TW201339578A - 在低傳導率下具有增加之靈敏度的自體抗體測量 - Google Patents

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Abstract

本發明提供偵測或捕捉生物樣品中之低親合力自體抗體的方法。將用於所關注之低親合力自體抗體的分析中之目標抗原固定於固相上。使生物樣品在低傳導率條件下與該目標抗原接觸，該等自體抗體對該目標抗原具有特異性結合親和力。接著偵測該目標抗原與該生物樣品中所關注之該等自體抗體的結合以確定所關注之該等自體抗體的存在或濃度。

Description

在低傳導率下具有增加之靈敏度的自體抗體測量
自體抗體於疾病中之作用為一個密集研究之主題。自體抗體形成具有以抗體、肽或核酸自體抗原為目標之能力的相異譜系。此等自體抗體可為單價或多反應性抗體且可展現不同親和力及親合力；解離常數可在10-5至10-8 M之範圍內。雖然自體抗體廣泛與自體免疫疾病有關，但自體抗體之子集亦在維持免疫內穩定及功能適當之免疫系統中起非病理學作用。有愈來愈多的證據證明自體抗體對外周免疫系統中之T及B淋巴細胞之存活及/或發育、針對微生物感染之防禦、發炎抑制、介導胞葬作用(efferocytosis)、抗遺傳型免疫調節及細胞激素產生之調節必不可少。參見Elkon等人(2008)Nat Clin Pract Rheumatol 4(9)：491-498；Silverman等人(2009)Discovery Medicine 8(42)：151-156；及Lacroix-Desmazes S.等人，(1998)：J Immunol Methods 216,117-137。
偵測懷疑患有或經診斷患有自體免疫疾病之患者中的自體抗體在研究或臨床情形中具有顯著效用。自體抗體可用作疾病進展之診斷標記物或指示物。舉例而言，SLE(全身性紅斑狼瘡)中之dsDNA抗體的含量升高與 疾病活性增加有關且有時先於患者之臨床復發。在文獻中多種自體抗體與多種病症有關聯。參見Watts等人(2002)Medicine 30(10)：2-6。一些實例包括阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)中之抗類澱粉蛋白-β；甲狀腺炎中之抗甲狀腺球蛋白；自體免疫肝病、自體免疫聽力損失及自體免疫甲狀腺疾病中之抗微管蛋白；類風濕性關節炎中之類風濕因子；及SLE中之抗dsDNA抗體(Ab)。
自體抗體之測量亦適用於治療性目的，尤其隨著用於愈來愈多的自體免疫疾病之靜脈內免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)療法的出現。實例包括(但不排除)免疫血小板減少性紫癜、川崎病(Kawasaki disease)、古-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、多發性肌炎/皮肌炎、血管炎及全身性紅斑狼瘡(SLE)。參見Yaniv等人(2000年9月)「Intravenous Immunoglobulin(IVIG)in Autoimmune Diseases Expanding Indications and Increasing Specificity」,American Autoimmune Related Diseases Association公司之Research Report。亦已顯示IVIG療法有效治療阿茲海默氏病。研究已證明抗Aβ自體抗體於促進清除神經毒性Aβ組件及減少CSF(腦脊髓液)中之血清Aβ、轉而又減少大腦Aβ肽沈積及認知衰退中的作用。參見Szabo等人(2008)Autoimmuity Reviews 7：415-420。
然而，自體抗體分析結果僅與該分析所產生之資料品質一樣有用。諸如Farr分析、短膜鞭毛蟲屬(Crithidia)IFA(免疫螢光分析)及ELISA之習知免疫偵測方法在特異性與靈敏度之間折中且具有其各別限制。參見Hughes等人(2006)CLI 18(7)：12-17。舉例而言，Farr分析使dsDNA/抗dsDNA Ab之免疫複合物在高鹽濃度下在硫酸銨中沈澱，由此引起低親合力dsDNA/抗dsDNA抗體複合物解離且從而侷限於偵測具有相對高親合力之自體抗體。此結果遭受挫折，因為自體抗體關於其親合力高度異質且中等至低親合力之自體抗體亦可具有臨床顯著性，如阿茲海默氏病(AD)中所見，其 中IgG自體抗體結合於β類澱粉蛋白(Aβ)單體上之抗原決定基且以中等親合力聚集。參見Szabo等人(2010)Journal of Neuroimmunology 227：167-174。此外，Farr分析利用放射性標記且勞動密集並昂貴。雖然IFA短膜鞭毛蟲屬能夠偵測中等至高親合力之自體抗體，但由於其依賴於載片計分而相當耗時且具主觀性。ELISA分析一般更加靈敏且易自動化，因此通常為所選分析。
標準ELISA方法並非無缺點。與諸如免疫沈澱及免疫電泳之其他方法相比，其一般特異性較小且遭受如文獻中所說明之大量問題。作為範例，標準ELISA方法對AD患者中相對於老年正常對照者中之抗Aβ自體抗體的相對效價產生廣泛不同的估計。藉由標準ELISA方法對完整血漿試樣之最初研究將針對Aβ單體之內源性抗體的效價與老年匹配非癡呆對照者相比較低歸因於AD患者(Weksler等人，Exp Gerontol.,37：943-948(2002))。後續研究基於對在低pH值下自蛋白G管柱洗提之血漿免疫球蛋白進行的ELISA報導AD患者中之循環抗Aβ單體抗體的效價相等或增加(Mruthinti等人，Neurobiol Aging,25：1023-1032(2004))(Akerström等人，J Biol Chem.,261：10240-10247(1986))。假設由此方法獲得之較高效價反映在全血漿分析中未偵測到且當藉由在蛋白G純化過程中酸化來清除抗原時可測量之經結合抗類澱粉蛋白抗體池之存在。
Aβ之錯誤摺疊及聚集為AD之首要發病機制。人類免疫球蛋白G(IgG)譜系含有在疫苗接種或被動免疫接種不存在下出現的針對Aβ肽之自體抗體且已在各種年齡之正常成人及AD患者之血液中偵測到該抗Aβ自體抗體活性(Weksler等人，Exp Gerontol.,37：943-948(2002)；Hyman等人，Ann Neurol.,49：808-810.5(2001)；Mruthinti等人，Neurobiol Aging.,25：1023-1032(2004)；Nath等人，Neuromolecular Med.,3：29-39(2003)；Sohn等人，Frontiers in Bioscience.,14：3879-3883(2009))。對該等抗類澱粉蛋白-β自體抗體之關注 已隨以下發現而增強：含有高含量之自體抗體的人類IVIG對AD患者具有治療性作用(Dodel等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry.,75：1472-1474(2004)；Hyman等人，Ann Neurol.,49：808-810.5(2001)；Mruthinti等人，Neurobiol Aging.,25：1023-1032(2004))。
儘管阿茲海默氏病研究有了最新進展，但準確測量抗類澱粉蛋白-β自體抗體之努力已被許多阻礙破壞。一個阻礙為存在多個種類之識別聚集形式之Aβ上的線性以及構形新抗原決定基之人類抗體。迄今為止，報導已鑑別針對Aβ原纖維(O'Nuallain等人，J Immunol.,176：7071-7078(2006))、Aβ寡聚物(Moir等人，J Biol Chem.,280：17458-17463(2005)；Relkin等人，Alzheimer's and Dementia,3：S196,X(2008)；O'Nuallain等人，Biochemistry,47：12254-12256(2008))及Aβ單體上之構形抗原決定基(Baumketner A等人，Prot Scl,15：420-428(2006))之內源性人類抗體。已報導其他類型之類澱粉蛋白結合抗體及甚至針對Aβ之催化抗體(Taguchi H等人，J Biol Chem.,284：4714-4722(2008))。
低親合力、多反應性自體抗體之測量為一特定挑戰，其歸因於結合於空ELISA孔之高背景及來自血液樣品中之其他血漿蛋白及組分的分析干擾。參見Szabo等人(2010)Journal of Neuroimmunology 227：167-174。此等問題必須克服，因為IVIG中之大部分IgG自體抗體為多反應性及低親合力抗體。
已努力改良抗Aβ自體抗體分析之靈敏度及信雜比，包括布雷特施奈德(Brettschneider)研究組所開發之放射免疫沈澱分析。參見Brettschneider等人(2005)Biol.Psychiatry 57：813-816。在另一項研究中，在聚苯乙烯及/或瓊脂糖管柱上進行IVIG之預分析通過，希望消耗非特異性自體抗體結合物。結果不夠理想，因為消耗對於結合空白培養板之自體抗體不具特異性且消耗降低了抗Aβ自體抗體已較低的濃度，此使測量進一步複雜化。多 反應性自體抗體之低親合力使其難以偵測，且所得信號強度進一步受來自其他血漿蛋白質及組分之干擾影響，從而導致抗類澱粉蛋白活性被低估。
補償多反應性、低親合力抗類澱粉蛋白-β自體抗體常見之低自體抗體濃度的習慣作法將稀釋較少之樣品用於分析。然而，此技術增加信號強度與雜訊。另一方法涉及用離液鹽(硫氰酸銨)處理經結合自體抗體-抗原複合物。參見Szabo等人(2010)Journal of neuroimmunology 227：167-174。
相反，針對改良低親合力、多反應性自體抗體偵測之信號強度的最新方法導致抗類澱粉蛋白活性被高估。舉例而言，已顯示有前途之技術涉及經由蛋白G層析及酸洗提自人類血漿分離IgG；該等分析導致表觀抗Aβ抗體效價增加50倍(Li等人，BMC Neurosci.,8：22(2007))。然而，高效價歸因於樣品中之抗體的部分變性及人為誘導之多價，如由空白培養板結合增加100倍所證明。
現加以解釋，外來抗原與自體抗原之多反應性抗體為人類天然抗體譜系之一部分(Djoumerska等人，Scand J of Immunol.,61：357-363(2005))。大部分多反應性抗體具有生殖系高變區，屬於IgG同型，與單價親和力成熟抗體相比對於其抗原顯示較低親和力及親合力，且具有可撓性更大之抗原結合位點。認為其可用作針對病原體之防禦機制。
自體抗體之準確測量為推進對阿茲海默氏病及其他自體免疫疾病之發病機制的研究之關鍵。同樣，對懷疑或經診斷患有自體免疫疾病之患者的臨床評估及治療需要改良之自體抗體分析。隨著發現IVIG作為阿茲海默氏病治療之潛力，強烈需要克服對抗類澱粉蛋白自體抗體測量之一些障礙且允許開發用於治療性用途及進一步研究之標準物。用於低親合力、多反應性自體抗體之可靠分析已基本上證明為難懂的。因此，需要開發具有靈敏度與特異性之用於低親合力、多反應性抗類澱粉蛋白自體抗體的改良分析。本發明提供在低傳導率條件下增加信號強度而不會不利地影響結合選 擇性之自體抗體分析。
本發明提供一種低傳導率緩衝液系統及使用其達成靈敏度增強之自體抗體偵測的方法。增加之靈敏度允許偵測濃度低至0.2 μg/mL之自體抗體，從而使對偵測臨限值之限制更小且避免伴隨分析更加濃縮樣品(亦即稀釋較少之樣品)之多種問題。此外，本發明之緩衝液系統及方法顯著增加免疫偵測分析之靈敏度而無相應選擇性損失。低傳導率條件亦提供低傳導率之流體環境，其中與塗有非抗原之孔的結合顯著降低。
本發明提供用於偵測及用於捕捉生物樣品中之自體抗體的方法。此等新穎方法可偵測對於目標抗原具有低親合力之多反應性自體抗體。在一些具體實例中，該等方法可偵測對於選自類澱粉蛋白-β抗原、DNA抗原、微管蛋白抗原及甲狀腺球蛋白抗原之目標抗原具有特異性結合親和力的自體抗體。類澱粉蛋白-β抗原可呈選自單體、二聚物、寡聚物、交聯寡聚物及原纖維之形式。DNA抗原可呈選自單股DNA及雙股DNA之形式。在本發明之一些方法中，可使用如本發明之教示所增強的此項技術中已知之任何多路分析同時分析生物樣品中複數種不同自體抗體之存在。舉例而言，本發明之方法可用於同時偵測不同特異性之自體抗體，故將複數種不同抗原固定於固相上涵蓋於彼等具體實例中。
在一些具體實例中，該方法包含以下步驟：(a)使生物樣品在低傳導率條件下與目標抗原接觸，該自體抗體對於該目標抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該目標抗原與該自體抗體之結合。在一些具體實例中，將目標抗原固定於固相上且結合之存在指示生物樣品中之自體抗體。在一些具體實例中，該方法在步驟(b)之前包含：用低傳導率緩衝液洗滌該固相。
在一些具體實例中，生物樣品選自由血液、血清、血漿、其洗提份及其加工衍生物組成之群。在一些具體實例中，生物樣品為自血漿分離之IgG組成物，諸如靜脈內IgG製劑(intravenous IgG preparation，IVIG)、用於皮下投藥之IgG製劑、用於肌肉內製備之IgG製劑等。在一些具體實例中，生物樣品源自人類(例如人類IVIG)。
在一些具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針對目標抗原之自體抗體的物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體與存在之相應自體抗體特異性結合的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應自體抗體之目標抗原的任何複合物，該相應自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，偵測步驟(ii)包含使可偵測部分與指示物試劑(例如連接於物種特異性抗體之可偵測部分)接觸。
在一些具體實例中，物種特異性抗體與可偵測部分結合。在一些具體實例中，該可偵測部分可包含直接標記。該直接標記可包含過氧化酶。在其他具體實例中，可偵測部分包含間接標記。在一些具體實例中，物種特異性抗體選自IgG同型。
在一些具體實例中，欲分析之自體抗體具有選自IgG、IgA及IgM之同型。在較佳具體實例中，欲偵測之多反應性、低親合力自體抗體具有IgG同型。在更佳具體實例中，多反應性、低親合力自體抗體具有人類IgG同型。
在一些具體實例中，在步驟(a)之前生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,000倍或至少5,000倍。在某些具體實例中，上述方法在步驟(a)之前進一步包含用低傳導率緩衝液阻斷培養板。偵測可涉及在一些情況下證實所關注之自體抗體的存在或在其他情況下定量所關注之自體抗體的濃度。熟習此項技術者應瞭解本文所述之方法具有不僅偵測或捕捉多反應 性、低親合力自體抗體而且偵測或捕捉單價自體抗體之能力。
在一些具體實例中，生物樣品為選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊髓液及滑液之流體。較佳地，生物樣品選自全血、血清、血漿、靜脈內IgG製劑(IVIG)或其一些洗提份或加工衍生物。在一些具體實例中，生物樣品為IVIG製造過程中間物。
【發明詳細說明】
低傳導率條件增強分析靈敏度且改良選擇性之發現可用作目前在臨床或實驗室中用於偵測各種不同非親和力成熟、多反應性、人類自體抗體IgG之技術的輔助。預期本發明亦可用於改良其他非人類哺乳動物物種之非親和力成熟、多反應性自體抗體的偵測。亦預期使用本發明所述之方法自特定樣品捕捉所關注之低親合力、多反應性自體抗體或作為此項技術中已知之自體抗體純化方法的輔助。
非親和力成熟自體抗體(例如多反應性或其他抗體)與習知固體基質中所用之玻璃、金屬、塑膠或其他物質之非特異性結合為免疫偵測中熟知之誤差來源。舉例而言，人類血漿含有相對大量對於類澱粉蛋白聚集體(目標抗原)具有特異性之非親和力成熟、多反應性抗體。該等多反應性自體抗體以及非特異性結合於分析基質之抗體的存在人為地升高所偵測之所關注之多反應性自體抗體的濃度。有利的是，本文所提供之方法藉由使用本文教示之低傳導率分析條件來增加對於非親和力成熟自體抗體之分析靈敏度且減少該等自體抗體與基質之結合。
典型地，在ELISA分析中在中等至高傳導率下使抗原與抗體結合且隨後洗滌其所形成之複合物，以降低非特異性抗原抗體相互作用。舉例而言，通常在進行ELISA分析之前用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline，PBS)或Tris緩衝生理食鹽水(Tris buffered saline，TBS)稀釋生物樣品。PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4)與TBS(50 mM Tris、150 mM NaCl)緩衝液皆具有中等離子強度，認為適用於提高ELISA分析之嚴格度。許多ELISA方案亦在PBS或TBS緩衝液中進行抗原-抗體複合物之結合及洗滌。
有利的是，本文中顯示在自體抗體偵測分析中使用低傳導率溶液條件實質上增加分析之靈敏度而不損害特異性，例如不會引起非特異性結合(「背景雜訊」)增加。舉例而言，如圖7中所示，在含有60 mM氯化鈉之溶液條件下進行之抗DNA自體抗體偵測分析比在含有150 mM氯化鈉之溶液條件下(如存在於TBS緩衝液中)進行之分析靈敏約100倍。甚至更驚人的是，在鹽不存在下(例如0 mM氯化鈉)進行之分析幾乎比在含有150 mM氯化鈉之溶液條件下進行之分析靈敏10,000倍。因此，在一些具體實例中，描述自體抗體偵測分析，其中溶液條件維持低離子強度(例如，其中結合及/或洗滌緩衝液含有低含量之離子組分，諸如鹽)。
I.定義
自體抗體在本文中可與術語「內源性抗體(endogenous antibody)」互換使用，指由生物體產生且結合於該生物體之內源性抗原的抗體。本文所述之方法偵測「生物樣品中之自體抗體(autoantibody in a biological sample)」，該自體抗體被視為由生物體產生且結合於該生物體之內源性抗原的自體抗體，該生物體為得到該生物樣品之生物物質的來源。就結構而言，IgM同型之自體抗體具有五個Fc區及十個Fab區；IgG同型之自體抗體具有一個Fc區及兩個Fab區；且IgA同型之自體抗體具有兩個Fc區及四個Fab區。熟習此項技術者應瞭解，可藉由該等方法偵測之自體抗體將包括親和力成熟自體抗體或非親和力成熟自體抗體以及多反應性自體抗體或單反應性自體抗體。
術語「自體抗原(autoantigen)」可與術語「內原性抗原(endogenous antigen)」及「自體抗原(self-antigen)」互換使用，為個體身體之組分，其引發該個體產生抗體。
「單反應性(mono-reactive)」抗體指Fab區與單一抗原反應或結合之抗體。
「多反應性(polyreactive)」抗體指Fab區與多種抗原反應或結合之抗體。
如本文中所使用，「多反應性自體抗體(polyreactive autoantibody)」指Fab區與多種抗原反應或結合之自體抗體。在一些具體實例中，多反應性自體抗體與一或多種自體抗原反應。在其他具體實例中，多反應性自體抗體與自體抗原及外來抗原反應。
如本文中所使用，「非親和力成熟自體抗體(non-affinity maturated autoantibody)」指未經歷親和力成熟之由B細胞表現之自體抗體。親和力成熟為選擇表現對於生發中心所呈現之抗原具有較高親和力之抗體的B細胞用於活化的過程。該過程涉及體細胞超突變之反覆，隨後進行基於親和力 之選擇，從而促使產生表現對於目標抗原具有較高親和力之抗體的B細胞群體。
如本文中所使用，術語「親和力(affinity)」指抗原上之單一抗原決定子與抗體上之其相應結合位點之間的相互作用強度。其為作用於抗原決定子與抗體之相應結合位點之間的吸引力及推斥力之總和。親和力被描述為特性化抗原-抗體相互作用之解離常數(例如KD或Kd)。抗體對於抗原之親和力愈高，Kd愈低。
如本文中所使用，術語「親合力(avidity)」為描述抗體與其目標抗原之間的結合總強度之特徵，考慮多個位點處之其彼此相互作用。在一些情況下，抗體與其目標抗原之間的結合總強度大於個別鍵親和力之總和。現加以說明，對於具有同時與單一抗原相互作用之多個抗原結合位點之抗體而言，其自身上之各個別結合相互作用可容易被破壞。然而，當抗體及其目標抗原在多個位點處結合時，總效應為協同效應，因為該抗體與其目標抗原之結合將因抗體上之單一結合位點與目標抗原上之其相應抗原決定子短暫分離時存在其他結合相互作用而增強。
如本文中所使用，「類澱粉蛋白-β抗原(amyloid-β antigen)」呈選自單體、二聚物、寡聚物、交聯寡聚物之聚集體及原纖維之形式。類澱粉蛋白-β抗原可包含全長類澱粉蛋白-β蛋白或其一部分，該部分包含選擇用於捕捉或偵測所關注之自體抗體的抗原決定子。Aβ寡聚物之組成可變化且對應於Aβ蛋白之N端序列、C端序列或任何部分。在一些具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原在天然及原纖維形式之Aβ的曝露之N端六個殘基中包含抗原決定基。參見Solomon等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93：452-455。在其他具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原為選自單體、二聚物、寡聚物、交聯寡聚物之聚集體及原纖維之類澱粉蛋白-β-40肽(胺基酸1-40)形式。在其他具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原為選自單體、二聚物、寡聚 物、交聯寡聚物之聚集體及原纖維之類澱粉蛋白-β-42肽(胺基酸1-42)形式。
可溶性蛋白質及肽轉化為不溶性類澱粉蛋白原纖維反映一系列構形變化，其涉及形成致類澱粉中間物；此等組分經由β片之間產生原絲/基原纖維之相互作用而自我締合及穩定化；及最後組分相互作用以形成成熟原纖維。參見Serpell(2000)Biochim Biophys Acta 1502：15-30；Dobson(2004)Methods 34：4-14；Makin等人(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102：315-320。因此，預期所選類澱粉蛋白-β抗原可採用上述過渡狀態中之任一者，例如致類澱粉中間物、原絲或基原纖維。在一些具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原包含原纖維上曝露之序列特異性線性抗原決定基以及部分展開之致類澱粉中間物及天然前驅蛋白。在其他具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原包含存在於原纖維及組裝中間物上之新抗原決定基(neoepitope)(例如埋於天然分子中且由於蛋白質展開而變成曝露之抗原性區域)。在其他具體實例中，類澱粉蛋白-β抗原包含為所有原纖維所共有之通用構形抗原決定基，其與一級結構無關。參見Hrncic等人(2000)Am J.Pathol 157：1239-1246；O'Nuallain等人(2002)Proc natl Acad Sci USA 99：1485-1490。另一例示性類澱粉蛋白-β抗原包含為類澱粉蛋白β-40肽、輕鏈(LC)、血清類澱粉蛋白A(serum amyloid A，SAA)、運甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)及胰島類澱粉多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP)所共有之構形抗原決定基，其不存在於此等致類澱粉肽之天然非原纖維狀態中。
如本文中所使用，「微管蛋白抗原(tubulin antigen)」呈選自單體、二聚物、寡聚物及聚集體之形式。微管蛋白抗原可包含全長微管蛋白或其一部分，該部分包含選擇用於捕捉或偵測所關注之自體抗體的抗原決定子。微管蛋白抗原可包含亞型α、亞型β、亞型γ、亞型δ或亞型ε之一或多種微管蛋白多肽。微管蛋白抗原之組成可變化且對應於微管蛋白之N端序 列、C端序列或任何部分。此等或其他微管蛋白中之任一者可用於本文所提供之方法中。在較佳具體實例中，微管蛋白抗原源自與所分析之自體抗體相同的物種。
如本文中所使用，「甲狀腺球蛋白抗原(thyroglobulin antigen)」可包含全長甲狀腺球蛋白或其一部分，該部分包含選擇用於捕捉或偵測所關注之自體抗體的抗原決定子。甲狀腺球蛋白抗原之組成可變化且對應於甲狀腺球蛋白之N端序列、C端序列或任何部分。此等或其他甲狀腺球蛋白中之任一者可用於本文所提供之方法中。在較佳具體實例中，甲狀腺球蛋白抗原源自與所分析之自體抗體相同的物種。
如本文中所使用，「DNA抗原(DNA antigen)」呈選自單股DNA及雙股DNA之形式。DNA抗原之組成可變化且具有任何長度。在一些具體實例中，DNA抗原源自與所分析之自體抗體相同的物種。
在本發明之情形下，「目標抗原(target antigen)」為選擇用於偵測所關注之自體抗體的抗原。目標抗原可呈選自單體、二聚物、寡聚物、聚合物及聚集體之形式。在較佳具體實例中，目標抗原源自與所分析之自體抗體相同的物種。在選擇具體實例中，目標抗原與所分析之自體抗體皆為人類的。
如本文中所使用，術語「低傳導率(low conductivity)」指傳導率範圍為0 mS/cm至小於13 mS/cm、約1 mS/cm至約13 mS/cm、約2 mS/cm至約13 mS/cm、約3 mS/cm至約13 mS/cm、約4 mS/cm至約13 mS/cm、約5 mS/cm至約13 mS/cm、約6 mS/cm至約13 mS/cm、約7 mS/cm至約13 mS/cm、約8 mS/cm至約13 mS/cm、約9 mS/cm至約13 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、約11 mS/cm至約13 mS/cm及約12 mS/cm至約13 mS/cm。適用於本文所述之方法的低傳導率緩衝液或條件可選自低滲、等滲或高滲調配物。
術語「低滲(hypotonic)」描述張力實質上低於血液張力之調配物。張 力可例如使用蒸氣壓或冰凍型滲透壓計來測量。
選自低滲調配物的本發明之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度範圍一般將為約1 mOsm至小於約250 mOsm。在一些具體實例中，本發明之低傳導率緩衝液或條件的特徵為分別且獨立地選自以下之滲透壓度：約10 mOsm至小於約250 mOsm、約20 mOsm至小於約250 mOsm、約30 mOsm至小於約250 mOsm、約40 mOsm至小於約250 mOsm、約50 mOsm至小於約250 mOsm、約60 mOsm至小於約250 mOsm、約70 mOsm至小於約250 mOsm、約80 mOsm至小於約250 mOsm、約90 mOsm至小於約250 mOsm、約100 mOsm至小於約250 mOsm、約110 mOsm至小於約250 mOsm、約120 mOsm至小於約250 mOsm、約130 mOsm至小於約250 mOsm、約140 mOsm至小於約250 mOsm、約150 mOsm至小於約250 mOsm、約160 mOsm至小於約250 mOsm、約170 mOsm至小於約250 mOsm、約180 mOsm至小於約250 mOsm、約190 mOsm至小於約250 mOsm、約200 mOsm至小於約250 mOsm、約210 mOsm至小於約250 mOsm、約220 mOsm至小於約250 mOsm、約230 mOsm至小於約250 mOsm、約240 mOsm至小於約250 mOsm。
在一些具體實例中，選自低滲調配物之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度分別且獨立地選自約1-100 mOsm、約1-75 mOsm、約1-50 mOsm及約1-25 mOsm之範圍。在其他具體實例中，低傳導率緩衝液或條件之滲透壓度分別且獨立地選自約25-250 mOsm、約50-225 mOsm、約75-200 mOsm、約100-175 mOsm、約125-150 mOsm之範圍。
術語「等滲(isotonic)」描述張力接近血液張力之調配物。在一些具體實例中，選自等滲調配物之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度分別且獨立地選自約250 mOsm至350 mOsm之範圍。在一些具體實例中，選自等滲調配物之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度分別且獨立地選自約250 mOsm至約325 mOsm、約250 mOsm至約300 mOsm、約250 mOsm至約275 mOsm 之範圍。在其他具體實例中，選自等滲調配物之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度分別且獨立地選自約275 mOsm至約350 mOsm、約300 mOsm至約350 mOsm、約325 mOsm至約350 mOsm之範圍。在其他具體實例中，選自等滲調配物之低傳導率緩衝液或條件的滲透壓度分別且獨立地選自約275 mOsm至約325 mOsm之範圍。
術語「高滲(hypertonic)」描述張力實質上高於血液張力之調配物。在一些具體實例中，本發明之低傳導率緩衝液或條件的特徵為分別且獨立地選自以下範圍之滲透壓度：大於350 mOsm至約2000 mOsm、大於350 mOsm至約1950 mOsm、大於350 mOsm至約1900 mOsm、大於350 mOsm至約1850 mOsm、大於350 mOsm至約1800 mOsm、大於350 mOsm至約1750 mOsm、大於350 mOsm至約1700 mOsm、大於350 mOsm至約1650 mOsm、大於350 mOsm至約1600 mOsm、大於350 mOsm至約1550 mOsm、大於350 mOsm至約1500 mOsm、大於350 mOsm至約1450 mOsm、大於350 mOsm至約1400 mOsm、大於350 mOsm至約1350 mOsm、大於350 mOsm至約1300 mOsm、大於350 mOsm至約1250 mOsm、大於350 mOsm至約1200 mOsm、大於350 mOsm至約1150 mOsm、大於350 mOsm至約1100 mOsm、大於350 mOsm至約1050 mOsm、大於350 mOsm至約1000 mOsm、大於350 mOsm至約950 mOsm、大於350 mOsm至約900 mOsm、大於350 mOsm至約850 mOsm、大於350 mOsm至約800 mOsm、大於350 mOsm至約750 mOsm、大於350 mOsm至約700 mOsm、大於350 mOsm至約650 mOsm、大於350 mOsm至約625 mOsm、大於350 mOsm至約600 mOsm、大於350 mOsm至約550 mOsm、大於350 mOsm至約500 mOsm、大於350 mOsm至約450 mOsm、大於350 mOsm至約400 mOsm。
術語「個體(individual)」、「個體(subject)」及「患者(patient)」在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括(但不限於)鼠類、猴類、人類、哺 乳動物農畜、哺乳動物運動型動物及哺乳動物寵物。在較佳具體實例中，個體為人類。
如本文中所使用，術語「樣品(sample)」指出於試管內評估之目的所獲得之生物樣品。在本發明之方法中，樣品源自取自相同物種之一或多個個體的生物流體。在較佳具體實例中，生物流體來源於人類。例示性生物流體包括血液、血清、血漿、腦脊髓液、滑液、尿液或唾液。在較佳具體實例中，生物流體選自全血、血清、血漿及其洗提份或加工衍生物(例如自血液、血漿、混合血液或混合血漿分離之IgG溶液，諸如IVIG)。
術語「劑量(dose)」及「劑量(dosage)」在本文中可互換使用。劑量(dose)指每次投藥時給與個體之活性成分的量。劑量將視許多因素而變化，包括投藥頻率；個體之體型及耐受性；病狀之嚴重程度；副作用之風險；及投藥途徑。熟習此項技術者應認識到，劑量可視上述因素或基於治療進展而加以調節。術語「劑型(dosage form)」指藥物之特定格式，且視投藥途徑而定。舉例而言，劑型可呈液體，例如注射用生理食鹽水溶液。
「治療有效」量或劑量或「足夠/有效」量或劑量為投予時產生作用之劑量。準確劑量將視治療目的而定，且將由熟習此項技術者使用已知技術來確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第20版，2003,Gennaro編，Lippincott,Williams & Wilkins)。
術語「療法(therapy)」、「治療(treatment)」及「改善(amelioration)」指症狀之嚴重程度或類澱粉蛋白聚集之量的任何降低，或認知功能之改善。如本文中所使用，術語「治療(treat)」及「預防(prevent)」不欲為絕對術語。治療可指任何發作延緩、症狀改善、患者存活改善、存活時間或存活率增加等。可將治療作用與未接受治療之個體或個體集合相比較。
「對照(control)」樣品或值指用作參考、通常為已知參考以與測試樣品相比較之樣品。舉例而言，測試樣品可為已知IgG濃度之參考樣品。對照亦可表示自類似個體群體收集之平均值，例如具有類似醫學背景或相同年齡、體重等之阿茲海默氏病患者、帕金森氏病患者、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)患者等。對照值亦可獲自同一個體，例如獲自早期獲得之樣品、在症狀之前、或在不同醫療時間點之前或之時。在一些情況下，對照可包括在個體中或在個體之間比較，例如比較抗類澱粉蛋白抗體效價與一或多種已知抗體之效價。
熟習此項技術者應瞭解在特定情形下何種對照有價值且能夠基於與對照值之比較來分析資料。對照亦對於確定資料之顯著性有價值。舉例而言，若特定參數之值在各對照中廣泛不同，則測試樣品中之變化將不會視為顯著的。
預期本發明之系統及方法可應用於單一測量偵測分析以及多路分析。如本文中所使用，術語「多路分析(multiplexed assay)」指能夠同時進行不同測量之分析，諸如美國專利5,763,158或美國專利第5,981,180號中所述者。「不同測量(Different measurements)」應理解為意謂偵測複數個不同分析物或藉由複數個不同珠粒子集偵測單一分析物，或兩者之組合。在此情形下，「同時(simultaneously)」應理解為意謂偵測多個分析物，或藉由不同珠粒集合偵測單一分析物，或在同一分析中進行測量組合。典型地，在含有若干粒子集合(例如混合之粒子子集)之單一容器中進行多路分析，以使得單一多路分析將提供資訊之多個讀出。
在更詳細描述本發明之前，應瞭解本發明並不限於所述之特定具體實例，因為該等具體實例當然可變化。亦應瞭解，本文中所使用之術語僅出於描述特定具體實例之目的，且不欲加以限制，因為本發明之範疇將僅由隨附申請專利範圍來限制。
當提供值之範圍時，應瞭解所述範圍之上限與下限之間的各居中值(除非本文另外明確指示，否則至下限單元的十分之一)及該指定範圍內之任何其他指定值或居中值涵蓋於本發明中。此等較小範圍的上限及下限可獨立地包括於該等較小範圍內且亦涵蓋於本發明中，經受指定範圍內之任何具體排除界限。當指定範圍包括一個或兩個界限時，不包括任一個或兩個所包括之界限的範圍亦包括於本發明中。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有如一般熟習本發明所屬領域之技術者通常所瞭解的相同含義。儘管類似或等效於本文所述方法及物質之任何方法及物質亦可用於本發明之實踐或測試，但現仍描述代表性說明性方法及物質。
本說明書中所引用之所有公開案及專利均以引用的方式併入本文中，就如同各個別公開案或專利具體且個別地指示以引用的方式併入本文中一般，且以引用的方式併入本文中以揭示並描述與引用該等公開案有關之方法及/或物質。對任何公開案之引用均係針對該公開案在申請日期之前的揭示內容，且不應視為承認本發明無權由於先前發明而早於該公開案。此外，所提供之公開日期可能不同於實際公開日期，實際公開日期可能需要獨立地證實。
應注意，除非本文另外明確指示，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、一「(an)」及「該(the)」包括複數個指示物。另外應注意，申請專利範圍可起草為不包括任何視情況存在之要素。因此，此陳述意欲用作關於申請專利範圍要素之敍述使用諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之獨佔術語或使用「否定(negative)」限制之前述基礎。
熟習此項技術者在閱讀本發明時將顯而易見，本文所述及所說明之個別具體實例中之每一者具有個別組分及特點，其可容易在不脫離本發明之 範疇或精神的情況下自其他若干具體實例中之任一者之特點分離或與之組合。任何所述方法可以所述事件之次序或以邏輯上可能之任何其他次序進行。
II.詳細描述
本發明適合用於分析一系列生物樣品中之非親和力成熟自體抗體，例如多反應性或其他抗體。由本發明涵蓋之生物樣品包括選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、滑液及腦脊髓液之任何流體。較佳地，生物樣品選自全血、血清、血漿、自血液或血漿分離之IgG組成物(例如靜脈內IgG)或其洗提份或加工衍生物。
生物樣品可藉由各種方法來獲得。在一些具體實例中，收集生物樣品或進行生檢且試管內測試所收集之生物樣品。在某些具體實例中，在偵測之前使樣品中存在之免疫球蛋白增濃。在其他具體實例中，在偵測之前不另外使免疫球蛋白增濃。樣品可進一步分離為例如血漿及細胞物質，以分離含有抗體之洗提份，但此步驟非必需的。亦可使樣品曝露於尺寸過濾及/或層析方法。在一些具體實例中，使樣品曝露於喜硫層析以自樣品移除非免疫球蛋白蛋白質。
在本發明之一些具體實例中，將生物樣品稀釋至至少1/20稀釋度、至少1/1000稀釋度或至少1/500,000稀釋度。
如上文所提及，本發明之方法包括(a)使生物樣品在低傳導率條件下與目標抗原接觸，非親和力成熟自體抗體對於該目標抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該目標抗原與該自體抗體之結合。在接觸步驟(a)之前目標抗原已固定於固相上。在一些具體實例中，所偵測之非親和力成熟自體抗體為多反應性抗體。因此，對結合之偵測指示生物樣品中之非親和力成熟自體抗體。
在一些具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針 對目標抗原之目標抗原特異性非親和力成熟自體抗體之物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應目標抗原特異性自體抗體的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應目標抗原特異性自體抗體之目標抗原的任何複合物，該相應目標抗原特異性自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，所偵測之目標抗原特異性非親和力成熟自體抗體為多反應性抗體。該物種選自任何哺乳動物物種，例如靈長類物種，諸如人類及黑猩猩；鼠類，諸如大鼠及小鼠；犬類；貓類；牛類；羊類；馬類；等。在較佳具體實例中，該物種為人類。
在一些具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針對類澱粉蛋白-β抗原之類澱粉蛋白-β特異性非親和力成熟自體抗體之物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體之類澱粉蛋白-β抗原的任何複合物，該相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，所偵測之類澱粉蛋白-β特異性非親和力成熟自體抗體為多反應性抗體。該物種選自任何哺乳動物物種，例如靈長類物種，諸如人類及黑猩猩；鼠類，諸如大鼠及小鼠；犬類；貓類；牛類；羊類；馬類；等。在較佳具體實例中，該物種為人類。
在其他具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針對DNA抗原之DNA特異性非親和力成熟自體抗體之物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應DNA特異性自體抗體的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應DNA特異性自體抗體之DNA抗原的任何 複合物，該相應DNA特異性自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，所偵測之DNA特異性非親和力成熟自體抗體為多反應性抗體。該物種選自任何哺乳動物物種，例如靈長類物種，諸如人類及黑猩猩；鼠類，諸如大鼠及小鼠；犬類；貓類；牛類；羊類；馬類；等。在較佳具體實例中，該物種為人類。
在一些具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針對微管蛋白抗原之微管蛋白特異性非親和力成熟自體抗體之物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應微管蛋白特異性自體抗體的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應微管蛋白特異性自體抗體之微管蛋白抗原的任何複合物，該相應微管蛋白特異性自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，所偵測之自體抗體為多反應性抗體。該物種選自任何哺乳動物物種，例如靈長類物種，諸如人類及黑猩猩；鼠類，諸如大鼠及小鼠；犬類；貓類；牛類；羊類；馬類；等。在較佳具體實例中，該物種為人類。
在其他具體實例中，偵測步驟(b)包含：(i)使生物樣品與結合於針對甲狀腺球蛋白抗原之甲狀腺球蛋白特異性非親和力成熟自體抗體之物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應甲狀腺球蛋白特異性自體抗體的條件下該物種特異性抗體對於獲得生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於相應甲狀腺球蛋白特異性自體抗體之甲狀腺球蛋白抗原的任何複合物，該相應甲狀腺球蛋白特異性自體抗體結合於物種特異性抗體。在一些具體實例中，所偵測之自體抗體為多反應性抗體。該物種選自任何哺乳動物物種，例如靈長類物種，諸如人類及黑猩猩；鼠類，諸如大鼠及小鼠；犬類；貓類；牛類；羊類；馬類；等。在較佳具體實例中，該物種為人類。
在一些具體實例中，提供一種偵測血液樣品或其洗提份中存在之對於目標抗原具有親和力的非親和力成熟自體抗體之方法，該方法包含以下步驟：(a)將該樣品稀釋至不大於100 μg/mL之最終免疫球蛋白濃度；(b)使該經稀釋之血液或血清樣品與該目標抗原在第一低傳導率溶液條件下接觸以形成包含該自體抗體及該目標抗原之複合物；及(c)偵測該複合物，其中該第一低傳導率溶液條件之傳導率小於11 mS/cm。在某些具體實例中，第一低傳導率溶液條件之傳導率小於10 mS/cm、小於9 mS/cm、小於8 mS/cm、小於7 mS/cm、小於6 mS/cm、小於5 mS/cm、小於4 mS/cm、小於3 mS/cm、小於2 mS/cm或小於1 mS/cm。
在一些具體實例中，該方法進一步包含步驟(d)：用傳導率小於11 mS/cm之第一洗滌緩衝液洗滌步驟(b)中所形成之複合物。在一些具體實例中，該第一洗滌緩衝液之傳導率小於11 mS/cm。在某些具體實例中，第一低傳導率溶液條件之傳導率小於10 mS/cm、小於9 mS/cm、小於8 mS/cm、小於7 mS/cm、小於6 mS/cm、小於5 mS/cm、小於4 mS/cm、小於3 mS/cm、小於2 mS/cm或小於1 mS/cm。
在一些具體實例中，偵測複合物之步驟包含以下子步驟：(i)使包含自體抗體及目標抗原之複合物與抗人類免疫球蛋白抗體在傳導率小於11 mS/cm之第二低傳導率溶液條件下接觸以形成三元複合物；(ii)用傳導率小於11 mS/cm之第二洗滌緩衝液洗滌子步驟(i)中所形成之該三元複合物；及(iii)偵測該抗人類免疫球蛋白抗體之存在。在一些具體實例中，第二低傳導率溶液條件之傳導率小於10 mS/cm、小於9 mS/cm、小於8 mS/cm、小於7 mS/cm、小於6 mS/cm、小於5 mS/cm、小於4 mS/cm、小於3 mS/cm、小於2 mS/cm或小於1 mS/cm。在一些具體實例中，第二洗滌緩衝液之傳導率小於10 mS/cm、小於9 mS/cm、小於8 mS/cm、小於7 mS/cm、小於6 mS/cm、小於5 mS/cm、小於4 mS/cm、小於3 mS/cm、小於2 mS/cm或小於1 mS/cm。 在一些具體實例中，偵測抗人類免疫球蛋白抗體之存在包含測定抗人類免疫球蛋白抗體之相對濃度。
在上述具體實例中，當物種特異性抗體與可偵測部分結合時，偵測步驟(ii)包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
在其他具體實例中，該方法在步驟(b)之前進一步包含：用低傳導率緩衝液洗滌固相。
熟習此項技術者應瞭解，相同或不同組成之低傳導率緩衝液可用於以下一或多個目的之任何組合：在固定目標抗原後洗滌培養板；稀釋生物樣品；阻斷培養板；洗滌所形成之複合物；使該複合物與二級免疫球蛋白接觸；洗滌所形成之三元複合物。
低傳導率阻斷緩衝液之特徵可為選自以下範圍之傳導率：大於0 mS/cm至小於13 mS/cm、約1 mS/cm至約13 mS/cm、約2 mS/cm至約13 mS/cm、約3 mS/cm至約13 mS/cm、約4 mS/cm至約13 mS/cm、約5 mS/cm至約13 mS/cm、約6 mS/cm至約13 mS/cm、約7 mS/cm至約13 mS/cm、約8 mS/cm至約13 mS/cm、約9 mS/cm至約13 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、約11 mS/cm至約13 mS/cm及約12 mS/cm至約13 mS/cm。
在其他具體實例中，低傳導率阻斷緩衝液之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於12 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約11 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約10 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約9 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約8 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約7 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約6 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約5 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約4 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約3 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約2 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約1 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率阻斷緩衝液之傳導率選自以下範圍：約1 mS/cm至約12 mS/cm、約2 mS/cm至約11 mS/cm、約3 mS/cm至約10 mS/cm、約4 mS/cm至約9 mS/cm、約5 mS/cm至約8 mS/cm、and約6 mS/cm至約7 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率阻斷緩衝液之傳導率小於約13 mS/cm、小於約11 mS/cm、小於約9 mS/cm、小於約7 mS/cm、小於約5 mS/cm、小於約3 mS/cm或小於約1 mS/cm。
在一些具體實例中，低傳導率條件之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於13 mS/cm、約1 mS/cm至約13 mS/cm、約2 mS/cm至約13 mS/cm、約3 mS/cm至約13 mS/cm、約4 mS/cm至約13 mS/cm、約5 mS/cm至約13 mS/cm、約6 mS/cm至約13 mS/cm、約7 mS/cm至約13 mS/cm、約8 mS/cm至約13 mS/cm、約9 mS/cm至約13 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、約11 mS/cm至約13 mS/cm及約12 mS/cm至約13 mS/cm。
在其他具體實例中，低傳導率條件之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於12 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約11 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約10 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約9 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約8 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約7 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約6 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約5 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約4 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約3 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約2 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約1 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率條件之傳導率選自以下範圍：約1 mS/cm至約12 mS/cm、約2 mS/cm至約11 mS/cm、約3 mS/cm至約10 mS/cm、約4 mS/cm至約9 mS/cm、約5 mS/cm至約8 mS/cm及約6 mS/cm至約7 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率條件之傳導率小於約13 mS/cm、小於約11 mS/cm、小於約9 mS/cm、小於約7 mS/cm、小於約5 mS/cm、小於約3 mS/cm或小於約1 mS/cm。
在一些具體實例中，低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
在一些具體實例中，低傳導率洗滌緩衝液之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於13 mS/cm、約1 mS/cm至約13 mS/cm、約2 mS/cm至約13 mS/cm、約3 mS/cm至約13 mS/cm、約4 mS/cm至約13 mS/cm、約5 mS/cm至約13 mS/cm、約6 mS/cm至約13 mS/cm、約7 mS/cm至約13 mS/cm、約8 mS/cm至約13 mS/cm、約9 mS/cm至約13 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、約11 mS/cm至約13 mS/cm及約12 mS/cm至約13 mS/cm。
在其他具體實例中，低傳導率洗滌緩衝液之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於12 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約11 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約10 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約9 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約8 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約7 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約6 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約5 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約4 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約3 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約2 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約1 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率洗滌緩衝液之傳導率選自以下範圍：約1 mS/cm至約12 mS/cm、約2 mS/cm至約11 mS/cm、約3 mS/cm至約10 mS/cm、約4 mS/cm至約9 mS/cm、約5 mS/cm至約8 mS/cm及約6 mS/cm至約7 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於約13 mS/cm、小於約11 mS/cm、小於約9 mS/cm、小於約7 mS/cm、小於約5 mS/cm、小於約3 mS/cm或小於約1 mS/cm。
在一些具體實例中，低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
在一些具體實例中，低傳導率稀釋緩衝液之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於13 mS/cm、約1 mS/cm至約13 mS/cm、約2 mS/cm至約13 mS/cm、約3 mS/cm至約13 mS/cm、約4 mS/cm至約13 mS/cm、約5 mS/cm 至約13 mS/cm、約6 mS/cm至約13 mS/cm、約7 mS/cm至約13 mS/cm、約8 mS/cm至約13 mS/cm、約9 mS/cm至約13 mS/cm、約10 mS/cm至約13 mS/cm、約11 mS/cm至約13 mS/cm及約12 mS/cm至約13 mS/cm。
在其他具體實例中，低傳導率稀釋緩衝液之傳導率選自以下範圍：大於0 mS/cm至小於12 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約11 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約10 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約9 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約8 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約7 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約6 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約5 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約4 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約3 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約2 mS/cm、大於0 mS/cm至小於約1 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率稀釋緩衝液之傳導率選自以下範圍：約1 mS/cm至約12 mS/cm、約2 mS/cm至約11 mS/cm、約3 mS/cm至約10 mS/cm、約4 mS/cm至約9 mS/cm、約5 mS/cm至約8 mS/cm及約6 mS/cm至約7 mS/cm。在其他具體實例中，低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於約13 mS/cm、小於約11 mS/cm、小於約9 mS/cm、小於約7 mS/cm、小於約5 mS/cm、小於約3 mS/cm或小於約1 mS/cm。
在一些具體實例中，低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
用於本發明之方法及系統中之低傳導率緩衝液可購自任何商業供應商，諸如VWR、Fisher Scientific或Sigma Aldrich，或由一般技術者產生。在一些具體實例中，低傳導率溶液經緩衝至生理學pH值。在其他具體實例中，適合之低傳導率緩衝液含有一或多種選自KCl、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3-Na2CO3、Na2HPO4、NaHCO3及其混合物之生理鹽。在其他具體實例中，低傳導率緩衝液含有一或多種此項技術中已知之非生 理鹽。熟習此項技術者應瞭解，適用於本發明所述之方法及系統的低傳導率緩衝液可選自TAPS、CAPS、TES、MOPS、CHES、MES、二甘胺酸、BIS-TRIS丙烷、TRIS鹼、BIS-TRIS、HEPES、其他有機胺緩衝液或其各種組合。
適用於本發明中之例示性低傳導率緩衝液在一些具體實例中包含不同濃度之HEPES，在其他具體實例中包含不同濃度之HEPES及吐溫20(Tween 20)，在其他具體實例中包含不同濃度之HEPES、吐溫20及CaCl2，或在其他具體實例中包含不同濃度之HEPES及吐溫20、NaCl及CaCl2。在一些具體實例中，低傳導率緩衝液具有選自以下任一者之調配物：20 mM HEPES；20 mM HEPES及20 mM NaCl；20 mM HEPES及40 mM NaCl；20 mM HEPES及60 mM NaCl；20 mM HEPES及80 mM NaCl；20 mM HEPES及100 mM NaCl；20 mM HEPES及120 mM NaCl；20 mM HEPES及150 mM NaCl；20 mM HEPES及2 mM CaCl2、0.1%吐溫20；20 mM HEPES及0.1%吐溫20。
其他例示性低傳導率緩衝液包括緩衝液80 mM NaCl、1.8 mM KCl、1.33 mM KH2 PO4及5.33 mM K2 HPO4，pH 7.4.+-.0.1；緩衝液60 mM NaCl、1.35 mM KCl、1 mM KH2 PO4及3.99 mM K2 HPO4，pH 7.4.+-.0.1；緩衝液70 mM NaCl、20 mM NaHCO3、4 mM KH2 PO4及2.6 mM K2 HPO4，pH 7.4.+-.0.1；及緩衝液65 mM NaCl、1 mM KH2 PO4及4 mM K2 HPO4，pH 7.4.+-.0.1。在其他具體實例中，低傳導率緩衝液實質上不含非生理鹽。
低傳導率洗滌緩衝液溶液可選自上述緩衝液中之任一者。此外，由本發明指導，熟習此項技術者將準備好選擇或產生適用於移除未結合抗體及洗去弱結合於非特異性位點之抗體之目的的低傳導率緩衝液。例示性洗滌緩衝液可包括用Tris緩衝生理食鹽水或蒸餾水稀釋之少量清潔劑。在其他具體實例中，洗滌緩衝液不包括清潔劑。
熟習此項技術者應瞭解，本發明可適合於許多習知固相偵測方法。此等方法包括(但不限於)酶聯結免疫吸附分析(ELISA)、螢光免疫吸附劑 分析(fluorescent immunosorbent assay，FIA)、化學物質聯結免疫吸附劑分析(chemical linked immunosorbent assay，CLIA)及免疫墨點法。關於可使用之不同免疫分析之評述。參見The Immunoassay Handbook,David Wild編，Stockton Press,New York,1994，其內容在此以全文引用的方式明確地併入本文中以用於各種用途。
如熟習此項技術者應瞭解，此項技術中已知之各種偵測方法可與本發明結合使用。在一些具體實例中，將目標抗原固定於固體載體或表面上，諸如珠粒、培養板、載片或微量滴定培養皿。將樣品之等分試樣添加至固體載體中且使其與目標抗原一起在液相中培育。接著添加選擇用於識別所分析之自體抗體之恆定區的免疫球蛋白(本文中另外稱為二級抗體)。在較佳具體實例中，二級抗體之特徵為IgG同型。或者，二級抗體之特徵為對於所分析之自體抗體的一些恆定區具有高親和力。自液相分離固體載體後，檢查載體相之可偵測信號。固體載體上存在信號指示載體上之目標抗原的自體抗體已結合其目標。
信號產生系統由一或多種組分構成，其中至少一種組分為標記，其產生與經結合標記之量有關的可偵測信號。該標記為產生信號或可誘導產生信號之分子。適合於該用途之可偵測標記包括藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電、光學或化學方法可偵測之任何組成物。適合之標記的實例包括螢光增白劑、酶、化學發光劑、光敏劑或可懸浮粒子。偵測該信號且可藉由偵測酶活性、發光或吸光度來測量。
適用於本發明之標記包括磁性珠粒(例如DYNABEADS)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅(Texas red)、若丹明(rhodamine)、綠色螢光蛋白及其類似物)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及ELISA中常用之其他酶)及比色標記(諸如膠態金或有色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠)珠粒)。適用 技術之一般概述可見於Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual(1988)中，其內容在此以全文引用的方式明確地併入本文中以用於各種用途。
儘管亦可使用放射性標記且使用閃爍計數器偵測及測量放射性程度，但其由於安全性及環境關注而非較佳。最常用之產生系統利用酶介導之產色機制或螢光團介導之螢光機制。在產色報導因子情況下，接著使任何結合酶標記與受質反應，得到可用光學顯微鏡分析之有色產物。可使用之其他酶標記的實例包括(但不限於)β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(「G6PDH」)及葡萄糖氧化酶。
在螢光報導系統下，螢光團與探針或二級抗體結合且不需要如產色偵測系統中使用受質來活化酶。此外，螢光報導系統尤其適用於多路分析。可使用之螢光增白劑標記的實例包括(但不限於)螢光素、異硫氰酸酯、若丹明化合物、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻藍蛋白(phycocyanin)、別藻藍蛋白(allophycocyanin)、鄰苯二甲醛及胺螢(fluorescamine)。化學發光劑包括例如異魯米諾(isoluminol)。
反應中存在之顏色、螢光、發光或放射性(視所用之信號產生系統而定)之量或強度應與樣品中之自體抗體濃度有關。光學密度之定量可使用光譜測定法進行。放射性標記信號之定量可使用閃爍計數進行。當使用酶標記時，酶促活性視若干變數而定，包括酶及受質濃度、緩衝液、pH值、溫度及可能為光。可使用之酶-受質系統描述於此項技術中且可包括(但不限於)DAB-HRP；金屬增強之DAB-HRP；BCIP-AP；NBT-AP及葡萄糖氧化酶；1-步驟NBT-BCIP及AP等。
可使用一般技術者已知之方法使酶共價連接於用於本發明之方法中的目標抗原反應性抗體。舉例而言，可使用戊二醛使鹼性磷酸酶及辣根過氧化酶與抗體結合。亦可使用過碘酸方法結合辣根過氧化酶。用於酶結合抗體之商業套組廣泛可用。結合酶之抗人類及抗小鼠免疫球蛋白特異性抗體 購自多個商業來源。
或者，自體抗體之間接偵測可使用如一般技術者所熟悉之抗生物素蛋白-生物素複合物方法、經標記抗生蛋白鏈菌素生物素方法或磷酸酶-抗磷酸酶方法來實現。
經酶標記之抗體產生不同信號來源，此視受質而定。信號產生涉及將受質添加至反應混合物中。常見過氧化酶受質包括3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)、ABTSTM(2,2'-次偶氮基雙(乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯))、OPD(鄰苯二胺)及TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)。磷酸對硝基苯酯為常用鹼性磷酸酶受質。當使用鹼性磷酸酶標記時，選擇受質為氯化硝基藍四唑鹽(nitro blue tetrazolium chloride，NBT)與5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphat，BCIP)之組合。當使用葡萄糖氧化酶標記時，選擇受質為氯化硝基藍四唑鹽。當使用β-半乳糖苷酶標記時，選擇受質為5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-哌喃半乳糖苷(BCIG或X-Gal)。在培育期期間，酶逐漸轉化受質與其終產物之比例。在培育期結束時，可添加中止酶活性之中止試劑。藉由測量光學密度(通常經由光譜光度計)來測定信號強度。
經鹼性磷酸酶標記之抗體亦可藉由螢光測定法來測量。因此，在本發明之免疫偵測方法中，可使用受質4-甲基香豆素磷酸酯(4-UMP)。鹼性磷酸酶使4-UMP去磷酸以形成4-甲基香豆素(4-MU)，即螢光團。入射光為365 nm且發射光為448 nm。
在整個分析中，在試劑之各種組合後可能需要培育及/或洗滌步驟。培育步驟可自約5秒至數小時變化，例如約5分鐘至約24小時。然而，培育時間將視分析格式、抗體、溶液體積、濃度及其類似因素而定。通常，分析將在周圍溫度下進行，但其可在一定範圍之溫度內(諸如10℃至40℃)進行。
在一些具體實例中，在樣品旁邊操作至少一個對照組，且比較抗體量及/或結合程度。在其他具體實例中，可將分析結果與先前對於所關注之系統所確定的對照程度相比較。舉例而言，陽性對照組可包括自已知患有類澱粉蛋白相關疾病之個體或一組個體獲得之相同生物樣品。適合之陽性對照組的另一實例為用於比較之已知抗類澱粉蛋白單株抗體。例示性陰性對照組可包括自具有發展類澱粉蛋白相關疾病之低風險的個體或一組個體獲得之相同生物樣品。適合之陰性對照組的另一實例為對於非類澱粉蛋白抗原具有特異性之已知抗體。
使用該等方法，且將相對高含量之抗類澱粉蛋白抗體與個體患有類澱粉蛋白相關自體免疫病症或處於發展類澱粉蛋白相關自體免疫病症之高風險下的可能性增加相關，熟習此項技術者可診斷個體之類澱粉蛋白相關自體免疫疾病。
上述方法可應用於選擇患者組用於類澱粉蛋白相關疾病療法。舉例而言，可測定複數個個體之抗類澱粉蛋白抗體之含量。如上文所解釋，可選擇經測定具有相對高含量之抗類澱粉蛋白抗體的彼等個體用於治療。在一些具體實例中，在治療過程中週期性偵測抗類澱粉蛋白抗體之含量。在一些具體實例中，治療包含投予IVIG。
阿茲海默氏病及其他類澱粉蛋白相關病症
類澱粉蛋白及異常蛋白質聚集體在許多不同疾病及病狀中起作用。本發明之方法使得能夠針對各種形式之類澱粉蛋白抗原或多肽聚集體偵測某些非親和力成熟、多反應性自體抗體。預期對某些非親和力成熟抗類澱粉蛋白自體抗體之偵測將有助於熟習此項技術者對類澱粉蛋白用作疾病標記物之任何疾病進行治療過程之診斷或測定。因此，在一些具體實例中，本發明之方法包含偵測抗類澱粉蛋白自體抗體，隨後進行診斷。本發明之方法可包含偵測抗類澱粉蛋白自體抗體，隨後進行診斷，且進一步包含測定 改善阿茲海默氏病或其他類澱粉蛋白相關自體免疫病症之治療過程的步驟。另外預期本文所述之本發明之一些具體實例可包含偵測所關注之自體抗體，隨後向有需要之患者投予治療有效量之IVIG。
類澱粉蛋白相關病症不僅包括阿茲海默氏病(AD)，而且包括2型糖尿病、帕金森氏病、傳染性海綿狀腦病、亨廷頓氏病(Huntington's Disease)、甲狀腺髓樣癌、心律不整、動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、主動脈中層類澱粉蛋白、泌乳素瘤、家族性類澱粉蛋白多發性神經病、遺傳性非神經性系統性類澱粉變性、透析相關類澱粉變性、芬蘭型類澱粉變性(Finnish amyloidosis)、格子狀角膜營養失調症、大腦類澱粉血管病變、大腦類澱粉血管病變(冰島型)及全身性AL類澱粉變性。在一些具體實例中，與目標抗原有關之疾病或病狀為阿茲海默氏病。
因此，本發明可用於偵測及/或捕捉針對類澱粉蛋白相關病症中所見之特定形式之類澱粉蛋白抗原及類澱粉蛋白聚集體的自體抗體。另外，本文所揭示之方法可應用於偵測針對由以下形成之異常蛋白質聚集體之抗體：β類澱粉蛋白(Aβ；Abeta)、胰島類澱粉多肽(IAPP；支鏈澱粉)、α-突觸核蛋白(SNCA)、主要朊病毒蛋白(PrP)、亨廷頓(HD)、降血鈣素(CCP)、心房利尿鈉因子(ANF)、脂蛋白元AI(Apo-Al)、血清類澱粉A蛋白(SAA)、Medin類澱粉蛋白(乳脂小球-EGF因子8蛋白之片段；MFG-E8)、促乳素(PRL)、運甲狀腺素蛋白(ATTR)、溶菌酶C(1,4-β-N-乙醯基胞壁質酶C)、β2微球蛋白(β2M)、膠溶素(AGEL)、轉型生長因子-β誘導之蛋白ig-h3(β ig-h3；角膜上皮蛋白)、胱抑素C(CST3)、免疫球蛋白輕鏈(AL)、具有polyQ重複之蛋白質、τ蛋白(τ)及其他類澱粉蛋白。
在一些具體實例中，本文所述之方法可應用於偵測針對此項技術中之任何致類澱粉蛋白之自體抗體，諸如下表中所列者：
與改變之胺基酸序列、起源或生物學功能無關，所有類型之原纖維共有幾乎相同的著色及超結構特點，例如當由重氮苯甲啶磺酸酯染料剛果紅(Congo red)染色及藉由偏光顯微術檢查時，原纖維展現特徵性綠色雙折射率(參見Westermark等人(2002)Amyloid J Protein Folding Disord 9：197-200)且其與硫磺素T(ThT)之相互作用導致此苯并噻唑化合物之激發光譜的120 nm紅移(參見LeVine等人(1995)Int J Exp Clin Invest 2：1-6)。所有原纖維在不考慮蛋白組成的情況下均共有通用構形抗原決定基之說明已提供證據證明此等分子間存在結構共性。預期本文所述之方法可用於經由選擇適當目標抗原來偵測特異性識別表現於類澱粉蛋白原纖維或可溶性寡聚組裝中間 物上之抗原決定子之自體抗體。
在本文所提供之方法的某些具體實例中，特定類澱粉蛋白之存在或含量的偵測適用於診斷特定疾病或病狀，或選擇用於治療特定疾病或病狀之候選者。此項技術中已知之類澱粉蛋白疾病相關性的非限制性實例見於表1中。在某些具體實例中，對於表1中所列之類澱粉蛋白具有特異性之非親和力成熟抗體的存在或含量之偵測將診斷所列之相應疾病。
在AD及帕金森氏病之情況下對特定自體抗體(諸如抗Aβ寡聚物)之偵測可用於診斷或風險因素評估。本發明之診斷方法可應用於被認為處於發展類澱粉蛋白相關病症之風險中的個體，例如基於年齡、家族史、認知症狀等，如可由熟習藥物技術者來判定。
類澱粉蛋白相關病症之風險因素及症狀將最好由熟練醫學從業者來確認。發展此等病症之風險隨年齡增加，且與家族史有關。在許多情況下，絕對確定的診斷被視為不可行的。AD之可觀察症狀包括分裂性記憶損失、解決問題的能力之差異、關於時間或位置之混亂、對於完成日常工作感到困擾、社會退縮及情緒變化。此等症狀與疾病之身體表現有關，諸如類澱粉蛋白斑形成增加及總腦量降低。
阿茲海默氏病及其他類澱粉蛋白相關疾病及病症之治療
在本發明之一些具體實例中，本文所述之方法進一步包含測定疾病進展之預後，或指派治療過程或向個體投予治療之步驟。一般，當生物樣品中抗類澱粉蛋白抗體之含量高於對照臨限值(例如指示疾病之高可能性或進展的臨限值)，或與陰性對照組(例如來自尚未經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)相比更接近地類似於陽性對照組(例如來自已經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)時，將對治療過程開立處方。
用於類澱粉蛋白相關疾病及病狀(諸如AD)之治療典型地集中於疾病之認知及情緒症狀。早期治療及預防方案包括身體及社會活動、記憶遊戲、及謎與問題解決。用於有症狀個體之藥物療法包括膽鹼酯酶抑制劑(解決乙醯膽鹼降低)、部分麩胺酸拮抗劑(例如美金剛(Memantine))及精神病 藥物(例如抗精神病藥、睡眠輔助藥、抗焦慮藥及β-阻斷劑)。膽鹼酯酶抑制劑包括Aricept®(鹽酸多奈哌齊(donepezil hydrochloride))、Exelon®(雷斯替明(rivastigmine))、Razadyne®(加蘭他敏(galantamine))及Cognex®(塔克林(tacrine))。
亦已觀察到混合免疫球蛋白製劑(例如IVIG)可有效改善AD症狀。舉例而言，IVIG(靜脈內免疫球蛋白)之製備為此項技術所熟知。自混合血漿分離IgG之方法例如見於美國專利申請公開案第2010/0330071號及第2011/0293638號中。簡言之，藉由混合自一個以上個體(例如大於1,000個個體)貢獻之血液或血漿，分離血漿洗提份，及使用層析、超濾及透濾之組合增濃IgG免疫球蛋白來形成IVIG。IVIG典型地藉由靜脈內輸注來投予。使用IVIG治療AD、帕金森氏病及其他蛋白質聚集病症之方法揭示於美國公開案第2009/0148463號及第2009/0221017號中。
在AD及帕金森氏病之情況下對特定自體抗體(諸如針對Aβ寡聚物者)之偵測可用於診斷或風險因素評估。本發明之診斷方法可應用於被認為處於發展類澱粉蛋白相關病症之風險中的個體，例如基於年齡、家族史、認知症狀等，如可由熟習藥物者來判定。
類澱粉蛋白相關病症之風險因素及症狀將最好由熟練醫學從業者來確認。發展此等病症之風險隨年齡增加，且與家族史有關。在許多情況下，絕對確定的診斷被視為不可行的。AD之可觀察症狀包括分裂性記憶損失、解決問題的能力之差異、關於時間或位置之混亂、對於完成日常工作感到困擾、社會退縮及情緒變化。此等症狀與疾病之身體表現有關，諸如類澱粉蛋白斑形成增加及總腦量降低。
在本發明之其他具體實例中，使用偵測方法監測或產生相關疾病進展之預後，對照組來自經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組類似或增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在一些具體 實例中，對照組來自未經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組之類似含量指示疾病進展之低可能性。在另一具體實例中，對照組在較早時取自同一患者，以使得殘餘複合物相對於對照組增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在某些具體實例中，先前樣品可能在約1個月前取得，或在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個月前，或在4、5、6、7、8、9、10年前或超過10年前取得。熟習此項技術者應瞭解如何選擇至少一種適當對照組且相應地解釋結果。
用於全身性紅斑狼瘡及其他DNA相關疾病及病症之療法
在本發明之一些具體實例中，本文所述之方法進一步包含測定疾病進展之預後，或指派治療過程或向個體投予治療之步驟。一般，當生物樣品中抗DNA抗體之含量高於對照臨限值(例如指示疾病之高可能性或進展的臨限值)，或與陰性對照組(例如來自尚未經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)相比更接近地類似於陽性對照組(例如來自已經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)時，將對治療過程開立處方。
用於DNA相關疾病及病狀(諸如全身性紅斑狼瘡)之療法為此項技術所已知。用於有症狀個體之藥物療法包括非類固醇消炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，諸如布洛芬(ibuprofen)及萘普生(naproxen)；抗瘧疾藥，諸如羥氯喹(PlaquenilTM)；皮質類固醇，諸如潑尼松(prednisone)(DeltasoneTM)、氫皮質酮(hydrocortisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(MedrolTM)及地塞米松(dexamethasone)(DecadronTM、HexadrolTM)；免疫抑制藥，諸如環磷醯胺(cyclophosphamide)(CytoxanTM)及黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)(CellCeptTM)；BLyS特定抑制劑，諸如貝利單抗(Belimumab)(BenlystaTM)；甲胺喋呤(methotrexate)(Folex、Mexate、Rheumatrex)；改善疾病之抗風濕藥物可用於幫助控制疾病。其他治療可包 括激素療法，諸如去氫表雄固酮(DHEA)及靜脈內免疫球蛋白，其亦適用於控制狼瘡，尤其在其他治療未能解決症狀之情況下。
在全身性紅斑狼瘡之情況下對特定自體抗體(諸如抗dsDNA)之偵測可用於診斷或風險因素評估。本發明之診斷方法可應用於被認為處於發展全身性紅斑狼瘡之風險中的個體，例如基於遺傳學、存在高於對照臨限值之自體抗體(諸如抗Sm、抗RNP、抗Ro(SSA)及抗La(SSB)自體抗體)、曝露於感染劑(諸如病毒，諸如埃-巴二氏病毒)及陽光、應力、激素、香菸、煙霧或某些藥物、症狀等，如可由熟習藥物者來判定。
DNA相關自體免疫病症之風險因素及症狀將最好由熟練醫學從業者來確認。在許多情況下，絕對確定的診斷被視為不可行的。全身性紅斑狼瘡之症狀可為輕度至重度且可包括(不排除)以下一或多者：關節疼痛或腫脹(關節炎)，無法解釋的發熱，極度疲勞，鼻子及臉頰、面部、耳朵、上臂、肩部、胸部、手部上之紅色皮疹，光敏感性，胸痛，毛髮損失，貧血，口潰瘍，由寒冷及應力引起之蒼白或紫色手指，頭痛，眩暈，抑鬱症，意識模糊或癲癇發作。在本發明之其他具體實例中，使用偵測方法監測或產生相關疾病進展之預後，對照組來自經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組類似或增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在一些具體實例中，對照組來自未經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組之類似含量指示疾病進展之低可能性。在另一具體實例中，對照組在較早時取自同一患者，以使得殘餘複合物相對於對照組增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在某些具體實例中，先前樣品可能在約1個月前取得，或在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個月前，或在3、4、5、6、7、8、9、10年前或超過10年前取得。熟習此項技術者應瞭解如何選擇至少一種適當對照組且相 應地解釋結果。
用於甲狀腺炎及其他甲狀腺球蛋白相關或微管蛋白相關疾病及病症之療法
在本發明之一些具體實例中，本文所述之方法進一步包含測定疾病進展之預後，或指派治療過程或向個體投予治療之步驟。一般，當生物樣品中抗甲狀腺球蛋白或抗微管蛋白自體抗體之含量高於對照臨限值(例如指示疾病之高可能性或進展的臨限值)，或與陰性對照組(例如來自尚未經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)相比更接近地類似於陽性對照組(例如來自已經歷疾病進展之一組或個體的對照含量)時，將對治療過程開立處方。
用於甲狀腺球蛋白相關疾病及病狀(諸如甲狀腺炎，例如格雷氏症(Graves disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲狀腺機能減退、甲狀腺癌、甲狀腺毒症)之療法為此項技術所已知。用於有症狀個體之藥物療法包括激素替代物，諸如左旋甲狀腺素治療(LevothroidTM、LevoxylTM、SynthroidTM)、特殊化膳食、及補充，其可用於幫助控制疾病。其他治療包括靜脈內免疫球蛋白，其已證明於治療橋本氏甲狀腺炎患者之臨床前甲狀腺機能減退中的作用。
在橋本氏甲狀腺炎之情況下對特定自體抗體(諸如抗甲狀腺球蛋白)之偵測可用於診斷或風險因素評估。本發明之診斷方法可應用於被認為處於發展橋本氏甲狀腺炎之風險中的個體，例如基於遺傳學、存在高於對照臨限值之自體抗體(諸如抗甲狀腺過氧化酶自體抗體)、TSH含量、症狀等，如可由熟習藥物者來判定。
甲狀腺球蛋白相關自體免疫病症之風險因素及症狀將最好由熟練醫學從業者來確認。在許多情況下，絕對確定的診斷被視為不可行的。橋本氏甲狀腺炎之症狀可為輕度至重度且可包括(不排除)以下一或多者：橋本氏甲狀腺炎(即最常見形式之自體免疫甲狀腺機能減退)之症狀可包括甲 狀腺腫脹、長期疲勞、對寒冷敏感度增加、便秘、抑鬱症、面部浮腫、嗓音嘶啞、血液膽固醇含量升高、肌肉隱痛、觸痛及僵硬、肌無力、月經過多、毛髮及皮膚乾燥、缺乏專心、足或腿腫脹及體重增加。
在本發明之其他具體實例中，使用偵測方法監測或產生相關疾病進展之預後，對照組來自經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組類似或增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在一些具體實例中，對照組來自未經歷疾病進展之個體或一組個體，以使得殘餘複合物相對於對照組之類似含量指示疾病進展之低可能性。在另一具體實例中，對照組在較早時取自同一患者，以使得殘餘複合物相對於對照組增加之含量指示疾病之高可能性或進展。在某些具體實例中，先前樣品可能在約1個月前取得，或在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個月前，或在4、5、6、7、8、9、10年前或超過10年前取得。熟習此項技術者應瞭解如何選擇至少一種適當對照組且相應地解釋結果。
醫藥組成物及劑量
預期本文所述之方法可用於標準化或定量選自本文所述之類型的生物樣品中所關注之非親和力成熟自體抗體的量，其可接著投予有需要之個體以用於治療性作用。在一些具體實例中，所關注之自體抗體為多反應性抗體。或者，本文所述之方法用於自生物樣品捕捉所關注之非親和力成熟自體抗體以在調配物中復原用於投予有需要之個體。包含免疫球蛋白之醫藥組成物(例如包含異質人類抗體之增濃免疫球蛋白製劑)可藉由此項技術中已知之各種方法投予。投藥途徑及/或方式視所需結果而變化，但將典型地為靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下。醫藥組成物可包括適合於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)之可接受載劑。
組成物之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗層、在分散液之情況下藉由維持所需粒徑、及藉由使用界面活性劑來維持。在一些情況下，組成物中較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。可藉由在組成物中包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來實現可注射性組成物之長期吸收。
本發明之醫藥組成物可根據此項技術中熟知且常規實踐之方法來製備。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing公司，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker有限公司，New York,1978。醫藥組成物較佳在GMP條件下製造。典型地，本發明之醫藥組成物中使用治療有效劑量或有效劑量之免疫球蛋白製劑。醫藥組成物可藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配為劑型。調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投予單次大丸劑，可隨時間投予若干分次劑量，或劑量可如治療情況之迫切性所指示按比例降低或增加。宜將非經腸組成物調配為單位劑型以便於投藥及劑量之均一性。如本文中所使用，單位劑型指適合作為單一劑量用於待治療個體之物理個別單元；各單元含有經計算可產生所需治療性作用之預定量之活性化合物以及所需醫藥載劑。
實際劑量水準可有所改變以獲得有效達成特定患者所需之治療反應而對該患者無毒之量的活性成分。醫師可以低於達成所需治療性作用所需之水準開始醫藥組成物之劑量且逐漸增加劑量直至達成所需作用。一般而言，有效劑量視許多不同因素而變化，包括待治療之特定疾病或病狀、其嚴重程度、患者之生理狀態、所投予之其他藥療、及治療為預防性治療或治療性治療。例示性治療方法需要每兩週投藥一次或一個月投藥一次或每3至6個月投藥一次。
組成物可在多種情況下投予。單次劑量之間的時間間隔可為每週、每 月或每年。時間間隔亦可不規律，如藉由測量患者之治療性進展所指示。劑量及頻率視抗體在患者中之半衰期而變化。
在免疫球蛋白製劑之情況下，常用靜脈內免疫球蛋白(IVIG)。IVIG調配物經設計用於藉由注射投藥。因為本發明之IgG製劑已達到特別高的免疫球蛋白濃度(例如在一些具體實例中為10% w/v、在其他具體實例中為15% w/v、在其他具體實例中為20% w/v及在其他具體實例中為至多25% w/v)，其顯著降低治療有效劑量之量，故本發明之組成物尤其有利於皮下及/或肌肉內投予患者，以及靜脈內投藥。
術語「有效量(effective amount)」指使得個體之所治療醫學病狀(例如阿茲海默氏病、帕金森氏病、全身性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、自體免疫肝病、自體免疫聽力損失及自體免疫甲狀腺疾病等)得到改善或治療之免疫球蛋白(尤其IgG)製劑的量。待投予個體之有效量可由醫師考慮到年齡、體重、疾病嚴重程度之個體差異、投藥途徑(例如靜脈內相對於皮下)及對療法之反應來判定。在某些具體實例中，本發明之免疫球蛋白製劑可基於臨床反應以每3至4週約300至約600毫克/公斤投予個體。對於靜脈內投藥，例示性初始輸注速率將為0.5 mL/kg/h(0.8 mg/kg/min)持續30分鐘，而例示性維持輸注速率將每30分鐘增加速率，若耐受則增加至至多5 mL/kg/h(8 mg/kg/min)。
對於皮下投藥，例示性劑量為1.37乘以先前靜脈內劑量除以靜脈內劑量之間的週數，而例示性維持劑量係基於臨床反應及目標IgG最低含量。對於皮下投予40kg體重及更重之個體，例示性初始輸注速率為在每一部位20 mL/h下每一部位30 mL，而例示性維持輸注速率為在每一部位20-30 mL/h下每一部位30 mL。對於皮下投予小於40 kg體重之個體，例示性初始輸注速率為在每一部位15 mL/h下每一部位20 mL，而例示性維持輸注速率為在每一部位15-20 mL/h下每一部位20 mL。在其他具體實例中，免疫球蛋白製 劑之劑量可更大或更小。熟悉由IgG製劑治療之疾病的臨床醫師可根據此項技術中已知之準則來判定用於患者之適當劑量。
根據本發明，完成治療過程所需之時間可由醫師判定且範圍可為短至一天至大於一個月。在某些具體實例中，治療過程可為1至6個月。
套組
本發明進一步提供用於偵測及/或分離非親和力成熟自體抗體(包括多反應性自體抗體)之套組。該等套組可用於診斷任何自體免疫病症，及鑑別易經受特定治療方法(諸如用IVIG)之個體。
套組將典型地包括書面或電子格式之使用說明書，及用於所需分析之標準試劑、溶液及緩衝液。套組可視情況包括標準對照或可消耗實驗室器皿，諸如ELISA培養板、層析工具、容器及反應容器。套組亦可包括用於收集生物樣品之裝置，例如注射器及血液部分分離裝置。
本發明之套組可包括本文所述之用於偵測對於任何內源性目標抗原具有特異性之非親和力成熟、多反應性抗體的物質，該等內源性目標抗原包括(但不排除)DNA、微管蛋白、甲狀腺球蛋白及類澱粉蛋白。套組可包括喜硫層析試劑及適當洗滌及洗提緩衝液以將IgG與樣品中之其他蛋白質分離。
套組亦可包括將所關注之非親和力成熟自體抗體與非特異性抗體分離之物質。該等物質可包括與所需形式之目標抗原(例如單體、寡聚(球狀)、聚合或聚集體)結合之固體載體。該固體載體可為珠粒、層析固定相(例如瓊脂糖、二氧化矽等)、ELJSA培養板等。物質亦可在一些具體實例中包括至少一種離液洗滌緩衝液，以在偵測後自結合類澱粉蛋白之載體分離及移除低親和力抗體以復原至調配物中用於治療性用途或進一步加工。
藉由參考附圖中所說明之本發明之某些例示性具體實例來對本發明作更具體描述。此等圖形成說明書之一部分。然而，應注意附圖說明本發明之例示性具體實例且因此並不視為限制其範疇。
圖1展示分別使用實施例1中所述之例示性分析測量人類血漿及IVIG製劑樣品中之抗Aβ(1-40)IgG。結合曲線對應於在整個分析中使用16 mS/cm或低傳導率條件對於各樣品類型之連續稀釋液所獲得之測量值。抗Aβ(1-40)IgG之含量以空白校正OD表示。
圖2展示使用實施例2中所述之例示性分析測量八批IVIG製造過程中間物中之抗Aβ(1-42)IgG。抗Aβ(1-42)IgG之含量以每毫克IgG之空白校正OD表示。
圖3展示使用實施例4中所述之例示性具體實例測量八批IVIG製造過程中間物中之抗Aβ原纖維IgG。抗Aβ(1-42)IgG之含量以每毫克IgG之空白校正OD表示。
圖4展示使用實施例5中所述之例示性分析測量人類血漿樣品中之抗DNA IgG。結合曲線對應於在整個分析中使用16 mS/cm或低傳導率條件對於連續稀釋液所獲得之測量值。抗DNA IgG之含量以空白校正OD表示。
圖5展示使用實施例6中所述之例示性分析測量人類血漿樣品中之抗微管蛋白IgG。結合曲線對應於在整個分析中使用16 mS/cm或低傳導率條 件對於連續稀釋液所獲得之測量值。抗微管蛋白IgG之含量以空白校正OD表示。
圖6展示使用實施例7中所述之例示性分析測量人類血漿樣品中之抗甲狀腺球蛋白IgG。結合曲線對應於在整個分析中使用16 mS/cm或低傳導率條件對於連續稀釋液所獲得之測量值。抗甲狀腺球蛋白IgG之含量以空白校正OD表示。
圖7展示使用實施例8中所述之例示性分析測量人類參考血漿中之抗DNA IgG。結合曲線對應於在以下不同鹽濃度[NaCl]下對於連續稀釋液所獲得之測量值：0 mM、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、120 mM及150 mM，且證明在遞減鹽濃度下分析靈敏度遞增。抗DNA IgG之含量以空白校正OD表示。
圖8為相對信號強度相對於實施例8中所述之分析緩衝液的傳導率之圖。傳導率與信號強度對數之間的線性回歸曲線(帶有平方相關性係數R2=0.98)證明傳導率與信號強度之間存在反比關係。
圖9展示在實施例9中所提供之比較研究中在低傳導率條件下抗DNA及抗微管蛋白IgG結合之競爭曲線。所獲得之資料證實分析緩衝液之低傳導率不會影響結合分析之特異性。
以下提供實施例以說明本發明。此等實施例不欲將本發明限於任何特 定應用或操作理論。
實施例1：測量血漿及靜脈內IgG製劑(IVIG)中之抗類澱粉蛋白(1-40)(Aβ40)IgG
將合成人類Aβ40肽(Calbiochem)以1 mg/mL溶解於三氟乙酸中且用0.1 M NaHCO3-Na2CO3緩衝液(pH 9.5)稀釋至10 μg/mL。在4℃下將此溶液與NUNC Maxisorp F96培養板之孔一起培育隔夜(每孔100 μL)。接著用具有16 mS/cm傳導率之洗滌緩衝液或低傳導率濃度之NaCl洗滌該培養板。在兩種情況下，洗滌緩衝液為20 mM HEPES、2 mM CaCl2、0.1%吐溫20，含有0(WBs)或150 mM NaCl(WBi)。在添加10 mg/mL人類血清白蛋白(human serum albumin，hSA)後使用各別洗滌緩衝液稀釋樣品，即人類參考血漿製劑#1R92及靜脈內IVIG製劑(Gammagard Liquid，#LE12G036)。此等稀釋緩衝液亦用於阻斷培養板，其藉由在室溫(RT)下培育2小時來達成。接著洗滌培養板且隨後與樣品之連續稀釋液(每孔100 μL)一起培育2小時。洗滌步驟後，在室溫下將用各別稀釋緩衝液稀釋(1/1,000)之兔抗人類IgG過氧化酶結合物(Dako P-214)與培養板(每孔100 μl)一起培育1小時。藉由洗滌步驟終止培育且用即用四甲基聯苯胺受質SureBlue(KPL；每孔100 μL)測量結合之過氧化酶，在室溫下培育直至顯現適當顏色。接著用每孔100 μL 1.5 M硫酸中止反應。在60分鐘內，接著在ELISA讀取器中在450 nm下測量培養板，其中在620 nm下進行參考測量。接著藉由減去試劑空白(對於所有稀釋度均相同)及藉由減去樣品特定空白及稀釋度特定空白來校正對於連續稀釋液所測量之光學密度(OD)。此特定空白藉由將連續稀釋液與未塗佈Aβ40肽之空白孔一起培育來獲得。圖1展示在整個分析中使用16 mS/cm或低傳導率條件對於人類血漿及IVIG製劑所獲得之結合曲線。
分析期間所用之低傳導率條件明顯增強人類血漿及IVIG製劑中存在之 天然抗Aβ IgG與結合培養板之Aβ40肽的結合。因此，當在整個分析中使用低傳導率20 mM HEPES緩衝液進行洗滌、稀釋及偵測時，所獲得之信號高至少100倍。另外，使用低傳導率緩衝液可顯著(>50%)降低塗有Aβ之孔與空白孔上所測量之信號之間的比率。在低傳導率系統中與空白孔之結合降低超過60%。
實施例2：測量IVIG中間物中之抗Aβ42 IgG
使用實施例1中所述之方法研究來自IVIG製造過程且純度高於85%之八批過程中間物的抗Aβ42 IgG水準。與所述之緩衝液相反，所用之緩衝液不含有CaCl2。圖2展示所測量之抗Aβ42 IgG水準，以每毫克IgG經空白校正之OD表示。
在所有情況下，低傳導率條件均使得信號明顯增加。在低傳導率條件下所獲得之分析信號平均為在16 mS/cm條件下所獲得之分析信號的50倍。個別增加範圍為24至102倍。伴隨的是，塗有Aβ之孔與空白孔上信號之間的比率平均降低大於50%且發現對於16 mS/cm或低傳導率條件而言平均比率為0.13及0.04。
實施例3：測量IVIG中間物中之抗Aβ40寡聚物(CAPS)IgG
用如(O'Nuallain B.等人，(2010)：J Clin Immunol May；30增刊1：S37-42)所述獲得之抗Aβ40寡聚物(CAPS，交聯β-類澱粉蛋白物質)塗佈培養板。接著如實施例1中所述使用無CaCl2之緩衝液進行分析。研究來自IVIG製造過程且純度高於85%之八批過程中間物的抗CAPS IgG水準。表2展示給出IgG濃度(以g/mL表示)及塗有CAPS之孔(OD)及空白孔(空白)上所獲得之相應信號的結果。另外，給出相應信號與相對於蛋白質濃度校正之信號之間的比率(比率)及差異(A)，以OD/mg表示：
所形成之抗原-抗體複合物的量如圖所示藉由低傳導率分析系統中所獲得之信號強度增加而增加。所有研究樣品均觀察到此情況。信號強度平均增加54倍，其中個別值增加35至77倍。
實施例4：測量IVIG中間物中之抗Aβ原纖維IgG
用如(O'Nuallain B.等人，(2008).Biochemistry 47,12254-12256)所述獲得之抗Aβ原纖維塗佈培養板。接著如實施例1中所述使用無CaCl2之緩衝液進行分析。研究來自IVIG製造過程且純度高於85%之八批過程中間物的抗CAPS IgG水準。圖3展示所測量之抗Aβ原纖維IgG水準，以每毫克IgG經空白校正之OD表示。
低傳導率條件在所有情況均使得信號明顯增加。在低傳導率條件下所 獲得之分析信號平均為在16 mS/cm條件下所獲得之分析信號的64倍。個別增加範圍為41至116倍。
實施例5：測量人類血漿中之抗DNA IgG
抗DNA抗體為充分描述之人類自體抗體。實施例5展示在固相分析中對於在低傳導率及16 mS/cm分析條件下所獲得之人類血漿中的抗DNA IgG所獲得之結合曲線。在4℃下將單股DNA(小牛胸腺，Sigma D8899)以5 μg/mL與NUNC Maxisorp F96培養板之孔一起培育隔夜(每孔100 μL)。接著如實施例1中所述使用無CaCl2之緩衝液進行固相結合分析。使用來自Technoclone(Vienna)之參考血漿製劑#1R01B00。連續稀釋液以對應於250 μg/mL之IgG濃度的最小稀釋度1/20開始。分析安排，亦即用於獲得樣品特定及稀釋液特定空白之方法如實施例1中所述進行。圖4展示由於對於兩種緩衝液系統所觀察到之信號強度的巨大差異而使用log/lin形式之表述所獲得之結合曲線。
濃度-反應曲線明顯證明低傳導率緩衝液可使信號強度增加至少100倍。另外，使用低傳導率條件使與空白孔之結合(對在16 mS/cm條件下所獲得之信號的67%進行計數)降低90%。
實施力6：測量人類血漿中之抗微管蛋白IgG
微管蛋白為微管之一部分，其為存在於幾乎所有真核細胞及一部分細胞骨架系統中之圓柱形絲狀結構。抗微管蛋白自體抗體為一些人類血清之正常組分，但大多數抗微管蛋白IgG似乎以免疫複合物形式存在(Bernier-Valentin等人，(1988)：Clin.exp.Immunol.71,261-268)。實施例6展示在固相分析中對於在低傳導率及16 mS/cm分析條件下所獲得之人類血漿中的抗微管蛋白IgG所獲得之結合曲線。在4℃下將微管蛋白(豬，Sigma T6954)以5 μg/mL與NUNC Maxisorp F96培養板之孔一起培育隔夜(每孔100 μL)。接著如實施例1中所述使用無CaCl2之緩衝液進行固相結合分析。 使用來自Technoclone(Vienna)之參考血漿製劑#1R01B00。連續稀釋液以對應於250 μg/mL之IgG濃度的最小稀釋度1/20開始。分析安排，亦即用於獲得樣品特定及稀釋液特定空白之方法如實施例1中所述進行。圖5展示由於對於兩種緩衝液系統所觀察到之信號強度的巨大差異而使用log/lin形式之表述所獲得之結合曲線。
濃度-反應曲線明顯證明低傳導率緩衝液可使信號強度增加至少100倍。另外，使用低傳導率條件使與空白孔之結合(對在16 mS/cm條件下所獲得之信號的50%進行計數)降低90%。
實施例7：測量人類血漿中之抗甲狀腺球蛋白IgG
實施例7展示在固相分析中對於在低傳導率及16 mS/cm分析條件下所獲得之人類血漿中的抗甲狀腺球蛋白IgG所獲得之結合曲線。在4℃下將甲狀腺球蛋白(豬，Sigma T1126)以5 μg/mL與NUNC Maxisorp F96培養板之孔一起培育隔夜(每孔100 μL)。接著如實施例1中所述使用無CaCl2之緩衝液進行固相結合分析。使用來自Technoclone(Vienna)之參考血漿製劑#1R01B00。連續稀釋液以對應於250 μg/mL之IgG濃度的最小稀釋度1/20開始。分析安排，亦即用於獲得樣品特定及稀釋液特定空白之方法如實施例1中所述進行。圖6展示由於對於兩種緩衝液系統所觀察到之信號強度的巨大差異而使用log/lin形式之表述所獲得之結合曲線。濃度-反應曲線明顯證明低傳導率緩衝液可使信號強度增加至少100倍。
實施例8：傳導率對偵測來自人類血漿之自體抗體抗DNA IgG之靈敏度的影響
實施例5中所述之條件及DNA製劑亦用於研究所用分析緩衝液之傳導率對分析靈敏度之影響。因此，製備含有介於0至150 mM範圍內之八種不同濃度之NaCl的20 mM HEPES緩衝液且用作洗滌緩衝液且在添加10 mg/mL HSA後用於稀釋人類參考血漿樣品。圖7展示所獲得之八個結合曲 線。
分析緩衝液之傳導率與固相抗DNA結合分析之靈敏度之間的關係由結果顯而易見。因此，將獲得例如與由150 mM NaCl緩衝液獲得之信號相差1,000倍的經空白校正信號0.2所需之IgG濃度與不含有NaCl之緩衝液的結果作比較。傳導率與信號強度之間的反比關係遵循如圖8中所示之數學函數，其中相對於所用分析緩衝液之傳導率對相對信號強度製圖。傳導率與信號強度之對數之間的線性回歸曲線具有平方相關性係數R2=0.98，其有力地證明此信號強度增加基於函數關係之結論。
實施例9：顯示在低傳導率條件下抗DNA及抗微管蛋白IgG之結合特異性的競爭研究
與可溶性抗原競爭為一種使用結合培養板之抗原證明結合測試之特異性的常見方法。因此，使用此方法證實低傳導率條件不利於非特異性結合，其假設為在此等條件下所觀察到之信號強度增加的可能解釋。此展示於實施例9中，其中抗DNA IgG及抗微管蛋白與其結合培養板之抗原的結合與可溶性抗原競爭。出於該目的，將血漿樣品與遞減濃度之各別抗原一起培育1小時。接著分別如實施例5及實施例6中所述分析此等樣品。圖9展示由在兩種情況下由溶液中之抗原引起的明顯濃度依賴性競爭獲得之競爭曲線。在9.9及18 μg/mL(分別為DNA及微管蛋白)之濃度下獲得50%競爭結合於結合培養板之抗原的水準。此等資料證實分析緩衝液之低傳導率不會影響結合分析之特異性。
實施例10：在低傳導率分析條件下使用源自免疫接種之抗體的習知ELISA系統之效能
自體抗體存在於先前未用其所針對之其目標抗原免疫接種或疫苗接種的血漿中。對於用於ELISA之幾乎所有抗體肯定並非如此，該等抗體典型地藉由主動免疫接種目標抗原產生。此過程主要造成自體抗體與藉由主動 免疫接種所產生之其對應物之間的差異。實施例10研究對於藉由主動免疫接種所產生之抗體的ELISA分析使用低傳導率緩衝液是否會增加在彼等情況下之靈敏度。因此，使用已明確建立、經驗證之α1-抗胰蛋白酶的ELISA，其基於使用多株兔IgG(Weber A.等人，(2011)：Vox Sanguinis Apr；100(3)：285-97)，用低傳導率緩衝液系統更換標準16 mS/cm緩衝液。該分析執行時無任何明顯變化。然而，與多種自體抗體之結合分析結果相反，對於藉由主動免疫接種所產生之抗體觀察到無信號強度增加。
儘管出於清楚理解之目的，已經由說明及實施例相當詳細地描述以上發明，但熟習此項技術者根據本發明之教示顯而易見，在不脫離隨附申請專利範圍之精神或範疇的情況下可對其進行某些變化及修改。
基於本發明，熟習此項技術者應瞭解，本發明可用於偵測跨越多種不同親和力、親合力及反應性(多反應性相對於單價)且針對不同類型之目標抗原(包括肽及核酸)的自體抗體。預期本文所提供之方法亦可偵測對於目標抗原具有高親合力之自體抗體，其Fab區對於目標抗原具有特異性，但相對於習知ELISA分析不一定具有增強之靈敏度。

Claims (127)

  1. 一種偵測生物樣品中之類澱粉蛋白-β特異性自體抗體的方法，該方法包含以下步驟：(a)使該生物樣品在低傳導率條件下與類澱粉蛋白-β抗原接觸，類澱粉蛋白-β特異性自體抗體對於該抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該類澱粉蛋白-β抗原與該類澱粉蛋白-β特異性自體抗體之結合，其中將該類澱粉蛋白-β抗原固定於固相上且該結合之存在指示該生物樣品中之類澱粉蛋白-β特異性自體抗體，且其中該低傳導率條件之傳導率小於11 mS/cm。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該類澱粉蛋白-β特異性自體抗體為非親和力成熟自體抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該生物樣品選自由血液、血清、血漿、其洗提份(fraction)及其加工衍生物組成之群。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該生物樣品為靜脈內IgG製劑。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該生物樣品源自人類。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中該類澱粉蛋白-β抗原呈選自單體、二聚物、寡聚物、交聯寡聚物及原纖維之形式。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於9 mS/cm。
  8. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於7 mS/cm。
  9. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於5 mS/cm。
  10. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於3 mS/cm。
  11. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率不大於1 mS/cm。
  12. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之方法，其中該固相包含微量培養板。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之方法，其中該偵測步驟(b)包含：(i)使該生物樣品與結合於針對該類澱粉蛋白-β抗原之類澱粉蛋白-β特異性自體抗體的物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體的條件下，該物種特異性抗體對於獲得該生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於該相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體之類澱粉蛋白-β抗原的任何複合物，該相應類澱粉蛋白-β特異性自體抗體結合於該物種特異性抗體。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該物種特異性抗體與可偵測部分結合。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該可偵測部分包含直接標記。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該直接標記包含過氧化酶。
  18. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該可偵測部分包含間接標記。
  19. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該(ii)偵測任何複合物包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
  20. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之方法，其中該自體抗體選自IgG抗體、IgA抗體及IgM抗體。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項之方法，其中在步驟(a)之前該生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,000倍或至少5,000倍。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  24. 如申請專利範圍第1項至第23項中任一項之方法，其進一步包含在步驟(b)之前：用低傳導率洗滌緩衝液洗滌該固相。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  26. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  27. 一種偵測生物樣品中之自體抗體的方法，該自體抗體對於目標抗原具 有特異性，該方法包含以下步驟：(a)使該生物樣品在低傳導率條件下與該目標抗原接觸，該自體抗體對於該目標抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該目標抗原與該自體抗體之結合，其中將該目標抗原固定於固相上且該結合之存在指示該生物樣品中之該自體抗體，且其中該低傳導率條件之傳導率小於11 mS/cm。
  28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該自體抗體為非親和力成熟自體抗體。
  29. 如申請專利範圍第27項或第28項之方法，其中該生物樣品選自由血液、血清、血漿、其洗提份及其加工衍生物組成之群。
  30. 如申請專利範圍第27項或第28項之方法，其中該生物樣品為靜脈內IgG製劑。
  31. 如申請專利範圍第27項至第30項中任一項之方法，其中該生物樣品源自人類。
  32. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於9 mS/cm。
  33. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於7 mS/cm。
  34. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於5 mS/cm。
  35. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於3 mS/cm。
  36. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率不大於1 mS/cm。
  37. 如申請專利範圍第27項至第31項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  38. 如申請專利範圍第27項至第37項中任一項之方法，其中該固相包含微量培養板。
  39. 如申請專利範圍第27項至第38項中任一項之方法，其中該偵測步驟(b)包含：(i)使該生物樣品與結合於針對該目標抗原之自體抗體的物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應自體抗體的條件下，該物種特異性抗體對於獲得該生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於該相應自體抗體之目標抗原的任何複合物，該相應自體抗體結合於該物種特異性抗體。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該物種特異性抗體與可偵測部分結合。
  41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該可偵測部分包含直接標記。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該直接標記包含過氧化酶。
  43. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該可偵測部分包含間接標記。
  44. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該(ii)偵測任何複合物包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
  45. 如申請專利範圍第27項至第44項中任一項之方法，其中該自體抗體選自IgG抗體、IgA抗體及IgM抗體。
  46. 如申請專利範圍第27項至第44項中任一項之方法，其中在步驟(a) 之前該生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,000倍或至少5,000倍。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  48. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  49. 如申請專利範圍第27項至第48項中任一項之方法，其進一步包含在步驟(b)之前：用低傳導率洗滌緩衝液洗滌該固相。
  50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  51. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  52. 一種偵測生物樣品中之DNA特異性自體抗體的方法，該方法包含以下步驟：(a)使該生物樣品在低傳導率條件下與DNA抗原接觸，該自體抗體對於該DNA抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該DNA抗原與該自體抗體之結合， 其中將該DNA抗原固定於固相上且該結合之存在指示該生物樣品中之該自體抗體，且其中該低傳導率條件之傳導率小於11 mS/cm。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該DNA特異性自體抗體為非親和力成熟自體抗體。
  54. 如申請專利範圍第52項或第53項之方法，其中該生物樣品選自由血液、血清、血漿、其洗提份及其加工衍生物組成之群。
  55. 如申請專利範圍第52項或第53項之方法，其中該生物樣品為靜脈內IgG製劑。
  56. 如申請專利範圍第52項至第55項中任一項之方法，其中該生物樣品源自人類。
  57. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於9 mS/cm。
  58. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於7 mS/cm。
  59. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於5 mS/cm。
  60. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於3 mS/cm。
  61. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率不大於1 mS/cm。
  62. 如申請專利範圍第52項至第56項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶 液之傳導率。
  63. 如申請專利範圍第52項至第62項中任一項之方法，其中該固相包含微量培養板。
  64. 如申請專利範圍第52項至第63項中任一項之方法，其中該偵測步驟(b)包含：(i)使該生物樣品與結合於針對該DNA抗原之自體抗體的物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應自體抗體的條件下，該物種特異性抗體對於獲得該生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於該相應自體抗體之DNA抗原的任何複合物，該相應自體抗體結合於該物種特異性抗體。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該物種特異性抗體與可偵測部分結合。
  66. 如申請專利範圍第65項之方法，其中該可偵測部分包含直接標記。
  67. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該直接標記包含過氧化酶。
  68. 如申請專利範圍第65項之方法，其中該可偵測部分包含間接標記。
  69. 如申請專利範圍第65項之方法，其中該(ii)偵測任何複合物包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
  70. 如申請專利範圍第52項至第69項中任一項之方法，其中該自體抗體選自IgG抗體、IgA抗體及IgM抗體。
  71. 如申請專利範圍第52項至第70項中任一項之方法，其中在步驟(a)之前該生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,000倍或至少5,000倍。
  72. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  73. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  74. 如申請專利範圍第52項至第73項中任一項之方法，其進一步包含在步驟(b)之前：用低傳導率洗滌緩衝液洗滌該固相。
  75. 如申請專利範圍第74項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  76. 如申請專利範圍第74項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  77. 如申請專利範圍第52項至第76項中任一項之方法，其中該DNA抗原呈選自單股DNA及雙股DNA之形式。
  78. 一種偵測生物樣品中之微管蛋白特異性自體抗體的方法，該方法包含以下步驟：(a)使該生物樣品在低傳導率條件下與微管蛋白抗原接觸，該自體抗體對於該微管蛋白抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該微管蛋白抗原與該自體抗體之結合，其中將該微管蛋白抗原固定於固相上且該結合之存在指示該生物樣品中之該自體抗體，且 其中該低傳導率條件之傳導率小於11 mS/cm。
  79. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該微管蛋白特異性自體抗體為非親和力成熟自體抗體。
  80. 如申請專利範圍第78項或第79項之方法，其中該生物樣品選自由血液、血清、血漿、其洗提份及其加工衍生物組成之群。
  81. 如申請專利範圍第78項或第79項之方法，其中該生物樣品為靜脈內IgG製劑。
  82. 如申請專利範圍第78項至第81項中任一項之方法，其中該生物樣品源自人類。
  83. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於9 mS/cm。
  84. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於7 mS/cm。
  85. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於5 mS/cm。
  86. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於3 mS/cm。
  87. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率不大於1 mS/cm。
  88. 如申請專利範圍第78項至第82項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  89. 如申請專利範圍第78項至第88項中任一項之方法，其中該固相包含微 量培養板。
  90. 如申請專利範圍第78項至第89項中任一項之方法，其中該偵測步驟(b)包含：(i)使該生物樣品與結合於針對該微管蛋白抗原之自體抗體的物種特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應自體抗體的條件下，該物種特異性抗體對於獲得該生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於該相應自體抗體之微管蛋白抗原的任何複合物，該相應自體抗體結合於該物種特異性抗體。
  91. 如申請專利範圍第90項之方法，其中該物種特異性抗體與可偵測部分結合。
  92. 如申請專利範圍第91項之方法，其中該可偵測部分包含直接標記。
  93. 如申請專利範圍第92項之方法，其中該直接標記包含過氧化酶。
  94. 如申請專利範圍第91項之方法，其中該可偵測部分包含間接標記。
  95. 如申請專利範圍第91項之方法，其中該(ii)偵測任何複合物包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
  96. 如申請專利範圍第78項至第95項中任一項之方法，其中該自體抗體選自IgG抗體、IgA抗體及IgM抗體。
  97. 如申請專利範圍第78項至第96項中任一項之方法，其中在步驟(a)之前該生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,OOO倍或至少5,OOO倍。
  98. 如申請專利範圍第97項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  99. 如申請專利範圍第97項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率 小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  100. 如申請專利範圍第78項至第99項中任一項之方法，其進一步包含在步驟(b)之前：用低傳導率緩衝液洗滌該固相。
  101. 如申請專利範圍第100項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  102. 如申請專利範圍第100項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  103. 一種偵測生物樣品中之甲狀腺球蛋白特異性自體抗體的方法，該方法包含以下步驟：(a)使該生物樣品在低傳導率條件下與甲狀腺球蛋白抗原接觸，該自體抗體對於該甲狀腺球蛋白抗原具有特異性結合親和力；及(b)偵測該生物樣品中該甲狀腺球蛋白抗原與該自體抗體之結合，其中將該甲狀腺球蛋白抗原固定於固相上且該結合之存在指示該生物樣品中之該自體抗體，且其中該低傳導率條件之傳導率小於11 mS/cm。
  104. 如申請專利範圍第103項之方法，其中該甲狀腺球蛋白特異性自體抗體為非親和力成熟自體抗體。
  105. 如申請專利範圍第103項或第104項之方法，其中該生物樣品選自由血 液、血清、血漿、其洗提份及其加工衍生物組成之群。
  106. 如申請專利範圍第103項或第104項之方法，其中該生物樣品為靜脈內IgG製劑。
  107. 如申請專利範圍第103項至第106項中任一項之方法，其中該生物樣品源自人類。
  108. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於9 mS/cm。
  109. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於7 mS/cm。
  110. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於5 mS/cm。
  111. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於3 mS/cm。
  112. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率不大於1 mS/cm。
  113. 如申請專利範圍第103項至第107項中任一項之方法，其中該低傳導率條件之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  114. 如申請專利範圍第103項至第113項中任一項之方法，其中該固相包含微量培養板。
  115. 如申請專利範圍第103項至第114項中任一項之方法，其中該偵測步驟(b)包含：(i)使該生物樣品與結合於針對該甲狀腺球蛋白抗原之自體抗體的物種 特異性抗體接觸，其中在足以使該物種特異性抗體特異性結合於存在之相應自體抗體的條件下，該物種特異性抗體對於獲得該生物樣品之物種具有特異性；及(ii)偵測包含結合於該相應自體抗體之甲狀腺球蛋白抗原的任何複合物，該相應自體抗體結合於該物種特異性抗體。
  116. 如申請專利範圍第115項之方法，其中該物種特異性抗體與可偵測部分結合。
  117. 如申請專利範圍第116項之方法，其中該可偵測部分包含直接標記。
  118. 如申請專利範圍第117項之方法，其中該直接標記包含過氧化酶。
  119. 如申請專利範圍第116項之方法，其中該可偵測部分包含間接標記。
  120. 如申請專利範圍第116項之方法，其中該(ii)偵測任何複合物包含使該可偵測部分與指示物試劑接觸。
  121. 如申請專利範圍第103項至第120項中任一項之方法，其中該自體抗體選自IgG抗體、IgA抗體及IgM抗體。
  122. 如申請專利範圍第103項至第121項中任一項之方法，其中在步驟(a)之前該生物樣品用低傳導率稀釋緩衝液稀釋至少1,000倍或至少5,000倍。
  123. 如申請專利範圍第122項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  124. 如申請專利範圍第122項之方法，其中該低傳導率稀釋緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
  125. 如申請專利範圍第103項至第124項中任一項之方法，該方法進一步包含在步驟(b)之前：用低傳導率緩衝液洗滌該固相。
  126. 如申請專利範圍第125項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於9 mS/cm、小於7 mS/cm、小於5 mS/cm、小於3 mS/cm或不大於1 mS/cm。
  127. 如申請專利範圍第125項之方法，其中該低傳導率洗滌緩衝液之傳導率小於150 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於120 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於90 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於60 mM氯化鈉溶液之傳導率、小於40 mM氯化鈉溶液之傳導率或小於20 mM氯化鈉溶液之傳導率。
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