ES2318847T3 - Metodos y reactivos mejorados para el diagnostico y el tratamiento de diabetes y del sindrome de stiff man. - Google Patents
Metodos y reactivos mejorados para el diagnostico y el tratamiento de diabetes y del sindrome de stiff man. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA FRAGMENTOS DE GAD 65 QUE SON ESPECIFICAMENTE REACTIVAS CON AL MENOS UNA CLASE DE AUTOANTICUERPOS GAD{SUB,65}. LA MAYORIA DE LOS FRAGMENTOS ESTAN SUSTANCIALMENTE LIBRES DE AMINOACIDOS N-TERMINALES QUE DE OTRA MANERA LIMITARIAN LA SOLUBILIDAD. LOS DIFERENTES FRAGMENTOS CONTIENEN EPITOPOS PARA LAS DISTINTAS CLASES DE ANTICUERPOS GAD{SUB,65}. LOS ANTICUERPOS SON UTILIZADOS EN METODOS DE DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DEL MELLITUS DIABETICO DEPENDIENTE DE LA INSULINA Y EL SINDROME DE STIFF MAN.
Description
Métodos y reactivos mejorados para el
diagnóstico y el tratamiento de diabetes y del síndrome de Stiff
Man.
Esta solicitud se relaciona en contenido con la
solicitud estadounidense con serial número 07/984.935, presentada
en 3 de diciembre de 1992. El contenido de la presente invención se
relaciona con aquel de USSN 07/756.207, presentada el 6 de
septiembre de 1991.
La presente invención se relaciona generalmente
con métodos y reactivos mejorados para identificar y tratar
individuos que sufren de, o son susceptibles a la diabetes mellitus
dependiente de insulina o al síndrome de Stiff Man.
La diabetes mellitus dependiente de insulina
(IDDM) (también conocida como diabetes tipo 1) aflige principalmente
a gente joven. Aunque se encuentra disponible insulina para el
tratamiento, la morbilidad y la mortalidad varias veces mayores
asociadas con esta enfermedad requieren del desarrollo de métodos
preventivos y de diagnóstico temprano. La destrucción de las
células \beta pancreáticas (que son las células que segregan
insulina de los islotes de Langerhans) que precede al nacimiento
clínico de la IDDM, es mediada por mecanismos autoinmunes. Entre
las anormalidades autoinmunes estudiadas más completamente asociadas
con la enfermedad está la alta incidencia de anticuerpos
circulantes específicos para las células \beta al momento del
diagnóstico. Los estudios familiares han mostrado que los
anticuerpos aparecen antes de una IDDM palpable con varios años de
anticipación, lo cual sugiere un largo período que anuncia la
presencia de la enfermedad de autoinmunidad humoral antes de la
aparición de los síntomas clínicos. Los estudios familiares han
documentado también una pérdida lenta pero progresiva de la
respuesta de la insulina a la glucosa intravenosa en los años
previos al diagnóstico. La presencia de anticuerpos específicos
para las células \beta en el período prediabético probablemente
refleja el progreso del proceso autoinmune, en que eventualmente
conduce a un agotamiento crítico de células \beta y a dependencia
de la insulina. Se ha estimado que únicamente el 10% de la masa
total de células \beta permanece al momento del nacimiento
clínico.
El objetivo de los anticuerpos en células
\beta pancreáticas en la IDDM fue identificado originalmente como
un antígeno de 64 kDa por medio de experimentos de
inmunoprecipitación utilizando lisados de detergente de islotes
humanos (Baekkeskov y colaboradores, (1982), Nature 298: 167 - 169).
Anticuerpos para el antígeno de 64 kDa preceden al inicio clínico de
la IDDM y se ha mostrado que tienen una incidencia de
aproximadamente del 80% en el inicio clínico y durante el período
prediabético (Baekkeskov y colaboradores, (1987), J. Clin. Invest.
79: 926 - 934; Atkinson y colaboradores, (1990), Lancet 335: 1357 -
1360; y Christie y colaboradores, (1988), Diabetología 31: 597 -
602). La proteína de 64 kDa humana y de rata son altamente
homólogas con relación a los epítopos autoantigénicos (Christie y
colaboradores, (1990), J. Biol. Chem. 265: 376 - 381). El
autoantígeno de 64 kDa en islotes de Langerhans se detecta en tres
formas diferentes con relación a la hidrofobicidad y la
compartamentalización: una forma hidrofílica soluble de 65 kDa y Pi
de aproximadamente 7,1; una forma hidrófoba de 64 kDa, que es
soluble o de una baja avidez de membrana y tiene un Pi de
aproximadamente 6,7; y una forma hidrófoba firmemente anclada a la
membrana de la misma movilidad electroforética y Pi. Tanto la forma
enlazada a la membrana como la hidrófoba soluble de 64 kDa existen
como dos isoformas, a y b, que tienen idéntico Pi y propiedades
hidrófobas pero difieren aproximadamente en 1 kDa (Baekkeskov y
colaboradores, (1989), Diabetes 38: 1133 - 1141). Se encontró que el
autoantígeno de 64 kDa era específico para la célula \beta en un
análisis de una cantidad de tejidos, que no incluyeron al cerebro
(Christie y colaboradores, ver más arriba).
Se ha demostrado recientemente que el
autoantígeno de 64 kDa de células \beta pancreáticas es ácido
glutámico descarboxilasa (GAD, L-glutamato
1-carboxi-liase, EC 4.1.1.15). La
enzima GAD sintetiza GABA a partir de ácido glutámico y es una
proteína abundante de las neuronas que secretan GABA en el sistema
nervioso central (CNS). Ver la solicitud de patente en trámite
junto con la presente, con Serial Número 07/756,207; Baekkeskov y
colaboradores, (1990), Nature 347: 151 - 157.
GAD es una proteína abundante y parcialmente
caracterizada de neuronas que segregan GABA en el sistema nervioso
central. La enzima GAD tiene dos formas codificadas por dos genes no
alélicos distintos, GAD_{67} y GAD_{65} (conocidas también como
GAD-1 y GAD-2), que pueden haberse
desarrollado de un gen ancestral común durante filogenia de
vertebrados. GAD_{67} y GAD_{65} son muy diferentes en los
primeros 95 aminoácidos pero comparten una homología significativa
(aproximadamente del 75%) en el resto de la molécula. Ambas tienen
una zona activa proteolítica de 80 - 90 aminoácidos a partir del
N-terminal (Christgau y colaboradores, (1991), J.
Biol. Chem. 266: 21257 - 21264; Christgau y colaboradores, (1992),
J. Cell Biol. 118: 309 - 320), que puede representar un límite de
un dominio. El dominio N-terminal alberga las
modificaciones posteriores a la traducción que resultan en el
anclaje de GAD_{65} a la membrana de vesículas sinápticas y
controla la ubicación subcelular precisa de esta proteína.
En tejido cerebral, se producen tanto GAD_{65}
como GAD_{67} (Bu y colaboradores, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 2115 - 2119; Kaufman y colaboradores, (1986), Science 232:
1138 - 1140; Chang & Gottlieb (1988), J. Neurosci. 8: 2123 -
2130). Algunas especies expresan ambas proteínas GAD en sus islotes
pancreáticos. Sin embargo, en islotes humanos únicamente se expresa
GAD_{65} (Karlsen y colaboradores, (1991), Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 88: 8337 - 8341; Karlsen y colaboradores, (1992), Diabetes 41:
1355 - 1359). La reactividad inmunogénica cruzada entre islotes de
GAD_{65} y GAD_{67} de diferentes especies de vertebrados indica
un alto grado de conservación de determinantes antigénicos desde
roedores hasta humanos (Legay y colaboradores, (1986), J.
Neurochem. 46: 1478 - 1486). Consistente con esta observación, los
polipéptidos de las GAD_{65} y GAD_{67} humanas comparten una
identidad de secuencia de aminoácidos mayor al 90% con polipéptidos
análogos en otros mamíferos. Bu y colaboradores, ver más
arriba.
Los ADNc de GAD_{67} y GAD_{65} del CNS
humano han sido clonados y secuenciados (Bu y colaboradores, ver
más arriba). Karlsen y colaboradores, (1991), ver más arriba, han
reportado datos de secuencia para GAD_{65} de la célula
pancreática beta humana. La información de la secuencia de ADN está
disponible también para las GAD_{65} y GAD_{67} del CNS de rata
(Erlander y colaboradores, (1991), Neuron 7: 91 - 100; Julien y
colaboradores, (1990), J. Neurochem. 54: 703 - 705) y GAD_{65} de
células beta de rata (Michelson y colaboradores, (1991), Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 8754 - 8758).
La equivalencia demostrada del antígeno de 64
kDa de IDDM y GAD explica las primeras observaciones que relacionan
a la IDDM con una rara, pero severa, enfermedad neurológica llamada
síndrome de Stiff Man, en la cual se ha reconocido a la GAD como el
antígeno predominante (Solimena y colaboradores, (1988), N. Engl. J.
Med. 318: 1012 - 1020; Solimena y colaboradores, (1990), N. Engl.
J. Med. 322: 1555 - 1560). Casi todos los pacientes positivos para
autoanticuerpo neuronal GABA-érgico fueron también positivos para
anticuerpos citoplasmáticos de células de islote, y un tercio tenía
IDDM. Además, se detectaron anticuerpos para neuronas GABA-érgicas
en 3 de 74 pacientes con IDDM sin SMS (Solimena y colaboradores,
(1988), ver más arriba, y Solimena y colaboradores, (1990), ver más
arriba). Otros estudios también han reportado una alta incidencia de
IDDM en pacientes con SMS (Lorish y colaboradores, (1989), Mayo
Clin. Proc. 64: 629 - 636).
La equivalencia demostrada del antígeno de 64
kDa y GAD ha conducido también a alguna mejora en los métodos para
diagnosticar IDDM. Previamente, el antígeno de 64 kDa había sido
identificado únicamente en la célula pancreática \beta, y no
podía ser purificado en cantidades suficientes para permitir la
clonación, secuenciación u otra caracterización que hubiera
permitido la preparación ha gran escala de los reactivos necesarios
para una detección o terapia eficientes. En contraste, la
abundancia de GAD en el cerebro permite la producción fácil por
clonación, o bien, de grandes cantidades de proteína GAD (ya sea
GAD_{65} o GAD_{67}) como un reactivo para diagnóstico. Ver la
solicitud de patente en trámite junto con la presente,
07/756.207.
Aunque es una mejora sobre los métodos
anteriores, el diagnóstico utilizando formas de longitud completa de
proteína GAD purificada no es aún completamente satisfactorio. Las
moléculas de GAD tienen una modificación de lípidos en la región
N-terminal y son por lo tanto insolubles, excepto en
presencia de detergente. La insolubilidad de las moléculas de GAD
de longitud completa entorpece la purificación, y el uso de GAD, en
ensayos simples como la inmunoprecipitación, ELISA o
radioinmunoensayos. Además, el uso de GAD de longitud completa como
reactivo de diagnóstico no distingue entre diferentes clases de
anticuerpos de GAD, el cual puede ser diagnóstico de diferentes
fases temporales de una enfermedad autoinmune y/o de diferentes
enfermedades. Además, las proteínas GAD insolubles son inadecuadas
para administración in vivo como reactivos terapéuticos.
WO 92/0546 discute el uso GAD_{65}
recombinante o de fragmentos de la misma para diagnóstico de
tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de insulina.
Con base en lo anterior, es claro que existe la
necesidad por métodos y reactivos mejorados para diagnosticar y
tratar a pacientes que tienen, o están en riesgo de, IDDM y del
síndrome de Stiff Man. La presente invención satisface esta y otras
necesidades.
De acuerdo a una modalidad de la invención, la
invención provee un método para elaborar un fragmento soluble de
una proteína GAD_{65} que es específicamente reactiva con un
anticuerpo de GAD_{65}, lo cual incluye la expresión de un vector
que codifica al fragmento soluble para producir el fragmento
soluble, en donde el fragmento está libre de aminoácidos
N-terminales que limitan la solubilidad. En algunos
fragmentos, los aminoácidos N-terminales 24 - 31 y
preferiblemente 45 de una proteína GAD_{65} son suprimidos o
mutados. Adecuadamente, existe un residuo de alanina en una
posición del fragmento en lugar de un residuo de cisteína de
ocurrencia natural. Otros fragmentos contienen una supresión mayor
de secuencias N-terminales, que pueden cubrir a los
aminoácidos 1 - 244. Algunos fragmentos también están libres de un
segmento que tiene un epítopo específicamente reactivo con un
segundo anticuerpo de GAD_{65}. Estos fragmentos son útiles para
métodos de diagnóstico diferencial (por ejemplo, que distinguen la
IDDM del síndrome de Stiff Man o que distinguen las diferentes
fases temporales de la IDDM). Por ejemplo, en algunos fragmentos, se
remueve el segmento que cubre a los aminoácidos 545 - 585, en otros
fragmentos, el segmento de aminoácidos 245 - 295.
Convenientemente, el fragmento consiste de al
menos ocho aminoácidos contiguos desde el aminoácido 545 al 585.
Algunos fragmentos solubles incluyen una
secuencia contigua de aminoácidos 245 - 585 de una proteína
GAD_{65}. Estos fragmentos incluyen tres epítopos diferentes
específicamente reactivos con tres diferentes anticuerpos de
GAD_{65}.
Otros fragmentos adecuados incluyen una
secuencia contigua de al menos ocho aminoácidos de los aminoácidos
1 - 20 ó 70 - 101 por ejemplo un fragmento que consiste de los
aminoácidos 1 - 20 ó 70 - 101. Estos fragmentos son específicamente
reactivos con dos clases de anticuerpos contra la proteína
GAD_{65} que son diagnóstico del síndrome de Stiff Man. Algunos
de estos fragmentos están sustancialmente libres de los aminoácidos
245 - 585 y se vuelven por lo tanto incapaces de enlazarse
específicamente con tres clases de anticuerpos para diagnóstico de
IDDM.
En otro aspecto, la invención provee un
polipéptido de fusión GAD_{65} inmovilizado a un soporte sólido,
incluyendo el polipéptido de fusión un polipéptido GAD_{65}
específicamente reactivo con un anticuerpo de GAD_{65} y un
polipéptido de extensión fusionado al N-terminal del
polipéptido GAD_{65}, en donde el polipéptido de fusión está
inmovilizado en el soporte a través del péptido de extensión. La
unión a través del péptido de extensión asegura que los epítopos
enlazados al anticuerpo de GAD_{65} en la proteína GAD_{65} o
fragmento de la misma sean accesibles a los anticuerpos de
enlazamiento. Se puede detectar la interacción específica entre la
proteína GAD_{65} o un fragmento y los anticuerpos de GAD_{65}
en el suero.
En otro aspecto, la invención provee un
polipéptido GAD_{65} inmovilizado a un soporte sólido, en donde
el polipéptido es específicamente reactivo con un autoanticuerpo de
GAD_{65}, y el polipéptido está inmovilizado al soporte a través
de un anticuerpo anti-GAD_{65} específicamente
reactivo dentro de los aminoácidos 1 - 244 del polipéptido
GAD_{65}. La inmovilización a través del anticuerpo deja al resto
de la proteína GAD_{65} o un fragmento de la misma, que contiene
un segundo epítopo específicamente reactivo con un anticuerpo de
GAD_{65}, accesible para enlazamiento con los anticuerpos. Se
puede detectar la interacción específica entre la proteína
GAD_{65} o un fragmento de la misma y los anticuerpos de
GAD_{65} en el suero.
En otro aspecto, la invención provee un método
para detectar anticuerpos de GAD_{65} en sueros, comprendiendo el
método:
- exponer una muestra de suero a un fragmento soluble de GAD_{65} producido como se describió anteriormente que es específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el fragmento de GAD_{65} y el autoanticuerpo.
Preferiblemente, el fragmento de la misma
secuencia de aminoácidos es de ocurrencia natural.
Preferiblemente, el autoanticuerpo de GAD_{65}
es un autoanticuerpo de célula humana pancreática \beta de 64
kDa.
Preferiblemente, el fragmento soluble de
GAD_{65} está marcado.
Preferiblemente, el método comprende además la
etapa de precipitar un complejo formado entre el fragmento soluble
de GAD_{65} y el autoanticuerpo de GAD_{65} antes de la etapa de
detección.
Preferiblemente, el método comprende además la
etapa de añadir un polipéptido GAD_{65} no marcado que compite
con el fragmento marcado de GAD_{65} por el enlazamiento
específico con el autoanticuerpo de GAD_{65}.
Preferiblemente, el método comprende además la
etapa de combinar la muestra de suero con un anticuerpo marcado que
compite con el auto anticuerpo para formar complejos con el
fragmento de GAD_{65}.
Preferiblemente, el fragmento de GAD_{65} está
enlazado a una fase sólida y el método comprende además la etapa de
remover la fase sólida de la muestra de suero para separar los
complejos del anticuerpo marcado no enlazado.
En otro aspecto, la invención provee un método
para detectar autoanticuerpos de GAD_{65} en sueros, comprendiendo
el método:
- proveer un polipéptido de fusión que incluye una proteína GAD_{65} o fragmento de la misma, específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65}, y un polipéptido de extensión fusionado al N-terminal de la proteína o el fragmento de la misma;
- inmovilizar el polipéptido de fusión a un soporte sólido a través del polipéptido de extensión;
- exponer una muestra de suero al polipéptido de fusión; y
- detectar una interacción específica entre el fragmento y el autoanticuerpo.
En otro aspecto, la invención provee un método
para detectar anticuerpos de GAD_{65} en sueros, comprendiendo el
método:
- proveer un primer anticuerpo específicamente reactivo con un primer epítopo que se presenta dentro de los aminoácidos 1 a 244 o un polipéptido GAD_{65};
- inmovilizar el primer anticuerpo a un soporte sólido;
- exponer el polipéptido GAD_{65} al primer anticuerpo para inmovilizar la proteína a dicho soporte a través del primer anticuerpo, en donde el polipéptido GAD_{65} incluye a un primer epítopo reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65};
- exponer una muestra de suero al fragmento de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el fragmento de GAD_{65} y el autoanticuerpo.
Preferiblemente, el polipéptido GAD_{65} se
presenta naturalmente y el primer anticuerpo es específicamente
reactivo con un primer epítopo entre los aminoácidos 60 y 120 del
polipéptido GAD_{65}.
En otro aspecto, la invención provee un método
para diagnosticar o monitorear diabetes mellitus dependiente de
insulina en un paciente, comprendiendo el método:
- exponer una muestra de suero del paciente a un fragmento soluble de GAD_{65} que tiene un epítopo específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65} para diagnóstico de diabetes mellitus dependiente de insulina producido como se describió anteriormente; y
- detectar la interacción entre el fragmento y el autoanticuerpo para diagnóstico de la diabetes mellitus dependiente de insulina.
En otro aspecto, la invención provee un método
de monitorear la progresión de la diabetes mellitus dependiente de
insulina en un paciente, comprendiendo el método las etapas de:
- exponer una muestra de suero del paciente a un primer fragmento de GAD_{65} que incluye un primer epítopo específicamente reactivo con un primer autoanticuerpo de GAD_{65}, en donde el fragmento de GAD es producido como se describió anteriormente;
- detectar la interacción específica entre el primer fragmento y el primer autoanticuerpo;
- exponer la muestra de suero a un segundo fragmento de GAD_{65} que incluye un segundo epítopo específicamente reactivo con un segundo autoanticuerpo de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el segundo fragmento y el segundo autoanticuerpo.
Preferiblemente, el primer autoanticuerpo es
diagnóstico de una primera fase temporal de la diabetes mellitus
dependiente de insulina y el segundo autoanticuerpo es diagnóstico
de una segunda fase temporal de la diabetes mellitus dependiente de
insulina.
Preferiblemente, los fragmentos son
solubles.
En otro aspecto, la invención provee una
composición farmacéutica que incluye un fragmento soluble de
GAD_{65} específicamente reactivo con un autoanticuerpo de
GAD_{65}, en donde el fragmento está libre de aminoácidos
N-terminales que limitan la solubilidad, en un
portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención provee el uso de
un fragmento soluble de GAD_{65} en la fabricación de una
composición para uso en terapia en un método para tratar a un
paciente que sufre de, o con riesgo de, diabetes mellitus
dependiente de insulina o de síndrome de Stiff Man.
En algunos métodos, se administra una dosis
terapéuticamente efectiva de un fragmento soluble de GAD_{65} que
es específicamente reactivo con un anticuerpo de GAD_{65} o con
una célula T a un paciente para inducir inmunotolerancia a un
auto-antígeno de GAD_{65}. En otro método, se
utiliza un fragmento soluble GAD_{65} para generar células
auxiliares T específicas para el fragmento de GAD_{65} de las
células de sangre periférica obtenidas de un paciente. Las células
auxiliares T así generadas, o una porción de las mismas, que se
capaz de incluir una respuesta inmune in vivo contra las
células auxiliares T, es administrada al paciente.
En otro aspecto, la invención provee un
fragmento soluble de GAD_{65}, en donde el fragmento está libre
de aminoácidos N-terminales que limitan la
solubilidad, y contiene un epítopo específicamente reactivo con un
autoanticuerpo de GAD_{65} y acoplado a una inmunoglobulina o
célula linfoide de un paciente que va a ser tratado con eso.
En otro aspecto, la invención provee un
fragmento soluble de una proteína GAD_{65}, en donde el fragmento
está libre de aminoácidos N-terminales que limitan
la solubilidad, y es específicamente reactivo con autoanticuerpo de
GAD_{65} para uso en un método de tratamiento o profilaxis de la
IDDM.
En los dibujos acompañantes:
La Fig. 1 muestra las secuencias de aminoácidos
de las proteínas GAD_{65} humanas (parte de arriba) (SEQ ID NO:
1) y de rata (parte inferior) (SEQ ID NO: 2). Para la secuencia de
rata, únicamente se muestran los aminoácidos que difieren de la
secuencia humana.
La Fig. 2 muestra los resultados de
inmunoprecipitación de las GAD_{65} y GAD_{67} humanas marcadas
con metionina con ^{35}S expresadas a partir de un vector
baculovirus en células Sf9 con las MICA, IgG humana (control), la
GAD6 monoclonal de ratón específica de GAD_{65} y el antisuero K2
de conejo específico de GAD_{67}. La inmunoprecipitación de
células Sf9 infectadas con baculovirus de tipo silvestre se muestra
en paralelo (sendas 15 - 21).
\newpage
La Fig. 3 muestra una transferencia Western de
GAD_{65} y GAD_{67} humanas expresadas a partir de un vector
baculovirus en células Sf9 junto con células Sf9 infectadas con
baculovirus de tipo silvestre (control) utilizando: antisuero 1266
que reconoce tanto GAD_{65} como GAD_{67} (sendas 1 - 3);
antisuero GAD6, que específicamente reconoce GAD_{65}, (sendas 4
- 6), MICA 1 (sendas 7 - 9), y MICA 2 (sendas 10 - 12).
La Fig. 4 muestra los resultados de
inmunoprecipitación de GAD_{65} de rata de tipo silvestre marcada
con metionina con ^{35}S y una proteína truncada expresada a
partir de un constructo de baculovirus en células Sf9 con las MICA,
GAD6 (un anticuerpo monoclonal anti-GAD_{65} de
ratón), o IgG humana (control). La inmunoprecipitación de células
Sf9 infectadas con baculovirus de tipo silvestre se muestra en
paralelo.
La Fig. 5 muestra la huella de la proteína de
inmunocomplejos entre las MICA o la IgG humana (control) y
GAD_{65} humana marcada con metionina con ^{35}S de células
Sf9.
La Fig. 6 muestra la reactividad de las MICA con
mutantes de supresión de GAD_{65}.
- A.
- Resumen del enlazamiento de anticuerpo a mutantes de GAD_{65} de rata expresados en células COS-7. GAD1 y GAD6 son anticuerpos monoclonales anti-GAD de ratón (Gottlieb y colaboradores, 1986, Chang y Gottlieb 1988). GAD1 es distinta de otras monoclonales en que únicamente reconoce GAD_{65} intacta. GAD6 tiene un patrón de reconocimiento similar a MICA2, excepto porque GAD6 reacciona igualmente bien en condiciones nativa y desnaturalizada.
- B.
- La inmunoprecipitación de mutantes de supresión N-terminales de GAD_{65} de rata, expresados en células COS-7 con las MICA, GAD6 e IgG humana (control).
- C.
- La inmunoprecipitación de mutantes de supresión C-terminales de GAD_{65} de rata, expresados en células COS-7 con las MICA, GAD6 e IgG humana (control).
La Fig. 7 muestra inmunoprecipitación de
mutantes de supresión N-terminales y
C-terminales de GAD_{65} de rata expresados en
células COS-7 con sueros de nueve pacientes
diabéticos recientemente diagnosticados en forma independiente
(D1-9). Se analizaron también los sueros de un
individuo prediabético (PI), un positivo individual para
anticuerpos citoplasmáticos de células de islote (P2), y de dos
individuos sanos de control (C1 y C2). El suero D10 es del paciente
del cual se derivaron las MICA 1 - 6.
La Fig. 8 muestra transferencias Western de
GAD_{67}, GAD_{65}, GAD_{65} \Delta 1-69/70,
y GAD_{65} \Delta 1-101, coloreadas con un
suero SMS típico, y un suero de control positivo.
La Fig. 9 muestra análisis en gel SDS de
GAD_{65} y proteínas mutantes marcadas por ácido palmítico con
[^{3}H] y metionina con ^{35}S.
La Fig. 10 muestra transferencias Western de
fracciones acuosas (A) y en detergente (D) de proteína celular
total de células COS que expresan GAD_{65} y mutantes de supresión
N-terminales, coloreadas con sueros reactivos con
un péptido C-terminal de GAD_{65}.
Cuando se describe un fragmente de GAD_{65}
como "sustancialmente libre" de un segmento de aminoácidos,
aproximadamente al menos 50%, más usualmente aproximadamente al
menos 75%, y lo más comúnmente aproximadamente al menos 90% de los
aminoácidos dentro del segmento especificado están ausentes o
sustituidos. La remoción de estos aminoácidos confiere un cambio en
una propiedad biológica o química del fragmento residual, tal como
la pérdida de capacidad para reaccionar con una clase de anticuerpo,
o la adquisición de solubilidad en solventes acuosos.
Los términos "interacción específica" y
"específicamente reactivo" significa que la constante de
disociación para el enlazamiento de un ligando y un anticuerpo es
aproximadamente menor de 1 iM, más usualmente aproximadamente menor
de 1 nM.
El término "análogo" se refiere a una
secuencia génica que está evolutiva y funcionalmente relacionada
entre especies. Por ejemplo, en el genoma humano, el gen CD4 humano
es el gen análogo al gen CD4 de ratón, ya que las secuencias y
estructuras de estos dos genes indican que son altamente homólogos y
ambos genes codifican una proteína que funciona en el señalamiento
de la activación de la célula T a través del reconocimiento del
antígeno restringido de MCH clase II. Los genes análogos preferidos
son: el humano, de rata, de conejo, de canino, de primate no
humano, de porcino, de múrido y de hámster.
El término análogo de GAD_{65} incluye
cualquier proteína que compita con la proteína GAD_{65} de rata
de Bu y colaboradores, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
89:2115-2119, para el enlazamiento con anticuerpos
GAD_{65}. Los análogos incluyen polipéptidos mutantes naturales e
inducidos. Las proteína análogas pueden incluir estereoisómeros
(esto es, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos
convencionales, aminoácidos no naturales tales como
\alpha,\alpha-disustituidos,
N-alquil aminoácidos, ácido láctico,
4-hidroxiprolina,
\gamma-carboxiglutamato,
\varepsilon-N,N,N-trimetillisina,
\varepsilon-N-acetillisina,
O-fosfoserina, N-acetilserina,
N-formilmetionina, 3-metilhistidina,
5-hidroxilisina,
\omega-N-metilarginina, y otros
aminoácidos similares e imino ácidos (por ejemplo,
4-hidroxiprolina). Las proteínas análogas también
incluyen proteínas que tienen columnas vertebrales modificadas por
fosforilación, glicosilación, palmitoilación y
similares.
similares.
Las condiciones rigurosas dependen de la
secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias.
Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser
aproximadamente 5ºC menores que el punto térmico de fusión (Tm)
para la secuencia específica con una fuerza iónica y un pH
definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH
definidos) a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida con una
sonda perfectamente correspondiente. Típicamente, las condiciones
rigurosas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea
aproximadamente al menos de 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es
aproximadamente al menos de 60ºC. Ya que otros factores pueden
afectar significativamente la rigurosidad de la hibridación,
incluyendo, entre otros, la composición de la base y el tamaño de
las cadenas complementarias, la presencia de solventes orgánicos y
el grado de incompatibilidad de las bases, la combinación de
parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera
de éstas.
El término "sustancialmente soluble"
significa que un fragmento exhibe típicamente una solubilidad de al
menos 50 \mug/ml en un solvente acuoso.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos e incluye proteínas de longitud completa y
fragmentos de la misma.
Se describirán ahora modalidades preferidas de
la invención.
De acuerdo a una modalidad de la invención, se
proveen los reactivos para diagnóstico de pacientes que sufren de,
o que están en riesgo de padecer IDDM y/o el síndrome de Stiff Man.
Los polipéptidos son usualmente fragmentos solubles de GAD_{65}
que enlazan uno o más anticuerpos de GAD_{65}, diagnóstico para
una de estas enfermedades.
Como se discutió anteriormente, GAD_{65} es
uno de dos genes (siendo el otro GAD_{67}) que codifican a dos
subtipos de enzima GAD. Dentro de cada subtipo no alélico existen
también diferentes variantes alélicas (ver la Sección de
Antecedentes). Por lo tanto, el término anticuerpo de GAD_{65}
incluye anticuerpos reactivos con cualquier variante alélica de la
enzima GAD_{65} o un epítopo de la misma. Por ejemplo, el término
anticuerpo de GAD_{65} abarca anticuerpos para el autoantígeno de
células \beta pancreáticas de 64 kDa. La detección de anticuerpos
para GAD_{65} en suero humano es diagnóstica de IDDM y/o del
síndrome de Stiff Man. La detección de anticuerpos para GAD_{67}
puede ser un método factible de diagnóstico. Sin embargo, los
resultados del Ejemplo 3 sugieren que los anticuerpos para la
enzima GAD_{65} son mucho más predominantes que aquellos para
GAD_{67}. Por lo tanto, se prefiere la detección de los
anticuerpos para GAD_{65}.
Frecuentemente, se detectan los anticuerpos para
la enzima GAD_{65} utilizando fragmentos de polipéptidos de
GAD_{65}. Estos fragmentos son producidos por medio de una
variedad de métodos. Los fragmentos de la presente invención pueden
ser naturales, esto es, fragmentos de CNS o de GAD_{65}
pancreático, aislados de fuentes adecuadas, tales como el CNS
humano o no humano y de células pancreáticas. Los métodos para tal
aislamiento están descritos en Oertel y colaboradores (1980), Brain
Res. Bull. Vol. 5, Suplemento 2, páginas 713 - 719; Oertel y
colaboradores, (1981), J. Neurosci. 6: 2689 - 2700; y Chang &
Gottlieb (1988), J. Neurosci. 8: 2123 - 2130. Usualmente, los
polipéptidos naturales se aislaran de células del CNS donde
GAD_{65} es más abundante que en células pancreáticas. Las
composiciones purificadas de la forma pancreática de GAD_{65} se
pueden aislar y caracterizar completamente utilizando GAD_{65} del
CNS como referencia. Debido a que los genes para GAD_{65} y las
proteínas están altamente conservados entre especies, la proteína
GAD_{65} y los fragmentos de la misma utilizados en la presente
invención pueden ser humanos o no humanos.
Los polipéptidos naturales se aíslan por medio
de técnicas convencionales tales como cromatografía de afinidad.
Por ejemplo, se incrementan los anticuerpos policlonales o
monoclonales contra las GAD_{65} previamente purificadas y se
unen a una columna adecuada de afinidad por medio de técnicas
conocidas. Ver, por ejemplo, Hudson & Hay, Practical Immunology
(Blackwell Scientific Publications, Oxford, Reino Unido, 1980),
Capítulo 8. Usualmente, se obtiene una forma intacta de GAD_{65}
por medio de tales técnicas de aislamiento. Se generan fragmentos
de péptido a partir de GAD_{65} por medio de escisión química o
enzimática de la molécula intacta.
Como una alternativa para el aislamiento de
proteína GAD_{65} intacta y de fragmentos de la misma a partir de
fuentes naturales, estos polipéptidos se preparan con base en la
secuencia de nucleótidos de un gen para GAD_{65} o de una
secuencia de aminoácidos de una proteína GAD. La gran extensión de
datos de la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico de
GAD_{65} de diferentes especies ya se encuentra disponible (ver,
la Sección de Antecedentes). Los datos adicionales, si procede, se
generan fácilmente por medio de métodos convencionales. Por
ejemplo, una secuencia conocida de nucleótidos de una especie se
puede utilizar como sonda para clonar genes para GAD_{65} de otra
especie. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos para una
proteína GAD_{65} conocida como sondas para detectar los
productos de expresión de GAD_{65}. Una vez clonados, se
secuencian fácilmente los genes para GAD_{65} por medio de métodos
convencionales.
Se pueden producir proteína y polipéptidos
sintéticos por medio de al menos 3 aproximaciones generales.
Primero, se pueden sintetizar polipéptidos que tienen
aproximadamente hasta 150 aminoácidos, usualmente que tienen
aproximadamente menos de 100 aminoácidos, y mas usualmente que
tienen aproximadamente menos de 75 aminoácidos, por medio del
método de síntesis conocido en fase sólida de Merrifield en el cual
se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena en crecimiento.
Ver, Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 - 2156. Los
sintetizadores automatizados de péptidos se encuentran
comercialmente disponibles con numerosos proveedores, tales como
Applied Biosystems, Foster City, California.
Un segundo método para síntesis de las proteínas
y de los péptidos de la presente invención involucra la expresión
en células de cultivo de mamífero de moléculas de ADN recombinante
que codifican al gen deseado para GAD_{65} o una porción del
mismo. Los sistemas de expresión de mamíferos, tales como las
células de ovario de hámster chino (CHO), efectúan la modificación
post-traduccional de las proteínas y polipéptidos
mejorando así la similitud inmunológica de los productos sintéticos
con las formas nativas de GAD_{65}. Además, los sistemas de
expresión de baculovirus y levadura a menudo efectúan las
necesarias modificaciones post-traduccionales. El
gen para GAD_{65} puede ser natural o sintético, pudiendo se
obtener el gen natural a partir de ADNc o de bibliotecas genómicas
utilizando sondas degeneradas con base en la secuencia conocida de
aminoácidos expuesta en Julien y colaboradores, ver más arriba.
Alternativamente, se pueden sintetizar nucleótidos con base en la
secuencia reportada de ADN por medio de técnicas conocidas. Por
ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ADN monocatenario por
medio del método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers
(1981), Tett. Letters 22: 1859 - 1862. Se puede obtener entonces un
fragmento bicatenario sintetizando la cadena complementaria y
apareando las cadenas juntas bajo condiciones apropiadas o por
medio de la adición de la cadena complementaria utilizando ADN
polimerasa con una secuencia apropiada de iniciador.
Los fragmentos naturales o sintéticos de ADN que
codifican para la proteína GAD_{65} deseada o fragmento de la
misma se incorporan luego en constructos de ADN. Usualmente, los
constructos de ADN son capaces de replicar en huéspedes procariotas
con el propósito de facilitar la manipulación inicial y la
multiplicación del constructo. Después de que se ha obtenido una
cantidad suficiente del constructo, se introduce dentro del genoma
del mamífero cultivado, insecto (por ejemplo, SF9), levadura u
otras líneas celulares eucariotas.
Los constructos adecuados de ADN para
introducción en bacterias o levadura usualmente incluyen un sistema
de replicación reconocido por el huésped, el fragmento de ADN para
GAD_{65} que codifica a la proteína deseada o al producto
polipeptídico, iniciación transcripcional y de traducción y
secuencias reguladoras unidas al extremo 5' de la secuencia
estructural de ADN y las secuencias iniciadoras de transcripción y
de traducción y las reguladoras unidas al extremo 5' de la
secuencia estructural de ADN, y las secuencias reguladoras de
terminación de transcripción y de traducción unidas al extremo 3' de
la secuencia estructural. Las secuencias reguladoras de
transcripción incluyen un promotor heterólogo que es reconocido por
el huésped.
Convenientemente, se pueden emplear los vectores
de clonación disponibles que incluyen al sistema de replicación y
las secuencias reguladoras de transcripción y de traducción junto
con un sitio de inserción para la secuencia de ADN del GAD_{65}.
Para la transformación de líneas celulares de mamífero y de otras
eucariotas, se puede emplear la cotransfección de las líneas
celulares en presencia de un marcador adecuado, tal como el gen
DHFR. La transfección se puede lograr utilizando también técnicas
químicas o de electroporación.
Se purifican los polipéptidos GAD_{65}, si se
desea, a partir de cultivos celulares que expresan genes
recombinantes por medio de una variedad de métodos. Por ejemplo, se
puede purificar el polipéptido por medio de una combinación de
métodos convencionales con base en las diferencias en tamaño
(filtración por gel), carga (cromatografía de intercambio iónico),
hidrofobicidad (cromatografía de fenil- sefarosa) u otros parámetros
físicos. Se puede utilizar también cromatografía de afinidad
inmunoabsorbente que soporta anticuerpos específicos para
GAD_{65}. La cromatografía de afinidad se lleva a cabo enlazando
primero los anticuerpos a un soporte en fase sólida y luego
poniendo en contacto a los anticuerpos enlazados con una fuente de
los polipéptidos que van a ser purificados, por ejemplo, lisados
del CNS o de células pancreáticas o de células que han sido
modificadas en forma recombinante para producir GAD_{65}, o de
súper mutantes de células que han sido modificadas en forma
recombinante para secretar GAD_{65} cuando se las cultiva.
Un tercer método para sintetizar polipéptidos
GAD_{65} es emplear un sistema de transcripción/traducción in
vitro. Se clona un ADN que codifica a un polipéptido GAD_{65}
sobre un vector de expresión como se describe más arriba. Se
transcribe y traduce luego el vector de expresión in vitro,
por ejemplo, en un sistema lisado de reticulocitos de conejo. Se
puede utilizar el producto de la traducción directamente o
purificado primero. Los péptidos resultantes de la traducción in
vitro típicamente no contienen las modificaciones
post-traducción presentes sobre polipéptidos
sintetizados in vivo. Por ejemplo, los polipéptidos
GAD_{65} traducidos in vitro son típicamente no
palmitoilados en los aminoácidos 31 y 45, y estos aminoácidos no
tendrían necesariamente que ser mutados o suprimidos para conferir
solubilidad en solventes acuosos.
Para uso en purificación, se pueden obtener
anticuerpos para GAD_{65} inyectando fragmentos de los mismos
GAD_{65} en una amplia variedad de vertebrados de acuerdo con
técnicas convencionales. Los vertebrados adecuados incluyen
ratones, ratas, ovejas, y cabras. Usualmente, se sangran
periódicamente los animales con sangrados sucesivos que tienen un
título y especificidad mejorados. Los antígenos pueden ser
inyectados en forma intramuscular, interperitoneal, subcutánea, o
similares, usualmente, en un adyuvante completo o incompleto de
Freund. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales por medio de
técnicas conocidas. Se pueden producir también fragmentos
monoclonales Fab. Ver, por ejemplo, Huse y colaboradores (1989),
Science 246: 1275 - 1281.
Los fragmentos de GAD_{65} de la presente
invención pueden ser utilizados ya sea como un componente de un
lisado crudo o en forma sustancialmente pura. "Sustancialmente
pura" significa que un polipéptido es típicamente
aproximadamente al menos 50% p/p (peso/peso) puro, así como también
que está sustancialmente libre de proteínas y de contaminantes que
interfieren. Algunas veces los fragmentos se aíslan o se sintetizan
con una pureza de aproximadamente al menos el 80% p/p y, más
preferiblemente aproximadamente de al menos el 95% p/p de pureza.
Sin embargo, utilizando técnicas convencionales de purificación de
proteínas, se pueden obtener péptidos homogéneos al menos en un 99%
p/p.
Los fragmentos de polipéptido de la presente
invención contienen al menos un epítopo reactivo al menos con una
clase de anticuerpo contra la proteína GAD_{65}. La localización
de epítopos dentro de la proteína GAD_{65} es facilitada por la
disponibilidad de anticuerpos monoclonales reactivos con GAD_{65}
que se han obtenido de un paciente que sufre de, o que tiene riesgo
de padecer de IDDM o síndrome de Stiff Man. Los procedimientos para
aislar y seleccionar anticuerpos monoclonales humanos son descritos
por Richter y colaboradores (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
89: 8467 - 71. En resumen, se derivaron una cantidad de líneas
celulares ä inmortalizadas con EBV a partir de la sangre periférica
de pacientes recientemente diagnosticados con IDDM. Las líneas
celulares monoclonales B que producen IgG fueron seleccionadas para
enlazarse al antígeno de células ä pancreáticas de 64 kDa por medio
de coloración indirecta de inmunofluorescencia de secciones
congeladas de páncreas humano. Se estabilizaron las líneas
celulares por medio de clonación repetida de células individuales.
Seis líneas celulares estables aisladas por medio de este método
produjeron anticuerpos monoclonales denominados MIICA 1 - 6.
Se utilizan anticuerpos monoclonales humanos
contra GAD_{65}, o suero policlonal de pacientes que tienen, o
con riego de padecer, de IDDM o del síndrome de Stiff Man, para
mapear epítopos de GAD_{65} útiles para detectar la presencia de
autoanticuerpos de GAD_{65}. Los epítopos de GAD_{65} se mapean
analizando una colección de péptidos GAD_{65} (preparados como en
la Sección I.B) para enlazarse a anticuerpos monoclonales o a
sueros policlonales. El enlazamiento usualmente se detecta por medio
de un ensayo convencional de inmunoprecipitación. El enlazamiento
se puede detectar también por medio de transferencias Western. Sin
embargo, ya que las transferencias Western se realizan bajo
condiciones de desnaturalización, se detecta el enlazamiento
únicamente con epítopos lineales. La comparación de resultados de
inmunoprecipitación y de transferencias Western indica que epítopos
son lineales y cuales son conformacionales.
En otra aproximación, se pueden mapear los
epítopos por medio de huellas digitales de proteínas. En esta
técnica, se le permite a una proteína o péptido GAD_{65}
enlazarse a un anticuerpo y luego se exponen a una proteasa. Los
residuos de enlazamiento de GAD_{65} con el anticuerpo monoclonal
se protegen de degradación proteolítica, y se identifican por medio
de secuenciación de aminoácidos.
La identificación de las coordenadas de
secuencia de los epítopos de GAD_{65} reactivos con anticuerpos
permite la producción de fragmentos de GAD_{65} que contienen uno
o más de tales epítopos como reactivos de diagnóstico. Las
coordenadas de secuencia utilizadas para definir los fragmentos de
GAD_{65} se refieren a aminoácidos de la secuencia de 585
aminoácidos de GAD_{65} de rata divulgada por Bu y colaboradores
(1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 2115 - 2119 y mostrada en
la Fig. 1, correspondiente a los aminoácidos de la secuencia de 585
aminoácidos de GAD_{65} humana divulgada por Bu y colaboradores
(también mostrada en la Fig. 1), o los aminoácidos correspondientes
de cualquier otro de los polipéptidos afines o análogos de
GAD_{65}, cuando tales polipéptidos están alineados en forma
máxima con la secuencia de GAD_{65} de rata de Bu y
colaboradores. Una proteína se considera "alineada en forma
máxima" con las secuencias de GAD_{65} de rata de acuerdo con
el criterio de cualquiera de las siguientes referencias: Smith
& Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman &
Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson & Lipman (1988),
Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en
el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group,
575 Science Dr., Madison, WI. Usualmente, proteínas análogas son
codificadas por ácidos nucleicos que tienen la capacidad de
hibridar al ADN que codifica a la proteína GAD_{65} de rata bajo
condiciones restrictivas.
Usualmente, los fragmentos de GAD_{65} están
libres de aminoácidos N-terminales que limitan la
solubilidad en solventes acuosos. Tales aminoácidos se pueden
remover por medio de supresión y/o de sustitución. Los aminoácidos
N-terminales que son removidos y/o mutados pueden
incluir más de doscientos aminoácidos del N-terminal
de la proteína GAD_{65}. Sin embargo, algunos fragmentos de
GAD_{65} de la invención están libres de segmentos
N-terminales más cortos, que incluyen por ejemplo,
aproximadamente 8, 25, 50, 75, 100 y 150 aminoácidos de la región
N-terminal. Como mínimo, se deben remover o
sustituir los aminoácidos aproximadamente de las posiciones 24 -
31. Preferiblemente, el aminoácido 45 debe ser removido o sustituido
también. De este modo, por ejemplo, un fragmento que tiene una
supresión de los aminoácidos 1 - 31, y, preferiblemente, una
sustitución de un residuo de alanina por un residuo de cisteína en
el aminoácido 45 es soluble. Un fragmento que tiene una supresión
de los aminoácidos 1 - 45 es también soluble.
Alternativamente, los polipéptidos GAD_{65}
solubles se pueden producir sintetizando los polipéptidos bajo
condiciones tales que no ocurran modificaciones
post-traduccionales. Por ejemplo, se pueden
sintetizar polipéptidos en un sistema de traducción in vitro
o en un sintetizador de péptidos. Ver la Sección I.B más arriba. Se
pueden sintetizar también polipéptidos in vivo en presencia
de un inhibidor de unión de lípidos tal como la cerulenina.
A menudo, los aminoácidos que son removidos para
conferir solubilidad a un péptido GAD_{65}, son contiguos, pero
esto no es esencial. Todo lo que se necesita es que se suprima
suficiente secuencia de aminoácidos N-terminales
para que el resto del fragmento de la proteína sea soluble o
sustancialmente soluble en un medio acuoso, tal como el medio
típicamente empleado en la purificación de proteínas o para
inmunoensayo.
Sorprendentemente, los resultados presentados en
el Ejemplo 5 indican que la supresión de al menos los primeros 244
aminoácidos del N-terminal de GAD_{65} no
desmejora la reactividad de los epítopos principales de GAD_{65}
contra los anticuerpos de IDDM. De este modo, un fragmento soluble
que carezca de los 244 aminoácidos N-terminales,
pero que contenga los restantes aminoácidos de GAD_{65} (esto es,
una secuencia contigua de los aminoácidos 245 a 585 (el aminoácido
C-terminal)) es reactivo con todas las tres clases
de anticuerpos de IDDM definidas por MICA1/MICA3, MICA4/MICA6 y
MICA2. Ver el Ejemplo 5. También son adecuados los fragmentos
solubles de ocurrencia natural de GAD_{65} o de GAD_{67} que
resultan de degradación proteolítica o de patrones alternativos de
empalme. Estos fragmentos han sido detectados en extractos de
cerebro, en células \beta y en sistemas de expresión
recombinante. Los fragmentos usualmente tienen un peso molecular de
aproximadamente 55 - 57 kDa y carecen aproximadamente de 65 - 80
aminoácidos del N-terminal. Ver, por ejemplo,
Christgau y colaboradores (1992), J. Cell Biol. 118: 309 - 320. La
ausencia de estos aminoácidos N-terminales produce
los fragmentos sustancialmente solubles en solventes acuosos. Los
fragmentos de ocurrencia natural son purificados convenientemente
por medio de cromatografía de inmunoafinidad utilizando un
anticuerpo específico para los epítopos contenidos aproximadamente
dentro de los aminoácidos 60 - 120. Se puede utilizar el mismo
anticuerpo para inmovilizar los fragmentos para inmunoensayo.
La invención también provee fragmentos solubles
que tienen modificaciones tanto en el N-terminal
(para producir el fragmento soluble) como en otro sitio. Uno de
tales fragmentos está sustancialmente libre al menos aproximadamente
de 41 aminoácidos del C-terminal (esto es, los
aminoácidos 545 - 585). Un fragmento sustancialmente libre de los
41 aminoácidos C-terminales es capaz de reconocer a
los anticuerpos de la IDDM que tienen la especificidad de
MICA4/MICA6, pero no con la especificidad de MICA1/MICA3 o
MICA2.
Otro fragmento suministrado por la invención se
convierte en soluble por medio de la supresión o sustitución de los
aminoácidos N-terminales y está también
sustancialmente libre de un segmento de aproximadamente 245 a 295
aminoácidos. Este fragmento es capaz de reconocer autoanticuerpos de
IDDM con la especificidad de MICA2, pero no anticuerpos que tengan
la especificidad de MICA1/MICA3 o MICA2/MICA4.
Algunos fragmentos están sustancialmente libres
de los aminoácidos 70 - 101 y/o 1 - 20, y se los considera por lo
tanto libres de epítopos no conformacionales reactivos con
anticuerpos para diagnostico del síndrome de Stiff Man. Sin
embargo, tales fragmentos son reactivos con los anticuerpos del
síndrome de Stiff Man que reconocen epítopos conformacionales. Los
fragmentos que reaccionan con uno o más anticuerpos para el
diagnóstico de IDDM pero no reaccionan con ninguna clase de
anticuerpos para el diagnóstico de SMS pueden ser producidos por
medio de epítopos adicionales de localización de IDDM con fragmentos
de péptido de longitud mínima o casi mínima. Estos fragmentos
pueden constituir secuencias de aminoácidos de GAD_{65}, o
miniproteínas análogas, como las descritas por Ladner y
colaboradores, patente estadounidense No. 5.223.409 (1993). Los
fragmentos o miniproteínas podrían ser seleccionadas luego por
ausencia de reactividad con sueros de pacientes con SMS.
La invención también provee fragmentos que
contienen al menos un epítopo lineal (o no conformacional) reactivo
con anticuerpos del SMS. Como se observó anteriormente, estos
epítopos están contenidos dentro de los aminoácidos 1 - 20 (los
aminoácidos 1 - 10 son particularmente importantes para el
enlazamiento) y 70 - 101. Para un epítopo funcional, usualmente al
menos aproximadamente 6, 8 ó 10 aminoácidos contiguos y más
usualmente, todos, o sustancialmente todos (esto es, 70, 80, 90 ó
95%) de los segmentos especificados están presentes. Los epítopos
del SMS son ambos lineales y por lo tanto reactivos con anticuerpos
de SMS independientemente de la conformación del resto de la
molécula. De este modo, incluso un fragmento que consiste
esencialmente de los aminoácidos aproximadamente de 70 - 101 o de
los aminoácidos aproximadamente de 1 - 20 y que carece de
aminoácidos de flanqueo es reactivo con los anticuerpos del SMS.
Desde luego, tal fragmento carece de los epítopos requeridos para
enlazamiento con las clases principales de anticuerpos de la IDDM.
Sin embargo, se proveen fragmentos mayores en los cuales uno o más
de otros epítopos para diagnóstico de IDDM están presentes. De este
modo, por ejemplo, un fragmento que contiene a los aminoácidos 1 -
20, 70 - 101 y 245 - 585 contendrían epítopos para las tres clases
principales de anticuerpos de IDDM, así como para clases
conformacionales y no conformacionales de anticuerpos de
SMS.
SMS.
La provisión de fragmentos de GAD_{65} que
tienen epítopos de enlazamiento de anticuerpo ofrece numerosas
ventajas comparada con la GAD_{65} intacta. Los fragmentos de la
invención usualmente tienen una alta solubilidad en solventes
acuosos en contraste con la GAD_{65} intacta, que requiere de
detergente para solubilización y tiene una tendencia a formar
agregados y precipitan incluso en presencia de detergente. La
formación de agregados puede enmascarar epítopos y por lo tanto
reducir la sensibilidad y la precisión de la detección de
autoanticuerpos. Además, la presencia de detergente es a menudo
perjudicial para el enlazamiento con placas de ELISA. Aunque se
puede solubilizar GAD_{65} utilizando detergentes iónicos y
solventes de desnaturalización, tales condiciones son incompatibles
con el mantenimiento de epítopos conformacionales. La conformación
auténtica es particularmente importante para detectar anticuerpos
para IDDM de la especificidad de MICA1/MICA3 o MICA4/MICA6. Ver el
Ejemplo 4.
Una ventaja adicional de los presentes
fragmentos es que ellos permiten la distinción entre IDDM y el
síndrome de Stiff Man. Por ejemplo, un fragmento que consiste
esencialmente de los aminoácidos 1 - 20 y/o 70 - 101 es reactivo
únicamente con anticuerpos de SMS, un fragmento de los aminoácidos
245 - 585 es reactivo con anticuerpos de IDDM y con anticuerpos
conformacionales de SMS, y un fragmento que contiene a los
aminoácidos 1- 20 y/o 70 - 101 y 245 - 585 es reactivo con todas
estas clases de autoanticuerpos.
Una ventaja adicional más de los presentes
fragmentos es su capacidad para distinguir diferentes fases
temporales en el progreso de la IDDM. Como se discute en el Ejemplo
7, es probable que los autoanticuerpos que tengan la especificidad
de enlazamiento de MICA1/MICA3 aparezcan primero, seguidos por los
autoanticuerpos que tienen la especificidad de MICA4/MICA6,
seguidos por autoanticuerpos que tiene la especificidad de MICA2. De
este modo, las proporciones relativas de estos anticuerpos
diferentes en un suero de paciente permite monitorear la enfermedad
a través de sus fases primarias hasta el inicio clínico y más allá.
Los diferentes anticuerpos se distinguen fácilmente utilizando
diferentes fragmentos como reactivos de diagnóstico. Un fragmento
que contiene un segmento de GAD aproximadamente de los aminoácidos
245 - 585 enlaza a las tres clases de anticuerpos, un fragmento
aproximadamente de los aminoácidos 245 - 545 enlaza únicamente a la
clase MICA4/6 y un fragmento aproximadamente de los aminoácidos 445
- 585 enlaza únicamente a la clase MICA2.
Se pueden utilizar los fragmentos de GAD_{65}
de la invención para inmunizar animales de laboratorio y por lo
tanto derivar anticuerpos monoclonales contra los fragmentos. Se
utilizan luego a su vez los anticuerpos monoclonales para inmunizar
otros animales y generar anticuerpos
anti-idiotípicos. Se selecciona un
anti-idiotipo cuyo enlazamiento con el anticuerpo
primario es inhibido por un fragmento de GAD_{65}. Debido a que
tanto el anticuerpo anti-idiotípico como el
fragmento de GAD_{65} enlazan a la inmunoglobulina primaria, la
inmunoglobulina anti-idiotípica puede representar
la "imagen interna" de un epítopo y por lo tanto se puede
sustituir por el fragmento de GAD_{65}. Los anticuerpos
anti-idiotípicos se utilizan en métodos de
diagnóstico esencialmente de la misma forma que los fragmentos
de
GAD_{65}.
GAD_{65}.
Los métodos de diagnóstico de la presente
invención requieren de técnicas para detectar la interacción
específica entre ligandos (por ejemplo, un fragmento de GAD_{65})
y autoanticuerpos. El protocolo particular del ensayo escogido no
es crítico, y únicamente es necesario que el ensayo sea lo
suficientemente sensible para detectar un nivel de umbral del
autoantígeno que se considere que sea positivo. Los ensayos
adecuados incluyen protocolos tanto fase sólida (heterogénea) como
fase no sólida (homogénea). Se pueden llevar a cabo los ensayos
utilizando formatos tanto competitivos como no competitivos, y
utilizando una amplia variedad de marcadores, tales como
radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes,
marcadores de giro, y similares.
Los anticuerpos de GAD_{65} se detectan a
menudo por medio de una técnica de inmunoprecipitación, en la cual
los polipéptidos GAD_{65} son marcados con un isótopo o ligando.
Los polipéptidos se pueden marcar durante la síntesis (por ejemplo,
por medio de la adición de metionina con ^{35}S a un sistema de
traducción in vitro o sistema de expresión celular), o
después de la síntesis. Se incuba el polipéptido marcado con una
muestra de suero para formar inmunocomplejos. Los inmunocomplejos se
precipitan con polietilén glicol, con estafilococos aureus o con
proteína A inmovilizada sobre cuentas. Después de varios lavados, se
cuentan los inmunoprecipitados para evaluar cuanto antígeno
radiactivo ha sido precipitado. Opcionalmente, se puede añadir
también un polipéptido GAD_{65} no marcado para competir con el
polipéptido marcado para enlazamiento con autoanticuerpos.
Algunos ensayos se basan en protocolos
heterogéneos donde el ligando es enlazado a una fase sólida que es
utilizada para separar el complejo ligando - autoanticuerpo que se
forma cuando el autoanticuerpos está presente en una muestra de
suero. El ligando puede ser convenientemente inmovilizado sobre una
variedad de fases sólidas, tales como varillas indicadoras,
partículas, microesferas, partículas magnéticas, tubos de ensayo,
pozos de microtitulación, y membranas de nitrocelulosa o de nylon,
y similares.
Se expone la fase sólida a una muestra de suero
de tal manera que el autoanticuerpo, si lo hay, es capturado por el
ligando. Removiendo luego la fase sólida de la muestra de suero, el
autoanticuerpo capturado es removido de los autoanticuerpos no
enlazados y de otros contaminantes en la muestra de suero. Se puede
detectar luego el autoanticuerpo capturado utilizando la técnica
"sándwich" no competitiva donde se expone el ligando marcado
por el autoanticuerpo a la fase sólida lavada. Alternativamente, los
formatos competitivos cuentan con la introducción previa de un
anticuerpo marcado de GAD_{65} a la muestra de suero de tal manera
que las formas marcada y no marcada compitan por el enlazamiento
con la fase sólida. Tales técnicas de ensayo son bien conocidas y
están bien descritas tanto en patentes como en literatura
científica. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos.
3.791.932; 3.817.837; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987;
3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345;
4.034.074; y 4.098.876. Los métodos de ensayo de inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA) son descritos en detalle en las patentes
estadounidenses Nos. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.879.262; y
4.034.074. Los ensayos de ELISA detectan títulos muy bajos de
autoanticuerpos.
Se pueden detectar también autoanticuerpos por
medio de radioinmunoensayos en fase sólida (RIA). Se expone la fase
sólida a la muestra de suero en presencia de anticuerpos
radiomarcados que compiten por el enlazamiento con el ligando
inmovilizado. En este ensayo, la cantidad de radiomarcador enlazado
con la fase sólida está inversamente relacionada con la cantidad de
autoanticuerpos inicialmente presentes en la muestra de suero.
Después de la separación de la fase sólida, se remueve por medio de
lavado el radiomarcador no específicamente enlazado, y se determina
la cantidad de radiomarcador enlazado a la fase sólida. La cantidad
de radiomarcador enlazado, a su vez, está relacionada con la
cantidad de autoanticuerpos inicialmente presente en la muestra. En
una variación adicional, cuando el ligando es un fragmento de
GAD_{65} que contiene suficiente secuencia de aminoácidos para
retener la actividad de la L-glutamato
1-carboxilasa, se detecta autoanticuerpo por medio
de la extinción de la actividad enzimática en el enlazamiento de
autoanticuerpo.
Al menos tres métodos mejorados para detectar
autoanticuerpos de GAD_{65} se derivan en parte del descubrimiento
de que no se requieren cantidades sustanciales de secuencia
N-terminal de GAD_{65} para enlazarse a
autoanticuerpos de GAD_{65}. En algunos métodos, se detectan
autoanticuerpos de GAD_{65} utilizando fragmentos solubles de
GAD_{65}. Los fragmentos se vuelven solubles por medio de la
supresión o sustitución de aminoácidos N-terminales.
Como se discutió más arriba, al menos aproximadamente los
aminoácidos 24 - 31 y, preferiblemente el aminoácido 45 deben ser
removidos y/o sustituidos. Se pueden utilizar todos los fragmentos
solubles discutidos anteriormente. Las ventajas de los métodos de
diagnóstico utilizando fragmentos solubles, particularmente, la
facilidad de purificación del fragmento, y la capacidad para
realizar el ensayo bajo condiciones no desnaturalizantes, han sido
discutidas más arriba (ver la Sección I.D.).
El descubrimiento de los epítopos autorreactivos
en la mitad y en la parte C-terminal de la molécula
de GAD_{65} no solamente permite la supresión de algunos o de
todos los aminoácidos 1 - 244 para crear fragmentos solubles, sino
que libera mucha de la región N-terminal para otras
modificaciones útiles. Por ejemplo, las fracciones inmovilizadas
y/o radioactivas se pueden unir a la parte
N-terminal de la enzima sin afectar a los epítopos
principales de enlazamiento del anticuerpo, De este modo, algunos
métodos de la invención utilizan una proteína de fusión como el
reactivo de diagnóstico, y la proteína de fusión puede o no ser
soluble. La proteína de fusión tiene dos componentes peptídicos. Un
componente es una proteína GAD_{65}, o un péptido del mismo, que
tiene al menos un epítopo reactivo con un autoanticuerpo de
GAD_{65}. El segundo péptido no está usualmente relacionado con
GAD_{65} y es modificado por ingeniería genética para tener una o
más propiedades adecuadas para la purificación de la proteína de
fusión y/o el uso de la proteína de fusión como un reactivo de
diagnóstico. Por ejemplo, en Blanar & Rutter (1992), Science
256: 1014 - 1018 se describe una extensión amino terminal con
sitios de reconocimiento para un anticuerpo monoclonal y para una
proteína quinasa específica para el sitio. La fusión de tal
producto de extensión N-terminal a una proteína o
fragmento de GAD_{65} permite que la proteína de fusión sea
purificada en una única etapa por medio de cromatografía de
inmunoafinidad utilizando el anticuerpo monoclonal para la
extensión N-terminal. El fragmento se eluye por
medio de cantidades competitivas del péptido correspondiente, en
vez de extremos en el pH que dañan a los epítopos diabéticos
conformacionales. Se puede inmovilizar luego la molécula a placas
de ELISA a través del anticuerpo monoclonal que reconoce al péptido
de extensión N-terminal. Cuando se los inmoviliza en
esta orientación, los epítopos que enlazan a los anticuerpos
principales para diagnóstico de IDDM están alejados de la placa y
por lo tanto disponibles para enlazamiento. Esto elimina el
problema de impedimento estérico que puede resultar del
recubrimiento de las placas directamente con el antígeno. Además,
el sitio de la quinasa permite la marcación de la molécula con
^{32}P para radioinmunoensayos muy sensibles y rápidos después de
su purificación por medio de cromatografía de inmunoafinidad
utilizando el anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, se puede marcar un
sitio de una quinasa de músculo cardíaco con ATP con ^{32}P y
quinasa de músculo cardíaco.
En otros métodos de la invención, se inmoviliza
un fragmento de péptido o proteína GAD_{65} en un soporte sólido
utilizando un anticuerpo monoclonal específicamente reactivo con un
epítopo que se presenta dentro de los aminoácidos 1 - 244 del
N-terminal. Estos aminoácidos no se requieren para
el enlazamiento de los anticuerpos principales de IDDM con
GAD_{65}, y por lo tanto la unión a través de la secuencia
N-terminal no daña el enlazamiento con estos
autoanticuerpos. Un anticuerpo adecuado para anclar la secuencia
N-terminal surge inyectando un péptido formado por
los aminoácidos 1 - 244 (o un subfragmento del mismo) en un animal
de laboratorio, tal como conejos o ratones, y el aislamiento de un
anticuerpo monoclonal por medio de métodos convencionales. Esta
aproximación no necesita de la adición de la extensión amino
terminal a la molécula de GAD_{65} descrita anteriormente.
La inmovilización del fragmento de GAD_{65} a
través del anticuerpo tiene al menos dos ventajas. La primera, que
los fragmentos de GAD_{65} pueden ser purificados por medio de
cromatografía de inmunoafinidad (un procedimiento suave que
preserva la conformación de epítopos autoinmunes). Los fragmentos
purificados de GAD_{65} están entonces disponibles para uso, por
ejemplo, en ensayos de inmunoprecipitación. Alternativamente, se
inmoviliza una preparación cruda de GAD_{65} a través del
anticuerpo con las placas para ELISA. GAD_{65} se enlaza a las
placas en una orientación que permite que los epítopos sean
accesibles a los autoanticuerpos de IDDM. Se retiran las impurezas
lavándolas, mientras que la GAD_{65} permanece enlazada. Se
detectan luego los autoanticuerpos por medio de
ELISA.
ELISA.
Todos los tres tipos de métodos mejorados de
diagnóstico descritos pueden ser utilizados para detectar una o más
de las tres clases principales de autoanticuerpos para diagnóstico o
IDDM como se describe en los Ejemplos 5 y 7. La detección de estos
autoanticuerpos indican que un paciente tiene, o esta en riesgo de
padecer IDDM (esto es, que el paciente es prediabético). Los
pacientes prediabéticos tienen autoanticuerpos circulando para
GAD_{65} pero no han sufrido aún suficiente daño con las células
\beta productoras de insulina para ser clínicamente identificados
como pacientes con IDDM. Los ensayos son útiles también para
monitorear el efecto de la inmunoterapia para bloquear o prevenir
las reacciones autoinmunes con las células \beta y para
monitorear el progreso de la enfermedad desde la etapa prediabética
hasta la diabetes clínica. Los ensayos son útiles también para
monitorear el estado de las células \beta pancreáticas
trasplantadas en pacientes diabéticos, que han sufrido un injerto
de células de islote, donde la presencia de autoanticuerpos de
GAD_{65} indica una respuesta inmune adversa a las células
trasplantadas.
Los métodos de diagnóstico que utilizan
proteínas de fusión N-terminales son igualmente
aplicables para detectar autoanticuerpos para diagnóstico del
síndrome de Stiff Man que se enlazan a un epítopo lineal formado
entre los aminoácidos 1 - 20 ó 70 - 101. Debido a que estos
epítopos son no conformacionales, no es probable que la adición de
un péptido N-terminal afecte su capacidad de
enlazamiento con autoanticuerpos de SMS. Sin embargo, los otros
métodos mejorados que involucran la supresión de cantidades
sustanciales de secuencia N-terminal o el anclaje
de una proteína GAD_{65} o fragmento de la misma a través de su
secuencia N-terminal deben ser modificados para la
detección del síndrome de Stiff Man. Por ejemplo, mientras se pueden
suprimir longitudes sustanciales de la secuencia
N-terminal para producir un péptido soluble, la
secuencia suprimida usualmente no abarca a los aminoácidos 1 - 20 ó
70 - 101. En forma similar, en los métodos en los cuales el péptido
GAD_{65} se ancla a un soporte a través de un anticuerpo
monoclonal, el anticuerpo monoclonal se debe enlazar a un epítopo
que no se sobreponga a los epítopos de 1 - 120 y 70 - 101 y está
usualmente al menos a 10, más usualmente al menos a 50 aminoácidos
de distancia de estos
epítopos.
epítopos.
La invención también provee métodos para la
detección de ciertos autoanticuerpos de GAD_{65} utilizando
fragmentos insolubles de GAD_{65}. Los Ejemplos describen que una
clase de autoanticuerpos de IDDM (ejemplificados por MICA2) y dos
clases de autoanticuerpos de SMS reconocen epítopos no
conformacionales. Por lo tanto, los fragmentos que contienen estos
epítopos se pueden purificar por medio de solubilización en
detergentes iónicos sin preocuparse de que la perdida de
conformación alterará la capacidad de enlazamiento con
autoanticuerpos que se enlazan a los epítopos no conformacionales.
De este modo, en estos métodos, los fragmentos intactos o
insolubles de GAD_{65}, que incluyen un epítopo no conformacional
(esto es que incluyen al menos un segmento de los aminoácidos 1 -
20, 70 - 101 ó 545 - 585), se purifican en condiciones
desnaturalizantes, y se utilizan luego para detectar
autoanticuerpos de GAD_{65}, sin renaturalización.
En otro aspecto de la invención, se proveen
métodos de diagnóstico que distinguen entre IDDM y el síndrome de
Stiff Man, y/o entre diferentes fases temporales en la progresión de
la IDDM. Algunos métodos detectan autoanticuerpos para diagnóstico
del síndrome de Stiff Man sin detectar autoanticuerpos para
diagnóstico de IDDM. En estos métodos, el reactivo de diagnóstico
es un fragmento de GAD_{65} que tiene un epítopo reactivo con un
autoanticuerpo del síndrome de Stiff Man y está libre de un epítopo
reactivo con un autoanticuerpo de IDDM. Por ejemplo, es adecuado un
fragmento que contiene los aminoácidos 1 - 20 y/o los aminoácidos 70
- 101 y que está sustancialmente libre de los aminoácidos 245 -
585, de manera que carezca de los tres epítopos de enlazamiento del
autoanticuerpo principal de IDDM. Un fragmento que consiste
esencialmente de los aminoácidos 1 - 101, también es
adecuado.
adecuado.
Se proveen otros métodos para monitorear el
progreso temporal de la IDDM. Estos métodos distinguen entre el
reconocimiento temprano y tardío del epítopo y por lo tanto estiman
la duración de la respuesta inmune. Los métodos se derivan, en
parte, de la identificación de tres epítopos que enlazan diferentes
clases de autoanticuerpos para diagnostico de diferentes fases
temporales del progreso de la enfermedad. En estos métodos, se
expone una muestra de suero de un paciente a un primer fragmento de
GAD_{65} que tiene un epítopo reactivo con un primer
autoanticuerpo de GAD_{65}. Se detecta la presencia o la ausencia
de una interacción específica con un autoanticuerpo de GAD_{65},
que puede o no estar presente en el suero. Estas etapas se repiten
luego, utilizando un segundo fragmento de GAD_{65} que tiene un
epítopo reactivo con un segundo autoanticuerpo de GAD_{65}.
Los fragmentos adecuados de GAD_{65} para
diagnóstico temporal deferencial de la IDDM han sido discutidos en
la sección I.D., ver más arriba. En resumen, un fragmento que
incluye una secuencia contigua de los aminoácidos 245 - 585
contiene epítopos reactivos con todas las tres clases principales de
autoanticuerpos de IDDM. Estas clases son autoanticuerpos que
tienen la especificidad de enlazamiento de MICA1/MICA3 (producidos
primero), autoanticuerpos que tienen la misma especificidad de
enlazamiento que MICA4/6 (producidos en segundo lugar) y
autoanticuerpos que tienen la misma especificidad de enlazamiento
que MICA2 (producidos en tercer lugar). Un fragmento que carece
aproximadamente de los 41 aminoácidos C-terminales
(esto es, 545 - 585) es reactivo únicamente con autoanticuerpos de
la clase MICA4/MICA6. Un fragmento que incluye a los aminoácidos 545
- 585 y que está sustancialmente libre de los aminoácidos 245 - 295
es reactivo únicamente con autoanticuerpos de la clase MICA2. De
este modo, por ejemplo, una interacción específica con un fragmento
de los aminoácidos 245 - 585, pero no las otras dos clases de
fragmentos indica a un paciente en las fases tempranas de la
respuesta autoinmune al epítopo de células \beta. La interacción
específica tanto con un fragmento de 245 - 585 como con un
fragmento que carece de los 41 aminoácidos terminales indica a un
paciente en una fase intermedia de respuesta autoinmune. La
reactividad con los tres fragmentos indica una fase tardía de
respuesta autoinmune.
Después del inicio de los síntomas clínicos de
la IDDM, aproximadamente setenta por ciento de los pacientes
producen al menos una clase de autoanticuerpo de GAD_{65}. En
contraste, aproximadamente únicamente 1 - 2% de los pacientes
normales produce estos autoanticuerpos. Ver, por ejemplo Karlsen y
colaboradores, Diabetes 41, 1355 - 1359 (1992); Hagopian y
colaboradores, Diabetes 42, 631 - 636 (1993). Por lo tanto, la
detección de autoanticuerpos de GAD_{65} es fuertemente
diagnóstica de una IDDM establecida.
La detección de autoanticuerpos de GAD_{65} en
individuos normales es también altamente predictiva en la
identificación de individuos con riesgo de desarrollar IDDM. En un
estudio, se analizaron muestras de suero de niños inicialmente
sanos durante un período de tiempo de once años. Siete de las
muestras tomadas al comienzo del estudio se encontró que contenían
al menos una clase de autoanticuerpos de GAD_{65}. Cinco de los
siete niños de los cuales se derivaban estas muestras procedieron a
desarrollar IDDM durante el transcurso del estudio. En contraste,
entre cien niños cuyas muestras iniciales estaban libres de
autoanticuerpos de GAD_{65}, únicamente uno desarrolló IDDM.
Se administran los fragmentos solubles de
GAD_{65} descritos anteriormente a un paciente in vivo para
inducir tolerancia inmunogénica a los determinantes antigénicos
sobre el fragmento soluble. Desde luego, se debe tener cuidado de
que la administración de los fragmentos de GAD_{65} no perpetúe la
respuesta inmune. La naturaleza de la respuesta (esto es,
inmunogénica o tolerogénica) depende de la dosis, de la forma física
y de la ruta de administración del antígeno. Dosis altas o bajas de
un antígeno conducen a menudo a inmunotolerancia, mientras que
dosis intermedias pueden ser inmunogénicas. Las formas monoméricas
de antígeno son usualmente tolerogénicas, mientras que agregados de
alto peso molecular probablemente son inmunogénicas. Una
administración oral, nasal, gástrica o una inyección intravenosa de
antígeno frecuentemente conducen a tolerancia, mientras que un reto
intradérmico o intramuscular especialmente en presencia de
adyuvantes favorece una respuesta inmunogénica. Se ha mostrado que
la administración oral de una antígeno autoinmune protege contra el
desarrollo de encefalomielitis alérgica experimental en modelos
animales, y suprime la artritis reumatoide en modelos animales y en
ensayos clínicos. Ver, Marx, Science 252, 27 - 28 (1991); Trentham
y colaboradores, Science 261, 1727 - 1730 (1993). También se ha
reportado que la administración nasal de un autoantígeno confiere
protección contra encefalomielitis alérgica experimental, y es una
ruta preferida para administración de fragmentos pequeños. Ver
Metzler & Wraith, International Immunology 5, 1159 - 1165
(1993). En algunos métodos, la inmunotolerancia es inducida bajo la
cobertura del tratamiento inmunosupresor. Ver, Cobbold y
colaboradores, WO90/15152 (1990).
La tolerancia se imparte por medio de la
eliminación o de la inducción de no sensibilidad en células T o B
autoinmunes. Se puede inducir en parte por medio de la activación de
mecanismos supresores por parte del fragmento soluble, que suprime
las respuestas celulares y humorales dirigidas al fragmento. La
supresión de respuestas celulares es de importancia particular en
la prevención de la destrucción de las células \beta pancreáticas
en la IDDM. Por lo tanto, los fragmentos de GAD_{65} que
específicamente se enlazan a una célula T autoreactiva de
GAD_{65} (célula T de GAD_{65}) son particularmente adecuados
para la inducción de inmunotolerancia. Ver, por ejemplo, Kaufman y
colaboradores, (1993), Nature 366: 69 - 71; Tisch y colaboradores
(1993), Nature 366, 71 - 75. La supresión de respuestas humorales
se cree que es de importancia particular en la prevención del daño
de las neuronas en el síndrome de Stiff Man.
En algunas modalidades, la generación de la
falta de respuesta y el consecuente daño de la respuesta autoinmune
se facilita por medio del acoplamiento de los fragmentos solubles de
GAD_{65} de la presente invención con inmunoglobulinas, por
ejemplo, IgG, o con células linfoides del paciente que está siendo
tratado. Ver, Bradley-Mullen (1982), Annals N.Y.
Acad. Sci. 392: 156 - 166.
Los fragmentos solubles de GAD_{65} también
son utilizados para inhibir la activación de las células T por
medio del bloqueo del enlazamiento de autoantígenos con un receptor
de MHC utilizando, por ejemplo, el método descrito por Wraith y
colaboradores (1989), Cell 59: 247 - 255. Los fragmentos de
GAD_{65} para uso en estos métodos son sometidos primero a una
modificación de su secuencia de ocurrencia natural. La modificación
se puede efectuar, por ejemplo, por medio de mutagénesis in
vitro de fragmentos de ADN que codifican para GAD_{65}, o por
medio de una nueva síntesis de péptidos análogos sobre un
sintetizador de péptidos. Las modificaciones introducidas dentro de
los fragmentos solubles de GAD_{65} sirven para reducir o eliminar
la afinidad de enlazamiento de los fragmentos solubles de
GAD_{65} por un receptor de células T, mientras que el
mantenimiento, o preferiblemente el reforzamiento de la capacidad
de los fragmentos para enlazarse a moléculas de MHS. Las moléculas
con la especificidad de enlazamiento deseada se pueden seleccionar
por medio, por ejemplo, de una tecnología con despliegue de fagos.
Ver, por ejemplo, Devlin, WO91/18980. Los fragmentos solubles de
GAD_{65} modificados de esta forma compiten con los autoantígenos
de GAD_{65} por el enlazamiento con moléculas de MHC, pero son
incapaces de activar a las células T cuando están enlazados. Por lo
tanto, se reducen la cantidad de autoantígeno auténtico de
GAD_{65} enlazada a receptores de MHC, y el grado de respuesta
inmune mediada por células T logrado por tal enlazamiento.
Otra aproximación para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes se basa en la inducción de una respuesta
inmune de células B dirigida contra las células T responsables por
mediar una enfermedad autoinmune. Ver, generalmente, Sinha y
colaboradores (1990), Science 248: 1380-1388. En
estos métodos, se utilizan fragmentos solubles de GAD_{65} para
la propagación y el aislamiento de aislados clonales de células T
auxiliares o citotóxicas específicas para el autoantígeno de
GAD_{65}. Estas células T o componentes de las mismas son
utilizadas luego como una vacuna para inducir una respuesta inmune
de las células B.
Se recolectan los linfocitos de sangre
periférica de un individuo que sufre, o está en riesgo de sufrir de
IDDM o del síndrome de Stiff Man. Se estimulan las células T
auxiliares o citotóxicas dentro de los linfocitos de sangre
periférica por medio de la exposición a un péptido soluble de
GAD_{65}, utilizando métodos conocidos en el arte (ver, por
ejemplo, Leukocyte Typing II, Vol. 1 (Reinherz y colaboradores eds.,
Springer Verlag, NY, 1986). Usualmente, están presentes otros
mitógenos y reforzadores de crecimiento, por ejemplo,
fitohemaglutinina, interleuquina 2, y similares. Se aíslan los
clones de células auxiliares T o de células T citotóxicas de estos
cultivos. Se pueden atenuar luego los clones de las células T (por
ejemplo, por medio de exposición a la radiación) antes de la
incorporación en una composición farmacéutica para administración
in vivo. Como una alternativa a la atenuación, porciones de
las células T, que son capaces de actuar como inmunógenos, pero que
por si mismas carecen de la actividad auxiliar de T o citotóxica de
T de una célula intacta, por ejemplo, por fraccionamiento
bioquímico. El receptor de las células T o de los fragmentos
inmunogénicos de las mismas, que son capaces de una respuesta
inmune específica para un aislado clonal de células T, son
particularmente adecuados. Se preparan fragmentos de receptores de
células T por medio de técnicas convencionales de ADN
recombinante.
Se pueden incorporar fragmentos solubles de
GAD_{65} o componentes de células T en composiciones farmacéuticas
útiles para atenuar, inhibir, o prevenir la destrucción de células
\beta pancreáticas asociadas con el inicio de la diabetes
mellitus dependiente de insulina, o el daño de las neuronas asociado
con el síndrome de Stiff Man. Las composiciones deben contener una
cantidad terapéutica o profiláctica de al menos un fragmento soluble
de GAD_{65} y/o un componente de células T (por ejemplo, un
fragmento receptor de células T) en un portador farmacéuticamente
aceptable. El portador farmacéutico puede ser cualquier sustancia no
tóxica compatible adecuada para suministrar los polipéptidos al
paciente. Se pueden utilizar como portadores, agua estéril,
alcoholes, grasas, ceras, y sólidos inertes. Los adyuvantes
farmacéuticamente aceptables, agentes amortiguadores, agentes
dispersantes, y similares, pueden ser incorporados también en las
composiciones farmacéuticas. La concentración del péptido
GAD_{65} o de otro agente activo en la composición farmacéutica
puede variar ampliamente, esto es, aproximadamente de menos de 0,1%
en peso, usualmente siendo al menos aproximadamente de 1% en peso
hasta un 20% en peso o más.
Para administración oral, se puede administrar
el ingrediente activo en formas de dosificación sólidas, tales como
cápsulas, y polvos, o en formas de dosificación líquida, tales como
elíxires, jarabes, y suspensiones. El(los)
componente(s) activo(s) se puede(n) encapsular
en cápsulas de gelatina junto con ingredientes activos y portadores
en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón,
celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido
esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnesio y
similares. Los ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que
pueden ser añadidos para suministrar características deseables de
color, sabor, estabilidad, capacidad amortiguadora, dispersión u
otras características conocidas deseables son el óxido de hierro
rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio,
tinta blanca comestible y similares. Se pueden utilizar diluyentes
similares para elaborar tabletas comprimidas. Tanto las tabletas
como las cápsulas se pueden elaborar como productos de liberación
sostenida para proveer una liberación continuada del medicamento
durante un período de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar
recubiertas de azúcar o recubiertas con una película para
enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger la tableta de la
atmósfera, o con un recubrimiento entérico para desintegración
selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas líquidas de
dosificación para administración oral pueden contener colorante y
saborizante para incrementar la aceptación por parte del
paciente.
Una composición típica para infusión intravenosa
podría ser elaborada para contener de 100 a 500 ml de solución
estéril de Ringer y de 100 a 500 mg de un péptido GAD_{65} o de un
péptido receptor de células T. Se elaboraría una composición
farmacéutica típica para inyección intramuscular para contener, por
ejemplo, 1 ml de agua amortiguada estéril y de 1 a 100 \mug del
ligando purificado de la presente invención. Los métodos para
preparar composiciones que pueden administrarse en forma parenteral
son bien conocidos en el arte y están descritos con más detalle en
diferentes fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton,
PA,
1980).
1980).
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se las administra usualmente en forma intravenosa u oral.
La administración intradérmica o intramuscular es posible también en
algunas circunstancias. Las composiciones se pueden administrar
para tratamiento profiláctico de individuos que sufren de, o que
están riesgo de sufrir, de IDDM o de síndrome de Stiff Man, como
los identificados por medio de los métodos de diagnóstico de la
presente invención. Para aplicaciones terapéuticas, se administran
las composiciones farmacéuticas a un paciente que sufre de diabetes
establecida en una cantidad suficiente para inhibir o para evitar
una destrucción adicional de células \beta. Para individuos con
riego de padecer de IDDM o de síndrome de Stiff Man, se administran
las composiciones farmacéuticas profilácticamente en una cantidad
suficiente ya sea para prevenir o para inhibir la destrucción
inmunológica de las células \beta. Una cantidad adecuada para
lograr esto está definida como una "dosis terapéuticamente
efectiva". Tal dosis efectiva dependerá de la severidad de la
respuesta autoinmune y del estado general de salud del paciente,
pero estará generalmente en un rango aproximadamente entre 1 y 500
mg de ligando purificado por kilogramo de peso corporal, siendo
utilizada más comúnmente una dosis aproximadamente entre 5 y 25 mg
por kilogramo.
También se proveen células T que han sido
estimuladas por exposición a un fragmento soluble de GAD_{65}.
Las células T son usualmente células T auxiliares o citotóxicas. Las
células T son específicas para fragmentos de GAD_{65} ya que
ellas exhiben enlazamiento específico con células que soportan
tales fragmentos formando complejos con moléculas de MHC. También
se proveen componentes de las células T que son capaces de inducir
una respuesta inmune contra células T específicas para GAD_{65}.
Los componentes son usualmente receptores de células T o fragmentos
de los mismos. Los fragmentos del receptor deben ser capaces de
inducir una respuesta inmune contra los aislados clonales de
células T a partir de los cuales se deriva el fragmento.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de
ilustración y no como una limitante.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se construyeron vectores baculovirus
recombinantes que expresan GAD_{67} humana y GAD_{65} de rata
ligando un fragmento de BamHI de 1,8 kb de un clon de ADNc que
codifica para GAD_{65} humana dentro del sitio BamHI del vector
baculovirus pVL 941 (del Dr. D. Morgan, UCSF) y un fragmento de
EcoRI de 2,7 kb de GAD_{67} humana o un fragmento EcoRI de 2,4 kb
de un clon de ADNc que codifica para GAD_{65} de rata dentro del
sitio EcoRI del vector baculovirus pVL1392 (Invitrogen, San Diego,
CA). Los ADNc que codifican para GAD_{65} y GAD_{67} eran del
Dr. A. Tobin, UCLA. Se derivaron y aislaron los virus recombinantes
como se describió (ver, Christgau y colaboradores (1992), J. Cell
Biol. 118: 309 - 320) utilizando métodos establecidos (Summers y
Smith (1987), Tex. Agric. Exp. Stn. Bull. 1555: 1 - 56). Se
describió antes el baculovirus recombinante que hospeda a la
GAD_{65} (ver, Christgau y colaboradores (1992), más arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se generó un mutante de supresión
N-terminal, que carecía de los primeros 101
aminoácidos, por medio de mutagénesis dirigida de oligonucleótidos
(ver, Kunkel (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 488 - 492) del
constructo de GAD_{65} de longitud completa insertado dentro del
vector pVL1392, y expresado en células de insecto.
Se prepararon otros mutantes de supresión para
expresión en células COS-7 (American Type Culture
Collection, Bethesda, MD) de la siguiente forma. Se subclonó
GAD_{65} dentro de los sitios KpnI y NotI del vector
pSV-SPORT (BRL, Gaithersburg, MD). Se generó una
colección de mutantes de supresión N-terminales y
C-terminales de GAD_{65} por medio de reacción en
cadena de la polimerasa (ver, Saiki y colaboradores (1988), Science
239: 487 - 494) en sitios predeterminados utilizando iniciadores
anclados. Se generó un mutante interno de supresión que carecía de
los aminoácidos 363 - 422 utilizando los sitios de restricción NsiI
en GAD_{65}. En forma similar, se utilizaron sitios de
restricción BglII para generar una molécula híbrida que contenía los
aminoácidos 1 - 95 de GAD_{67} de rata y los aminoácidos 353 -
585 de GAD_{65} de rata. Se analizó la expresión de los
fragmentos de proteína por medio transferencias Western utilizando
anticuerpos específicos de GAD_{65} o específicos de GAD_{67}
como sondas. Estos anticuerpos fueron obtenidos de las siguientes
fuentes: GAD1monoclonal de ratón (ver, Gottlieb y colaboradores
(1986), Neurobiol. 83: 8808 - 8812), que reconoce las formas nativas
de GAD_{65} y de GAD_{67}, a partir de la American Type Tissue
Collection. GAD6 monoclonal de ratón (ver, Chang y Gottlieb (1988),
J. Neurosci. 7: 2123 - 2130), que es específico para GAD_{65}, fue
donado por el Dr. D. Gottlieb (Washington University, St. Louis).
Un anticuerpo policlonal de conejo, 1266, surgido contra un péptido
C-terminal de GAD_{67} de rata, que reconoce tanto
a GAD_{65} como a GAD_{67}, fue un obsequio del Dr. J. S.
Petersen, Hagedorn Research Laboratory, Copenhague. El antisuero K2,
que reconoce predominante a GAD_{67}, fue un obsequio del Dr. A.
Tobin, UCLA. El suero de un paciente con SMS fue obtenido con el
Dr. Vanda Lennon (Mayo Clinic, Rochester, NY).
Se purificaron los fragmentos de proteína de
células para ensayo como lo describen Christgau y colaboradores
(1991), J. Biol. Chem. 266: 21257 - 21264; Christgau y colaboradores
(1992), J. Cell Biol. 118: 309 - 320).
\newpage
Ejemplo
3
Se examinó la habilidad de un conjunto de
anticuerpos monoclonales derivados de un paciente diabético tipo 1
(las MICA 1-6, ver, Richter y colaboradores, más
arriba) para reconocer proteínas GAD_{65} y/o GAD_{67} humanas
nativas expresadas en células Sf9 de insecto o en células
COS-7. Se evaluó el enlazamiento de anticuerpos con
GAD_{65} por medio de inmunoprecipitación como lo describen
Christgau y colaboradores (1992), ver más arriba; Baekkeskov y
colaboradores (1990), Nature 347: 151 - 157).
Las MICA 1, 2, 3, 4, y 6 todas reconocidas por
GAD_{65}, pero no por GAD_{67}, bajo condiciones nativas.
(Ver, Fig. 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se determine la dependencia de la conformación
analizando la habilidad de las MICA 1 - 4 y 6 para enlazarse con
proteína GAD_{65} bajo condiciones desnaturalizantes, como se
determinó por medio de transferencias Western (ver, Christgau y
colaboradores (1992), más arriba, Baekkeskov y colaboradores (1990),
más arriba. Únicamente MICA2 reconoció GAD_{65} desnaturalizada
sobre transferencias Western (Fig. 3). Además, el suero del
paciente diabético tipo 1 del cual se derivaron las MICA 1 - 6,
coloreó débilmente la GAD_{65} desnaturalizada, pero no la
GAD_{67}, sobre transferencias Western. Los resultados muestran
que las MICA 1, 3, 4 y 6 únicamente reconocen los epítopos no
lineales o conformacionales, mientras que MICA2 reconoce a un
epítopo lineal específico para la molécula de GAD_{65}. Por lo
tanto, la proteína GAD_{65} hospeda epítopos autoinmunes lineales,
así como no lineales o conformacionales, ausentes en la molécula de
GAD_{67}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En experimentos de inmunoprecipitación, todas
las MICA reconocieron a un mutante de supresión que carecía de los
primeros 101 aminoácidos (Fig. 4). Para localizar además los
dominios reconocidos por las MICA, se analizaron una cantidad de
mutantes de supresión N-terminales así como
C-terminales de GAD_{65} de rata expresados en
células COS-7 por enlazamiento con las MICA. El
tamaño de los fragmentos expresados de GAD_{65}, su ubicación en
la secuencia de aminoácidos, y su reactividad con diferentes MICA se
resumen en la Fig. 6A. El mutante de supresión
N-terminal GAD_{65}N44, que carece de los primeros
194 aminoácidos, así como el mutante de supresión
N-terminal GAD_{65}N39, que pierde 50 aminoácidos
adicionales (\Delta1 - 244), fueron reconocidos por todos los
monoclonales en experimentos de inmunoprecipitación (Figs. 6A y 6B).
El mutante de supresión N-terminal GAD_{65}N33,
en el cual se han suprimido 51 aminoácidos adicionales del
N-terminal (\Delta1 - 295) no fue sin embargo
reconocido por las MICA 1, 4, y 6, y fue o bien muy débilmente
positivo o negativo con MICA3 y débilmente positivo con MICA2 en
experimentos de inmunoprecipitación (Figs. 6A y 6B). MICA2
reaccionó igualmente bien con esta forma sobre transferencias
Western que con la molécula de longitud completa. Sin embargo,
MICA2, fue únicamente débilmente positiva en experimentos de
inmunoprecipitación (Figs. 6A y 6B), sugiriendo que el epítopo
lineal reconocido por este anticuerpo monoclonal es secuestrado en
la proteína truncada plegada.
El análisis de los mutantes de supresión
C-terminales mostro que la remoción de 41
aminoácidos en el C-terminal eliminó el
enlazamiento de MICA1, MICA2 y MICA3 (Fig. 6A y 6C). Sin embargo,
MICA4 y MICA6 reconocieron tanto a este mutante (GAD_{65}C61,
\Delta545 - 585) como al mutante de supresión
C-terminal GAD_{65}C53 (\Delta476 - 585) que
carecía de 69 aminoácidos adicionales en el
C-terminal (Figs. 6A y 6C). MICA4 mostró un
enlazamiento más fuerte con ambos mutantes que MICA6. Ninguno de
los monoclonales mostró reactividad con el mutante de supresión
C-terminal GAD_{65}C41 (\Delta376 - 585), que
está perdiendo 100 aminoácidos adicionales en el
C-terminal (Fig. 6A).
Para analizar el efecto de las supresiones en la
parte interna de la molécula, se analizó el enlazamiento de las
MICA con un mutante de supresión, GAD_{65}I59, que carecía de los
aminoácidos 363 - 422 que hospedaban al sitio de enlazamiento de
piridoxalfosfato de la enzima. Ninguna de las MICA excepto MICA2
reconoció a este mutante en experimentos de inmunoprecipitación.
Sin embargo, aunque MICA2 reaccionó igualmente bien con este
mutante y con la molécula de longitud completa sobre transferencias
Western, se enlazó únicamente débilmente en experimentos de
inmunoprecipitación (Fig. 6A) sugiriendo que el epítopo lineal de
MICA2 está únicamente parcialmente expuesto bajo las condiciones
nativas inmunoprecipitación. Se observó el mismo patrón de reacción
con una molécula híbrida que contenía los aminoácidos 1 - 95 de
GAD_{67} enlazada a los últimos 233 aminoácidos de GAD_{65}
(Fig. 6A). Se puede concluir que los aminoácidos dentro de los
últimos 41 aminoácidos de la molécula de GAD_{65} son parte del
epítopo lineal MICA2. Entre aquellos 41 aminoácidos los últimos 16
probablemente no juegan un papel debido a que son idénticos a
GAD_{67} (ver, Erlander y colaboradores (1991), Neuron. 7: 91 -
100) y debido a las cantidades excesivas de un péptido que contiene
esta secuencia no afectó el enlazamiento de ninguna MICA con
GAD_{65}. Entre los 5 aminoácidos que difieren entre GAD_{65} y
GAD_{67} en los 25 aminoácidos restantes, uno es un cambio
conservado. Uno o más de los 4 aminoácidos restantes probablemente
juegan un papel principal en el epítopo de MICA2.
El análisis de los mutantes de supresión indica
tres patrones principales de reconocimiento de las MICA. Uno,
definido por las MICA 1 y 3, depende de los últimos 41 aminoácidos
en la molécula. El segundo, definido por las MICA4 y 6, depende de
estos residuos y está confinado a los aminoácidos hacia el centro de
la molécula. El tercero, definido por MICA2, depende de los últimos
41 aminoácidos en la molécula, pero es independiente de los otros
aminoácidos.
GAD_{67} y GAD_{65} son muy diversas en los
primeros 95 aminoácidos pero comparten una homología significativa
(aproximadamente del 75%) en el resto de la molécula. Ver, Erlander
y colaboradores (1991), más arriba. Sin embargo, sorprendentemente,
ninguno de los epítopos específicos de GAD_{65} reconocidos por
las MICA fue localizados en los primeros 244 aminoácidos en el
N-terminal. Por lo tanto, los epítopos de las MICA
se concentran en áreas de la molécula que están significativamente
apartadas del dominio de anclaje N-terminal en la
membrana. Los últimos 110 aminoácidos en el
C-terminal no contribuyen con el (los)
epítopo(s) de MICA 4 y 6, que abarca(n) a los
residuos en la mitad de la molécula. En contraste, la supresión de
41 aminoácidos en el C-terminal elimina los
epítopos de las MICA 1 y 3. Además, la supresión de los aminoácidos
245 - 295 elimina todos los cambios conformacionales en la región
C-terminal, como lo sugiere el enlazamiento débil de
MICA2 con este mutante, mientras que la supresión de los
aminoácidos 1 - 41 y 42 - 110 en el C-terminal no
parece afectar a la región media de la molécula de GAD_{65} donde
los epítopos de las MICA 4 y 6 permanecen intactos. Finalmente,
MICA3 se enlazó débilmente con el mutante GAD_{65}N33, mientras
que no se detectó enlazamiento con los mutantes de supresión
C-terminales. Por lo tanto, la supresión de los
aminoácidos 244 - 295 probablemente afecta la conformación de la
región C-terminal, mientras que la supresión de los
aminoácidos C-terminales parece afectar
directamente a los epítopos de las MICA 1 y 3. Una parte
significativa del epítopo lineal de MICA2 está localizada entre los
aminoácidos 545 y 569, esto es, cerca al
C-terminal.
C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Las similitudes y diferencias en el
reconocimiento del epítopo por medio de las MICA fueron analizadas
por medio de la huella digital de la proteína (ver, Sheshberadaran
& Payne (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 1 - 5), utilizando
500 \mul de sobrenadante de MICA o 10 \mul de GAD6 o GAD1 de
ascitis respectivamente. Se aislaron los inmunocomplejos por medio
del enlazamiento con proteína-A- sefarosa y se lavó.
Para estabilizar los inmunocomplejos, se incubó anticuerpo IgG
anti-humano (específico de H+L, fragmentos
F(ab)2, Jackson) con el complejo PAS
antígeno-anticuerpo durante 45 minutos a 4ºC antes
de incubar con proteasas. Las incubaciones con proteasas fueron de
30 minutos sobre hielo (quimotripsina y tripsina) o de 1 hora a 37ºC
(quimotripsina). Se detuvo el tratamiento con proteasa lavando los
complejos enlazados con PAS en amortiguador de IMP, seguido por
análisis SDS-PAGE y fluorografía. Se digirieron los
inmunocomplejos de GAD_{65}, enlazadas a las MICA individuales y
se estabilizó por medio del enlazamiento con un anticuerpo
secundario, con tripsina y quimotripsina. Se analizaron entonces
los fragmentos protegidos de la degradación por las MICA, por medio
de SDS-PAGE.
La Fig. 5 muestra dos patrones principales
distintos de huellas digitales que distinguen a las MICA 1, 2 y 3
de las MICA 4 y 6. Dentro del primer grupo, MICA 1 y 3 mostraron
patrones idénticos que fueron similares aunque distintos de
aquellos de MICA2. Además, en el Segundo grupo, MICA4 y MICA6
mostraron únicamente diferencias menores (Fig. 5).
Tanto MICA4 como MICA6 protegieron a la molécula
de longitud completa de GAD_{65} y a un fragmento de 55 kDa que
carecía del N-terminal (ver, Christgau y
colaboradores (1992), más arriba), más eficientemente de lo que lo
hicieron las MICA 1, 2 y 3. Por lo tanto, en contraste con las MICA
4 y 6, no se detectó GAD_{65} de longitud completa o un fragmento
de 55 kDa en inmunocomplejos con las MICA 1, 2 y 3 después de una
incubación prolongada con quimotripsina. (Fig. 5, comparación de
las líneas 10 y 11 con las líneas 7 y 9). Estos resultados sugieren
que la MICA4 y la MICA6 enlazan áreas de la molécula cercanas al
N-terminal y por lo tanto protegen esta parte de la
molécula mejor que las MICA 1, 2, y 3.
Mientras que las MICA 1, 3, 4 y 6 mostraban aún
un patrón de huella digital complejo después de incubaciones
prolongadas con quimotripsina (Fig. 5, líneas 7 - 12), únicamente 1
banda de aproximadamente 14 kDa fue protegida por medio de MICA2
bajo esas condiciones (Fig. 5, línea 8).
En resumen, los patrones de huellas digitales
complejas de las MICA 1, 3, 4 y 6 son consistentes con un
reconocimiento no lineal del epítopo, mientras que el fragmento
individual de 14 kDa protegido por MICA2 es consistente con un
reconocimiento lineal del epítopo por medio de este anticuerpo
monoclonal. Además, los resultados de la huella digital sugieren
que las MICA 4 y 6 reconocen áreas más hacia el
N-terminal que las MICA 1, 2, y 3.
\newpage
Ejemplo
7
Se analizaron los sueros de nueve pacientes
diabéticos jóvenes tipo 1 recientemente diagnosticados (\Delta1 -
9, Fig. 7) con edades entre 4-1/2 hasta 26 años (6H,
3M), y 1 individuo prediabético (PI, hembra, 11 años de edad)
muestreados 32 meses antes del inicio clínico de la enfermedad, por
su enlazamiento con los mutantes de supresión
N-terminal y C-terminal. Los sueros
de pacientes diabéticos tipo 1 fueron obtenidos con el Dr. H. J.
Aanstoot (Universidad de Rotterdam, Países Bajos) o descritos
previamente (ver, Baekkeskov y colaboradores (1987), J. Clin.
Invest. 79: 926 - 934).
Además, se analizaron paralelamente sueros del
paciente de quién se derivaron las MICA (D10) y de otro individuo
(macho de 24 años), positivos para autoanticuerpos citoplasmáticos
de células de islote, pero que no tenían síntomas clínicos de
diabetes tipo 1 (P2), (Fig. 7). Todos los once sueros nuevos
reconocieron al mutante de supresión N-terminal
GAD_{65}N44 (Ä1 - 194) (Fig. 7) al igual que la molécula de
longitud completa. La supresión de 244 aminoácidos
N-terminales (GAD_{65}N39) resultó en una
reactividad ligeramente menor con algo de los sueros (Fig. 7),
mientras que la supresión adicional de 51 aminoácidos
(GAD_{65}N33) eliminó el reconocimiento por parte de todos los
sueros. Los sueros probaron ser distinguibles en el análisis del
mutante que carecía de 41 aminoácidos en el
C-terminal (GAD_{65}C61). Cuatro sueros incluido
el suero del individuo prediabético (PI), muestreados 32 meses
antes del inicio clínico de la enfermedad, así como los sueros de
tres pacientes recientemente diagnosticados (D3, hembra de 11 años,
D4, macho de 4,5 años, y D5, macho de 26 años), todos los cuales
fueron fuertemente positivos para los anticuerpos de GAD_{65},
mostraron ser o bien muy débiles o no reactivos con el mutante
GAD_{65}C61 (Fig. 7). El resto de los sueros eran aún fuertemente
positives para esta proteína truncada (Fig. 7). En resumen, la
supresión de 1/3 de la molécula de GAD_{65} del
N-terminal no resultó en una disminución detectable
en inmunoreactividad con los sueros diabéticos, mientras que la
supresión de 41 aminoácidos del C-terminal
efectivamente eliminó los epítopos reconocidos por algunos de los
sueros de los pacientes. Ninguno de los 11 sueros de los pacientes
reconoció GAD_{65} sobre transferencias Western y por lo tanto no
contenían autoanticuerpos con un reconocimiento lineal de epítopo,
tal como MICA2.
Las frecuencias relativas con las cuales las
tres diferentes clases de anticuerpos de diabetes mellitus se
presentan en diferentes muestras de suero se pueden relacionar con
el tiempo en el cual se producen. En enfermedades autoinmunes,
tanto la autoinmunidad humoral como la celular están a menudo
dirigidas a un epítopo dominante único en las fases tempranas pero
pueden propagarse a otras regiones en el autoantígeno con mayor
duración de respuestas autoinmunes (ver, McNeilage y colaboradores,
(1990), J. Immunol. 145: 3829 - 3835; St. Clar y colaboradores,
(1990), J. Clin. Invest. 85: 515; Lehmann y colaboradores, (1992),
Nature 358: 155 - 157). Los autoanticuerpos de GAD_{65} han sido
detectados durante fases tempranas de destrucción de células \beta
pancreáticas, que es a menudo varios años antes de que la mayoría
de las células \beta hayan desaparecido y se hayan desarrollado
los síntomas clínicos (ver, Baekkeskov y colaboradores, (1987), más
arriba, Atkinson y colaboradores, (1990), Lancet 335: 1357 - 1360).
Estas observaciones sugieren que la respuesta autoinmune primaria
puede estar limitada a autoanticuerpos contra un epítopo único, con
autoanticuerpos más diversos desarrollándose posteriormente durante
la respuesta autoinmune primaria. Por lo tanto, es probable que los
epítopos de GAD_{65} definidos por las MICA representen tanto
respuestas humorales tempranas como tardías. El epítopo definido
por las MICA 1 y 3, que fue reconocido por todos los sueros
analizados, es probablemente indicativo de una respuesta humoral
temprana. El epítopo definido por las MICA 4 y 6, que fue reconocido
por algunos, pero no por todos los sueros analizados, probablemente
representa una respuesta humoral intermedia. El epítopo definido
por MICA2, que fue reconocido únicamente por sueros del paciente de
quien se derivaron las MICA, probablemente representa una respuesta
humoral tardía. Las respuestas tumorales progresivas propuestas par
alas diferentes clases de epítopos se pueden confirmar monitoreando
las muestras de suero de individuos prediabéticos durante un
período de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se han llevado a cabo experimentos para
localizar epítopos reconocidos por sueros de pacientes con SMS sobre
la molécula de GAD_{65}. Se construyeron mutantes de supresión
N-terminales de GAD_{65} en los cuales se
suprimieron los primeros 69 - 70 o los primeros 101 aminoácidos. Se
analizaron estos fragmentos para el enlazamiento con
autoanticuerpos en sueros de pacientes con SMS bajo condiciones
desnaturalizantes. La Fig. 8 muestra la coloración de
transferencias Western de GAD_{67} intacta, GAD_{65} intacta, de
un fragmento tríptico de 57 kDa de GAD_{65}, que carecen de los
primeros 69 - 70 aminoácidos, y un mutante de supresión de 55 kDa
de GAD_{65} que carece de los primeros 101 aminoácidos con i) un
suero típico del SMS, que reconoce GAD_{65} pero no GAD_{67},
que muestra una coloración más débil con el fragmento de 57 kDa que
la proteína de longitud completa, y que no muestra reactividad con
el mutante de supresión de 55 kDa, ii) sueros de conejo
policlonales de conejo de control, los cuales colorean todos los
fragmentos.
La Fig. 8 muestra que la reactividad de los
sueros del SMS con la proteína GAD_{65} cae significativamente en
el fragmento de GAD_{65} que carece de los primeros 69 - 70
aminoácidos, indicando que un epítopo lineal está localizado dentro
de estos residuos. La pérdida completa de reactividad en el
fragmento \Delta 101 de GAD_{65} indica que un segundo epítopo
está localizado entre los aminoácidos 69 ó 70 y el aminoácido 101.
De 26 muestras analizadas de sueros del SMS, 22 mostraron los
resultados anteriores.
Los dos epítopos lineales identificados por
medio de transferencias Western han sido localizados adicionalmente
por medio de experimentos de enlazamiento competitivo utilizando
péptidos GAD_{65} artificiales. Se ha encontrado que los péptidos
que contienen los aminoácidos 1 - 20 ó 70 - 101 de GAD_{65}
efectivamente compiten con los sueros del SMS por el enlazamiento
con GAD_{65}. Los resultados localizan un epítopo en los
aminoácidos 1 - 20, y otro epítopo en los aminoácidos 70 - 101.
La diferencia clara en el reconocimiento del
epítopo entre autoanticuerpos de pacientes que sufren de IDDM y del
síndrome de Stiff Man sugiere que la autoinmunidad humoral con
GAD_{65} está probablemente relacionada con los diferentes
mecanismos patogénicos a través de los cuales surge el síndrome de
Stiff Man o la IDDM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Como se discutió anteriormente, el dominio
N-terminal de GAD_{65} contiene modificaciones
lipídicas que hacen insoluble a la proteína intacta en solventes
acuosos. Este Ejemplo localiza los sitios de los aminoácidos en los
cuales se presentan las modificaciones, y que deben ser removidos
para generar un fragmento soluble de GAD_{65}.
Para analizar si los residuos de cisteína en las
posiciones 30 y 45 son sitios de palmitoilación, se construyeron
polipéptidos mutantes GAD_{65} por medio de mutagénesis dirigida
al sitio en la cual uno o ambos de estos residuos fueron
reemplazados con residuos de alanina. Los mutantes individuales
fueron llamados 30A y 45A, y el mutante doble fue llamado 30/45A.
Los vectores que contenían estos tres mutantes de GAD, GAD_{65} de
tipo silvestre o un mutante \Delta101 de GAD_{65} se expresaron
en forma transitoria en células COS en el medio que contenía ácido
palmítico con [^{3}H] o metionina con [^{35}S]. Se
inmunoprecipitaron los polipéptidos GAD_{65} y se los analizó por
medio de SDS PAGE. La Fig. 9 compara la incorporación de una
marcación en la variedad de tipo silvestre; en el mutante 30A, en el
mutante 45A, en el mutante \Delta1-101, y en el
mutante 30/45A. La figura muestra que el mutante doble 30/45A, pero
no los mutantes individuales 30A o 45A, han perdido la habilidad
para convertirse en palmitoilados. El mutante \Delta 101 ha
perdido también la habilidad para convertirse en palmitoilado.
Aunque los análisis anteriores identifican a los
aminoácidos 30 y 45 como los sitios de palmitoilación, otros
aminoácidos N-terminales pueden ser objeto de otras
modificaciones lipídicas. Esta posibilidad fue analizada por medio
de la construcción de una serie de mutantes de supresión del
fragmento 30/45A de GAD_{65}, en los cuales se suprimieron
cantidades crecientes de la secuencia N-terminal. Se
insertaron los fragmentos en los vectores de expresión y se los
transformó dentro de células COS. Se extrajo la proteína celular
total de las células COS que expresan GAD65 o a un mutante de
supresión N-terminal con amortiguador Hepes más
TX-114 al 1%, y se dividió entre una fase acuosa
(A) y una fase detergente (D) en un ensayo de partición en
TX-114. Se analizaron las fracciones por medio de
SDS PAGE, y se detectaron los polipéptidos GAD_{65} por medio de
transferencias Western utilizando sueros contra un péptido
GAD_{65} C-terminal como la sonda. La Fig. 10
muestra que para GAD_{65} de tipo silvestre y los mutantes de
supresión 30/45A \Delta 1 - 8, 30/45A A 1 - 15 y 30/45A \Delta
1 - 23, el fragmento de GAD_{65} aparece en ambas fases, la acuosa
y la detergente. Sin embargo, para los mutantes 30/45A \Delta 1 -
31 y 30/45A \Delta 1 - 38, el fragmento de GAD_{65} aparece
exclusivamente en la fase acuosa. La comparación de los aminoácidos
presentes en los polipéptidos hidrófobos e hidrofílicos indica que
los aminoácidos 24 - 31 confieren la hidrofobicidad de los
polipéptidos
GAD_{65}.
GAD_{65}.
Estos resultados han sido confirmados por medio
de análisis de inmunofluorescencia de células intactas que expresan
GAD_{65} de tipo silvestre o un mutante de supresión 30/45A
\Delta 1 - 38 de la misma. Mientras que la proteína GAD_{65} de
tipo silvestre se encuentra concentrada en estructuras membranosas
perinucleares consistentes con el anclaje en la proteína, la
ubicación del mutante de supresión N-terminal es
citosólica.
Se concluye que se puede producir un fragmento
soluble de GAD_{65} por medio de la supresión de los aminoácidos
24 - 31 y, preferiblemente, la mutación del aminoácido 45. Desde
luego, supresiones N-terminales más sustanciales
que abarcan estos cambios son también efectivas, por ejemplo, la
supresión de los aminoácidos 1 - 45. Se produciría también un
fragmento soluble de GAD_{65} por medio de la síntesis del
fragmento bajo condiciones, por ejemplo, de traducción in
vitro, bajo las cuales no ocurren las modificaciones posteriores
a la traducción.
Aunque la anterior invención ha sido descrita en
detalle para propósitos de claridad en su comprensión, será obvio
que se pueden practicar ciertas modificaciones dentro del alcance de
las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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<210> 1
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<211> 585
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Un método para elaborar un fragmento soluble
de una proteína GAD_{65} que es especialmente reactiva con un
autoanticuerpo de GAD_{65}, que comprende la expresión de un
vector que codifica al fragmento soluble para producir el fragmento
soluble, en donde el fragmento está libre de aminoácidos
N-terminales que limitan la solubili-
dad.
dad.
2. El método de la Reivindicación 1, en donde
los aminoácidos N-terminales son los aminoácidos 24
a 31, y 45, que tienen un residuo de alanina en la posición 45 del
fragmento en lugar de un residuo de cisteína de ocurrencia
natural.
3. El método de la Reivindicación 2, en donde
los aminoácidos N-terminales son los aminoácidos 1 a
244.
4. El método de la Reivindicación 1, en donde el
fragmento está libre de un segmento que tiene un epítopo
específicamente reactivo con un segundo autoanticuerpo de
GAD_{65}.
5. El método de la Reivindicación 4, en donde el
segmento es de los aminoácidos 545 a 585.
6. El método de la Reivindicación 4, en donde el
segmento es de los aminoácidos 245 a 295.
7. El método de la Reivindicación 6, en donde el
fragmento consiste de al menos ocho aminoácidos contiguos de los
aminoácidos 545 a 585.
8. El método de la Reivindicación 1, en donde el
fragmento comprende una secuencia contigua de los aminoácidos 245 a
585, y el fragmento comprende tres epítopos diferentes
específicamente reactivos con tres diferentes autoanticuerpos de
GAD_{65}.
9. El método de la Reivindicación 8, en donde
dicho fragmento está libre de los aminoácidos 1 a 101.
10. El método de la Reivindicación 1, en donde
el fragmento comprende una secuencia contigua de al menos ocho
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos 70 a 101.
11. El método de la Reivindicación 10, en donde
el fragmento comprende una secuencia contigua de los aminoácidos 70
- 101.
12. El método de la Reivindicación 1, en donde
el fragmento comprende una secuencia contigua de al menos ocho
aminoácidos de los aminoácidos 1 a 20.
13. El método de la Reivindicación 12, en donde
el fragmento comprende una secuencia contigua de los aminoácidos 1
a 20.
14. El método de la Reivindicación 11, en donde
el fragmento consiste de los aminoácidos 70 a 101.
15. El método de la Reivindicación 12, en donde
el fragmento consiste de los aminoácidos 1 a 20.
16. Un polipéptido de fusión GAD_{65}
inmovilizado a un soporte sólido, el polipéptido de fusión
incluyendo un polipéptido GAD_{65} específicamente reactivo con
un autoanticuerpo de GAD_{65}, y un polipéptido de extensión
fusionado al N-terminal del polipéptido GAD_{65},
en donde el polipéptido de fusión está inmovilizado al soporte a
través del péptido de extensión.
17. Un polipéptido GAD_{65} inmovilizado a un
soporte sólido, en donde el polipéptido es específicamente reactivo
con un autoanticuerpo de GAD_{65}, y el polipéptido está
inmovilizado al soporte a través de un anticuerpo
anti-GAD_{65} específicamente reactivo con un
epítopo dentro de los aminoácidos 1 - 244 del polipéptido
GAD_{65}.
18. Un método para detectar autoanticuerpos de
GAD_{65} en sueros, el método comprendiendo:
- exponer una muestra de suero a un fragmento soluble de GAD_{65} producido como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15 que es específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el fragmento de GAD_{65} y el autoanticuerpo.
19. El método de la Reivindicación 18, en donde
el fragmento de la misma secuencia de aminoácidos es de ocurrencia
natural.
20. El método de la Reivindicación 18 o la
Reivindicación 19, en donde el autoanticuerpo de GAD_{65} es un
autoanticuerpo de célula pancreática \beta de 64 kDa.
21. El método de cualquiera de las
Reivindicaciones 18 a 20, en donde el fragmento soluble de
GAD_{65} está marcado.
22. El método de la Reivindicación 21 que
comprende además la etapa de precipitar un complejo formado entre el
fragmento soluble de GAD_{65} y el autoanticuerpo de GAD_{65}
antes de la etapa de detección.
23. El método de la Reivindicación 21 que
comprende además la etapa de añadir un polipéptido GAD_{65} no
marcado que compite con el fragmento marcado de GAD_{65} por el
enlazamiento específico con el autoanticuerpo de GAD_{65}.
24. El método de la Reivindicación 20, que
comprende además la etapa de combinar la muestra de suero con un
anticuerpo marcado que compite con el autoanticuerpo para formar
complejos con el fragmento de GAD_{65}.
25. El método de la Reivindicación 24, en donde
el fragmento de GAD_{65} se enlaza a una fase sólida y el método
comprende además la etapa de remover la fase sólida de la muestra de
suero para separar los complejos de anticuerpo marcado no
enlazado.
26. Un método para detectar autoanticuerpos de
GAD_{65} en sueros, el método comprendiendo:
- proveer un polipéptido de fusión que incluye una proteína GAD_{65} o fragmento de la misma, específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65}, y un polipéptido de extensión fusionado al N-terminal de la proteína o del fragmento;
- inmovilizar el polipéptido de fusión a un soporte sólido a través del polipéptido de extensión;
- exponer una muestra de suero al polipéptido de fusión; y detectar una interacción específica entre el fragmento y el autoanticuerpo.
27. Un método para detectar autoanticuerpos de
GAD_{65} en sueros, el método comprendiendo:
- proveer un primer anticuerpo específicamente reactivo con un primer epítopo que se presenta dentro de los aminoácidos 1 a 244 o un polipéptido GAD_{65};
- inmovilizar el primer anticuerpo a un soporte sólido; exponer el polipéptido GAD_{65} al primer anticuerpo para inmovilizar la proteína a dicho soporte a través del primer anticuerpo, en donde el polipéptido GAD_{65} incluye a un primer epítopo reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65}; exponer una muestra de suero al fragmento de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el fragmento de GAD_{65} y el autoanticuerpo.
28. El método de la Reivindicación 27, en donde
el polipéptido GAD_{65} es de ocurrencia natural y el primer
anticuerpo es específicamente reactivo con un primer epítopo entre
los aminoácidos 60 y 120 del péptido GAD_{65}.
29. Un método para diagnosticar o monitorear
diabetes mellitus dependiente de insulina en un paciente,
comprendiendo el método:
- exponer una muestra de suero del paciente a un fragmento soluble de GAD_{65} que tiene un epítopo específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65} para diagnóstico de diabetes mellitus dependiente de insulina producido como en cualquiera de las Reivindicaciones 1 - 15; y
- detectar la interacción entre el fragmento y el autoanticuerpo diagnóstico para la diabetes mellitus dependiente de insulina.
30. Un método para monitorear el progreso de la
diabetes mellitus dependiente de insulina en un paciente, el método
comprendiendo las etapas de:
- exponer una muestra de suero del paciente a un primer fragmento de GAD_{65} que incluye un primer epítopo específicamente reactivo con un primer autoanticuerpo de GAD_{65}, en donde el fragmento de GAD es producido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 - 15;
- detectar una interacción específica entre el primer fragmento y el primer autoanticuerpo;
- exponer la muestra de suero a un segundo fragmento de GAD_{65} que incluye un segundo epítopo específicamente reactivo con un segundo autoanticuerpo de GAD_{65}; y
- detectar una interacción específica entre el segundo fragmento y el segundo autoanticuerpo.
\newpage
31. El método de la Reivindicación 30, en donde
el primer autoanticuerpo es diagnóstico de una primera fase temporal
de la diabetes mellitus dependiente de insulina y el segundo
autoanticuerpo es diagnóstico de una segunda fase temporal de
diabetes mellitus dependiente de insulina.
32. El método de la Reivindicación 31, en donde
los fragmentos son solubles.
33. Una composición farmacéutica que incluye un
fragmento soluble de GAD_{65} específicamente reactivo con un
autoanticuerpo de GAD_{65}, en donde el fragmento está libre de
aminoácidos N-terminales que limitan la
solubilidad, en un portador farmacéuticamente aceptable.
34. El uso de un fragmento soluble de GAD_{65}
en la fabricación de una composición para uso en terapia en un
método para tratar a un paciente que sufre de, o que está en riesgo
de padecer de diabetes mellitus dependiente de insulina o de
síndrome de Stiff Man.
35. Un fragmento soluble de GAD_{65}, en donde
el fragmento está libre de aminoácidos N-terminales
que limitan la solubilidad, y que contiene un epítopo
específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65} y
acoplado con una inmunoglobulina o célula linfoide de un paciente
que va a ser tratado con eso.
36. Un fragmento soluble de una proteína
GAD_{65}, en donde el fragmento está libre de aminoácidos
N-terminales que limitan la solubilidad, y es
específicamente reactivo con un autoanticuerpo de GAD_{65} para
uso en un método de tratamiento o profilaxis de IDDM.
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