ−２Ａｂレベルは７６単位／ｍＬとなった。

⁶ 陽性試料は、４及び５において説明したものと同じになった（指数値は、それぞれ７．８及び４．８）。

様々な患者グループにおけるＧＡＤ₆₅ ＡｂＥＬＩＳＡ、ＩＡ−２ＡｂＥＬＩＳＡ、及び結合ＧＡＤ₆₅ Ａｂ＋ＩＡ−２ＡｂＥＬＩＳＡの結果
⁷ この二つの陽性試料では、ＧＡＤ₆₅ Ａｂレベルは９及び＞５００単位／ｍＬとなったが、ＩＡ−２Ａｂは陰性となった。

⁸ 陽性試料は、７において説明したものと同じになった。これらの試料の指数値は、それぞれ３．６及び５５．０となった。

⁹ ＧＡＤ₆₅ Ａｂレベルは１５単位／ｍＬとなったが、ＩＡ−２Ａｂは陰性となった。

¹⁰ 陽性試料は、９において説明したものと同じになった。指数値は、６．０となった。

Claims

ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７及びＩＡ−２、或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された抗原分子に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットであって、
（ａ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の第一のソースと、
（ｂ）検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な抗原分子の第二のソースと、
（ｃ）［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む複合体内に存在する前記第一のソースの前記抗原分子を、前記第一のソースの抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に固体支持体に固定化する手段であって、前記固体支持体を前記第一のソースの前記抗原分子でコーティングするステップを含んでいる手段と、
（ｄ）（ａ）及び（ｂ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に接触させる手段であって、これにより、（ｃ）において定められる複合体が形成可能となる手段と、
（ｅ）（ｃ）において定められる複合体内に存在する前記第二のソースの前記抗原分子に、前記第二のソースの前記抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｆ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｃ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備え、

前記第一及び第二のソースの前記抗原分子は、前記複合体内に存在する時に、共通の抗原分子を含むか、又はこれに由来し、或いは、前記第一及び第二のソースの前記抗原分子の結合領域は、前記検体の自己抗体に関して、前記一つ以上の複合体内に存在する時に、共通の抗原分子内に存在するか、又はこれに由来し、

前記抗原分子の第一のソースは、前記第二のソースの抗原分子で二価複合体を形成できる［抗原分子］−［検体の自己抗体］を含んだ一価の中間複合体を形成する量で提供され、前記二価の複合体は［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含んでおり、

前記抗原分子の第一のソースは、ＧＡＤ抗原分子の第一のソース及びＩＡ−２抗原分子の第一のソースを含み、
（ｉ）前記ＧＡＤ抗原分子の第一のソースは、ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、ＩＡ−２及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択される二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つはＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、又は一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、若しくは断片を含み、
（ｉｉ）前記ＩＡ−２抗原分子の第一のソースは、ＩＡ−２、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＩＡ−２、ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択される二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つはＩＡ−２又は一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、若しくは断片を含み、

前記抗原分子の第二のソースは、ＧＡＤ抗原分子の第二のソース及びＩＡ−２抗原分子の第二のソースを含み、
（ｉ）前記ＧＡＤ抗原分子の第二のソースは、ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、ＩＡ−２及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択される二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つはＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７又は一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、若しくは断片を含み、
（ｉｉ）前記ＩＡ−２抗原分子の第二のソースは、ＩＡ−２、一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＩＡ−２、ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７及び一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択される二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択され、前記融合分子の前記抗原分子の少なくとも一つはＩＡ−２又は一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、若しくは断片を含む、キット。
ＧＡＤ或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＧＡＤ_６５、ＧＡＤ_６７、及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択されたＧＡＤ抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースと、
（ｂ）（ａ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、連続的に接触させる手段であって、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子］を含む複合体が形成可能となる手段と、
（ｃ）（ｂ）において定められる複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＧＡＤ抗原分子を、前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、固体支持体に固定化する手段であって、この固定化は前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子で前記固体支持体をコーティングするものである手段と、
（ｄ）（ｂ）において定められる複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子に、前記第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｅ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｂ）において定められ、（ｃ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備え、
前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子が、前記第二のソースの抗原分子で二価複合体を形成できる［抗原分子］−［検体の自己抗体］を含んだ一価の中間複合体を形成する量で提供され、前記二価の複合体は［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含んでおり、
前記第一のソースのＧＡＤ抗原分子は、（ｃ）において定められる固体支持体に固定化され、
前記第二のソースのＧＡＤ抗原分子には、（ｄ）において定められる標識手段が設けられる、キット。
ＩＡ−２或いは一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片に反応する検体の自己抗体に関して、動物被検体から取得した体液試料をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＩＡ−２、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能な一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片、並びにＩＡ−２及び前記一つ以上のその変異体、類似体、誘導体、又は断片から選択された、二つ以上の直接的又は間接的に融合した抗原分子を含む融合分子から選択されたＩＡ−２抗原分子により本質的に構成される、抗原分子の第一及び第二のソースと、
（ｂ）（ａ）で提供された前記抗原分子を、スクリーニング中の前記体液試料に、連続的に接触させる手段であって、これにより、検体の自己抗体は、前記体液試料内に存在する時、前記抗原分子と相互作用でき、［前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子］を含む複合体が形成可能となる手段と、
（ｃ）（ｂ）において定められる複合体内に存在する前記第一のソースの前記ＩＡ−２抗原分子を、前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、固体支持体に固定化する手段であって、この固定化は前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子で前記固体支持体をコーティングするものである手段と、
（ｄ）（ｂ）において定められる複合体内に存在する前記第二のソースの前記ＩＡ−２抗原分子に、前記第二のソースの前記ＩＡ−２抗原分子とスクリーニング中の体液試料との接触の前に、又は同時に、又は後に、直接的又は間接的に検出可能な標識手段を提供する手段と、
（ｅ）前記試料内に存在する検体の自己抗体の表示を提供できるように、（ｂ）において定められ、（ｃ）において定められるように固定化された複合体の存在を検出する手段と、を備え、
前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子が、前記第二のソースの抗原分子で二価複合体を形成できる［抗原分子］―［検体の自己抗体］を含んだ一価の中間複合体を形成する量で提供され、前記二価の複合体は［前記第一のソースの抗原分子］―［検体の自己抗体］―［前記第二のソースの抗原分子］を含んでおり、
前記第一のソースのＩＡ−２抗原分子は、（ｃ）において定められる固体支持体に固定化され、
前記第二のソースのＩＡ−２抗原分子には、（ｄ）において定められる標識手段が設けられる、キット。
第一及び第二のソースの抗原分子が、一つ以上の共通抗原分子を含む、請求項１から３のいずれかに記載のキット。
前記第一及び第二のソースの前記ＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ_６５又はＧＡＤ_６７を含む、請求項１又は２記載のキット。
第一又は第二のソースのいずれかのＧＡＤ抗原分子が、ＧＡＤ_６５又はＧＡＤ_６７を含み、他方のソースのＧＡＤ抗原分子が、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能であるＧＡＤ_６５又はＧＡＤ_６７の一つ以上の変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む、請求項１又は２記載のキット
第一及び第二のソースの両方の抗原分子が、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、共通の抗原分子の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む、請求項１又は２記載のキット。
第一及び第二のソースの両方のＧＡＤ抗原分子が、検体の自己抗体が前記体液試料内に存在する時に相互作用可能である、ＧＡＤ_６５又はＧＡＤ_６７の、同じもの又は異なるものにすることが可能な、変異体、類似体、誘導体、又は断片を含む、請求項７記載のキット。
固定化手段を備え、これにより、前記一つ以上の第一のソースの抗原分子が、スクリーニング中の体液試料との接触の前に、固体支持体に固定化される、請求項１から８のいずれかに記載のキット。
接触手段を備え、これにより、このように固定化された、前記一つ以上の第一のソースの抗原分子を、体液試料と前記一つ以上の第二のソースの抗原分子との接触と同時に、或いは連続して、スクリーニング中の体液試料と接触させる、請求項９記載のキット。
接触手段が提供され、これにより、固定化された、前記一つ以上の第一のソースの抗原分子を、抗原分子が固体支持体に固定化された［抗原分子］−［検体の自己抗体］を含む中間複合体が形成できるようにスクリーニング中の体液試料に接触させ、こうして形成された固定化中間複合体は、その後、溶液相において存在する、前記一つ以上の第二のソースの抗原分子と接触させ、前記第一のソースの抗原分子を介して固定支持体に固定化された［前記第一のソースの抗原分子］−［検体の自己抗体］−［前記第二のソースの抗原分子］を含む、前記一つ以上の複合体を形成できるようにする、請求項１０記載のキット。