ES2320427T3 - Deteccion de anticuerpos reactivos con moleculas antigenicas de las celulas de los islotes pancreaticos. - Google Patents

Deteccion de anticuerpos reactivos con moleculas antigenicas de las celulas de los islotes pancreaticos. Download PDF

Info

Publication number
ES2320427T3
ES2320427T3 ES02779738T ES02779738T ES2320427T3 ES 2320427 T3 ES2320427 T3 ES 2320427T3 ES 02779738 T ES02779738 T ES 02779738T ES 02779738 T ES02779738 T ES 02779738T ES 2320427 T3 ES2320427 T3 ES 2320427T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gad
molecules
antigenic
source
antigenic molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02779738T
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Rees Smith
Jadwiga Furmaniak
Michael Powell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RSR Ltd
Original Assignee
RSR Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9926667&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2320427(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by RSR Ltd filed Critical RSR Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2320427T3 publication Critical patent/ES2320427T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01048—Fusarinine-C ornithinesterase (3.1.1.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un método para cribar una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal en busca de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD65, GAD67 y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y dicho método comprende: (a) proporcionar una o más primeras fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD65, GAD67 e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD 65, GAD 67 e IA-2; (b) proporcionar una o más segundas fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD 65, GAD 67 e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD65, GAD67 e IA-2; (c) poner en contacto dichas moléculas antigénicas proporcionadas por las etapas (a) y (b) de forma simultánea o sucesiva con dicha muestra de líquido corporal a cribar, por lo cual los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar con dichas moléculas antigénicas para formar uno o más complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente]; (d) antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio de inmovilización por el cual dicha molécula antigénica de dicha primera fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) se inmoviliza en un soporte sólido antes de, o durante, o después de, la etapa (c); (e) antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio para el marcaje detectable directo o indirecto, por lo que se proporciona a dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) tal medio de marcaje detectable directo o indirecto antes de, o durante, o después de, la etapa (c); y (f) detectar la presencia de complejos formados en (c) inmovilizados según (d) para proporcionar una indicación de los analitos de autoanticuerpos presentes en dicha muestra.

Description

Detección de anticuerpos reactivos con moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos.
La presente invención se refiere a métodos y equipos útiles para la detección de autoanticuerpos reactivos con moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos y/o insulina, por ejemplo métodos y equipos útiles para la detección de autoanticuerpos indicativos del inicio o de la presencia de diabetes mellitus insulinodependiente (DMID, diabetes tipo 1).
La diabetes tipo 1 es una de las enfermedades autoinmunitarias más prevalentes que afectan al ser humano, con más de 2 millones de individuos en Europa y Norteamérica afectados por la enfermedad (M A Atkinson, G S Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. The Lancet, 2001 358: 221-229). Además, la incidencia de la diabetes tipo 1 se está incrementando en todo el mundo un 2,5% por año, y se estima que la incidencia de esta enfermedad será un 40% mayor en 2010 que en 1998 (M A Atkinson, G S Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. The Lancet, 2001 358: 221-229).
Los autoanticuerpos hacia antígenos de las células \beta pancreáticas son marcadores serológicos bien reconocidos de la diabetes tipo 1, e incluyen: autoanticuerpos reactivos con las células de los islotes en análisis de inmunofluorescencia (ICA), autoanticuerpos hacia la ácido glutámico descarboxilasa (GAD, en particular su isoforma de 65 kDa, GAD_{65}), autoanticuerpos hacia el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (que se puede denominar IA-2 o ICA512) y autoanticuerpos hacia insulina. Los autoanticuerpos hacia GAD_{65} y los autoanticuerpos hacia IA-2 son componentes de la reactividad de los ICA (M A Atkinson, G S Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. The Lancet, 2001 358: 221-229). Al menos uno de los tres tipos de autoanticuerpos hacia GAD_{65}, IA-2 e insulina están presentes en el momento del diagnóstico en los sueros de alrededor del 90% de los pacientes con diabetes tipo 1 (M A Atkinson, G S Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. The Lancet, 2001 358: 221-229). La medida de los autoanticuerpos mencionados anteriormente que son marcadores serológicos de la autoinmunidad hacia las células \beta pancreáticas también puede ser útil en la monitorización de pacientes involucrados en ensayos para la prevención de la diabetes (M A Atkinson, G S Eisenbarth. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. The Lancet, 2001 358:
221-229).
En la actualidad, los autoanticuerpos hacia GAD_{65} se miden mediante el uso de análisis de inmunoprecipitación (IPA) que emplean GAD_{65} marcada radiactivamente con ^{35}S, ^{3}H o ^{125}I. Se ha producido GAD_{65} marcada con ^{35}S o ^{3}H en un sistema de transcripción/traducción in vitro (C E Grubin, T Daniels, B Toivola, M Landdin-Olsson, W A Hagopian, L Li, A E Karlsen, E Boel, B Michelsen, \ring{A} Lernmark. A novel radioligand binding assay to determine diagnostic accuracy of isoform-specific glutamic acid decarboxylase antibodies in childhood IDDM. Diabetologia, 1994 37: 344-350; J S Petersen, K R Hejnaes, A Moody, A E Karlsen, M O Marshall, M Høier-Madsen, E Boel, B K Michelsen, T Dyrberg. Detection of GAD_{65} antibodies in diabetes and other autoimmune diseases using a simple radioligand assay. Diabetes, 1994 43: 459-467; y A Falorni, E Örtqvist, B Persson, \ring{A} Lernmark. Radioimmunoassays for glutamic acid decarboxylase (GAD_{65}) and GAD_{65} autoantibodies using ^{35}S or ^{3}H recombinant human ligands. Journal of Immunological Methods, 1995 186: 88-89). Se ha marcado GAD_{65} nativa, por ejemplo GAD_{65} de rata o de cerdo aislada de tejido cerebral (M J Rowley, I R Mackay, Q-Y Chen, W J Knowles, P Z Zimmet. Antibodies to glutamic acid decarboxylase discriminate major types of diabetes mellitus. Diabetes, 1992 41: 548:551; y M Ohta, H Obayashi, K Takahashi, Y Kitagawa, K Nakano, S Matsuo, M Ohishi, N Itoh, K Hayashi, K Ohta. A simple solid-phase radioimmunoassay for glutamic acid decarboxylase (GAD) antibodies in patients with diabetes mellitus. J Clin Biochem Nutr, 1996 20: 139-148) o GAD_{65} humana recombinante, por ejemplo expresada en células de insecto, levadura o células de mamífero (F Lühder, K-P Woltanski, L Mauch, H Haubruck, K-D Kohnert, I Rjasanowski, D Michaelis, M Ziegler. Detection of autoantibodies to the 65-kD isoform of glutamate decarboxylase by radioimmunoassay. European Journal of Endocrinology, 1994 130: 575-80; M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Rees Smith, J Furmaniak. Clinica Chimica Acta, 1996 256: 175-188; y T Matsuba, M Yano, No Abiru, H Takino, S Akazawa, S Nagataki, K Yasukawa. Expression of recombinant human glutamic acid decarboxylase (GAD) in myeloma cells and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for autoantibodies to GAD. J Biochem, 1997 121: 20-24) con ^{125}I, y se ha usado en IPAs. También se han usado proteínas de fusión recombinantes de GAD_{65} e IA-2 en IPAs para el análisis combinado de autoanticuerpos (A Zavialov, M Ankelo, A Westerlund-Karlsson, M Knip, J Illonen, A Hinkkanen. Novel fusion proteins in the analysis of diabetes associated autoantibodies to GAD_{65} and IA-2. Journal of Immunological Methods, 2000 246: 91-96; y M Rickert, J Seissler, W Dangel, H Lorenz, W Richter. Fusion proteins for combined analysis of autoantibodies to the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 in insulin dependent diabetes mellitus. Clinical Chemistry, 2001 47
(5): 926-934).
Los IPAs disponibles actualmente basados en ^{35}S-GAD_{65}, no obstante, han sido técnicamente complejos, difíciles de normalizar, relativamente caros y no han sido adaptables a un formato de equipo. Los ensayos basados en ^{125}I-GAD_{65} humana recombinante han tenido una sensibilidad y especificidad iguales a las de los ensayos basados en ^{35}S-GAD_{65}, y han mostrado la ventaja añadida de una buena reproducibilidad, simplicidad técnica, costes inferiores, y se han adaptado fácilmente a un formato de equipo. Lamentablemente, sin embargo, los ensayos basados en ^{125}I-GAD_{65} aislada de tejido cerebral de rata o de cerdo han tenido una especificidad menor debido a la contaminación con la isoforma GAD_{67}.
Los autoanticuerpos hacia GAD_{65} se han medido también mediante diferentes tipos de ELISAs (A M Gronowski, E C C Wong, T R Wilhite, D L Martin, C H Smith, C A Parvin, M Landt. Detection of glutamic acid decarboxylase autoantibodies with the varelisa ELISA. Clinical Chemistry, 1995 41 (10): 1532-1534; y H D Mehta, B S Vold, S Minkin, E Fullman. DELISA: sensitive nonisotopic assay for GAD_{65} autoantibodies, a key risk-assessment marker for insulin-dependent diabetes mellitus. Clinical Chemistry, 1996 42 (2): 263-269).
Sin embargo, los análisis disponibles actualmente para medir los autoanticuerpos hacia GAD_{65} mediante ELISA tienen una sensibilidad y especificidad menores que los IPAs anteriormente mencionados, y son inferiores a los IPAs en los estudios de competencia (R S Schmidli, P G Colman, E Bonifacio, laboratorios participantes. Disease sensitivity and specificity of 52 assays for glutamic acid decarboxylase antibodies. The second international GAD Ab workshop. Diabetes, 1995 44: 636-640).
Schmidli et al (1994 : Diabetes, vol. 43, págs. 1005-1009) describe un ELISA para GAD en el que los autoanticuerpos se capturan mediante el uso de una fase sólida revestida con el antígeno de GAD, y la detención se lleva a cabo con un anticuerpo anti-humano-HRP. Se forma un complejo [molécula antigénica]-[autoanticuerpo]-[anticuerpo dirigido contra el autoanticuerpo]. El ensayo tiene una sensibilidad menor que los métodos radiactivos.
La presente invención, sin embargo, mitiga los problemas asociados hasta ahora con los métodos y los equipos empleados en el cribado de autoanticuerpos indicativos del inicio o de la presencia de diabetes tipo 1, y tiene una aplicabilidad general en la detección de autoanticuerpos reactivos con moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos. En particular, la presente invención emplea métodos y equipos que tienen una especificidad y sensibilidad mejoradas en comparación con los métodos de la técnica anterior discutidos anteriormente.
La presente invención proporciona un método para cribar una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal en busca de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos, seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y dicho método comprende:
(a)
proporcionar una o más primeras fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2;
(b)
proporcionar una o más segundas fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2;
(c)
poner en contacto dichas moléculas antigénicas proporcionadas por las etapas (a) y (b) de forma simultánea o sucesiva con dicha muestra de líquido corporal a cribar, por lo cual los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar con dichas moléculas antigénicas para formar uno o más complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente];
(d)
antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio de inmovilización por el cual dicha molécula antigénica de dicha primera fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) se inmoviliza en un soporte sólido antes de, o durante, o después de, la etapa (c);
(e)
antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio para el marcaje detectable directo o indirecto, por lo que se proporciona a dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) tal medio de marcaje detectable directo o indirecto antes de, o durante, o después de, la etapa (c); y
(f)
detectar la presencia de complejos formados en (c) inmovilizados según (d) para proporcionar una indicación de los analitos de autoanticuerpos presentes en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
El método para cribar en busca de analitos de autoanticuerpos según la presente invención es especialmente ventajoso para proporcionar un método para tal detección de autoanticuerpos con una especificidad y sensibilidad elevadas.
Se apreciará que los términos GAD_{65} y GAD_{67} usados en este documento abarcan todas las isoformas de GAD_{65} y GAD_{67}, respectivamente. En ciertas realizaciones de la presente invención se puede preferir que se emplee GAD_{65}, y en otras realizaciones de la presente invención se puede preferir que se emplee GAD_{67}. También se apreciará a partir de lo anterior que la presente invención puede incluir dentro de su alcance moléculas de fusión que pueden comprender GAD_{65} o GAD_{67}, o uno o más fragmentos suyos (tales como sus regiones de unión). Por ejemplo, las moléculas de fusión para el uso dentro del alcance de la presente invención pueden comprender GAD_{65}, fusionada directamente o indirectamente a GAD_{67}, o una o más regiones de unión de GAD_{65}, fusionadas directamente o indirectamente a una o más regiones de unión de GAD_{67}. Además, también se apreciará que las moléculas de fusión para el uso dentro del alcance de la presente invención pueden comprender IA-2, o una o más regiones de unión suyas, fusionadas directamente o indirectamente a IA-2 beta, o una o más regiones de unión suyas. La presente invención también tiene en cuenta GAD_{65} o GAD_{67}, o una o más variantes, análogos, derivados o fragmentos suyos, fusionados directamente o indirectamente a IA-2, o una o más variantes, análogos, derivados o fragmentos suyos.
En particular, la o las moléculas antigénicas, o su o sus variantes, análogos, derivados o fragmentos, que pueden reaccionar con tales analitos de autoanticuerpos como requiere la presente invención, se seleccionan del grupo que consiste en ácido glutámico descarboxilasa (en particular GAD_{65} o GAD_{67}) y antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), o una o más variantes, análogos, derivados o fragmentos suyos, con los cuales los analitos de autoanticuerpos pueden interaccionar cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal.
Cuando se emplean las moléculas antigénicas de fusión en la presente invención, las moléculas de fusión adecuadas pueden comprender GAD_{65} o GAD_{67} o una o más variantes, análogos, derivados o fragmentos suyos, fusionados directamente o indirectamente a IA-2, o una o más variantes, análogos, derivados o fragmentos suyos; de forma alternativa, las moléculas de fusión adecuadas pueden comprender GAD_{65} fusionada directamente o indirectamente a GAD_{67}, o una o más regiones de unión de GAD_{65} fusionadas directamente o indirectamente a una o más regiones de unión de GAD_{67}; de forma alternativa, las moléculas de fusión adecuadas pueden comprender IA-2, o una o más regiones de unión suyas, fusionadas directamente o indirectamente a IA-2 beta, o una o más regiones de unión suyas.
Preferiblemente, un método según la presente invención comprende proporcionar (i) primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas de GAD con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas de GAD se seleccionan de GAD_{65}, GAD_{67}, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67}, antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende GAD_{65} o GAD_{67}, en el que las moléculas antigénicas de GAD de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido según la etapa (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas de GAD de dicha segunda fuente según la etapa (e); y (ii) las primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) con las cuales los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) se seleccionan del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), GAD_{65}, GAD_{67}, y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), en el que las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido según la etapa (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha segunda fuente según la etapa (e).
En un método preferido adicional de la invención, las moléculas antigénicas de dicha o dichas primeras fuentes se inmovilizan en un soporte sólido antes de la puesta en contacto con una muestra de líquido corporal a cribar; y de forma beneficiosa las moléculas antigénicas inmovilizadas de la o las primeras fuentes se ponen en contacto posteriormente con la muestra de líquido corporal a cribar, de forma simultánea o sucesiva con la puesta en contacto de la muestra de líquido corporal con las moléculas antigénicas de la o las segundas fuentes. En una realización ejemplar adicional del método según la invención, las moléculas antigénicas inmovilizadas de la o las primeras fuentes se ponen en contacto posteriormente con la muestra de líquido corporal a cribar para formar un complejo intermedio que comprende [molécula antigénica]-[analito de autoanticuerpo] en el que la molécula antigénica se inmoviliza en un soporte sólido, y el complejo intermedio así inmovilizado se pone en contacto posteriormente con dichas moléculas antigénicas de la o las segundas fuentes, presentes en la fase de disolución, para formar complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente] inmovilizados en el soporte sólido por medio de la molécula antigénica de la primera fuente.
La presente invención también proporciona un equipo para cribar una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal en busca de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y dicho equipo comprende:
(a)
una o más primeras fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2);
(b)
una o más segundas fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2);
(c)
medios para poner en contacto dichas moléculas antigénicas proporcionadas por (a) y (b) de forma simultánea o sucesiva con dicha muestra de líquido corporal a cribar, por lo cual los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar con dichas moléculas antigénicas para formar uno o más complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente];
(d)
medios para inmovilizar en un soporte sólido dicha molécula antigénica de dicha primera fuente presente en un complejo como se definió en (c), antes de, o durante, o después de, la puesta en contacto de la molécula antigénica de dicha primera fuente con la muestra de líquido corporal a cribar;
(e)
medios para proporcionar un medio de marcaje detectable directo o indirecto a dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente presente en un complejo como se definió en (c), antes de, o durante, o después de, la puesta en contacto de dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente con dicha muestra de líquido corporal a cribar; y
(f)
medios para detectar la presencia de complejos como se definieron en (c) inmovilizados como se definió en (d) para proporcionar una indicación de los analitos de autoanticuerpos en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Un equipo para cribar en busca de analitos de autoanticuerpos según la presente invención es especialmente ventajoso al permitir una detección de autoanticuerpos de especificidad y sensibilidad elevadas.
Las moléculas antigénicas se seleccionan de las moléculas antigénicas de GAD_{65} y GAD_{67} o de las moléculas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2).
Preferiblemente, un equipo según la presente invención comprende (i) primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas de GAD con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas de GAD se seleccionan de GAD_{65}, GAD_{67}, y moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67}, antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende GAD_{65} o GAD_{67}, en el que las moléculas antigénicas de GAD de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido como se definió en (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas de GAD de dicha segunda fuente como se definió en (e); y (ii) las primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) con las cuales los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) se seleccionan del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), GAD_{65}, GAD_{67}, y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), en el que las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido como se definió en (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha segunda fuente como se definió en (e).
Preferiblemente, un equipo según una realización preferida de la invención puede comprender un medio de inmovilización por el cual las moléculas antigénicas de la o las primeras fuentes se inmovilizan en un soporte sólido antes de la puesta en contacto con una muestra de líquido corporal a cribar. De forma beneficiosa, el equipo puede comprender un medio de contacto por el cual tales moléculas antigénicas inmovilizadas de la o las primeras fuentes se ponen en contacto con la muestra de líquido corporal a cribar, de forma simultánea o sucesiva con la puesta en contacto de la muestra de líquido corporal con las moléculas antigénicas de la o las segundas fuentes. Se puede proporcionar de forma beneficiosa un medio de contacto por el cual las moléculas antigénicas inmovilizadas de la o las primeras fuentes se ponen en contacto con la muestra de líquido corporal a cribar para formar un complejo intermedio que comprende [molécula antigénica]-[analito de autoanticuerpo] en el que la molécula antigénica se inmoviliza en un soporte sólido, y el complejo intermedio inmovilizado así formado se pone en contacto posteriormente con dichas moléculas antigénicas de la o las segundas fuentes presentes en la fase de disolución, para formar dicho o dichos complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente] inmovilizados en el soporte sólido por medio de la molécula antigénica de la
primera fuente.
En una realización ejemplar de un método o de un equipo según la invención, dicha muestra de líquido corporal puede ser de un sujeto animal que se sospecha que padece de, es susceptible a, o que tiene una o más de las siguientes enfermedades, diabetes mellitus tipo 1 y/o síndrome de la persona rígida, diabetes mellitus tipo 2, una o más enfermedades autoinmunitarias tiroideas, enfermedad celíaca, una o más enfermedades del tejido conectivo, autoinmunidad suprarrenal, o una combinación de dos o más enfermedades autoinmunitarias diferentes.
Con respecto a los soportes sólidos y las condiciones que se emplean en un equipo según la presente invención, los soportes y las condiciones no difieren en general fundamentalmente de los soportes y las condiciones convencionales que se emplean en las técnicas de inmunoanálisis conocidas. Un soporte sólido para el uso en un equipo según la presente invención puede comprender una placa de ELISA tal como se emplea actualmente en las técnicas de ELISA conocidas, o se puede emplear cualquier otro soporte adecuado para el uso en la presente invención, tal como tubos, partículas, esferas magnéticas, nitrocelulosa o similares.
La detección de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2 según un método proporcionado por la presente invención, o mediante el empleo de un equipo proporcionado por la presente invención, puede ser útil en el diagnóstico de varias enfermedades a las que está asociada la presencia de tales analitos de autoanticuerpos. En particular, la presente invención se puede emplear en el cribado de una muestra de líquido corporal de un sujeto animal que se sospecha que padece de, es susceptible a, o que tiene cualquiera de las siguientes enfermedades, diabetes mellitus tipo 1 y/o síndrome de la persona rígida, diabetes mellitus tipo 2, una o más enfermedades autoinmunitarias tiroideas, enfermedad celíaca, una o más enfermedades del tejido conectivo, autoinmunidad suprarrenal, o una combinación de dos o más enfermedades autoinmunitarias diferentes, y la presente invención proporciona además un método para diagnosticar cualquiera de las enfermedades anteriores en un sujeto animal.
Se apreciará a partir de la descripción anterior que la presente invención proporciona métodos de ensayo y equipos para detectar, en una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal, analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2, y que son indicativas del inicio o de la presencia de enfermedades a las que está asociada la presencia de tales analitos de autoanticuerpos. La detección de tales autoanticuerpos en la muestra de líquido corporal (o al menos el nivel de tales autoanticuerpos en la muestra) es indicativa del inicio o la presencia probable de tales enfermedades en el sujeto del cual se obtiene la muestra, y puede permitir, por lo tanto, el diagnóstico del inicio o la presencia probable de tales enfermedades.
Además, la presente invención proporciona, por lo tanto, un método para ayudar a diagnosticar el inicio o la presencia probable de enfermedades asociadas a la presencia de autoanticuerpos reactivos con GAD_{65}, GAD_{67} o IA-2 en una o más enfermedades seleccionadas de diabetes mellitus tipo 2, una o más enfermedades autoinmunitarias tiroideas, enfermedad celíaca, una o más enfermedades del tejido conectivo, autoinmunidad suprarrenal en un sujeto animal que se sospecha que tiene o que es susceptible a dicha o dichas enfermedades, y el método comprende detectar autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67}, y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), por el cual se emplea un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, y los autoanticuerpos detectados pueden proporcionar una ayuda en el diagnóstico del inicio o la presencia probable de dichas enfermedades.
Una muestra de líquido corporal a cribar mediante la presente invención comprenderá en general las muestras de sangre u otras fracciones líquidas de la sangre, tales como en particular muestras de suero o muestras de plasma, pero la muestra puede ser en principio otro líquido biológico, tal como saliva u orina o extractos de tejidos solubilizados.
El término "antígeno" o "moléculas antigénicas", como se usa en este documento, indica un compuesto con el cual pueden interaccionar los anticuerpos descritos en este documento, y que es capaz de unirse a un anticuerpo para formar complejos específicos anticuerpo-antígeno. El antígeno o las moléculas antigénicas pueden ser naturales o sintéticas, y sus modificaciones se hacen preferiblemente de forma que no afecten de manera perjudicial a sus propiedades de unión a un anticuerpo específico.
Como se indicó anteriormente, la presente invención cubre el uso de "variantes", "análogos", "derivados" y "fragmentos" de las moléculas antigénicas descritas en este documento, y los términos "variantes", "análogos", "derivados" y "fragmentos", como se usan en este documento, se pueden caracterizar como polipéptidos que mantienen esencialmente la misma función o actividad biológica que las moléculas antigénicas naturales, y en particular con respecto a sus propiedades de unión para un anticuerpo específico. De forma adecuada, las variantes, los análogos, los derivados y los fragmentos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos descritos en este documento, tienen una conformación estructural primaria de aminoácidos en la que varios o algunos (tal como 5 a 10, 1 a 5 ó 1 a 3) residuos de aminoácidos de las moléculas antigénicas naturales están sustituidos, delecionados o añadidos, en cualquier combinación. Se prefieren especialmente entre éstos las sustituciones, adiciones o deleciones equivalentes, que no alteran o que no alteran sustancialmente la actividad o función biológica de las moléculas antigénicas naturales. Se pueden preferir las sustituciones conservativas como se describen más adelante con más detalle.
Más en particular, las variantes, los análogos o los derivados de las moléculas antigénicas adecuadas para el uso según la presente invención pueden ser aquellos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado), o aquellos en los que uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente o similar. Se considera que tales variantes, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de este documento.
Más en general, las variantes, los análogos o los derivados son aquellos que varían respecto de una referencia (tal como las moléculas antigénicas naturales a las que se hace referencia en este documento) mediante sustituciones conservativas de aminoácidos. Tales sustituciones son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones consideradas en general como conservativas son las sustituciones, de uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos A, V, L e I; entre los residuos de hidroxilo S y T; entre los residuos ácidos D y E; entre los residuos de amida N y Q; entre los residuos básicos K y R; y entre los residuos aromáticos F e Y.
Más en particular, el término "fragmento", como se usa en este documento, indica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente igual a parte de, pero no a toda, la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos naturales a los que se hace referencia en este documento, y sus variantes o derivados y tales fragmentos pueden ser "independientes", es decir, no formar parte de, o no estar fusionados a, otros aminoácidos o polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región. En el contexto de la presente invención, se apreciará que los fragmentos particularmente preferidos para el uso según la presente invención pueden ser uno o más epítopos de las moléculas antigénicas a las que se hace referencia en este documento, y como se describió anteriormente tales fragmentos de epítopos se pueden usar de forma "independiente" o se pueden usar dentro de un polipéptido mayor, tal como un polipéptido estructural, del cual pueden formar una parte o región. El uso de tales fragmentos de epítopos en una forma sustancialmente aislada o independiente según la presente invención puede ser ventajoso en cuanto a la estabilidad incrementada de tales fragmentos de epítopos sustancialmente aislados o independientes, en comparación con el uso de un antígeno de tamaño completo, y/o la especificidad incrementada asociada con el uso de tales fragmentos de epítopos sustancialmente aislados o independientes en comparación con el uso de un antígeno de tamaño completo.
La presente invención se ilustrará adicionalmente a continuación mediante el siguiente ejemplo, que no limita el alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplo
Preparación de placas de ELISA revestidas con GAD_{65}
Se diluyó GAD_{65} humana recombinante de >95% de pureza determinada mediante SDS-PAGE (M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Rees Smith, J Furmaniak. Clinica Chimica Acta, 1996 256: 175-188) hasta 150 \mug/L en un tampón de revestimiento que comprendía 1,59 g/L de Na_{2}CO_{3}, 2,94 g/L de NaHCO_{3}, 0,1 g/L de NaN_{3}, 0,01 g/L de rojo fenol y 5 mg/L de BSA (pH 9,2), y se añadieron 150 \muL de la disolución resultante a placas de ELISA de 96 pocillos (disponibles bajo la marca comercial Nunc F8 MaxiSorp). Las placas se incubaron después durante la noche a 4ºC, el contenido de los pocillos se aspiró y los pocillos se lavaron tres veces con un tampón de elevada salinidad (HSB) que comprendía 10 g/L de BSA, 1 g/L de NaN_{3}, 11,69 g/L de NaCl, 18,17 g/L de Tris, y 10 mL/L de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (disponible bajo la marca comercial Tween 20 (pH 8,3)). Se añadió un tampón post-revestimiento que comprendía 3 g/L de BSA, 9 g/L de NaCl, 20 g/L de sacarosa y 0,2 g/L de NaN_{3} a los pocillos (250 \muL por pocillo) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se aspiró el tampón post-revestimiento, las placas se secaron en vacío y se almacenaron en bolsas selladas con gel de sílice a 4ºC hasta su uso.
Marcaje de GAD_{65} con biotina
Se hizo reaccionar GAD_{65} humana recombinante en PBS (1,15 g/L de Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g/L de KH_{2}PO_{4}, 0,2 g/L de KCl, 8 g/L de NaCl) con un reactivo de biotinilización comercial (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin, disponible bajo la marca comercial EZ-Link de Perbio Science), a una proporción molar de 1 parte de GAD_{65} respecto de 24 partes de reactivo de biotinilización durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se paró mediante diálisis con PBS a 4ºC, y el material resultante se almacenó a -70ºC en alícuotas pequeñas.
La GAD_{65} resultante marcada con biotina según las técnicas anteriores (GAD_{65}-Bi) se diluyó hasta 3 mg/L en 20 g/L de BSA, se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum, se hicieron alícuotas de 1 mL por vial, se liofilizaron y después se almacenaron a -20ºC. Para el uso, se añadieron 7,5 mL de HSB al vial, lo que proporcionó una concentración final de GAD_{65}-Bi de 400 \mug/L.
Preparación de calibradores para el ensayo de autoanticuerpos de GAD_{65}
Se diluyeron preparaciones de IgG de tres autoanticuerpos monoclonales humanos hacia GAD_{65} (M J Powell, N Hayakawa, M Masuda, J Sanders, M Evans, LDKE Premawardhana, J Furmaniak, B Rees Smith. Isolation and characterization of three human monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase (GAD_{65}) from a patient without clinical diabetes. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2001 17 (S1): 021) en HSB para proporcionar una absorbancia a 450 nm de 4,0 a 0,1. Se sabe que estos anticuerpos monoclonales son representativos de los autoanticuerpos hacia GAD_{65} hallados en los sueros de pacientes con diabetes tipo 1 (M J Powell, N Hayakawa, M Masuda, J Sanders, M Evans, LDKE Premawardhana, J Furmaniak, B Rees Smith. Isolation and characterization of three human monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase (GAD_{65}) from a patient without clinical diabetes. Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 2001 17 (S1): 021).
\global\parskip0.850000\baselineskip
Detección de autoanticuerpos hacia GAD_{65}
Las placas revestidas con GAD_{65} preparadas según las técnicas anteriores se llevaron a temperatura ambiente, y se añadieron 25 \muL de muestra de suero sin diluir obtenida de donantes de ensayo, o los calibradores preparados según las técnicas anteriores, a los pocillos de la placa por duplicado, y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 200 rpm. Después se aspiraron las muestras, los pocillos se lavaron tres veces con tampón (8,7 g/L de NaCl, 2,4 g/L de Tris, 0,5 mL/L de Tween 20, pH 7,6), seguido de la adición de 100 \muL de GAD_{65}-Bi diluido en HSB (400 \mug/L) preparado según las técnicas anteriores, e incubación durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 200 rpm. Tras la incubación se aspiraron los contenidos de los pocillos, y se lavaron los pocillos tres veces con tampón (8,7 g/L de NaCl, 2,4 g/L de Tris, 0,5 mL/L de Tween 20, pH 7,6). A continuación, se añadieron 100 \muL de un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano diluido hasta 1 \mug/mL y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente, con agitación a 200 rpm. Tras la aspiración, los pocillos se lavaron tres veces con tampón (8,7 g/L de NaCl, 2,4 g/L de Tris, 0,5 mL/L de Tween 20, pH 7,6) y una vez con agua. Después se añadieron 100 \muL de tetrametilbencidina y se incubó durante 20 minutos en la oscuridad, seguido de la adición de 50 \muL de H_{2}SO_{4} de 0,5 mol/L. La absorbancia de los pocillos se midió después en un lector de placas de ELISA a 450 nm, o en el caso de las muestras que proporcionaban una DO a 450 nm > 4,0, la absorbancia se midió también a 405 nm.
Los procedimientos anteriores se aplicaron a autoanticuerpos hacia IA-2 y también a la detección combinada de autoanticuerpos hacia GAD_{65} e IA-2 (en particular, que implicaba la preparación de IA-2 marcado con biotina, IA-2-Bi). Las preparaciones de referencia de autoanticuerpos hacia IA-2 para la generación de una curva de calibración se prepararon a partir de autoanticuerpos policlonales hacia IA-2.
Resultados
Se muestra una curva de calibración típica para GAD_{65} obtenida mediante la DO a 450 nm en la Figura 1a. Se incluyeron siete calibradores de unidades de ELISA asignadas arbitrariamente de autoanticuerpos hacia GAD_{65} desde 0 unidades de ELISA/mL hasta 512 unidades de ELISA/mL. Los valores de DO a 450 nm para los calibradores fueron 0,033, 0,168, 0,310, 1,020, 3,187, >4,0 y >4,0 para los calibradores 0, 1,0, 2,0, 8,0, 32, 128 y 512, respectivamente. Los valores de DO a 405 nm fueron 0,008, 0,048, 0,090, 0,290, 0,929, 1,385 y 1,620 para los calibradores 0, 1,0, 2,0, 8,0, 32, 128 y 512, respectivamente, como se muestra en la Figura 1b. Por lo tanto, las muestras que proporcionaron valores de DO a 450 nm >4,0 se pudieron medir dentro del intervalo de la curva de calibración de DO a 405 nm mostrada en la Figura 1b. La absorbancia media \pm SD a 450 nm para n=25 sueros de donantes de sangre sanos fue 0,04 \pm 0,015.
Los resultados de las medidas de autoanticuerpos hacia GAD_{65} según la presente invención se muestran en las Tablas 1 y 2. Los resultados de los autoanticuerpos hacia GAD_{65} en los sueros de n=18 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 y n=14 pacientes con enfermedad de Graves se muestran en la Tabla 1. Los 18 sueros de diabéticos fueron positivos para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} cuando se emplearon técnicas basadas en ELISA según la presente invención (niveles >1,0 unidades de ELISA/mL), sin embargo solamente 13 de estos pacientes dieron positivo en el radioinmunoensayo (RIA). Las 5 muestras que fueron negativas en el RIA mostraron niveles bajos de autoanticuerpos hacia GAD_{65} en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención con una DO a 450 nm entre 0,117 y 0,980 (1,3 a 10,7 unidades de ELISA/mL). En el caso de las muestras con niveles bajos en el RIA (1,0 a 7,5 unidades de RIA/mL), los valores de DO a 450 nm en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención fueron de entre 0,290 y 1,060 (12,0 a 105,8 unidades de ELISA/mL). En el caso de las muestras con niveles mayores de autoanticuerpos hacia GAD_{65} en el RIA (26,8 a 118,8 unidades de RIA/mL), los valores de DO a 450 nm en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención fueron muy elevados, >4,0 (>128 unidades de ELISA/mL) y, por lo tanto, la relación entre los niveles de autoanticuerpos hacia GAD_{65} en la muestra y la curva de calibración se calculó tras la medida a 405 nm. La preincubación de los sueros de ensayo con GAD_{65} sin marcar (a una concentración final de 0,0005 a 0,01 \mug/mL) antes de llevar a cabo el ELISA dio como resultado una reducción dependiente de la dosis de los valores de DO a 450 nm. Estos experimentos confirmaron la especificidad de las técnicas basadas en ELISA con autoanticuerpos hacia GAD_{65} según la presente invención.
En el caso de n=14 sueros de pacientes con la enfermedad de Graves, los valores de DO a 450 nm para todas las muestras fueron menores de 0,05 (<1 unidades de ELISA/mL en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención); todas estas muestras dieron negativo para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} en el RIA (<1 unidades de RIA/mL).
La comparación del límite de detección inferior para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención y con RIA se muestra en la Tabla 2. En las diluciones de RIA de una preparación de referencia de la OMS de autoanticuerpos de las células de los islotes [NIBSC 97/550] de 250 a 31,25 unidades de la OMS/mL, se observaron niveles detectables de autoanticuerpos hacia GAD_{65}. Sin embargo, en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención, los autoanticuerpos hacia GAD_{65} fueron detectables en el caso de las diluciones de los patrones de la OMS de 250 a 3,91 unidades de la OMS/mL. Además, se muestra un ejemplo del perfil de dilución de una muestra de suero Z (de un paciente con niveles elevados de autoanticuerpos hacia GAD_{65}) en la Tabla 2. En el caso del RIA, los autoanticuerpos hacia GAD_{65} fueron detectables en la muestra Z en el intervalo de diluciones 1/8 a 1/8192. En el caso de las técnicas basadas en ELISA según la presente invención, los autoanticuerpos hacia GAD_{65} fueron detectables en el intervalo de diluciones 1/8 a 1/32768. Por lo tanto, los análisis de diluciones a punto final del patrón de la OMS y del suero del paciente indicaron que las diluciones de 4 veces a 8 veces mayores fueron detectables en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención en comparación con el RIA.
Se muestra un ejemplo de los resultados de la medida de autoanticuerpos hacia IA-2 mediante técnicas basadas en ELISA según la presente invención en la Tabla 3. Los valores típicos de DO a 450 nm para el grupo de calibradores de autoanticuerpos hacia IA-2 (0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16, 32, 64, 128 unidades de ELISA/mL) fueron de 0,054 a >4,0 y los valores de DO a 405 fueron de 0,008 a 1,874. Los sueros de n=10 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 que tenían niveles de autoanticuerpos hacia IA-2 en el RIA de 2,0 a 38,9 unidades de RIA/mL fueron todos positivos en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención. Estas muestras proporcionaron valores de DO a 450 nm entre 0,209 y >4,0 (2,6 a >32 unidades de ELISA/mL). El patrón de la OMS fue detectable en el RIA de autoanticuerpos hacia IA-2 a 250 unidades de la OMS/mL y 125 unidades de la OMS/mL, sin embargo, las diluciones adicionales (62,5 unidades de la OMS/mL y 31,25 unidades de la OMS/mL) fueron detectables en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención. Los valores de DO a 450 nm en el caso de n=10 sueros de donantes de sangre sanos (todos negativos para los autoanticuerpos hacia IA-2 en el RIA) fueron de entre 0,030 y 0,071 (<1 unidades de ELISA/mL).
Los resultados de un ensayo combinado de autoanticuerpos hacia GAD_{65} y de autoanticuerpos hacia IA-2 se muestran en las Tablas 4 y 5. La Tabla 4 muestra los resultados de la medida combinada de autoanticuerpos hacia GAD_{65} y de autoanticuerpos hacia IA-2 en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención, cuando se usó IA-2-Bi o GAD_{65}-Bi o IA-2-Bi más GAD_{65}-Bi en el ensayo. En el caso de los calibradores de autoanticuerpos hacia IA-2, no se detectó ninguna señal en las técnicas basadas en ELISA según la presente invención cuando se usó GAD_{65}-Bi, mientras que se observó un incremento dependiente de la dosis de la DO a 450 nm cuando se usó IA-2-Bi o IA-2-Bi más GAD_{65}-Bi. La señal de DO a 450 nm con IA-2-Bi solo fue básicamente igual que la señal con IA-2-Bi más GAD_{65}-Bi. En el caso de los calibradores de autoanticuerpos hacia GAD_{65}, no se detectó señal cuando se usó IA-2-Bi en el ensayo, mientras que se observó una respuesta dependiente de la dosis de la DO a 450 nm con GAD_{65}-Bi e IA-2-Bi más GAD_{65}-Bi. Las señales de DO a 450 nm en el caso de GAD_{65}-Bi solo e IA-2-Bi más GAD_{65}-Bi fueron comparables. La medida de ambos autoanticuerpos en diferentes diluciones de la muestra de suero Z mostró una buena concordancia con los resultados de los autoanticuerpos hacia IA-2 o los autoanticuerpos hacia GAD_{65} solos. El suero de un donante de sangre sano individual o de una mezcla de sueros de donantes de sangre sanos proporcionaron valores muy bajos de DO a 450 nm desde 0,006 hasta 0,046 independientemente de qué antígeno biotinilado se usó. Este experimento demuestra que en el ensayo combinado para medir los autoanticuerpos hacia IA-2 y los autoanticuerpos hacia GAD_{65}, los resultados son específicos y reflejan la presencia de los dos autoanticuerpos en la muestra de ensayo.
Se muestran resultados más detallados de la medida combinada de autoanticuerpos hacia IA-2 y autoanticuerpos hacia GAD_{65} en la Tabla 5. Se ensayaron sueros de pacientes con diabetes tipo 1 en el ensayo. Los autoanticuerpos hacia IA-2 y los autoanticuerpos hacia GAD_{65} se determinaron en estos sueros mediante RIA; los sueros 1-3 fueron positivos para ambos autoanticuerpos hacia IA-2 y autoanticuerpos hacia GAD_{65}, los sueros 4-6 fueron negativos para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} pero positivos para los autoanticuerpos hacia IA-2, los sueros 7-9 fueron positivos para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} pero negativos para los autoanticuerpos hacia IA-2, y los sueros 10-12 fueron negativos tanto para los autoanticuerpos hacia IA-2 o GAD_{65}. Como se muestra en la Tabla 5, en el ensayo combinado se detectaron uno u otro o ambos autoanticuerpos en las muestras de suero. Además, en el caso del suero 6 que tuvo niveles dudosos de autoanticuerpos hacia IA-2 mediante RIA (0,9 unidades de RIA/mL), la señal en las técnicas basadas en ELISA combinadas según la presente invención fue claramente positiva.
Se muestran ejemplos adicionales de resultados con ELISA de autoanticuerpos hacia GAD_{65}, autoanticuerpos hacia IA-2 y autoanticuerpos hacia GAD_{65} e IA-2 combinados según la presente invención para diferentes subgrupos de pacientes en las Tablas 6, 7 y 8, respectivamente.
Conclusiones
Los resultados anteriores demuestran que las técnicas basadas en procedimientos no radiactivos según la presente invención permiten la medida de autoanticuerpos hacia GAD_{65} en las muestras de ensayo. Las técnicas basadas en procedimientos no radiactivos según la presente invención se pueden emplear también para medir autoanticuerpos hacia IA-2 por separado o simultáneamente. Las medidas son específicas y concuerdan con los resultados de las medidas de autoanticuerpos hacia GAD_{65} y autoanticuerpos hacia IA-2 mediante métodos de referencia radiactivos establecidos (M Powell, L Prentice, T Asawa, R Kato, J Sawicka, H Tanaka, V Petersen, A Munkley, S Morgan, B Rees Smith, J Furmaniak. Clinica Chimica Acta, 1996 256: 175-188; y M Masuda, M Powell, S Chen, C Beer, P Fichna, B Rees Smith, J Furmaniak. Autoantibodies to IA-2 in insulin-dependent diabetes mellitus. Measurements with a new immunoprecipitation assay. Clinica Chimica Acta, 2000 291: 53-66). Además, las medidas de autoanticuerpos hacia GAD_{65} y de autoanticuerpos hacia IA-2 mediante las técnicas basadas en procedimientos no radiactivos según la pre-
sente invención son al menos igual de sensibles en comparación con los resultados mediante RIA (Tablas 1, 2 y 3).
Las técnicas según la presente invención proporcionan un ensayo que no es radiactivo para medir los autoanticuerpos hacia GAD_{65} o los autoanticuerpos hacia IA-2 con una sensibilidad elevada, que es cómodo de usar para fines de diagnóstico y de cribado. Un ensayo combinado para los autoanticuerpos hacia GAD_{65} e IA-2 según la presente invención puede ser particularmente beneficioso para el uso en programas de cribado con poblaciones grandes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Autoanticuerpos hacia GAD_{65} en sueros de pacientes en ELISA según la presente invención y radioinmunoensayo
1
2
TABLA 2 Comparación de la sensibilidad de la medida del Ab hacia GAD_{65} en ELISA y en RIA
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Medidas de autoanticuerpos hacia IA-2/ICA512 en ELISA y en RIA basado en IA-2/ICA512 marcado con ^{125}I
5
6
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Medidas combinadas de Ab hacia GAD_{65} y hacia IA-2/ICA512 en ELISA
7
TABLA 5 Medidas combinadas de Ab hacia GAD_{65} y Ab hacia IA-2/ICA512 en ELISA
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Ab hacia GAD_{65} medido en diferentes grupos de pacientes mediante ELISA o radioinmunoensayo (RIA) basado en GAD_{65} marcado con ^{125}I
10
^{1}Los valores de las muestras positivas en el ELISA de Ab hacia GAD_{65} fueron de 11 unidades/mL y >500 unidades/mL (todas las unidades/mL son unidades de la OMS respecto del patrón 97/550). Los experimentos de adsorción indicaron la presencia de Ab específicos hacia GAD_{65}. Las mismas muestras fueron negativas y de 2500 unidades/mL en el RIA, respectivamente.
^{2}Los valores de las muestras positivas en el RIA de Ab hacia GAD_{65} fueron 33, 100 y 2500 unidades/mL. Las mismas muestras fueron negativas, negativas y >500 unidades/mL en el ELISA, respectivamente.
^{3}Intervalo de valores: 5,2 - mayor de 500 unidades/mL.
^{4}Intervalo de valores: negativo - 3800 unidades/mL.
^{5}El valor de una muestra positiva en el ELISA de Ab hacia GAD_{65} fue 40 unidades/mL. La misma muestra fue negativa en el RIA.
^{6}Los valores de las muestras positivas en el ELISA de Ab hacia GAD_{65} fueron 306 y 500 unidades/mL. Las mismas muestras tuvieron un valor de 354 unidades/mL y 1700 unidades/mL en el RIA, respectivamente.
^{7}Los valores de las muestras positivas en el RIA de Ab hacia GAD_{65} fueron 78, 354 y 1700 unidades/mL. Las mismas muestras tuvieron un valor negativo, 306 y 500 unidades/mL en el ELISA, respectivamente.
^{8}El valor de una muestra positiva en el ELISA de Ab hacia GAD_{65} fue 24 unidades/ml; esta muestra fue negativa en el RIA.
^{9}La misma muestra fue positiva en el ELISA y el RIA de Ab hacia GAD_{65}, con valores de 15 unidades/mL y 30 unidades/mL, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 7 Ab hacia IA-2 medido en diferentes grupos de pacientes mediante ELISA o radioinmunoensayo (RIA) basado en IA-2 marcado con ^{125}I
12
^{1}Los valores de las muestras positivas en el ELISA de Ab hacia IA-2 fueron de 44 unidades/mL y 179 unidades/mL (todas las unidades/mL son unidades de la OMS respecto del patrón 97/550). Los experimentos de adsorción indicaron la presencia de Ab específicos hacia IA-2 en estas muestras. Las mismas muestras fueron negativas en el RIA.
^{2}Los valores de las muestras positivas en el RIA de Ab hacia IA-2 fueron 150 unidades/mL y 288 unidades/mL. Las mismas muestras fueron negativas en el ELISA.
^{3}Intervalo de valores: 132 - >4000 unidades/mL.
^{4}Intervalo de valores: 178 - 4508 unidades/mL.
^{5}El valor de una muestra positiva para Ab hacia IA-2 fue 101 unidades/mL. Esta muestra fue negativa en el RIA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8 Resultados del ELISA de Ab hacia GAD_{65}, ELISA de Ab hacia IA-2 y ELISA de Ab hacia GAD_{65} + Ab hacia IA-2 en diferentes grupos de pacientes
13
^{1}El valor de Ab hacia GAD_{65} para las muestras positivas en el ELISA osciló en el intervalo 7,3 - >500 unidades/mL (las unidades/mL son unidades de la OMS respecto del patrón 97/550).
^{2}Los valores de Ab hacia IA-2 para las muestras positivas en el ELISA oscilaron en el intervalo 34 - 3613 unidades/mL (las unidades/mL son unidades de la OMS respecto del patrón 97/550).
^{3}Todos los resultados de los ELISA combinados se expresaron en forma de un índice calculado como sigue:
\frac{DO_{450 \ nm} \ de \ la \ muestra}{DO_{450 \ nm} \ de \ la \ mezcla \ de \ sueros \ de \ donantes \ de \ sangre \ sanos};
\newpage
los valores de 2,0 o superiores fueron positivos
18 sueros fueron positivos para Ab hacia GAD_{65} y negativos para Ab hacia IA-2; los 18 fueron positivos en el ELISA combinado.
4 sueros fueron positivos para Ab hacia IA-2 y negativos para Ab hacia GAD_{65}; los 4 fueron positivos en el ELISA combinado.
10 sueros fueron positivos para Ab hacia GAD_{65} y para Ab hacia IA-2; los 10 fueron positivos en el ELISA combinado.
1 suero fue negativo para Ab hacia GAD_{65} y para Ab hacia IA-2, pero positivo en el ELISA combinado.
2 sueros fueron negativos en los 3 ensayos.
^{4}Los niveles de Ab hacia GAD_{65} fueron de 10 unidades/mL y los Ab hacia IA-2 fueron negativos en la muestra positiva.
^{5}Los Ab hacia GAD_{65} fueron negativos y los niveles de Ab hacia IA-2 fueron de 76 unidades/mL en la muestra positiva.
^{6}Las muestras positivas fueron iguales a como se describió en 4 y 5 (valor del índice 7,8 y 4,8, respectivamente).
Resultados del ELISA de Ab hacia GAD_{65}, ELISA de Ab hacia IA-2 y ELISA de Ab hacia GAD_{65} + Ab hacia IA-2 en diferentes grupos de pacientes.
^{7}Los niveles de Ab hacia GAD_{65} fueron 9 y >500 unidades/mL pero los Ab hacia IA-2 fueron negativos en las dos muestras positivas.
^{8}Las muestras positivas fueron iguales a como se describió en 7. Los valores del índice para estas muestras fueron 3,6 y 55,0, respectivamente.
^{9}Los niveles de Ab hacia GAD_{65} fueron 15 unidades/mL, pero los Ab hacia IA-2 fueron negativos.
^{10}La muestra positiva fue igual a como se describió en 9. El valor del índice fue 6,0.

Claims (13)

1. Un método para cribar una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal en busca de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y dicho método comprende:
(a)
proporcionar una o más primeras fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2;
(b)
proporcionar una o más segundas fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan de dicho grupo de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67} e IA-2;
(c)
poner en contacto dichas moléculas antigénicas proporcionadas por las etapas (a) y (b) de forma simultánea o sucesiva con dicha muestra de líquido corporal a cribar, por lo cual los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar con dichas moléculas antigénicas para formar uno o más complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente];
(d)
antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio de inmovilización por el cual dicha molécula antigénica de dicha primera fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) se inmoviliza en un soporte sólido antes de, o durante, o después de, la etapa (c);
(e)
antes de, o durante, o después de, la etapa (c), proporcionar un medio para el marcaje detectable directo o indirecto, por lo que se proporciona a dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente presente en un complejo formado en la etapa (c) tal medio de marcaje detectable directo o indirecto antes de, o durante, o después de, la etapa (c); y
(f)
detectar la presencia de complejos formados en (c) inmovilizados según (d) para proporcionar una indicación de los analitos de autoanticuerpos presentes en dicha muestra.
2. Un método según la reivindicación 1, que comprende proporcionar (i) primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas de GAD con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas de GAD se seleccionan de GAD_{65}, GAD_{67}, y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67}, antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende GAD_{65} o GAD_{67}, en el que dichas moléculas antigénicas de GAD de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido según la etapa (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas de GAD de dicha segunda fuente según la etapa (e); y (ii) las primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) con las cuales los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) se seleccionan del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), GAD_{65}, GAD_{67}, y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), en el que las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido según la etapa (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha segunda fuente según la etapa (e).
3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichas moléculas antigénicas de dicha o dichas primeras fuentes se inmovilizan en un soporte sólido antes de la puesta en contacto con una muestra de líquido corporal a cribar.
4. Un método según la reivindicación 3, en el que dichas moléculas antigénicas inmovilizadas de dicha o dichas primeras fuentes se ponen en contacto posteriormente con la muestra de líquido corporal a cribar de forma simultánea o sucesiva con la puesta en contacto de la muestra de líquido corporal con dichas moléculas antigénicas de dicha o dichas segundas fuentes.
5. Un método según la reivindicación 4, en el que dichas moléculas antigénicas inmovilizadas de dicha o dichas primeras fuentes se ponen en contacto posteriormente con la muestra de líquido corporal a cribar para formar un complejo intermedio que comprende [molécula antigénica]-[analito de autoanticuerpo] en el que la molécula antigénica se inmoviliza en un soporte sólido, y el complejo intermedio así inmovilizado se pone en contacto posteriormente con dichas moléculas antigénicas de dicha o dichas segundas fuentes, presentes en la fase de disolución, para formar complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente] inmovilizados en el soporte sólido por medio de la molécula antigénica de la primera fuente.
6. Un equipo para cribar una muestra de líquido corporal obtenida de un sujeto animal en busca de analitos de autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y dicho equipo comprende:
(a)
una o más primeras fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2);
(b)
una o más segundas fuentes de moléculas antigénicas con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas se seleccionan del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67} y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2);
(c)
medios para poner en contacto dichas moléculas antigénicas proporcionadas por las etapas (a) y (b) de forma simultánea o sucesiva con dicha muestra de líquido corporal a cribar, por lo cual los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar con dichas moléculas antigénicas para formar uno o más complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente];
(d)
medios para inmovilizar en un soporte sólido dicha molécula antigénica de dicha primera fuente presente en un complejo como se definió en (c), antes de, o durante, o después de, la puesta en contacto de la molécula antigénica de dicha primera fuente con la muestra de líquido corporal a cribar;
(e)
medios para proporcionar un medio de marcaje detectable directo o indirecto a dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente presente en un complejo como se definió en (c), antes de, o durante, o después de, la puesta en contacto de dicha molécula antigénica de dicha segunda fuente con dicha muestra de líquido corporal a cribar; y
(f)
medios para detectar la presencia de complejos como se definieron en (c) inmovilizados como se definió en (d) para proporcionar una indicación de los analitos de autoanticuerpos en dicha muestra.
7. Un equipo según la reivindicación 6, en el que dichas moléculas antigénicas se seleccionan de moléculas antigénicas de GAD_{65} y GAD_{67} o de las moléculas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2).
8. Un equipo según la reivindicación 7, que comprende (i) primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas de GAD con las que los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas de GAD se seleccionan de GAD_{65}, GAD_{67}, y moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas de GAD_{65}, GAD_{67}, antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende GAD_{65} o GAD_{67}, en el que las moléculas antigénicas de GAD de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido como se definió en (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas de GAD de dicha segunda fuente como se definió en (e); y (ii) las primeras y segundas fuentes de moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) con las cuales los analitos de autoanticuerpos, cuando están presentes en dicha muestra de líquido corporal, pueden interaccionar, y cuyas moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) se seleccionan del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), y de las moléculas de fusión que comprenden dos o más moléculas antigénicas fusionadas directamente o indirectamente seleccionadas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), GAD_{65}, GAD_{67}, y en el que al menos una de dichas moléculas antigénicas de dicha molécula de fusión comprende el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), en el que las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha primera fuente se inmovilizan en un soporte sólido como se definió en (d), y se proporciona un medio de marcaje a las moléculas antigénicas del antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2) de dicha segunda fuente como se definió en (e).
9. Un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende un medio de inmovilización por el cual las moléculas antigénicas de dicha o dichas primeras fuentes se inmovilizan en un soporte sólido antes de la puesta en contacto con una muestra de líquido corporal a cribar.
10. Un equipo según la reivindicación 9, que comprende un medio de contacto por el cual tales moléculas antigénicas inmovilizadas de dicha o dichas primeras fuentes se ponen en contacto con la muestra de líquido corporal a cribar, de forma simultánea o sucesiva con la puesta en contacto de la muestra de líquido corporal con las moléculas antigénicas de dicha o dichas segundas fuentes.
11. Un equipo según la reivindicación 10, en el que se proporciona un medio de contacto por el cual las moléculas antigénicas inmovilizadas de dicha o dichas primeras fuentes se ponen en contacto con la muestra de líquido corporal a cribar para formar un complejo intermedio que comprende [molécula antigénica]-[analito de autoanticuerpo] en el que la molécula antigénica se inmoviliza en un soporte sólido, y el complejo intermedio inmovilizado así formado se pone en contacto posteriormente con las moléculas antigénicas de dicha o dichas segundas fuentes presentes en la fase de disolución, para formar dicho o dichos complejos que comprenden [molécula antigénica de dicha primera fuente]-[analito de autoanticuerpo]-[molécula antigénica de dicha segunda fuente] inmovilizados en el soporte sólido por medio de la molécula antigénica de la primera fuente.
12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que dicha muestra de líquido corporal es de un sujeto animal que se sospecha que padece de, es susceptible a, o que tiene una o más de las siguientes enfermedades, diabetes mellitus tipo 1 y/o síndrome de la persona rígida, diabetes mellitus tipo 2, una o más enfermedades autoinmunitarias tiroideas, enfermedad celíaca, una o más enfermedades del tejido conectivo, autoinmunidad suprarrenal, o una combinación de dos o más enfermedades autoinmunitarias diferentes.
13. Un método para ayudar a diagnosticar el inicio o la presencia probable de una o más enfermedades seleccionadas de diabetes mellitus tipo 2, una o más enfermedades autoinmunitarias tiroideas, enfermedad celíaca, una o más enfermedades del tejido conectivo, autoinmunidad suprarrenal, en un sujeto animal que se sospecha que tiene o que es susceptible a dicha o dichas enfermedades, y el método comprende detectar autoanticuerpos reactivos con una o más moléculas antigénicas de las células de los islotes pancreáticos seleccionadas del grupo que consiste en GAD_{65}, GAD_{67}, y el antígeno de las células de los islotes similar a la proteína tirosina fosfatasa (IA-2), por el cual se emplea un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, y los autoanticuerpos detectados pueden proporcionar una ayuda en el diagnóstico del inicio o la presencia probable de enfermedades asociadas a dichos autoanticuerpos.
ES02779738T 2001-11-28 2002-11-26 Deteccion de anticuerpos reactivos con moleculas antigenicas de las celulas de los islotes pancreaticos. Expired - Lifetime ES2320427T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0128583.2A GB0128583D0 (en) 2001-11-28 2001-11-28 Detection of autoantibodies indicative of diabetes
GB0128583 2001-11-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2320427T3 true ES2320427T3 (es) 2009-05-22

Family

ID=9926667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02779738T Expired - Lifetime ES2320427T3 (es) 2001-11-28 2002-11-26 Deteccion de anticuerpos reactivos con moleculas antigenicas de las celulas de los islotes pancreaticos.

Country Status (11)

Country Link
US (4) US8129132B2 (es)
EP (1) EP1448993B1 (es)
JP (2) JP2005512056A (es)
CN (1) CN100439920C (es)
AT (1) ATE426166T1 (es)
AU (1) AU2002343076A1 (es)
DE (1) DE60231639D1 (es)
DK (1) DK1448993T3 (es)
ES (1) ES2320427T3 (es)
GB (1) GB0128583D0 (es)
WO (1) WO2003048772A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0128583D0 (en) * 2001-11-28 2002-01-23 Rsr Ltd Detection of autoantibodies indicative of diabetes
US7131202B2 (en) * 2004-03-11 2006-11-07 The Gillette Company Cutting members for shaving razors with multiple blades
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
JP2011106644A (ja) 2009-10-22 2011-06-02 Honda Motor Co Ltd 変速機の油圧制御装置
EP3421487B1 (en) 2010-10-19 2023-06-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Peptides for modulating t-cell activity and uses thereof
EP2631653A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-28 Charité - Universitätsmedizin Berlin Identification of modulators of binding properties of antibodies reactive with a member of the insulin receptor family
CN102967704B (zh) * 2012-11-26 2014-05-14 深圳市伯劳特生物制品有限公司 一种用于糖尿病自身抗体6项联检试剂盒
WO2014123131A1 (ja) * 2013-02-05 2014-08-14 Hashida Seiichi １型糖尿病の早期診断マーカーであるｇａｄ抗体の高感度測定方法
CN104098670A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 苏州偲聚生物材料有限公司 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒
CN104098677A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 苏州偲聚生物材料有限公司 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒
CN104569425B (zh) * 2014-12-18 2017-02-08 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种与酪氨酸磷酸酶抗体特异结合的抗原蛋白质
CN104560911B (zh) * 2014-12-18 2018-06-05 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种融合抗原蛋白质
CN107044977A (zh) * 2016-06-30 2017-08-15 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 一种酪氨酸磷酸酶抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
US11793854B2 (en) 2019-03-21 2023-10-24 Op-T Llc Methods for reducing symptoms of multiple sclerosis using a six-amino acid long peptide that inhibits CD40-CD150 interaction
WO2020210726A1 (en) * 2019-04-12 2020-10-15 Op-T Llc Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
CN112710839A (zh) * 2020-12-14 2021-04-27 三诺生物传感股份有限公司 一种gad65自身抗体检测试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3874741T2 (de) * 1987-06-09 1993-07-22 Cambridge Life Sciences Immunassay-verfahren.
CN1036080A (zh) * 1988-03-23 1989-10-04 广东省肇庆地区第一人民医院 表面抗原的快速检测法
AU675416B2 (en) * 1991-11-01 1997-02-06 Joslin Diabetes Center Antigen associated with type I diabetes mellitus
ES2161697T3 (es) 1991-11-19 2001-12-16 Amylin Pharmaceuticals Inc Peptidos agonistas de amilina y usos de los mismos.
US5200318A (en) * 1992-05-13 1993-04-06 Miles Inc. Diagnosis of IDDM with a panel of immunoreagents
ES2318847T3 (es) * 1992-12-03 2009-05-01 The Regents Of The University Of California Metodos y reactivos mejorados para el diagnostico y el tratamiento de diabetes y del sindrome de stiff man.
CN1053276C (zh) * 1997-03-11 2000-06-07 中日友好医院 一种检测胰岛细胞抗体的方法
DE19723463A1 (de) * 1997-06-04 1998-12-10 Dade Behring Marburg Gmbh Immunchemische Bestimmung von multivalenten Analyten
GB9719357D0 (en) * 1997-09-11 1997-11-12 Ortho Clinical Diagnostics Immunoassay Utilizing Two Incubations With Labelled Antigen
US6187563B1 (en) * 1998-08-07 2001-02-13 Yale University βIV-spectrin-polypeptides and nucleic acids encoding same
CN1283794A (zh) * 2000-07-12 2001-02-14 华西医科大学 同步快速测定多项免疫指标技术
GB0128583D0 (en) * 2001-11-28 2002-01-23 Rsr Ltd Detection of autoantibodies indicative of diabetes

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002343076A1 (en) 2003-06-17
US10488410B2 (en) 2019-11-26
CN1585900A (zh) 2005-02-23
US8129132B2 (en) 2012-03-06
US20160356771A1 (en) 2016-12-08
DK1448993T3 (da) 2009-06-22
JP2009265109A (ja) 2009-11-12
DE60231639D1 (de) 2009-04-30
US20160356772A1 (en) 2016-12-08
EP1448993A2 (en) 2004-08-25
GB0128583D0 (en) 2002-01-23
WO2003048772A3 (en) 2003-10-16
US20120225955A1 (en) 2012-09-06
US9435797B2 (en) 2016-09-06
JP5711449B2 (ja) 2015-04-30
ATE426166T1 (de) 2009-04-15
WO2003048772A2 (en) 2003-06-12
US10481156B2 (en) 2019-11-19
EP1448993B1 (en) 2009-03-18
CN100439920C (zh) 2008-12-03
JP2005512056A (ja) 2005-04-28
US20050019837A1 (en) 2005-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10488410B2 (en) Detection of autoantibodies reactive with pancreatic islet cell antigenic molecules and/or insulin
US4857456A (en) Assay of Bone morphogenetic protein (BMP) and anti-BMP antibody for the diagnosis of bone disorders
US5200318A (en) Diagnosis of IDDM with a panel of immunoreagents
Endres et al. Immunochemiluminometric and immunoradiometric determinations of intact and total immunoreactive parathyrin: performance in the differential diagnosis of hypercalcemia and hypoparathyroidism
CA2089870C (en) Immunological test for the presence of antibodies in biological fluids, and a kit for carrying out the test
TW201339578A (zh) 在低傳導率下具有增加之靈敏度的自體抗體測量
CN109187971A (zh) 神经元特异性烯醇化酶化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CA2165970A1 (en) Mca assay/kit for detecting metal cations
US9778250B2 (en) Detecting inclusion body myositis
AU715797B2 (en) Methods for determining the presence of brain protein S-100
JP3425149B2 (ja) 無症候性患者における糖尿病可能性評価方法
US5674692A (en) Methods for diabetes susceptibility assessment in asymptomatic patients
EP1071956B1 (en) Assays for autoantibodies
JPS5925183B2 (ja) エラスタ−ゼ−１の測定方法
EP0627081B1 (en) Assay method for the determination of autoantibodies in biological fluids
EP0245459A1 (en) T CELL LYMPHOTROPHIC VIRUS PROTEIN AND TEST PROCEDURE.
Harchali et al. Microparticle-enhanced nephelometric immunoassay of anti-thyroid peroxidase autoantibodies in thyroid disorders
JPH0694708A (ja) 抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の検出方法
Hofstad et al. Myasthenia gravis muscle antibodies examined by ELISA: IgG and IgM antibodies characterize different patient subgroups
JPH0228558A (ja) 超高感度特異的抗体の測定法
GB2080949A (en) Method or measuring by Enzyme Immunoassay the Level of Antibody to a Liver-specific Membrane Lipoprotein