JP6333731B2 - 低伝導率条件下の高感度を有する自己抗体測定法 - Google Patents

Description

発明の背景
疾患における自己抗体の役割が、熱心に研究されている。自己抗体は、抗体、ペプチドまたは核酸の自己抗原を標的とする能力をもつ多様なレパートリーを形成する。これらの自己抗体は、一価または多価であり得、様々な親和性および結合活性を表し得、解離定数は１０^−５から１０^−８Ｍの範囲であり得る。自己抗体は自己免疫疾患において広く関与していると考えられているが、自己抗体のサブセットは、免疫性ホメオスタシスおよび適切に機能する免疫系を維持する、非病的役割も果たす。自己抗体が末梢免疫系でのＴリンパ球とＢリンパ球の生存および／または発生、細菌感染に対する防御、炎症の抑制、貪食除去の媒介、抗イディオタイプの免疫調節およびサイトカイン産生の制御にとって重要であることを示す数多くの証拠がある。Ｅｌｋｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ４（９）：４９１−４９８；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８（４２）：１５１−１５６およびＬａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８）：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６，１１７−１３７を参照されたい。

自己免疫疾患を有すると診断されたかまたは有する疑いのある患者における自己抗体の検出は、研究または臨床的コンテクストにおいて非常に有用である。自己抗体は、疾患の進行の診断マーカーまたは指標となり得る。たとえば、ＳＬＥ（全身性狼瘡エリテマトーデス）におけるｄｓＤＮＡ抗体の上昇レベルは、上昇する疾患活性と相関があり、時には患者における臨床的再発より先に生じる。文献では多くの自己抗体が様々な障害と関連づけられている。Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３０（１０）：２−６を参照されたい。一部の例には、アルツハイマー病における抗アミロイドβ；甲状腺炎における抗サイログロブリン；自己免疫性肝臓障害における抗チューブリン；自己免疫性聴覚消失および自己免疫性甲状腺疾患；リューマチ性関節炎におけるリューマチ因子；およびＳＬＥにおける抗ｄｓＤＮＡ抗体（Ａｂ）が含まれる。

自己抗体の測定は、治療目的でも有用であり、特に増え続ける自己免疫疾患の静脈内イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）治療の到来により有用になった。排他的ではない例としては、免疫性血小板減少性紫斑病、川崎病、ギランバレー症候群、多発性筋炎／皮膚筋炎、血管炎および全身性狼瘡エリテマトーデス（ＳＬＥ）が含まれる。Ｙａｎｉｖ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｐｔ ２０００）「Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＩＶＩＧ）ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃを参照されたい。ＩＶＩＧ治療は、アルツハイマー病の治療にも有効であることが示されている。研究は、神経毒性のＡβ凝集を除去し、ＣＳＦ（脳脊髄液）中の血清Ａβの低下を促進して、大脳のＡβペプチドの堆積と認知能力の低下を軽減する抗Ａβ自己抗体の役割を示している。Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｕｔｏｉｍｍｕｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７：４１５−４２０を参照されたい。

しかし、自己抗体アッセイの結果の有益性は、それから得られるデータの質と同程度である。ファーアッセイ、クリチジアＩＦＡ（免疫蛍光アッセイ）およびＥＬＩＳＡなどの一般的な免疫検出方法は、特異性と感度の間で妥協が生じ、それぞれに制限がある。Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＣＬＩ １８（７）：１２−１７を参照されたい。たとえばファーアッセイは、硫酸アンモニウム中、高塩濃度でｄｓＤＮＡ／抗ｄｓＤＮＡ Ａｂの免疫複合体を沈殿させるが、それにより低結合活性のｄｓＤＮＡ／抗ｄｓＤＮＡ抗体複合体が解離するので、検出は比較的高い結合活性の自己抗体に限られる。自己抗体は結合活性に関しては非常に不均一であり、アルツハイマー病（ＡＤ）ではＩｇＧ自己抗体がβアミロイド（Ａβ）モノマーのエピトープに結合し中程度の結合活性で凝集するように、中程度から低結合活性のものも臨床的意義を有し得るので、この結果は問題である。Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２７：１６７−１７４を参照されたい。さらに、ファーアッセイは、放射性標識を使用するので、手間がかかるうえに高価である。ＩＦＡクリチジアは、中程度から高結合活性の自己抗体の検出能がある一方で、かなり時間がかかり、スライドのスコアリングに依存するため主観的である。ＥＬＩＳＡアッセイは、一般に感度が高く、自動化されやすいので、しばしば選択されるアッセイである。

標準的なＥＬＩＳＡ法にも欠点はある。それらは一般に、免疫沈降や免疫電気泳動法などの他の方法よりも特異性が低く、文献に記載されるように多くの問題を抱えている。その例としては、標準的なＥＬＩＳＡ法は、ＡＤ患者対健常対照における抗Ａβ自己抗体の相対的力価について異なる評価結果を出している。標準的なＥＬＩＳＡ法によるインタクトな血漿検体の初期の研究は、同年齢の非認知症の対照よりも低い、対Ａβモノマーの内因性抗体価をＡＤ患者に帰因させた（Ｗｅｋｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３７：９４３−９４８（２００２））。その後の研究は、プロテインＧカラムから低ｐＨで溶出した血漿イムノグロブリンに行ったＥＬＩＳＡ（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６１：１０２４０−１０２４７（１９８６））に基づき、ＡＤ患者における循環抗Ａβモノマー抗体の同等または増加した力価を報告した（Ｍｒｕｔｈｉｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２５：１０２３−１０３２（２００４））。この方法で得られた高力価は、全血漿のアッセイで検出されなかった、プロテインＧ精製の過程で酸性化により抗原から離れると測定可能な、結合された抗アミロイド抗体のプールの存在を反映すると仮定された。

ＡＤの病変形成で重要なのは、Ａβのミスフォールドと凝集である。ヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）レパートリーは、ワクチンまたは受動免疫の非存在下で生じるＡβペプチドに対する自己抗体を含み、そのような抗Ａβ自己抗体活性は、様々な年齢の健常な成人とＡＤ患者の血液中に検出されている（Ｗｅｋｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３７：９４３−９４８（２００２）；Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．，４９：８０８−８１０．５（２００１）；Ｍｒｕｔｈｉｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．，２５：１０２３−１０３２（２００４）；Ｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ．，３：２９−３９（２００３）；Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．，１４：３８７９−３８８３（２００９））。そのような抗アミロイドβ自己抗体への関心は、高レベルの自己抗体を含むヒトＩＶＩＧが、ＡＤ患者において治療効果があることが発見され、高まっている（Ｄｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．，７５：１４７２−１４７４（２００４）；Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．，４９：８０８−８１０．５（２００１）；Ｍｒｕｔｈｉｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．，２５：１０２３−１０３２（２００４））。

アルツハイマー病の研究における最近の進歩にも関わらず、抗アミロイドβ自己抗体を正確に測定するための努力は多くの障害により覆されている。１つの障害は、Ａβ凝集体の立体のみならず直線状のネオエピトープを認識するヒト抗体が複数クラスで存在することである。これまでの報告は、Ａβ原繊維（Ｏ'Ｎｕａｌｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７６：７０７１−７０７８（２００６））、Ａβオリゴマー（Ｍｏｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８０：１７４５８−１７４６３（２００５）；Ｒｅｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ａｎｄ Ｄｅｍｅｎｔｉａ，３：Ｓ１９６，Ｘ（２００８）；Ｏ'Ｎｕａｌｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：１２２５４−１２２５６（２００８））およびＡβモノマーの立体エピトープ（Ｂａｕｍｋｅｔｎｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ．，１５：４２０−４２８（２００６））に対する内因性ヒト抗体を同定している。他の種類のアミロイド結合抗体、およびＡβに対する触媒抗体さえも報告されている（Ｔａｇｕｃｈｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８４：４７１４−４７２２（２００８））。

低結合活性の多反応性自己抗体の測定は、空のＥＬＩＳＡウェルへの高バックグラウンド結合と、血液試料中の他の血漿タンパクと成分によるアッセイの干渉により、特に困難である。Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２７：１６７−１７４を参照されたい。これらの問題は、ＩＶＩＧ中、高い比率のＩｇＧ自己抗体が多反応性で低結合活性であるため、克服されねばならない。

抗Ａβ自己抗体アッセイの感度と信号ノイズ比を改良する努力がなされており、それにはブレットシュナイダー・リサーチチームが開発した放射性免疫沈降アッセイが含まれる。Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５７：８１３−８１６を参照されたい。別の研究では、非特異的自己抗体結合剤を除去しようと、ＩＶＩＧのポリスチレンおよび／またはアガロースカラムのアッセイ前の通過を行った。結果は理想には程遠く、除去は空のプレートを結合する自己抗体に特化されず、もともと低濃度であった抗Ａβ自己抗体がさらに減少し、測定はより複雑になった。多反応性自己抗体の低結合活性によりその検出が困難になり、得られた信号強度は他の血漿タンパクおよび成分の干渉の影響をさらに受け、抗アミロイド活性を過小評価することになる。

多反応性の低結合活性抗アミロイドβ自己抗体では一般的な低自己抗体濃度を補償する一般的な技法では、希釈の少ない試料をアッセイに使用する。しかし、この技法は、信号強度とノイズの両方を増大させる。別の方法は、カオトロピックな塩（アンモニウムチオシアネート）を用いて結合した自己抗体−抗原複合体を処理することを含む。Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２２７：１６７−１７４を参照されたい。

他方で、低結合活性の多反応性自己抗体を検出する信号の強化に向けた最近の方法は、抗アミロイド活性を過大評価する結果になっている。たとえば、有望とされた技法は、プロテインＧクロマトグラフィーと酸溶出によりヒト血漿からＩｇＧを単離することを含み、そのアッセイの結果、見かけ抗Ａβ抗体力価は５０倍増加した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：２２（２００７））。しかし、この高力価は、空プレートにおける結合が１００倍増加したことからわかるように、試料中の抗体の部分変性と人工的に誘導された多価によるものであった。

説明すると、異種抗原と自己抗原の両方の多反応性抗体は、ヒトの自然抗体レパートリーの一部である（Ｄｊｏｕｍｅｒｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６１：３５７−３６３（２００５））。ほとんどの多反応性抗体は、生殖系の超可変領域を有し、ＩｇＧアイソタイプに属し、一価の親和性成熟抗体と比べて抗原に対し低い親和性と結合活性を示し、より柔軟な抗原結合性部位を持つ。それらは病原体に対する防御機構として働くと考えられている。

自己抗体の正確な測定は、アルツハイマー病および他の自己免疫疾患の病因研究の進歩への手がかりである。同様に、自己免疫疾患と診断されたかその疑いのある患者の臨床的評価と治療は、改良された自己抗体アッセイを必要としている。アルツハイマー病治療として発見されたＩＶＩＧの可能性とともに、抗アミロイド自己抗体測定のいくつかの障害を克服し治療用途の基準の開発とさらなる研究を可能にする必要性が高まっている。低結合活性の多反応性自己抗体の信頼できるアッセイは、なかなか得られないことが判明している。このように、感度と特異性の両方を備えた、低結合活性の多反応性抗アミロイド自己抗体の改良されたアッセイを開発する必要がある。本発明は、結合選択性に負の影響を与えることなく信号を増強する低伝導率条件での自己抗体アッセイを提供する。

本発明は、低伝導率緩衝系と、それを用いて高感度で自己抗体を検出する方法を提供する。感度が増加すると、０．２μｇ／ｍＬと低い濃度でも自己抗体を検出できるので、検出閾値の制約が減り、より濃縮された試料、すなわち希釈の少ない試料のアッセイに付随する様々な問題が回避される。さらに、本発明の緩衝系と方法は、対応して選択性を損失することなく免疫検出アッセイの感度を有意に増加させる。低伝導率条件は、抗原でコーティングされていないウェルへの結合が劇的に減少する低伝導率の流動性環境も提供する。

本発明は、生物学的試料中の自己抗体を検出し捕捉する方法を提供する。これらの新規の方法は、標的抗原に対し低結合活性を有する多反応性自己抗体を検出できる。一部の実施形態では、方法は、アミロイドβ抗原、ＤＮＡ抗原、チューブリン抗原およびサイログロブリン抗原から選択される標的抗原に対し特異的な結合親和性を有する自己抗体を検出できる。アミロイドβ抗原は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、架橋オリゴマーおよび原繊維から選択される形態であり得る。ＤＮＡ抗原は、単鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡから選択される形態であり得る。本発明の一部の方法では、生物学的試料は、本開示の開示により増強される当技術分野で既知のあらゆる多重アッセイを用いて、複数の個別の自己抗体の存在を同時に検定され得る。たとえば、本発明の方法は、様々な特異性の自己抗体を同時検出するのに使用され得るので、それらの実施形態では固相上の複数の個別の抗原の固定化が企図される。

一部の実施形態では、方法は、（ａ）自己抗体が特異的結合親和性を有する標的抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップと、（ｂ）生物学的試料中の前記標的抗原の前記自己抗体との結合を検出するステップを含む。標的抗原は、一部の実施形態では、固相に固定化され、結合の存在は生物学的試料中の自己抗体を示す。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）の前に固相を低伝導率緩衝液で洗うことを含む。

一部の実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、それらの画分およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される。一部の実施形態では、生物学的試料は、血漿から単離されたＩｇＧ組成物、たとえば静脈内ＩｇＧ調製物（ＩＶＩＧ）、皮下投与用のＩｇＧ調製物、筋肉内調製物用のＩｇＧ調製物などである。一部の実施形態では、生物学的試料は、ヒトに由来する（たとえば、ヒトＩＶＩＧ）。

一部の実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、標的抗原に対する自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応する自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応する自己抗体に結合された標的抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出ステップ（ｉｉ）は、検出可能部分（たとえば種特異的抗体に結合された検出可能部分）を指示試薬に接触させることを含む。

一部の実施形態では、種特異的抗体は、検出可能部分に結合される。検出可能部分は、一部の実施形態では、直接標識を含む。直接標識は、ペルオキシダーゼを含み得る。他の実施形態では、検出可能部分は、間接標識を含む。一部の実施形態では、種特異的抗体はＩｇＧアイソタイプから選択される。

一部の実施形態では、アッセイされる自己抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭから選択されるアイソタイプである。好ましい実施形態では、検出される多反応性の低結合活性自己抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。より好ましい実施形態では、多反応性の低結合活性自己抗体はヒトＩｇＧアイソタイプである。

一部の実施形態では、生物学的試料は、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも１，０００倍または少なくとも５，０００倍に希釈される。ある実施形態では、上記の方法は、ステップ（ａ）の前にプレートを低伝導率緩衝液でブロックすることをさらに含む。検出は、場合によっては目的の自己抗体の存在の確認、または他の場合は目的の自己抗体（複数可）の濃度の定量化を含み得る。当業者であれば、本明細書に記載される方法は、多反応性の低結合活性自己抗体のみならず一価の自己抗体も検出または捕捉する能力があることを理解しよう。

一部の実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液および滑液から選択される流体である。好ましくは、生物学的試料は、全血、血清、血漿、静脈内ＩｇＧ調製物（ＩＶＩＧ）またはそれらの何らかの画分もしくは加工誘導体から選択される。一部の実施形態では、生物学的試料は、ＩＶＩＧ製造過程の中間体である。
[本発明1001]
（ａ）アミロイドβ特異性自己抗体が特異的な結合親和性を有するアミロイドβ抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）生物学的試料中のアミロイドβ抗原のアミロイドβ特異性自己抗体への結合を検出するステップ
を含む、生物学的試料中のアミロイドβ特異性自己抗体を検出する方法であって、
アミロイドβ抗原は固相上に固定化されており、前記結合の存在は生物学的試料中のアミロイドβ特異性自己抗体の存在を示し、かつ
低伝導率条件は11ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、方法。
[本発明1002]
アミロイドβ特異性自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
生物学的試料がヒト由来である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1006]
アミロイドβ抗原が、モノマー、ダイマー、オリゴマー、架橋オリゴマー、および原繊維から選択される形態である、本発明1001から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
低伝導率条件が9ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
低伝導率条件が7ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
低伝導率条件が5ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1010]
低伝導率条件が3ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1011]
低伝導率条件が1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1012]
低伝導率条件が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1013]
固相がマイクロプレートを含む、本発明1001から1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
検出ステップ（ｂ）が、
（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、アミロイドβ抗原に対するアミロイドβ特異性自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応するアミロイドβ特異性自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
（ｉｉ）種特異的抗体に結合している対応するアミロイドβ特異性自己抗体に結合したアミロイドβ抗原を含むすべての複合体を検出すること
を含む、本発明1001から1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
検出可能部分が直接標識を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
直接標識がペルオキシダーゼを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
検出可能部分が間接標識を含む、本発明1015の方法。
[本発明1019]
（ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、本発明1015の方法。
[本発明1020]
自己抗体がＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、本発明1001から1013のいずれかの方法。
[本発明1021]
生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも1，000倍または少なくとも5，000倍に希釈される、本発明1001から1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
低伝導率希釈緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
低伝導率希釈緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1021の方法。
[本発明1024]
ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、本発明1001から1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
低伝導率洗浄緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
低伝導率洗浄緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1024の方法。
[本発明1027]
生物学的試料中の自己抗体を検出する方法であって、該自己抗体は標的抗原に対し特異的であり、該方法は、
（ａ）自己抗体が特異的な結合親和性を有する標的抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）生物学的試料中の前記標的抗原の前記自己抗体への結合を検出するステップを含み、
前記標的抗原は固相上に固定化され、前記結合の存在は生物学的試料中の自己抗体の存在を示し、かつ
低伝導率条件は11ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、方法。
[本発明1028]
自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、本発明1027または1028の方法。
[本発明1031]
生物学的試料がヒト由来である、本発明1027から1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
低伝導率条件が9ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
低伝導率条件が7ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
低伝導率条件が5ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1035]
低伝導率条件が3ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1036]
低伝導率条件が1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1037]
低伝導率条件が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1027から1031のいずれかの方法。
[本発明1038]
固相がマイクロプレートを含む、本発明1027から1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
検出ステップ（ｂ）が、
（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、標的抗原に対する自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応する自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
（ｉｉ）種特異的抗体に結合している対応する自己抗体に結合した標的抗原を含むすべての複合体を検出することを含む、本発明1027から1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、本発明1039の方法。
[本発明1041]
検出可能部分が直接標識を含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
直接標識がペルオキシダーゼを含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
検出可能部分が間接標識を含む、本発明1040の方法。
[本発明1044]
（ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、本発明1040の方法。
[本発明1045]
自己抗体がＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、本発明1027から1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも1、000倍または少なくとも5，000倍に希釈される、本発明1027から1044のいずれかの方法。
[本発明1047]
低伝導率希釈緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1046の方法。
[本発明1048]
低伝導率希釈緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1046の方法。
[本発明1049]
ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、本発明1027から1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
低伝導率洗浄緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1049の方法。
[本発明1051]
低伝導率洗浄緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1049の方法。
[本発明1052]
（ａ）自己抗体が特異的な結合親和性を有するＤＮＡ抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）生物学的試料中の前記ＤＮＡ抗原の前記自己抗体への結合を検出するステップ
を含む、生物学的試料中のＤＮＡ特異性自己抗体を検出する方法であって、
前記ＤＮＡ抗原は固相上に固定化され、前記結合の存在は生物学的試料中の自己抗体の存在を示し、かつ
低伝導率条件は11ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、方法。
[本発明1053]
前記ＤＮＡ特異性自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、本発明1052の方法。
[本発明1054]
生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、本発明1052または1053の方法。
[本発明1055]
生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、本発明1052または1053の方法。
[本発明1056]
生物学的試料がヒト由来である、本発明1052から1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
低伝導率条件が9ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
低伝導率条件が7ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1059]
低伝導率条件が5ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1060]
低伝導率条件が3ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1061]
低伝導率条件が1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1062]
低伝導率条件が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1052から1056のいずれかの方法。
[本発明1063]
固相がマイクロプレートを含む、本発明1052から1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
検出ステップ（ｂ）が、
（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、ＤＮＡ抗原に対する自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応する自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
（ｉｉ）種特異的抗体に結合している対応する自己抗体に結合したＤＮＡ抗原を含むすべての複合体を検出すること
を含む、本発明1052から1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
検出可能部分が直接標識を含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
直接標識がペルオキシダーゼを含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
検出可能部分が間接標識を含む、本発明1065の方法。
[本発明1069]
（ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、本発明1065の方法。
[本発明1070]
自己抗体がＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、本発明1052から1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも1，000倍または少なくとも5，000倍に希釈される、本発明1052から1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
低伝導率希釈緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1071の方法。
[本発明1073]
低伝導率希釈緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1071の方法。
[本発明1074]
ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、本発明1052から1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
低伝導率洗浄緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1074の方法。
[本発明1076]
低伝導率洗浄緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1074の方法。
[本発明1077]
前記ＤＮＡ抗原が、単鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡから選択される形態である、本発明1052から1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
（ａ）自己抗体が特異的な結合親和性を有するチューブリン抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）生物学的試料中の前記チューブリン抗原の前記自己抗体への結合を検出するステップ
を含む、生物学的試料中のチューブリン特異性自己抗体を検出する方法であって、
前記チューブリン抗原は固相上に固定化され、前記結合の存在は生物学的試料中の自己抗体の存在を示し、かつ
低伝導率条件は11ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、方法。
[本発明1079]
チューブリン特異性自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、本発明1078の方法。
[本発明1080]
生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、本発明1078または1079の方法。
[本発明1081]
生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、本発明1078または1079の方法。
[本発明1082]
生物学的試料がヒト由来である、本発明1078から1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
低伝導率条件が9ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
低伝導率条件が7ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1085]
低伝導率条件が5ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1086]
低伝導率条件が3ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1087]
低伝導率条件が1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1088]
低伝導率条件が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1078から1082のいずれかの方法。
[本発明1089]
固相がマイクロプレートを含む、本発明1078から1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
検出ステップ（ｂ）が、
（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、チューブリン抗原に対する自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応する自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
（ｉｉ）種特異的抗体に結合している対応する自己抗体に結合したチューブリン抗原を含むすべての複合体を検出することを含む、本発明1078から1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、本発明1090の方法。
[本発明1092]
検出可能部分が直接標識を含む、本発明1091の方法。
[本発明1093]
直接標識がペルオキシダーゼを含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
検出可能部分が間接標識を含む、本発明1091の方法。
[本発明1095]
（ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、本発明1091の方法。
[本発明1096]
自己抗体がＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、本発明1078から1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも1，000倍または少なくとも5，000倍に希釈される、本発明1078から1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
低伝導率希釈緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1097の方法。
[本発明1099]
低伝導率希釈緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1097の方法。
[本発明1100]
ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率緩衝液で洗浄することをさらに含む、本発明1078から1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
低伝導率洗浄緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1100の方法。
[本発明1102]
低伝導率洗浄緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1100の方法。
[本発明1103]
（ａ）自己抗体が特異的な結合親和性を有するサイログロブリン抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
（ｂ）生物学的試料中の前記サイログロブリン抗原の前記自己抗体への結合を検出するステップ
を含む、生物学的試料中のサイログロブリン特異性自己抗体を検出する方法であって、
前記サイログロブリン抗原は固相上に固定化され、前記結合の存在は生物学的試料中の自己抗体の存在を示し、かつ
低伝導率条件は11ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、方法。
[本発明1104]
サイログロブリン特異性自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、本発明1103の方法。
[本発明1105]
生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、本発明1103または1104の方法。
[本発明1106]
生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、本発明1103または1104の方法。
[本発明1107]
生物学的試料がヒト由来である、本発明1103から1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
低伝導率条件が9ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
低伝導率条件が7ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1110]
低伝導率条件が5ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1111]
低伝導率条件が3ｍＳ／ｃｍより低い伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1112]
低伝導率条件が1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1113]
低伝導率条件が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1103から1107のいずれかの方法。
[本発明1114]
固相がマイクロプレートを含む、本発明1103から1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
検出ステップ（ｂ）が、
（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、サイログロブリン抗原に対する自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応する自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
（ｉｉ）種特異的抗体に結合している対応する自己抗体に結合したサイログロブリン抗原を含むすべての複合体を検出することを含む、本発明1103から1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、本発明1115の方法。
[本発明1117]
検出可能部分が直接標識を含む、本発明1116の方法。
[本発明1118]
直接標識がペルオキシダーゼを含む、本発明1117の方法。
[本発明1119]
検出可能部分が間接標識を含む、本発明1116の方法。
[本発明1120]
（ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、本発明1116の方法。
[本発明1121]
自己抗体がＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＭ抗体から選択される、本発明1103から1120のいずれかの方法。
[本発明1122]
生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも1，000倍または少なくとも5，000倍に希釈される、本発明1103から1121のいずれかの方法。
[本発明1123]
低伝導率希釈緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1122の方法。
[本発明1124]
低伝導率希釈緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1122の方法。
[本発明1125]
ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率緩衝液で洗浄することをさらに含む、本発明1103から1124のいずれかの方法。
[本発明1126]
低伝導率洗浄緩衝液が、9ｍＳ／ｃｍ未満、7ｍＳ／ｃｍ未満、5ｍＳ／ｃｍ未満、3ｍＳ／ｃｍ未満、または1ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を有する、本発明1125の方法。
[本発明1127]
低伝導率洗浄緩衝液が、150ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、120ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、90ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、60ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、40ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または20ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、本発明1125の方法。

本発明のより具体的な説明は、添付の図面に例示されるその特定の例示的実施形態を参照してなされる。これらの図は本明細書の一部を形成する。しかし、添付の図は、本発明の例示的実施形態を例示するものであり、それらの範囲を限定するとみなしてはならない。
実施例１に記載される例示的アッセイを用いての、ヒト血漿とＩＶＩＧ調製物の各試料中の抗Ａβ（１−４０）ＩｇＧの測定を示す。結合曲線は、全アッセイを通して１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件を用いて各試料タイプの希釈系列で得られた測定値に対応する。抗Ａβ（１−４０）ＩｇＧのレベルはブランク補正ＯＤとして表される。 実施例２に記載される例示的アッセイを用いての、８ロットのＩＶＩＧ製造過程中間体における抗Ａβ（１−４２）ＩｇＧの測定を示す。抗Ａβ（１−４２）ＩｇＧのレベルはＩｇＧ１ｍｇあたりのブランク補正ＯＤとして表される。 実施例４に記載される例示的実施例を用いての、８ロットのＩＶＩＧ製造過程中間体における抗Ａβ原繊維ＩｇＧの測定を示す。抗Ａβ（１−４２）ＩｇＧのレベルはＩｇＧ１ｍｇあたりのブランク補正ＯＤとして表される。 実施例５に記載される例示的アッセイを用いての、ヒト血漿の試料中の抗ＤＮＡＩｇＧの測定を示す。結合曲線は、全アッセイを通して１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件を用いて希釈系列で得られた測定値に対応する。抗ＤＮＡＩｇＧのレベルはブランク補正ＯＤとして表される。 実施例６に記載される例示的アッセイを用いての、ヒト血漿の試料中の抗チューブリンＩｇＧの測定を示す。結合曲線は、全アッセイを通して１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件を用いて希釈系列で得られた測定値に対応する。抗チューブリンＩｇＧのレベルはブランク補正ＯＤとして表される。 実施例７に記載される例示的アッセイを用いての、ヒト血漿の試料中の抗サイログロブリンＩｇＧの測定を示す。結合曲線は、全アッセイを通して１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件を用いて希釈系列で得られた測定値に対応する。抗サイログロブリンＩｇＧのレベルはブランク補正ＯＤとして表される。 実施例８に記載される例示的アッセイを用いての、ヒト基準血漿中の抗ＤＮＡＩｇＧの測定を示す。結合曲線は、異なる塩濃度［ＮａＣｌ］：０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭおよび１５０ｍＭでの希釈系列で得られた測定値に対応し、塩濃度の低下に伴うアッセイ感度の上昇を示す。抗ＤＮＡＩｇＧのレベルはブランク補正ＯＤとして表される。 実施例８に記載されるアッセイ緩衝液の伝導率に対する相対的な信号強度のプロットである。伝導率と信号強度の対数間の線形回帰曲線は二乗相関係数Ｒ^２＝０．９８を有し、伝導率と信号強度の反比例関係の存在を支持している。 実施例９で提供される比較研究における低伝導率条件での抗ＤＮＡと抗チューブリンＩｇＧの結合の競合曲線を示す。得られたデータは、アッセイ緩衝液の低伝導率は結合アッセイの特異性に影響を及ぼさないことを立証する。

発明の詳細な説明
低伝導率条件がアッセイ感度を上昇させ選択性を改善するという発見は、病院や実験室で使用される多種多様な非親和性成熟多反応性ヒト自己抗体ＩｇＧを検出する現行の手法の補助として適用され得る。本発明は、他の非ヒト哺乳動物種の非親和性成熟多反応性ヒト自己抗体の検出向上にも使用され得ることも企図する。本記載の方法を所与の試料から目的の低結合活性の多反応性自己抗体を捕捉するのに使用すること、または当技術分野で既知の自己抗体精製法の補助的に使用することも企図される。

硝子、金属、プラスチックまたは一般的な固体基板に使用される他の材料への、たとえば多反応性その他の非親和性成熟自己抗体の非特異的結合は免疫検出における周知の誤差の源である。たとえば、ヒト血漿は、標的抗原であるアミロイド凝集に特異的な非親和性成熟多反応性抗体を比較的大量に含む。そのような多反応性自己抗体ならびにアッセイ基板に非特異的に結合する抗体の存在は、目的の多反応性自己抗体の検出濃度を人為的に高める。有利にも、本明細書で提供する方法は、本明細書で教示する低伝導率アッセイ条件の使用により、非親和性成熟自己抗体のアッセイ感度を高め、そのような自己抗体の基板への結合を低減する。

典型的には、抗原と抗体の結合、次いでその複合体の洗浄は、ＥＬＩＳＡアッセイでは、非特異的抗原抗体相互作用を低減するため中程度から高伝導率で実施される。たとえば、生物学的試料は一般的に、ＥＬＩＳＡアッセイを実施する前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中希釈される。ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４）緩衝液もＴＢＳ（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ）緩衝液も、中程度のイオン強度を有し、ＥＬＩＳＡアッセイの厳密性を高めるのに有用と考えられている。多くのＥＬＩＳＡプロトコルでもＰＢＳまたはＴＢＳ緩衝液中で抗原−抗体複合体の結合と洗浄を行う。

有利にも、本明細書では、自己抗体検出アッセイにおける低伝導率溶液条件の使用が、特異性を損なうことなく、たとえば非特異的結合（「バックグラウンドノイズ」）を増加させることなく、アッセイの感度を有意に増大させることが示される。たとえば図７に示すように、６０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶液条件下で実施された抗ＤＮＡ自己抗体検出アッセイは、（ＴＢＳ緩衝液で存在するように）１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶液条件下で実施されたアッセイよりも約１００倍感度が高い。さらに驚くべきことに、塩の非存在下で実施されたアッセイ（たとえば０ｍＭの塩化ナトリウム）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶液条件下で実施されたアッセイよりもほぼ１０，０００倍感度が高い。したがって、一部の実施形態では、溶液条件が低イオン強度に維持される自己抗体検出アッセイが記載される（たとえば結合および／または洗浄緩衝液が低濃度の塩などのイオン成分を含有する）。

Ｉ．定義
本明細書では「内因性抗体」という用語と交換可能に使用される自己抗体は、生物が産生する抗体であってその生物内因性の抗原に結合する抗体を指す。本明細書に記載される方法は、「生物学的試料中の自己抗体」を検出するが、これは生物が産生する抗体であってその生物内因性の抗原に結合する自己抗体と解釈され、前記生物は、生物学的試料が由来する生物学的材料の供給源である。構造については、ＩｇＭアイソタイプの自己抗体は、５つのＦｃ領域と１０のＦａｂ領域を有し、ＩｇＧアイソタイプの自己抗体は、１つのＦｃ領域と２つのＦａｂ領域を有し、ＩｇＡアイソタイプの自己抗体は、２つのＦｃ領域と４つのＦａｂ領域を有する。当業者であれば理解しようが、この方法で検出できる自己抗体は、親和性成熟自己抗体または非親和性成熟自己抗体ならびに多反応性自己抗体または単反応性自己抗体を含む。

「内因性抗原」および「自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語と交換可能に使用される「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、個体の体内でその個体の抗体産生を引き起こす成分である。

「単反応性」抗体は、Ｆａｂ領域が単一の抗原と反応するかまたは結合する抗体を指す。

「多反応性」抗体は、Ｆａｂ領域が複数の抗原と反応するかまたは結合する抗体を指す。

「多反応性」抗体は、本明細書では、Ｆａｂ領域が複数の抗原と反応するかまたは結合する自己抗体を指す。一部の実施形態では、 多反応性自己抗体は１または複数の自己抗原と反応性がある。他の実施形態では、多反応性自己抗体は、１つの自己抗原および１つの異種抗原と反応性がある。

本明細書では、「非親和性成熟自己抗体」は、親和性成熟していないＢ細胞に発現される自己抗体を指す。親和性成熟は、ジェミナル中心に提示された抗原（複数可）に対しより高い親和性を有する抗体を発現するＢ細胞が活性化に選択される過程である。この過程は体細胞超変異の反復とその後の親和性ベースの選択を含み、標的抗原に対しより高い親和性を有する抗体を発現するＢ細胞集団を生成する働きをする。

本明細書では、「親和性」という用語は、抗原上の単一の抗原決定基とそれに対応する抗体上の結合部位の間の相互作用の強度を指す。それは、抗原決定基とそれに対応する抗体の結合部位の間に働く誘因力と反発力の和である。親和性は、抗原−抗体相互作用を特徴づける解離定数（たとえばＫ_ＤまたはＫｄ）として記載される。抗体の抗原に対する親和性が高いほど、Ｋｄは低い。

本明細書では、「結合活性」という用語は、抗体とその標的抗原の間の全体的な結合強度を記述する特徴であり、複数部位でのそれらの相互作用を考慮に入れている。一部の例では、抗体とその標的抗原の間の全体的な結合強度は個々の結合親和性の和よりも大きい。説明すると、単一の抗原と同時に相互作用する複数の抗原結合部位を有する抗体にとっては、それ自体の個別の結合相互作用は容易に壊れ得る。しかし、抗体とその標的抗原が複数部位で結合していれば、そのような抗体の標的抗原への結合は、抗体上の単一の結合部位がそれに対応する標的抗原上の抗原決定基から一時的に分離した際に、他の結合相互作用の存在により強化されるので、全体的効果は相乗的である。

本明細書では、「アミロイドβ抗原」は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、架橋オリゴマーの凝集体および原繊維から選択される形態である。アミロイドβ抗原は、全長アミロイドβタンパク質またはその一部分を含み得、前記一部分は、目的の自己抗体を捕捉または検出するために選択された抗原決定基を含む。Ａβオリゴマーの組成は様々であり得、Ａβタンパク質のＮ末端配列、Ｃ末端配列またはあらゆる部分に対応し得る。一部の実施形態では、アミロイドβ抗原は、天然のＡβ原繊維型の露出したＮ末端の６残基内のエピトープを含む。Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：４５２−４５５を参照されたい。他の実施形態では、アミロイドβ抗原は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、架橋オリゴマーの凝集体および原繊維から選択されるアミロイドβ−４０ペプチド（アミノ酸１−４０）の形態である。他の実施形態では、アミロイドβ抗原は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、架橋オリゴマーの凝集体および原繊維から選択されるアミロイドβ−４２ペプチド（アミノ酸１−４２）の形態である。

可溶性タンパク質およびペプチドの不溶性アミロイド原繊維への形質転換は、アミロイド形成中間体の形成；プロトフィラメント／プロト原繊維をもたらす、βシート間の相互作用を通じてのこれらの成分の自己会合と安定化；および最後に、成熟原繊維を形成するための成分の相互作用を含む一連の立体的改変を反映している。Ｓｅｒｐｅｌｌ（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５０２：１５−３０；Ｄｏｂｓｏｎ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４：４−１４；Ｍａｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：３１５−３２０を参照されたい。したがって、選択されたアミロイドβ抗原は、たとえばアミロイド形成中間体、プロトフィラメントまたはプロ原繊維などの前述のいずれかの移行状態を取り得ることが企図される。一部の実施形態では、アミロイドβ抗原は、原繊維ならびに部分的にアンフォールドされたアミロイド形成中間体および天然前駆体タンパク質上に露出された配列特異性直線状エピトープ（複数可）を含む。他の実施形態では、アミロイドβ抗原は、原繊維および会合中間体上に存在するネオエピトープ（たとえば、タンパク質のアンフォールドの結果として露出される、天然分子に埋め込まれた抗原性領域）を含む。さらに他の実施形態では、アミロイドβ抗原は、一次構造に関わらず全原繊維に共通の一般的な立体エピトープ（複数可）を含む。Ｈｒｎｃｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １５７：１２３９−１２４６；Ｏ'Ｎｕａｌｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１４８５−１４９０を参照されたい。別の例示的アミロイドβ抗原は、アミロイドβ−４０ペプチド、軽鎖（ＬＣ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）およびこれらのアミロイド形成ペプチドの天然の非原繊維状態には存在しない島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）に共通の立体エピトープ（複数可）を含む。

本明細書では、「チューブリン抗原」は、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよび凝集体から選択される形態である。チューブリン抗原は、全長チューブリンタンパク質またはその一部分を含み得、前記一部分は、目的の自己抗体を捕捉または検出するために選択された抗原決定基を含む。チューブリン抗原は、サブタイプα、サブタイプβ、サブタイプγ、サブタイプδまたはサブタイプεの１または複数のチューブリンポリペプチドを含み得る。チューブリン抗原の組成は様々であり得、チューブリンタンパク質のＮ末端配列、Ｃ末端配列またはあらゆる部分に対応し得る。これらまたは他のいずれのチューブリンタンパク質でも本明細書に提供される方法に使用され得る。好ましい実施形態では、チューブリン抗原は、自己抗体がアッセイされる種と同じ種に由来する。

本明細書では、「サイログロブリン抗原」は、全長サイログロブリンタンパク質またはその一部分を含み得、前記一部分は、目的の自己抗体を捕捉または検出するために選択された抗原決定基を含む。サイログロブリン抗原の組成は様々であり得、サイログロブリンタンパク質のＮ末端配列、Ｃ末端配列またはあらゆる部分に対応し得る。これらまたは他のいずれのサイログロブリンタンパク質でも本明細書に提供される方法に使用され得る。好ましい実施形態では、サイログロブリン抗原は、自己抗体がアッセイされる種と同じ種に由来する。

本明細書では、「ＤＮＡ抗原」は、単鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡから選択される形態である。ＤＮＡ抗原は様々な組成であり得、どのような長さでもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡ抗原は、自己抗体がアッセイされる種と同じ種に由来する。

本発明のコンテクストでは、「標的抗原」は、目的の自己抗体を検出するために選択された抗原である。標的抗原は、モノマー、ダイマー、オリゴマー、ポリマーおよび凝集体から選択される形態であり得る。好ましい実施形態では、標的抗原は、自己抗体がアッセイされる種と同じ種に由来する。選択された実施形態では、標的抗原もアッセイされる自己抗体もヒトである。

「低伝導率」という用語は、本明細書では、０ｍＳ／ｃｍから１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍおよび約１２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導率を指す。本明細書に記載される方法に有用な低伝導率緩衝液または条件は、低張性、等張性または高張性製剤から選択され得る。

「低張性」という用語は、血液の張性よりも実質的に低い張性の製剤を記述する。張性はたとえば蒸気圧または製氷タイプの浸透圧計を用いて測定できる。

低張性製剤から選択される本発明の低伝導率緩衝液または条件は、一般に、約１ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満の範囲の重量モル浸透圧濃度を有する。一部の実施形態では、本発明の低伝導率緩衝液または条件は、約１０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約３０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約４０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約５０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約６０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約７０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約８０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約９０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１００ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１１０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１２０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１３０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１４０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１５０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１６０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１７０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１８０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約１９０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２００ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２１０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２２０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２３０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満、約２４０ｍＯｓｍから約２５０ｍＯｓｍ未満からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度により特徴づけられる。

一部の実施形態では、低張性製剤から選択される低伝導率緩衝液または条件は、約１〜１００ｍＯｓｍ、約１〜７５ｍＯｓｍ、約１〜５０ｍＯｓｍおよび約１〜２５ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。他の実施形態では、低伝導率緩衝液または条件は、約２５〜２５０ｍＯｓｍ、約５０〜２２５ｍＯｓｍ、約７５〜２００ｍＯｓｍ、約１００〜１７５ｍＯｓｍ、約１２５〜１５０ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。

「等張性」という用語は、血液の張性に近似の張性の製剤を記述する。一部の実施形態では、等張性製剤から選択される低伝導率緩衝液または条件は、約２５０ｍＯｓｍから３５０ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。一部の実施形態では、等張性製剤から選択される低伝導率緩衝液または条件は、約２５０ｍＯｓｍから約３２５ｍＯｓｍ、約２５０ｍＯｓｍから約３００ｍＯｓｍ、約２５０ｍＯｓｍから約２７５ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。他の実施形態では、等張性製剤から選択される低伝導率緩衝液または条件は、約２７５ｍＯｓｍから約３５０ｍＯｓｍ、約３００ｍＯｓｍから約３５０ｍＯｓｍ、約３２５ｍＯｓｍから約３５０ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。さらに他の実施形態では、等張性製剤から選択される低伝導率緩衝液または条件は、約２７５ｍＯｓｍから約３２５ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度を有する。

「高張性」という用語は、血液の張性よりも実質的に高い張性の製剤を記述する。一部の実施形態では、本発明の低伝導率緩衝液または条件は、３５０ｍＯｓｍ超から約２０００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１９５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１９００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１８５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１８００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１７５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１７００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１６５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１６００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１５５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１５００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１４５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１４００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１３５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１３００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１２５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１２００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１１５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１１００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１０５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約１０００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約９５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約９００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約８５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約８００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約７５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約７００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約６５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約６２５ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約６００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約５５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約５００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約４５０ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ超から約４００ｍＯｓｍの範囲からそれぞれ独立して選択される重量モル浸透圧濃度により特徴づけられる。

本明細書では交換可能に使用される「個体」「対象」および「患者」という用語は、限定ではなくマウス、サル、ヒト、家畜哺乳動物、スポーツ用哺乳動物およびペット用哺乳動物を含む哺乳動物を指す。好ましい実施形態では、個体はヒトである。

本明細書では「試料」という用語は、インビトロでの評価目的で得られた生物学的試料を指す。本発明の方法では、試料は、同じ種の１または複数の個体から採取された生物学的流体に由来する。好ましい実施形態では、生物学的流体はヒト由来である。生物学的流体は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、滑液、尿または唾液を含む。好ましい実施形態では、生物学的流体は、全血、血清、血漿およびそれらの画分または加工誘導体から選択される（たとえば、血液、血漿、貯留血液または貯留血漿から単離したＩＶＩＧなどのＩｇＧ溶液）。

「用量（ｄｏｓｅおよびｄｏｓａｇｅ）」は本明細書では交換可能に使用される。用量は、各投与につき個体に与えられる活性成分の量を指す。用量は、投与頻度；個体のサイズと忍容性；病状の重症度；副作用リスク；および投与経路を含む多くの要因により変わる。当業者であれば、用量は上記の要因により、または治療の進行により変更され得ることを認識しよう。「剤形」という用語は、医薬の特定の様式を指し、投与経路による。たとえば、剤形は液体であり、たとえば注射用の生理食塩水溶液である。

「治療上有効な」量または用量、または「十分な／有効（効果的）な」量または用量は、その投与量に対し効果を生じる用量である。厳密な用量は治療目的によるので、当業者が既知の技法を用いて確定し得る（たとえば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。

「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「寛解」という用語は、症状の重症度またはアミロイド凝集のあらゆる低減または認知機能の向上を指す。本明細書では、「治療する（ｔｒｅａｔ）」と「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」という用語は、絶対的な用語として意図しない。治療は、発症のあらゆる遅延、症状の寛解、患者生存の改善、生存時間または生存率の改善などを指し得る。治療効果は、治療を受けていない個体または個体集団と比較され得る。

「対照」試料または値は、試験試料と比較するための参照となる試料、通常は既知の参照を指す。たとえば、試験試料は、既知のＩｇＧ濃度の参照試料であり得る。対照は、類似の医療背景をもつかまたは年齢や体重などが同じの、類似の個体集団、たとえば、アルツハイマー病患者、パーキンソン病患者、クロイツフェルト・ヤコブ病患者の集団から集めた平均値を表すこともある。対照値は、同じ個体から得る場合もあり、たとえば症状以前に得られた試料、または以前のもしくは異なる治療時点の試料である。場合によっては、対照は、個体内または個体間での比較、たとえば抗アミロイド抗体の力価と１または複数の既知の抗体の力価の比較を含み得る。

当業者であれば、所与の状況ではどの対照が有益か理解し、対照値との比較に基づきデータを分析できよう。対照は、データの有意さを決定するのにも有用である。たとえば、所与のパラメータの値が対照において大きく異なる場合、試験試料におけるばらつきは有意とはみなされない。

本発明の系と方法は、単一測定検出アッセイならびに多重アッセイに適用され得ることが企図される。本明細書では、「多重アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｓｓａｙ）」という用語は、米国特許第５，７６３，１５８号または同第５，９８１，１８０号に記載されるような、同時に異なる測定が実施可能なアッセイを指す。「異なる測定」とは、複数の別個の分析物の検出、または複数の別個のビーズサブセットによる単一分析物の検出、またはそれらの組合せを意味すると理解される。このコンテクストで、「同時に」とは、複数の分析物が検出されるか、または異なるビーズセットにより単一分析物が検出されるか、または測定の組合せが、同一のアッセイで同時に実行されることを意味すると理解される。典型的には、多重アッセイは、複数のセットの粒子（たとえばプールされた粒子サブセット）を含む単一管で実施され、単一の多重アッセイから複数の読み取り情報が得られよう。

本発明の詳細な説明の前に、記載される特定の実施形態は当然ながら変更され得るので本発明はそれらに制限されるものではないことを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定的ではないことも理解すべきである。

ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の各値およびあらゆる他の記載範囲またはその記載範囲の間の値は、特に断りがないかぎり下限値の小数第１位まで本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値と下限値は、それぞれ独立してその範囲に含まれ得、また、記載の範囲において具体的に除外されたあらゆる端点を除き本発明に包含される。記載された範囲が端点の片方または両方を含む場合、それらの包含される端点の片方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、別途定義しない限り、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法や材料に類似または同等のあらゆる方法や材料も本発明の実施または試験において使用され得るが、代表的な方法と材料を以下に記載する。

本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、各刊行物および特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれると明示されるかのように参照により本明細書に組み込まれ、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示し記載するために参照により本明細書に組み込まれる。刊行物の引用はすべて出願日前の開示のためであり、本発明が先行発明のせいでそのような刊行物に先行しないという容認として解釈すべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、個別に確認の必要があるかもしれないが実際の発行日とは異なり得る。

本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形の指示物を包含することに注意されたい。さらに、特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を排除して作成され得ることに注意されたい。したがって、本記述は、特許請求の範囲に記載の要素に関連する「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」「だけ（ｏｎｌｙ）」などの排他的な用語の使用または「否定的（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用の先行詞となることが意図される。

本明細書を読めば当業者には明らかであろうが、本明細書に記載され例示されている各実施形態は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれの特徴からも容易に分離されるかまたは一緒にされ得る別個の構成要素と特徴を有する。記載される方法はいずれも、記載した順に、または論理的に可能な任意の他の順で実行され得る。

ＩＩ．詳細な説明
本発明は、さまざまな生物学的試料における、たとえば多反応性その他の非親和性成熟自己抗体のアッセイでの使用に適している。本発明が企図する生物学的試料には、血液、血清、血漿、尿、唾液、滑液および脳脊髄液から選択される任意の流体が含まれる。好ましくは、生物学的試料は、全血、血清、血漿、血液または血漿から単離されたＩｇＧ組成物（たとえば静脈内ＩｇＧ）またはその画分もしくは加工誘導体から選択される。

生物学的試料は、さまざまな手段で得られ得る。一部の実施形態では、生物学的試料が収集されるかまたは生検が行われ、収集された生物学的試料がインビトロで試験される。ある実施形態では、試料中に存在するイムノグロブリンが検出前に濃縮される。他の実施形態では、イムノグロブリンは検出前にそれ以上濃縮されない。試料は、抗体含有画分を単離するためにたとえば血漿や細胞物質にさらに分離され得るが、このステップは必要ではない。試料は、サイズ濾過および／またはクロマトグラフィー法に供してもよい。一部の実施形態では、試料から非イムノグロブリンタンパク質を除去するために、試料はチオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）クロマトグラフィーに供される。

本発明の一部の実施形態では、生物学的試料は、少なくとも１／２０の希釈液、少なくとも１／１０００の希釈液、または少なくとも１／５００，０００の希釈液に希釈される。

上述のように、本発明の方法は、（ａ）非親和性成熟自己抗体が特異的結合親和性を有する標的抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップと、（ｂ）生物学的試料中の前記標的抗原の前記自己抗体との結合を検出するステップを含む。標的抗原は、接触させるステップ（ａ）の前に固相に固定化されている。一部の実施形態では、検出された非親和性成熟自己抗体は多反応性である。したがって、結合の検出は、生物学的試料中の非親和性成熟自己抗体を示している。

一部の実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、標的抗原に対する標的抗原特異性非親和性成熟自己抗体に結合する種特異的抗体に、対応する存在する標的抗原特異性自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応する標的抗原特異性自己抗体に結合された標的抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出された標的抗原特異性非親和性成熟自己抗体は多反応性である。種は、あらゆる哺乳動物種、たとえば類人猿種、たとえばヒトやチンパンジー；マウス、たとえばラットやマウス；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマなどから選択される。好ましい実施形態では、種はヒトである。

一部の実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、アミロイドβ抗原に対するアミロイドβ特異性非親和性成熟自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応するアミロイドβ特異性自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応するアミロイドβ特異性自己抗体に結合されたアミロイドβ抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出されたアミロイドβ特異性非親和性成熟自己抗体は多反応性である。種は、あらゆる哺乳動物種、たとえば類人猿種、たとえばヒトやチンパンジー；マウス、たとえばラットやマウス；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマなどから選択される。好ましい実施形態では、種はヒトである。

他の実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、ＤＮＡ抗原に対するＤＮＡ特異性非親和性成熟自己抗体に結合する種特異的抗体に、種特異的抗体が存在する対応するＤＮＡ特異性自己抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応するＤＮＡ特異性自己抗体に結合されたＤＮＡ抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出されたＤＮＡ特異性非親和性成熟自己抗体は多反応性である。種は、あらゆる哺乳動物種、たとえば類人猿種、たとえばヒトやチンパンジー；マウス、たとえばラットやマウス；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマなどから選択される。好ましい実施形態では、種はヒトである。

さらにいくつかの実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、チューブリン抗原に対するチューブリン特異性非親和性成熟自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応するチューブリン特異性自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応するチューブリン特異性自己抗体に結合されたチューブリン抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出された自己抗体は多反応性である。種は、あらゆる哺乳動物種、たとえば類人猿種、たとえばヒトやチンパンジー；マウス、たとえばラットやマウス；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマなどから選択される。好ましい実施形態では、種はヒトである。

さらなる実施形態では、検出ステップ（ｂ）は、（ｉ）生物学的試料を採取した種に特異的であり、サイログロブリン抗原に対するサイログロブリン特異性非親和性成熟自己抗体に結合する種特異的抗体に、存在する対応するサイログロブリン特異性自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること、（ｉｉ）種特異的抗体に結合されている対応するサイログロブリン特異性自己抗体に結合されたサイログロブリン抗原を含むすべての複合体を検出すること、を含む。一部の実施形態では、検出された自己抗体は多反応性である。種は、あらゆる哺乳動物種、たとえば類人猿種、たとえばヒトやチンパンジー；マウス、たとえばラットやマウス；イヌ；ネコ；ウシ；ヒツジ；ウマなどから選択される。好ましい実施形態では、種はヒトである。

一部の実施形態では、血液試料またはその画分中に存在する、標的抗原に対し親和性を有する非親和性成熟自己抗体を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）試料を最終イムノグロブリン濃度１００μｇ／ｍＬ以下まで希釈するステップ、（ｂ）希釈した血液または血清試料を第１低伝導率溶液条件下で標的抗原と接触させて、自己抗体と標的抗原を含む複合体を形成するステップ、および（ｃ）複合体を検出するステップを含み、ここで第１低伝導率溶液条件は１１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある実施形態では、第１低伝導率溶液条件は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、９ｍＳ／ｃｍ未満、８ｍＳ／ｃｍ未満、７ｍＳ／ｃｍ未満、６ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、方法は、（ｄ）ステップ（ｂ）で形成された複合体を１１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する第１洗浄緩衝液で洗浄するステップを含む。一部の実施形態では、第１洗浄緩衝液は、１１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。ある実施形態では、第１低伝導率溶液条件は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、９ｍＳ／ｃｍ未満、８ｍＳ／ｃｍ未満、７ｍＳ／ｃｍ未満、６ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、複合体を検出するステップは、（ｉ）１１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する第２低伝導率溶液条件下で、自己抗体と標的抗原を含む複合体を、抗ヒトイムノグロブリン抗体と接触させて三元複合体を形成するサブステップ、（ｉｉ）サブステップ（ｉ）で形成された三元複合体を、１１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する第２洗浄緩衝液を用いて洗浄するサブステップ、および（ｉｉｉ）抗ヒトイムノグロブリン抗体の存在を検出するサブステップを含む。一部の実施形態では、第２低伝導率溶液条件は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、９ｍＳ／ｃｍ未満、８ｍＳ／ｃｍ未満、７ｍＳ／ｃｍ未満、６ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。一部の実施形態では、第２洗浄緩衝液は、１０ｍＳ／ｃｍ未満、９ｍＳ／ｃｍ未満、８ｍＳ／ｃｍ未満、７ｍＳ／ｃｍ未満、６ｍＳ／ｃｍ未満、５ｍＳ／ｃｍ未満、４ｍＳ／ｃｍ未満、３ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満または１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。一部の実施形態では、抗ヒトイムノグロブリン抗体の存在を検出することは、抗ヒトイムノグロブリン抗体の相対的濃度を決定することを含む。

種特異的抗体が検出可能部分に結合される上記の実施形態では、検出ステップ（ｉｉ）は検出可能部分を指示試薬に接触させることを含む。

他の実施形態では、方法は、ステップ（ｂ）の前に固相を低伝導率緩衝液で洗浄することをさらに含む。

当業者であれば、１または複数の次の目的のあらゆる組合せに同じかまたは異なる組成物の低伝導率緩衝液が使用され得ることを理解しよう：標的抗原を固定化した後プレートを洗浄すること；生物学的試料を希釈すること；プレートをブロックすること；形成された複合体（複数可）を洗浄すること；複合体を二次イムノグロブリンと接触させること；形成された三元複合体（複数可）を洗浄すること。

低伝導率ブロッキング緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍおよび約１２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率により特徴づけられ得る。

他の実施形態では、低伝導率ブロッキング緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１１ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１０ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約９ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約８ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約７ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約６ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約５ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約４ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約３ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１ｍＳ／ｃｍ未満の範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率ブロッキング緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍから約１２ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１１ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約９ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約８ｍＳ／ｃｍおよび約６ｍＳ／ｃｍから約７ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率ブロッキング緩衝液は、約１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１１ｍＳ／ｃｍ未満、約９ｍＳ／ｃｍ未満、約７ｍＳ／ｃｍ未満、約５ｍＳ／ｃｍ未満、約３ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率条件は、０ｍＳ／ｃｍ超から１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍおよび約１２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。

他の実施形態では、低伝導率条件は、０ｍＳ／ｃｍ超から１２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１１ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１０ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約９ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約８ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約７ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約６ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約５ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約４ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約３ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１ｍＳ／ｃｍ未満の範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率条件は、約１ｍＳ／ｃｍから約１２ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１１ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約９ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約８ｍＳ／ｃｍおよび約６ｍＳ／ｃｍから約７ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率条件は、約１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１１ｍＳ／ｃｍ未満、約９ｍＳ／ｃｍ未満、約７ｍＳ／ｃｍ未満、約５ｍＳ／ｃｍ未満、約３ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率条件は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、１２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、６０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率洗浄緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、および約１２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。

他の実施形態では、低伝導率洗浄緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１１ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１０ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約９ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約８ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約７ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約６ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約５ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約４ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約３ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１ｍＳ／ｃｍ未満の範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率洗浄緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍから約１２ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１１ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約９ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約８ｍＳ／ｃｍおよび約６ｍＳ／ｃｍから約７ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率洗浄緩衝液は、約１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１１ｍＳ／ｃｍ未満、約９ｍＳ／ｃｍ未満、約７ｍＳ／ｃｍ未満、約５ｍＳ／ｃｍ未満、約３ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率洗浄緩衝液は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、１２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、６０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率希釈緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約６ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍ、および約１２ｍＳ／ｃｍから約１３ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。

他の実施形態では、低伝導率希釈緩衝液は、０ｍＳ／ｃｍ超から１２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１１ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１０ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約９ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約８ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約７ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約６ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約５ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約４ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約３ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約２ｍＳ／ｃｍ未満、０ｍＳ／ｃｍ超から約１ｍＳ／ｃｍ未満の範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率希釈緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍから約１２ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍから約１１ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍから約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍから約９ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍから約８ｍＳ／ｃｍおよび約６ｍＳ／ｃｍから約７ｍＳ／ｃｍの範囲から選択される伝導率を有する。さらに他の実施形態では、低伝導率希釈緩衝液は、約１３ｍＳ／ｃｍ未満、約１１ｍＳ／ｃｍ未満、約９ｍＳ／ｃｍ未満、約７ｍＳ／ｃｍ未満、約５ｍＳ／ｃｍ未満、約３ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率を有する。

一部の実施形態では、低伝導率希釈緩衝液は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、１２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、６０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い、または２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する。

本発明の方法と系で使用される低伝導率緩衝液は、ＶＷＲ、 Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈなどのいずれの市販業者から購入してもよいし、当業者が作製してもよい。一部の実施形態では、低伝導率溶液は生理学的ｐＨになるまで緩衝液を加えられる。他の実施形態では、適切な低伝導率緩衝液は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３−Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３およびそれらの混合物から選択される１または複数の生理学的塩を含む。他の実施形態では、低伝導率緩衝液は、当技術分野で既知の１または複数の非生理学的塩を含む。当業者であれば、本明細書に記載の方法および系に有用な低伝導率緩衝液がＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＥＳ、ＭＥＳ、ビシン、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＴＲＩＳ塩基、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、他の有機アミン緩衝液またはそれらの様々な組合せから選択され得ることを理解しよう。

本発明で有用な例示的低伝導率緩衝液は、一部の実施形態では様々な濃度のＨＥＰＥＳを含み、他の実施形態では様々な濃度のＨＥＰＥＳおよびＴｗｅｅｎ２０を含み、さらに他の実施形態では様々な濃度のＨＥＰＥＳ、Ｔｗｅｅｎ２０およびＣａＣｌ_２を含み、またはさらに他の実施形態では様々な濃度のＨＥＰＥＳおよびＴｗｅｅｎ２０、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ_２を含む。一部の実施形態では、低伝導率緩衝液は、以下のいずれかから選択される製剤を有する：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと２０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと４０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと６０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと８０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと１００ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと１２０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと１５０ｍＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳと２ｍＭのＣａＣｌ_２、０．１％のＴｗｅｅｎ２０；２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０。

他の例示的低伝導率緩衝液は、８０ｍＭのＮａＣｌ、１．８ｍＭのＫＣｌ、１．３３ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４および５．３３ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４．±．０．１の緩衝液；６０ｍＭのＮａＣｌ、１．３５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４および３．９９ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４．±．０．１の緩衝液；７０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３、４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４および２．６ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４．±．０．１の緩衝液；および６５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４および４ｍＭのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．４．±．０．１緩衝液を含む。さらに他の実施形態では、低伝導率緩衝液は非生理学的塩を実質的に含まない。

低伝導率洗浄緩衝液溶液は、上記の緩衝液のいずれかから選択され得る。さらに、本開示の案内により、当業者であれば非結合抗体を除去し、非特異的部位に弱く結合した抗体を洗い流す目的に有用な、低伝導率緩衝液を選択または生成することができる。例示的洗浄緩衝液は、トリス緩衝生理食塩水または蒸留水に希釈された少量の界面活性剤を含み得る。他の実施形態では、洗浄緩衝液は界面活性剤を含まない。

当業者であれば、本発明が多くの一般的な固相検出方法に適用され得ることを理解しよう。これらには、限定ではなく、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）、化学物質免疫吸着アッセイ（ＣＬＩＡ）、および免疫ブロットが含まれる。使用され得る様々な免疫測定の概説は、Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたく、その全容が本明細書にあらゆる目的で明示的に組み込まれる。

当業者であれば理解しようが、当技術分野で既知のあらゆる検出方法が本発明に関して使用され得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ビーズ、プレート、スライドまたはマイクロタイターディッシュなどの固体支持体または表面に固定化される。試料のアリコートが固体支持体に加えられ、液相中で標的抗原とともにインキュベートされる。次に、測定されている自己抗体の定常領域を認識するのに選択されたイムノグロブリン（本明細書では二次抗体ともいう）が加えられる。好ましい実施形態では、二次抗体はＩｇＧアイソタイプにより特徴づけられる。あるいは、二次抗体は、測定されている自己抗体のどこかの定常領域に対し高い親和性を有することで特徴づけられる。固体支持体を液相から分離した後、支持相の検出可能信号を調べる。固体支持体上の信号の存在は、支持体上の標的抗原に対する自己抗体がその標的に結合していることを示す。

信号生成系は、１または複数の成分からできており、少なくともそのうちの１つが標識であり、結合した標識の量に関して検出可能な信号を生じる。標識は、信号を生成するかまたは信号を生成するように誘導され得る分子である。そのような使用に適した検出可能な標識は、分光法、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能なあらゆる組成物を含む。適した標識の例としては、蛍光剤、酵素、化学発光剤、感光剤または懸濁粒子が含まれる。信号は検出され、酵素活性、発光または光吸収の検出により測定され得る。

本発明に有用な標識には、磁性ビーズ（たとえばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびその他ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるもの）および比色標識、たとえばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（たとえばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス）ビーズが含まれる。使用可能な技術の概説は、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に見出され、その全容が本明細書にあらゆる目的で明示的に組み込まれる。

放射標識も使用され得、シンチレーションカウンターを用いて放射活性レベルが検出され測定され得るが、安全性と環境的問題により、好ましくない。もっとも一般的に使用される生産系は、酵素媒介色素生産またはフルオロフォア媒介蛍光機構を使用する。色素生産性レポーターにより、結合した酵素標識はすべて基質と反応して、光学顕微鏡で分析され得る着色生成物を生じる。使用され得る追加の酵素標識の例には、限定ではなく、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤＨ」）およびグルコースオキシダーゼが含まれる。

蛍光レポート系では、フルオロフォアはプローブまたは二次抗体に結合し、色素生産性検出系のように酵素を活性する基質を必要としない。さらに、蛍光レポート系は特に多重アッセイで有用である。使用され得る蛍光剤標識の例には、限定ではなく、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンが含まれる。化学発光剤は、たとえばイソルミノールを含む。

反応内に存在する色、蛍光、発光または放射活性の量または強度（使用される信号産生系による）は、試料中の自己抗体濃度と相関するはずである。分光光度法を用いて光学密度の定量化が実施され得る。放射標識信号の定量化は、シンチレーションカウントを用いて実施され得る。酵素標識が使用されているところでは、酵素活性は、酵素と基質濃度、緩衝液、ｐＨ、温度およびおそらくは光を含むいくつかの変数に依存する。使用され得る酵素−基質系が当技術分野で記載されており、限定ではなく、ＤＡＢ−ＨＲＰ；金属増強ＤＡＢ−ＨＲＰ；ＢＣＩＰ−ＡＰ；ＮＢＴ−ＡＰおよびグルコースオキシダーゼ；１ステップＮＢＴ−ＢＣＩＰおよびＡＰなどを含み得る。

酵素は、本発明で使用されるように当業者に既知の方法を用いて標的の抗原に反応性のある抗体に共有結合され得る。たとえば、アルカリホスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼが、グルタルアルデヒドを用いて抗体に結合され得る。西洋わさびペルオキシダーゼは、過ヨウ素酸法を用いて結合してもよい。市販の酵素結合抗体キットが広く入手可能である。酵素が結合された抗ヒトおよび抗マウスイムノグロブリン特異性抗体が複数の市販供給源から入手可能である。

あるいは、間接的な自己抗体の検出が、当業者には周知であるようなアビジン−ビオチン複合体法、標識化ストレプトアビジンビオチン法またはホスファターゼ−抗ホスファターゼ法を用いて達成され得る。

酵素標識抗体は、基質により、異なる信号源を生成する。信号生成は、反応混合物に基質を加えることを含む。一般的なペルオキシダーゼ基質は、３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ＡＢＴＳ（商標）２，２'−アジノビス（エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）およびＴＭＢ（３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン）を含む。パラニトロフェニルリン酸は一般的に使用されるアルカリホスファターゼ基質である。アルカリ性ホスファターゼ酵素標識が使用される場合、基質は塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）の併用として選択される。グルコースオキシダーゼ酵素標識が使用される場合、基質は塩化ニトロブルーテトラゾリウムが選択される。β−ガラクトシダーゼ酵素標識が使用される場合、基質は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧまたはＸ−Ｇａｌ）が選択される。インキュベーション期間中、酵素は徐々に基質の一部分をその最終生成物に変換する。インキュベーション期間が終わると、酵素活性を止める停止試薬が添加され得る。信号強度は、通常は分光光度計で光学密度を測定して決定される。

アルカリホスファターゼで標識された抗体は蛍光光度分析で測定され得る。したがって、本発明の免疫検出法では、基質４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＵＭＰ）が使用され得る。アルカリホスファターゼで脱リン酸化された４−ＵＭＰが４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）つまりフルオロフォアを形成する。入射光は３６５ｎｍ、放射光は４４８ｎｍである。

アッセイ全体を通じて、インキュベーションおよび／または洗浄ステップは、試薬を組み合わせるたびに必要であり得る。インキュベーションステップは、約５秒から数時間まで、たとえば約５分から約２４時間まで変動し得る。しかし、インキュベーション時間はアッセイの様式、抗体、溶液の体積、濃度などにより得る。アッセイは様々な温度で実施され得るが、通常は１０℃から４０℃などの周囲温度で実施される。

一部の実施形態では、少なくとも１つの対照を試料と並行して試験し、抗体量および／または結合レベルを比較する。他の実施形態では、アッセイの結果は、目的の系で以前に構築された対照レベルと比較され得る。たとえば、陽性対照は、アミロイド関連の疾患を有することがわかっている個体または個体群から得られたのと同じ生物学的試料を含み得る。適切な陽性対照の別の例は、比較用の既知の抗アミロイドモノクローナル抗体である。例示的陰性対照は、アミロイド関連の疾患を発症するリスクが低い個体または個体群から得られたのと同じ生物学的試料を含み得る。適切な陰性対照の別の例は、非アミロイド抗原に特異的な既知の抗体である。

そのような方法を用い、抗アミロイド抗体の比較的高いレベルを、対象がアミロイド関連の自己免疫性疾患を有するか発症する高リスクを有する高い可能性と相関させて、当業者は対象におけるアミロイド関連の自己免疫疾患を診断できる。

上述の方法は、アミロイド関連の疾患治療の患者を選択するのに利用できる。たとえば、抗アミロイド抗体のレベルが複数の個体において決定できる。上述したように、比較的高レベルの抗アミロイド抗体を有することが決定された個体は、治療対象として選択され得る。一部の実施形態では、抗アミロイド抗体のレベルは治療コースにおいて定期的に検出される。一部の実施形態では、治療はＩＶＩＧ投与を含む。

アルツハイマー病および他のアミロイド関連の疾患
アミロイドタンパク質および異常タンパク質凝集体は多くの疾患や病状において役割を果たしている。本発明の方法は、様々なタイプのアミロイド抗原またはポリペプチド凝集体に対する特定の非親和性成熟多反応性自己抗体の検出を可能にする。特定の非親和性成熟抗アミロイド自己抗体の検出は、当業者が治療またはアミロイドタンパク質が疾患マーカーとして作用するあらゆる疾患の治療コースの決定を行うのを容易にすることが企図される。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、抗アミロイド自己抗体を検出し、その後診断を行うことを含む。本発明の方法は、抗アミロイド自己抗体を検出し、その後診断を行うことを含み得、さらに、アルツハイマー病または他のアミロイド関連の自己免疫性疾患を緩和する治療コースを決定するステップを含む。本明細書に記載される本発明の一部の実施形態では、目的の自己抗体を検出し、その後治療上有効量のＩＶＩＧを、それを必要とする患者に投与することが含まれ得ることがさらに企図される。

アミロイド関連疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）だけではなく、２型糖尿病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、ハンチントン病、甲状腺髄様癌、心不整脈、アテローム硬化症、リューマチ性関節炎、大動脈内側アミロイド、プロラクチノーマ、家族性アミロイドポリニューロパチー、遺伝的非神経障害性全身性アミロイド症、透析関連アミロイド症、フィンランド型アミロイド症、格子状角膜ジストロフィー、脳アミロイド血管症、脳アミロイド血管症（アイスランド型）および全身性ＡＬアミロイド症も含む。一部の実施形態では、標的抗原と相関のある疾患または病状は、アルツハイマー病である。

したがって、本発明は、特定の型のアミロイド抗原およびアミロイド関連の疾患において見出されるアミロイド凝集体に対する自己抗体を検出および／または捕捉するのに使用され得る。さらに、本明細書で開示の方法は、βアミロイド（Ａβ；Ａベータ）、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ；アミリン）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、主プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ハンチンチン（ＨＤ）、カルシトニン（ＣＣＰ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、アポリポタンパク質ＡＩ（アポ−Ａ１）、血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ）、メジン（Ｍｅｄｉｎ）アミロイド（乳脂肪球ＥＧＦ因子８タンパク質の断片；ＭＦＧ−Ｅ８）、プロラクチン（ＰＲＬ）、トランスサイレチン（ＡＴＴＲ）、リゾチームＣ（１、４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼＣ）、β２マイクログロブリン（β２Ｍ）、ゲルゾリン（ＡＧＥＬ）、形質転換増殖因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（βｉｇ−ｈ３；ケラトエピセリン）、シスタチンＣ（ＣＳＴ３）、イムノグロブリン軽鎖（ＡＬ）、ポリＱリピートを有するタンパク質、タウタンパク質（Ｔａｕ）および他のアミロイドタンパク質から形成された異常タンパク質凝集体に対する抗体を検出するのに利用され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、当技術分野の任意のアミロイド形成タンパク質、たとえば以下の表に挙げられるようなものに対する自己抗体の検出に利用され得る。

アミロイド命名法：アミロイド原繊維タンパク質とヒトにおけるそれらの前駆体^*

^*Westermark et al., 2002を改変

様々なアミノ酸配列、由来または生物学的機能に関わらず、全タイプの原繊維は実質的に同一の染色および超微細構造特徴を有し、たとえば、ジアゾベンザジン（ｄｉａｚｏｂｅｎｚａｄｉｎｅ）スルホン酸色素コンゴレッドで染色され、偏光顕微鏡で調べられると、原繊維は特徴的な緑色の複屈折を示し（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｍｙｌｏｉｄ Ｊ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ Ｄｉｓｏｒｄ ９：１９７−２００を参照）、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）との相互作用は、このベンゾチアゾール化合物の励起スペクトルにおいて１２０ｎｍの赤色シフトをもたらす（ＬｅＶｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２：１−６を参照）。タンパク質組成に関わらず、全ての原繊維が一般的な立体エピトープを共通して有するという立証は、これらの分子間での構造的共通性の存在の根拠を提供する。本明細書に記載される方法が、適切な標的抗原（複数可）の選択を通じて、アミロイド原繊維または可溶性オリゴマー凝集体中間体上に発現した特異的に抗原決定基を識別する自己抗体の検出に使用され得ることが企図される。

本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、特定のアミロイドタンパク質の存在またはレベルの検出は、特定の疾患または病状の診断、または特定の疾患または病状の治療候補の選択に有用である。当技術分野で既知のアミロイド−疾患の相関の非限定的な例が表１に見られる。ある実施形態では、表１に挙げたアミロイドタンパク質に特異的な非親和性成熟抗体の存在またはレベルの検出は、列挙された対応する疾患の診断になる。

（表１）特定の疾患と関連付けられるアミロイドタンパク質の非限定例

ＡＤやパーキンソン病の場合は抗Ａβオリゴマーなどの特異的な自己抗体の検出が、診断またはリスクファクター評価に使用され得る。本発明の診断方法は、医師により判定され得るような、たとえば年齢、家族歴、認知的症状などに基づき、アミロイド関連の疾患を発症するリスクがあると考えられる個体に適用され得る。

アミロイド関連疾患のリスクファクターや症状は、熟練した医師によりもっともよく識別される。これらの疾患を発症するリスクは年齢と共に高まり、家族歴と相関する。多くの場合、絶対的かつ断定的診断は難しいと考えられている。ＡＤの観察可能な症状は、分裂的記憶喪失、問題解決能力の変化、時間や場所に関する混乱、日常的作業を完了するのが困難、引きこもりおよび気分の変化を含む。これらは、アミロイドプラーク形成の増加および脳体積の全体的な減少などの物理的な疾患の徴候と相関する。

アルツハイマー病ならびに他のアミロイド関連の疾患および障害の治療
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、疾患進行の予後の決定、または対象に治療コースを割り当てるかまたは治療を行うステップをさらに含む。一般に、治療コースは、生物学的試料における抗アミロイド抗体レベルが対照閾値を上回る場合（たとえば、疾患の高い可能性または進行を示す閾値）、または陰性対照（たとえば、疾患の進行を経験していない群または個体の対照レベル）と比べてより陽性対照（たとえば、疾患の進行を経験している群または個体の対照レベル）に近い場合に処方される。

ＡＤなどのアミロイド関連の疾患および症状の治療は、典型的には疾患の認知および気分の症状に焦点を当てる。初期の治療と予防措置は、肉体的および社交的活動、記憶ゲームおよびパズルや問題解決を含む。症候性個体の医薬治療は、コリンエステラーゼ阻害剤（アセチルコリン減少に対処する）、部分グルタミン酸アンタゴニスト（たとえば、メマンチン）および精神薬物（たとえば、抗精神薬、睡眠薬、抗不安薬およびベータブロッカー）を含む。コリンエステラーゼ阻害剤は、アリセプト（登録商標）（ドネペジル塩酸塩）、エクセロン（登録商標）（リバスチグミン）、ラザジン（登録商標）（ガランタミン）およびコグネックス（登録商標）（タクリン）を含む。

貯留イムノグロブリン調製物（たとえば、ＩＶＩＧ）がＡＤ症状を改善するのに効果的であり得ることも観察されている。たとえば、ＩＶＩＧの調製物（静脈内イムノグロブリン）は当技術分野で周知である。ＩｇＧを貯留血漿から単離する方法は、たとえば、米国特許出願公開第２０１０／０３３００７１号および同第２０１１／０２９３６３８号に見られる。簡単に説明すると、ＩＶＩＧは、１より多い個体（たとえば、１，０００を上回る個体）から採取された血液または血漿を貯留し、血漿画分を分離し、クロマトグラフィー、限外濾過およびダイアフィルトレーションの組合せを用いてＩｇＧイムノグロブリンを濃縮することで形成される。ＩＶＩＧは、典型的には静脈点滴で投与される。ＩＶＩＧを用いてＡＤ、パーキンソン病および他のタンパク質凝集性疾患を治療する方法が米国特許出願公開第２００９／０１４８４６３号および同第２００９／０２２１０１７号に開示されている。

ＡＤやパーキンソン病の場合はＡβオリゴマーに対するような特異的な自己抗体の検出が、診断またはリスクファクター評価に使用され得る。本発明の診断方法は、医師により判定され得るような、たとえば年齢、家族歴、認知的症状などに基づき、アミロイド関連の疾患を発症するリスクがあると考えられる個体に適用され得る。

アミロイド関連疾患のリスクファクターや症状は、熟練した医師によりもっともよく識別される。これらの疾患を発症するリスクは年齢と共に高まり、家族歴と相関する。多くの場合、絶対的かつ断定的診断は難しいと考えられている。ＡＤの観察可能な症状は、分裂的記憶喪失、問題解決能力の変化、時間や場所に関する混乱、日常的作業を完了するのが困難、引きこもりおよび気分の変化を含む。これらは、アミロイドプラーク形成の増加および脳体積の全体的な減少などの物理的な疾患の徴候と相関する。

本発明の他の実施形態では、検出法は、疾患進行に関連する予後を監視または生成するのに使用され、対照は疾患の進行を経験した個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似またはより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。一部の実施形態では、対照は、疾患の進行を経験しなかった個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似のレベルは疾患進行の可能性が低いことを示すことになる。さらに別の実施形態では、対照は同じ患者から初期に採取されたものであり、対照に対し残りの複合体のより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。ある実施形態では、以前の試料は、約ひと月前、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５か月前、または４、５、６、７、８、９、１０年以上前に採取されている場合がある。当業者であれば、少なくとも１つの適切な対照をいかに選択するか、および、それにしたがい結果をいかに解釈するかを理解する。

全身性狼瘡エリテマトーデスおよび他のＤＮＡ関連疾患および障害の治療
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、疾患進行の予後の決定、または対象に治療コースを割り当てるかまたは治療を行うステップをさらに含む。一般に、治療コースは、生物学的試料における抗ＤＮＡ抗体レベルが対照閾値を上回る場合（たとえば、疾患の高い可能性または進行を示す閾値）、または陰性対照（たとえば、疾患の進行を経験していない群または個体の対照レベル）と比べてより陽性対照（たとえば、疾患の進行を経験している群または個体の対照レベル）に近い場合に処方される。

全身性狼瘡エリテマトーデスなどのＤＮＡ関連疾患および病状の治療は当技術分野で既知である。症候性患者の医薬治療は、イブプロフェンおよびナプロキセンなどの非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ヒドロキシクロロキン（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標））などの抗マラリア薬、プレドニゾン（デルタゾン（商標））、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（メドロール（商標））およびデキサメタゾン（デカドロン（商標）、ヘキサドール（商標））などのコルチコステロイド、シクロホスファミド（シトキサン（商標））およびミコフェノール酸モフェチル（セルセプト（商標））などの免疫抑制剤、ベリムマブ（ベンリスタ（登録商標））などのＢＬｙＳ特異的阻害剤、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ、Ｍｅｘａｔｅ、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）、疾患のコントロールに使用され得る疾患の進行を遅らせる抗リウマチ薬物を含む。他の治療は、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）などのホルモン治療および静脈内イムノグロブリンを含み得、これは他の治療が症状に対処できない場合は特に、狼瘡のコントロールにも有用である。

全身性狼瘡エリテマトーデスの場合は抗ｄｓＤＮＡなどの特異的な自己抗体の検出が、診断またはリスクファクター評価に使用され得る。本発明の診断法は、医師により判定され得るような、たとえば遺伝学、対照閾値を上回る抗Ｓｍ、抗ＲＮＰ、抗Ｒｏ（ＳＳＡ）および抗Ｌａ（ＳＳＢ）自己抗体などの存在、エプスタイン・バーウイルスなどのウイルスなどの感染性因子への曝露、および日光、ストレス、ホルモン類、たばこ、煙または特定の薬物、症状などに基づき、全身性狼瘡エリテマトーデスを発症する危険があると考えられる個体に適用され得る。

ＤＮＡ関連の自己免疫疾患のリスクファクターや症状は、熟練した医師によりもっともよく識別される。多くの場合、絶対的かつ断定的診断は難しいと考えられている。全身性狼瘡エリテマトーデスの症状は、軽度から重度であり得、排他的ではなく、以下の１または複数を含み得る：痛みを伴うかまたは関節膨張（関節炎）、未解明の熱、極端な疲労、鼻と頬、顔、耳、上腕、肩、胸、手にかけて赤い発疹皮膚、光過敏、胸部痛、脱毛、貧血症、口内潰瘍、寒さとストレスによる青白いまたは紫色の指、頭痛、めまい、鬱、混乱または痙攣。本発明の他の実施形態では、検出法は、疾患進行に関連する予後を監視または生成するのに使用され、対照は疾患の進行を経験した個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似またはより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。一部の実施形態では、対照は、疾患の進行を経験しなかった個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似のレベルは疾患進行の可能性が低いことを示すことになる。さらに別の実施形態では、対照は同じ患者から初期に採取されたものであり、対照に対し残りの複合体のより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。ある実施形態では、以前の試料は、約ひと月前、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５か月前、または３、４、５、６、７、８、９、１０年以上前に採取されている場合がある。当業者であれば、少なくとも１つの適切な対照をいかに選択するか、および、それにしたがい結果をいかに解釈するかを理解する。

甲状腺炎および他のサイログロブリン関連またはチューブリン関連の疾患および障害の治療
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、疾患進行の予後の決定、または対象に治療コースを割り当てるかまたは治療を行うステップをさらに含む。一般に、治療コースは、生物学的試料における抗サイログロブリンまたは抗チューブリン自己抗体レベルが対照閾値を上回る場合（たとえば、疾患の高い可能性または進行を示す閾値）、または陰性対照（たとえば、疾患の進行を経験していない群または個体の対照レベル）と比べてより陽性対照（たとえば、疾患の進行を経験している群または個体の対照レベル）に近い場合に処方される。

甲状腺炎などのサイログロブリン関連の疾患および症状、たとえばグレーブス疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、甲状腺癌、甲状腺中毒症の治療が当技術分野では既知である。症候性の個体の医薬治療は、疾患のコントロールを補助するのに使用され得るレボチロキシン治療（レボトロイド（商標）、レボキシル（商標）、シントロイド（商標））などのホルモン補充療法、特別食および補充を含む。他の治療は、橋本甲状腺炎の患者における前臨床の甲状腺機能低下症の治療に効果を示している静脈内イムノグロブリンを含む。

橋本甲状腺炎の場合は抗サイログロブリンなどの特異的な自己抗体の検出が、診断またはリスクファクター評価に使用され得る。本発明の診断方法は、医師により判定され得るような、たとえば遺伝、対照閾値を上回る抗甲状腺ペルオキシダーゼ自己抗体などの自己抗体の存在、ＴＳＨレベル、症状などに基づき、橋本甲状腺炎を発症するリスクがあると考えられる個体に適用され得る。

サイログロブリン関連の自己免疫疾患のリスクファクターや症状は、熟練した医師によりもっともよく識別される。多くの場合、絶対的かつ断定的診断は難しいと考えられている。橋本甲状腺炎の症状は、軽度から重度であり得、排他的ではなく、以下の１または複数を含み得る：橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺機能低下症の最も一般的な型の症状は、腫大甲状腺、慢性疲労、寒さに対しより過敏になる、便秘 鬱、顔のむくみ、嗄れ声、血液コレステロールレベルの上昇、筋肉痛、圧痛および強張り、筋肉の弱化、月経過多、毛髪と皮膚の乾燥、集中力の欠如、脚または足のむくみ、および体重増加を含み得る。

本発明の他の実施形態では、検出法は、疾患進行に関連する予後を監視または生成するのに使用され、対照は疾患の進行を経験した個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似またはより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。一部の実施形態では、対照は、疾患の進行を経験しなかった個体または個体群由来であり、対照に対し残りの複合体の類似のレベルは疾患進行の可能性が低いことを示すことになる。さらに別の実施形態では、対照は同じ患者から初期に採取されたものであり、対照に対し残りの複合体のより高いレベルは疾患の高い可能性または進行を示すことになる。ある実施形態では、以前の試料は、約ひと月前、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５か月前、または４、５、６、７、８、９、１０年以上前に採取されている場合がある。当業者であれば、少なくとも１つの適切な対照をいかに選択するか、および、それにしたがい結果をいかに解釈するかを理解する。

医薬組成物および用量
本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるタイプから選択された生物学的試料中の目的の非親和性成熟自己抗体の量の標準化または定量化、次いでそれを必要とする対象へ治療効果を目的とする投与に使用され得ることが企図される。一部の実施形態では、目的の自己抗体は多反応性である。あるいは、本明細書に記載される方法は、生物学的試料から目的の非親和性成熟自己抗体を捕捉するのに使用され、必要とする対象に投与される製剤に再構成される。イムノグロブリンを含む医薬組成物、たとえば異種起源のヒト抗体を含む濃縮イムノグロブリン調製物は、当技術分野で既知のさまざまな方法で投与され得る。投与の経路および／または形態は所望される結果により異なるが、典型的には静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下となる。医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射または輸液による）に適した許容可能な担体を含み得る。

組成物の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを使用して、分散液の場合は必要な粒径を維持して、および界面活性剤の使用により、維持され得る。場合によっては、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射組成物に吸収遅延剤、例えばステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることで、組成物を長期にわたり吸収させることが可能になる。

本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の日常的に行われる方法により調製され得る。たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０^ｔｈ ｅｄ．，２０００；およびＳｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、イムノグロブリン調製物の治療上有効な用量または効果的な用量が本発明の医薬組成物で使用される。医薬組成物は、当業者には既知の一般的な方法で剤形へと製剤され得る。用量レジメンは最良の所望される反応（たとえば治療反応）が提供されるように調節される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、時間をかけて複数分割用量を投与してもよく、または用量を治療状況の緊急事態に比例して増量または減量してもよい。投与しやすさと用量の均一性のため、用量単位形態での非経口性組成物の製剤は特に有利であり得る。本明細書では、用量単位形態は、治療される対象の単位用量として適する物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要な薬剤的担体と関連して所望の治療効果を生成するために計算された活性化合物の所定量を含む。

実際の用量レベルは、患者に対し毒性とならずに特定の患者の所望される治療反応を得る効果がある量の活性成分が得られるように、変わり得る。医師は、所望の治療効果を得るのに必要なレベルよりも低い用量の医薬組成物から開始し、所望の効果が得られるまで徐々に用量を増加し得る。一般に、有効用量は、治療される特定の疾患または病状、その重症度、患者の生理学的状態、投与される他の薬、および治療が予防的か治療的か、を含む多くの異なる因子により変わる。例示的な治療計画は、２週おき、ひと月に一度、または３か月から６か月に一度の投与を伴う。

組成物は複数の機会に投与され得る。単回用量の間隔は、毎週、毎月または毎年であり得る。患者の治療進行度の測定から示されるのに合わせて、間隔は不定期な場合もある。用量と頻度は患者における抗体の半減期により変化し得る。

イムノグロブリンを調製する場合、静脈内イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）が一般的に使用される。ＩＶＩＧ製剤は、注射投与されるように設計される。本発明のＩｇＧ調製物は、治療上有効な用量の体積を有意に減少させる非常に高いイムノグロブリン濃度（たとえば一部の実施形態では１０％ｗ／ｖ、他の実施形態では１５％ｗ／ｖ、さらに他の実施形態では２０％ｗ／ｖ、さらに他の実施形態では最高２５％ｗ／ｖ）を達成しているので、本発明の組成物は、患者への静脈内投与と同じく皮下および／または筋肉内投与にも特に有利である。

「有効量」という用語は、対象において治療されている医学的症状（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病、全身性狼瘡エリテマトーデス、甲状腺炎、自己免疫性肝臓疾患、自己免疫性聴覚消失および自己免疫性甲状腺疾患など）の改善または治療をもたらすイムノグロブリン、特にＩｇＧの調製物の量を指す。対象に投与される有効量は、年齢、体重、疾患の重症度、投与経路（たとえば、静脈内ｖ．皮下）および治療への反応の個体差を考慮して医師により決定され得る。ある実施形態では、本発明のイムノグロブリン調製物は、約３００から約６００ｍｇ／キログラムで、臨床反応に応じて３から４週ごとに対象に投与され得る。静脈内投与については、例示的な初回輸液速度は、３０分で０．５ｍＬ／ｋｇ／時間（０．８ｍｇ／ｋｇ／分）であり、例示的な維持輸液速度は、許容されれば速度を３０分ごとに最高５ｍＬ／ｋｇ／時間（８ｍｇ／ｋｇ／分）まで増加させる。

皮下投与については、例示的用量は、以前の静脈内用量の１．３７倍を静脈内投与間の週数で分割したものであり、例示的維持用量は臨床反応および標的ＩｇＧトラフレベルに基づく。体重４０ｋｇ以上の個体への皮下投与については、例示的開始輸液速度は、２０ｍＬ／時間／部位で３０ｍＬ／部位であり、例示的維持輸液速度は、２０〜３０ｍＬ／時間／部位で３０ｍＬ／部位である。体重４０ｋｇ未満の個体への皮下投与については、例示的開始輸液速度は１５ｍＬ／時間／部位で２０ｍＬ／部位であり、例示的維持輸液速度は、１５〜２０ｍＬ／時間／部位で２０ｍＬ／部位である。他の実施形態では、イムノグロブリン調製物の用量は、より多いかより少ない場合がある。ＩｇＧ調製物で治療される疾患を熟知している医師は、当技術分野で既知の基準に従い患者にとっての適切な用量を決定できる。

本発明によると、治療コースを完了するのに必要な時間は、医師により決定され得、たった１日から、ひと月を超える範囲であり得る。ある実施形態では、治療コースは１か月から６か月であり得る。

キット
本発明は、多反応性自己抗体を含む非親和性成熟自己抗体を検出および／または単離するキットをさらに提供する。キットは、あらゆる自己免疫疾患の診断およびＩＶＩＧなどの特定の治療法に感受性の高い個体の同定に使用され得る。

キットは、典型的には書面のまたは電子フォーマットの説明書と、所望のアッセイの標準的試薬、溶液および緩衝液を含む。キットは、所望により標準的な対照または消耗実験器具、例えばＥＬＩＳＡプレート、クロマトグラフィーツール、容器および反応容器を含み得る。キットは、生物学的試料を採取するデバイス、たとえばシリンジおよび血液分画デバイスも含み得る。

本発明のキットは、排他的ではなくＤＮＡ、チューブリン、サイログロブリンおよびアミロイドを含むあらゆる内因性標的抗原に特異的な非親和性成熟多反応性抗体を検出する、本明細書に記載される材料を含み得る。キットは、チオフィリックなクロマトグラフィー試薬、ＩｇＧを試料中の他のタンパク質から分離する適切な洗浄および溶出緩衝液を含み得る。

キットは、目的の非親和性成熟自己抗体を非特異的抗体から分離する材料も含み得る。そのような材料は、所望の形態たとえばモノマー、オリゴマー（球状）、ポリマーまたは凝集体の標的抗原に結合される固体支持体を含み得る。固体支持体は、ビーズ、クロマトグラフィー固定相（たとえば、アガロース、シリカなど）、ＥＬＩＳＡプレートなどであり得る。材料は、一部の実施形態では、検出後治療用途の製剤に再構築されるかまたはさらなる加工をされる低親和性抗体をアミロイド結合支持体から分離し除去するための少なくとも１つのカオトロピックな洗浄緩衝液も含み得る。

本発明を例示するために以下に実施例を示す。これらの実施例には本発明をなんらかの特定の用途や機能理論に限定する意味はない。

実施例１：血漿および静脈内ＩｇＧ調製物（ＩＶＩＧ）中の抗アミロイド（１−４０）（Ａβ４０）ＩｇＧの測定

合成ヒトＡβ４０ペプチド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を１ｍｇ／ｍＬでトリフルオロ酢酸に溶解させ、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液、ｐＨ９．５を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液をＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６プレートのウェル内で（１００μＬ／ウェル）一晩４℃でインキュベートした。次にプレートを１６ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するかまたは低伝導率濃度のＮａＣｌを含む洗浄緩衝液で洗浄した。いずれの場合も、洗浄緩衝液は２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、０（ＷＢｓ）または１５０ｍＭのＮａＣｌ（ＷＢｉ）を含有する０．１％Ｔｗｅｅｎ２０であった。試料のヒト基準血漿調製物＃１Ｒ９２と静脈内ＩＶＩＧ調製物（Ｇａｍｍａｇａｒｄ Ｌｉｑｕｉｄ、＃ＬＥ１２Ｇ０３６）を１０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を添加した後各洗浄緩衝液で希釈した。これらの希釈緩衝液は、プレートのブロッキングにも使用され、ブロッキングはインキュベーションにより室温（ＲＴ）で２時間行われた。次にプレートを洗浄し、その後試料（１００μＬ／ウェル）の希釈系列で２時間インキュベートした。洗浄ステップの後、各希釈緩衝液（１／１，０００）中で希釈されたウサギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（ダコ社Ｐ−２１４）をプレート（１００μｌ／ウェル）内で、１時間室温でインキュベートした。インキュベーションを洗浄ステップにより終了し、結合したペルオキシダーゼを既製のテトラメチルベンジジン基質ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ；１００μＬ／ウェル）とともに適切に発色するまで室温でインキュベートして測定した。次いで反応を１００μＬ／ウェルの１．５Ｍの硫酸を用いて停止させた。その後６０分以内に、プレートを、６２０ｎｍの基準測定値を用いて、４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。次に、測定した希釈系列の光学密度（ＯＤ）を、全希釈物で同じ試薬ブランクを差し引き、試料および希釈液特異ブランクを差し引いて修正した。この特異ブランクは希釈系列をＡβ４０ペプチドがコーティングされていないブランクウェル内でインキュベートして得た。図１は、全アッセイを通じて１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件を用いて得られたヒト血漿およびＩＶＩＧ調製物の結合曲線を示す。

アッセイ中に用いた低伝導率条件は、ヒト血漿およびＩＶＩＧ調製物中に存在する天然抗ＡβＩｇＧの、プレートに結合されたＡβ４０ペプチドへの結合を明白に増強させた。したがって、得られた信号は、アッセイ全体を通して低伝導率の２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝液が洗浄、希釈および検出に使用された場合、少なくとも１００倍高かった。さらに、低伝導率の緩衝液の使用はＡβコーティングウェルとブランクウェルで測定された信号の比率を有意に（＞５０％）減少させた。ブランクウェルへの結合は、低伝導系では６０％超減少した。

実施例２：ＩＶＩＧ中間体における抗Ａβ４２ ＩｇＧの測定

ＩＶＩＧ製造プロセスからの８５％を超える純度のプロセス中間体８ロットの抗Ａβ４２ ＩｇＧレベルを実施例１に記載の方法を用いて調査した。記載の緩衝液とは異なり、使用した緩衝液はＣａＣｌ_２を含有しなかった。図２は、ＩｇＧ１ｍｇ当たりのブランク補正ＯＤとして表された、測定された抗Ａβ４２ ＩｇＧレベルを示す。

すべての場合において、低伝導率条件は明白な信号増加をもたらした。低伝導率条件下で得られたアッセイ信号は、１６ｍＳ／ｃｍ条件下で得られたものよりも平均で５０倍高かった。個々の増加は２４倍から１０２倍の範囲であった。同時にＡβコーティングウェルとブランクウェルの信号の比率は平均５０％超減少し、発明者らは１６ｍＳ／ｃｍまたは低伝導率条件の平均比率０．１３と０．０４を見出した。

実施例３：ＩＶＩＧ中間体における抗Ａβ４０オリゴマー（ＣＡＰＳ）ＩｇＧの測定

記載のとおりに（ Ｏ'Ｎｕａｌｌａｉｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０）：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍａｙ；３０ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３７−４２）得た抗Ａβ４０オリゴマー（ＣＡＰＳ、架橋β−アミロイドタンパク質種）でプレートをコーティングした。次に、ＣａＣｌ_２なしの緩衝液を用いて実施例１に記載のようにアッセイを行った。ＩＶＩＧ製造プロセスから８ロットの純度８５％超のプロセス中間体の抗ＣＡＰＳ ＩｇＧレベルを調査した。表２は、結果のＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）、およびＣＡＰＳコーティング（ＯＤ）とブランクウェル（ブランク）で得られた対応する信号を示す。さらに、対応する信号とタンパク質濃度に標準化した信号の比率（比率）と差（Δ）をＯＤ／ｍｇで表したものが示される。

（表２）抗ＣＡＰＳ ＩｇＧの測定

形成された抗原−抗体複合体の量は、低伝導率アッセイ系で得られた増加した信号強度により示されるように、増加した。このことは、調査した全試料で観察された。信号強度は、平均５４倍、個々の値では３５倍から７７倍増加した。

実施例４：ＩＶＩＧ中間体における抗Ａβ原繊維ＩｇＧの測定

記載のとおりに（Ｏ'Ｎｕａｌｌａｉｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７，１２２５４−１２２５６）得た抗Ａβ原繊維でプレートをコーティングした。次に、ＣａＣｌ_２なしの緩衝液を用いて実施例１に記載のようにアッセイを行った。ＩＶＩＧ製造プロセスから８ロットの純度８５％超のプロセス中間体の抗ＣＡＰＳ ＩｇＧレベルを調査した。図３は、ＩｇＧ１ｍｇ当たりのブランク補正ＯＤとして表された、測定された抗Ａβ原繊維 ＩｇＧレベルを示す。

いずれの場合も、低伝導率条件で信号が明白に増加した。低伝導率条件下で得られたアッセイ信号は、１６ｍＳ／ｃｍ条件下で得られたものよりも平均で６４倍高かった。個々の増加は４１倍から１１６倍の範囲であった。

実施例５：ヒト血漿中抗ＤＮＡ ＩｇＧの測定

抗ＤＮＡ抗体は、十分に記載されているヒト自己抗体である。実施例５は、低伝導率アッセイ条件と１６ｍＳ／ｃｍアッセイ条件下で得られたヒト血漿中の抗ＤＮＡ ＩｇＧの固相アッセイで得られた結合曲線を示す。単鎖ＤＮＡ（仔牛胸腺、Ｓｉｇｍａ Ｄ８８９９）を５μｇ／ｍＬでＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６プレートのウェル内で、一晩４℃でインキュベートした（１００μＬ／ウェル）。次に、ＣａＣｌ_２なしの緩衝液を用いて実施例１に記載のように固相結合アッセイを行った。Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ（Ｖｉｅｎｎａ）の基準血漿調製物＃１Ｒ０１Ｂ００を使用した。希釈系列は２５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度に対応する最小希釈倍率１／２０から開始した。アッセイのレイアウト、すなわち試料および希釈液特異ブランクを得るのに使用される方法を実施例１に記載のように行った。図４は、２種類の緩衝系で観察された信号強度に大差があったためｌｏｇ／ｌｉｎとして表し得られた結合曲線を示す。

濃度−反応曲線は、低伝導率緩衝液が信号強度を少なくとも１００倍増加させたことを明白に示す。さらに、１６ｍＳ／ｃｍ条件下での信号の６７％を占めたブランクウェルへの結合は、低伝導率条件を用いると９０％減少した。

実施例６：ヒト血漿中抗チューブリンＩｇＧの測定

チューブリンは微小管の一部であり、真核（ｅｕｋａｒｙｏｎｔｉｃ）細胞のほとんど全てと細胞骨格系の一部に存在する筒状線維構造である。抗チューブリン自己抗体は、一部のヒト血清の正常成分だが、抗チューブリンＩｇＧの大半は免疫複合体として存在するようである（Ｂｅｒｎｉｅｒ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）：Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１，２６１−２６８）。実施例６は、低伝導率アッセイ条件と１６ｍＳ／ｃｍアッセイ条件下で得られたヒト血漿中の抗チューブリンＩｇＧの固相アッセイで得られた結合曲線を示す。チューブリン（ブタ、Ｓｉｇｍａ Ｔ６９５４）を５μｇ／ｍＬでＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６プレートのウェル内で一晩４℃でインキュベートした（１００μＬ／ウェル）。次に、ＣａＣｌ_２なしの緩衝液を用いて実施例１に記載のように固相結合アッセイを行った。Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ（Ｖｉｅｎｎａ）の基準血漿調製物＃１Ｒ０１Ｂ００を使用した。希釈系列は２５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度に対応する最小希釈倍率１／２０から開始した。アッセイのレイアウト、すなわち試料および希釈液特異ブランクを得るのに使用される方法を実施例１に記載のように行った。図５は、２種類の緩衝系で観察された信号強度に大差があったためｌｏｇ／ｌｉｎとして表し得られた結合曲線を示す。

濃度−反応曲線は、低伝導率緩衝液が信号強度を少なくとも１００倍増加させたことを明白に示す。さらに、１６ｍＳ／ｃｍ条件下での信号の５０％を占めたブランクウェルへの結合は、低伝導率条件を用いると９０％減少した。

実施例７：ヒト血漿中抗サイログロブリンＩｇＧの測定

実施例７は、低伝導率アッセイ条件と１６ｍＳ／ｃｍアッセイ条件下で得られたヒト血漿中の抗サイログロブリンＩｇＧの固相アッセイで得られた結合曲線を示す。サイログロブリン（ブタ、Ｓｉｇｍａ Ｔ１１２６）を５μｇ／ｍＬでＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｆ９６プレートのウェル内で一晩４℃でインキュベートした（１００μＬ／ウェル）。次に、ＣａＣｌ_２なしの緩衝液を用いて実施例１に記載のように固相結合アッセイを行った。Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ（Ｖｉｅｎｎａ）の基準血漿調製物＃１Ｒ０１Ｂ００を使用した。希釈系列は２５０μｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度に対応する最小希釈倍率１／２０から開始した。アッセイのレイアウト、すなわち試料および希釈液特異ブランクを得るのに使用される方法を実施例１に記載のように行った。図６は、２種類の緩衝系で観察された信号強度に大差があったためｌｏｇ／ｌｉｎとして表し得られた結合曲線を示す。濃度−反応曲線は、低伝導率緩衝液が信号強度を少なくとも１００倍増加させたことを明白に示す。

実施例８：ヒト血漿からの自己抗体抗ＤＮＡ ＩｇＧ検出感度への伝導率の影響

実施例５で説明した条件とＤＮＡ調製物は、使用されるアッセイ緩衝液の伝導率がアッセイ感度に及ぼす影響の調査にも使用された。かくして、０ｍＭから１５０ｍＭまで異なる８つの濃度のＮａＣｌを含む２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ緩衝液を調製し、洗浄緩衝液として使用し、１０ｍｇ／ｍＬ ｈＳＡの添加後、ヒト基準血漿試料を希釈するのに用いた。図７は、得られた８つの結合曲線を示す。

結果から、アッセイ緩衝液の伝導率と固相抗ＤＮＡ結合アッセイの感度の関係は明白であった。たとえば０．２のブランク補正信号を得るのに必要なＩｇＧ濃度は、１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液で得られた信号を、ＮａＣｌを含有しなかった緩衝液の信号と比較すると、１，０００倍違った。伝導率と信号強度の反比例は、図８に示されるように数学的関数となり、相対的信号強度は使用されたアッセイ緩衝液の伝導率に対しプロットされている。伝導率と信号強度の対数の線形回帰曲線は、二乗相関係数Ｒ^２＝０．９８を有し、信号強度のこの増加が関数関係に基づくという結論が強力に支持される。

実施例９：低伝導率条件下での抗ＤＮＡと抗チューブリンＩｇＧの結合特異性を示す競合試験

可溶性抗原との競合は、プレートに結合させた抗原を用いる結合被検体の特異性を示す、１つの一般的な方法である。したがって、この方法を、これらの条件下で観察された増加した信号強度の考えられる説明としての仮説、すなわち低伝導率条件は非特異的結合を支持しない、ということを確認するのに使用した。これは実施例９に示され、プレートに結合させた抗原への結合が、抗ＤＮＡ ＩｇＧおよび抗チューブリン対可溶性抗原で競合された。そのために、血漿試料を各抗原の漸減する濃度で１時間インキュベートした。次にこれらの試料を実施例５と実施例６にそれぞれ記載のように分析した。図９は、両方の場合において、溶液中の抗原によりもたらされた、明白な濃度依存性競合を示す、得られた競合曲線を示す。プレートに結合させた抗原への結合の競合レベル５０％が、ＤＮＡとチューブリンについてそれぞれ９．９μｇ／ｍＬと１８μｇ／ｍＬの濃度で得られた。これらのデータから、アッセイ緩衝液の低伝導率は結合アッセイの特異性に影響しなかったことが確認された。

実施例１０：免疫化由来の抗体を用いた低伝導率アッセイ条件での一般的ＥＬＩＳＡ系の性能

自己抗体は、それらが標的とする抗原での事前の免疫化またはワクチン接種なしで血漿中に存在する。このことは、典型的には標的抗原での能動免疫化により生成される、ＥＬＩＳＡで使用されるほとんど全ての抗体にはまったく当てはまらない。このプロセスは、自己抗体と能動免疫化により生成されたカウンターパートとの差異の主たる原因である。実施例１０は、能動免疫化により生成された抗体のＥＬＩＳＡアッセイで低伝導率緩衝液を用いることで、それらの例において感度が上昇したかどうかを調査する。したがって、ポリクローナルのウサギＩｇＧを使用して確立され実証されたα_１−アンチトリプシンのＥＬＩＳＡ（Ｗｅｂｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）：Ｖｏｘ Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ Ａｐｒ；１００（３）：２８５−９７）で標準的な１６ｍＳ／ｃｍ緩衝液を低伝導率緩衝液系と交換して使用した。アッセイは何らの明白な変化なしに実施された。しかし、様々な自己抗体の結合アッセイの結果とは異なり、能動免疫化により生成された抗体では信号強度の増加は観察されなかった。

上述の発明を明白に理解するため例示および例を介して詳述してきたが、当業者にとっては、本発明の教示に鑑み、添付の特許請求の範囲と精神を逸脱することなく特定の変化や変更が加えられ得ることは容易に理解される。

本開示に基づき、当業者であれば、本発明が、多岐にわたる範囲の親和性、結合活性および反応性（多反応性対一価）の自己抗体の検出と、ペプチドや核酸を含む異なる種類の標的抗原に使用され得ることを理解すべきである。本明細書に記載の方法は、従来のＥＬＩＳＡアッセイよりも必ずしも感度が高くはないが、そのＦａｂ領域が特異性をもつ標的抗原に対し高い結合活性を有する自己抗体の検出も可能であることが企図される。

Claims (25)

1. 生物学的試料中のヒトＩｇＧ自己抗体を検出する方法であって、該ヒト自己抗体は標的抗原に対し特異的であり、該方法は、
   （ａ）ヒトＩｇＧ自己抗体が特異的な結合親和性を有する標的抗原と、生物学的試料を、低伝導率条件下で接触させるステップ；および
   （ｂ）生物学的試料中の前記標的抗原の前記ヒトＩｇＧ自己抗体への結合を検出するステップを含み、
   前記標的抗原は固相上に固定化され、前記結合の存在は生物学的試料中のヒトＩｇＧ自己抗体の存在を示し、かつ
   低伝導率条件は９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、方法。
2. ヒトＩｇＧ自己抗体が非親和性成熟自己抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 生物学的試料が、血液、血清、血漿、それらの画分、およびそれらの加工誘導体からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 生物学的試料が静脈内ＩｇＧ調製物である、請求項１または２に記載の方法。
5. 生物学的試料がヒト由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 低伝導率条件が６０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 低伝導率条件が４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
8. 低伝導率条件が２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
9. 固相がマイクロプレートを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 検出ステップ（ｂ）が、
    （ｉ）標的抗原に対するヒトＩｇＧ自己抗体に結合する種特異的抗体に、対応するヒトＩｇＧ自己抗体に種特異的抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、生物学的試料を接触させること；および
    （ｉｉ）標的抗原、ヒトＩｇＧ自己抗体、および種特異的抗体を含むすべての複合体を検出することを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 種特異的抗体が、検出可能部分に結合される、請求項１０に記載の方法。
12. 検出可能部分が直接標識を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 直接標識がペルオキシダーゼを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 検出可能部分が間接標識を含む、請求項１１に記載の方法。
15. （ｉｉ）すべての複合体を検出することが、検出可能部分を指示試薬と接触させることを含む、請求項１１に記載の方法。
16. 生物学的試料が、ステップ（ａ）の前に低伝導率希釈緩衝液で少なくとも１，０００倍に希釈される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 低伝導率希釈緩衝液が９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 低伝導率希釈緩衝液が６０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１６に記載の方法。
19. 低伝導率希釈緩衝液が４０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１６に記載の方法。
20. 低伝導率希釈緩衝液が２０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項１６に記載の方法。
21. ステップ（ｂ）の前に、固相を低伝導率洗浄緩衝液で洗浄することをさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 低伝導率洗浄緩衝液が９０ｍＭの塩化ナトリウム溶液の伝導率より低い伝導率を有する、請求項２１に記載の方法。
23. ヒトＩｇＧ自己抗体がアミロイドβ特異性ヒトＩｇＧ自己抗体、ＤＮＡ特異性ヒトＩｇＧ自己抗体、チューブリン特異性ヒトＩｇＧ自己抗体、およびサイログロブリン特異性ヒトＩｇＧ自己抗体からなる群より選択される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ヒトＩｇＧ自己抗体がアミロイドβ特異性ヒトＩｇＧ自己抗体であり、かつ標的抗原がアミロイドβモノマー、アミロイドβダイマー、アミロイドβオリゴマー、架橋アミロイドβオリゴマー、およびアミロイドβ原繊維から選択される形態であるアミロイドβ抗原である、請求項２３に記載の方法。
25. ヒトＩｇＧ自己抗体がＤＮＡ特異性ヒトＩｇＧ自己抗体であり、かつ標的抗原が単鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。

Images