JP6970975B2 - IgG4関連疾患の検査方法 - Google Patents
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Description
(1)IgG4関連疾患の検査方法であって、
IgG4関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は
IgG4関連疾患の指標として、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
(2)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体である、(1)に記載の方法。
(3)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗インテグリン抗体検出工程における前記抗体が、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記IgG4関連疾患が、IgG4関連腎疾患であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−521と免疫学的に反応する抗体である、(1)に記載の方法。
(5)前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記抗インテグリン抗体検出工程が、インテグリンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記検体が血液試料である、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(7’)自己免疫性膵炎の検査方法であって、
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
(8)ラミニンを含む、IgG4関連疾患を検査するための検査試薬。
(9)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−511である、(8)に記載の検査試薬。
(10)前記IgG4関連疾患が、IgG4関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−521である、(8)に記載の検査試薬。
(11)前記ラミニンを、固相に固定された形態で含む、(8)〜(10)のいずれかに記載の検査試薬。
(12)インテグリンを含む、IgG4関連疾患を検査するための検査試薬。
(13)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα6β1である、(12)に記載の検査試薬。
(14)前記インテグリンを、固相に固定された形態で含む、(12)又は(13)に記載の検査試薬。
(14’)ラミニン−511とインテグリンα6β1とを固相に固定された形態で含む、自己免疫性膵炎の検査試薬。
(15)IgG4関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
IgG4関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は、
IgG4関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
(16)IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、IgG4関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。
(17)IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、IgG4関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。
(18)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
(19)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗インテグリン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、インテグリンを抗原として免疫するインテグリン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
(20)IgG4関連疾患の指標を取得する方法であって、
検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は
検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
(21)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体である、(20)に記載の方法。
(22)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
抗インテグリン抗体検出工程における前記抗体が、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体である、(20)又は(21)に記載の方法。
(23)前記IgG4関連疾患が、IgG4関連腎疾患であり、
抗ラミニン抗体検出工程における前記抗体が、ラミニン−521と免疫学的に反応する抗体である、(20)に記載の方法。
(24)前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、(20)〜(23)のいずれかに記載の方法。
(25)前記抗インテグリン抗体検出工程が、インテグリンを抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、(20)〜(24)のいずれかに記載の方法。
(26)前記検体が、被検動物から分離された血液試料である、(20)〜(25)のいずれかに記載の方法。
(26’)自己免疫性膵炎の指標を取得する方法であって、
検体中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
検体中の、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。
(27)IgG4関連疾患を検査するための検査試薬の製造における、ラミニンの使用。
(28)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−511である、(27)に記載の使用。
(29)前記IgG4関連疾患が、IgG4関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−521である、(27)に記載の使用。
(30)前記ラミニンが、ラミニンが固定された固相の形態である、(27)〜(29)のいずれかに記載の使用。
(31)IgG4関連疾患を検査するための検査試薬の製造における、インテグリンの使用。
(32)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα6β1である、(31)に記載の使用。
(33)前記インテグリンが、インテグリンが固定された固相の形態である、(31)又は(32)に記載の使用。
(33’)自己免疫性膵炎の検査試薬の製造における、固相に固定された形態の、ラミニン−511及びインテグリンα6β1の使用。
(34)IgG4関連疾患の検査に使用するためのラミニン。
(35)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記ラミニンが、ラミニン−511である、(34)に記載のラミニン。
(36)前記IgG4関連疾患が、IgG4関連腎疾患であり、
前記ラミニンが、ラミニン−521である、(34)に記載のラミニン。
(37)前記ラミニンが、ラミニンが固定された固相の形態である、(34)〜(36)のいずれかに記載の使用。
(38)IgG4関連疾患を検査に使用するためのインテグリン。
(39)前記IgG4関連疾患が、自己免疫性膵炎であり、
前記インテグリンが、インテグリンα6β1である、(38)に記載のインテグリン。
(40)前記インテグリンが、インテグリンが固定された固相の形態である、(38)又は(39)に記載のインテグリン。
(40’)自己免疫性膵炎の検査に使用するための、固相に固定された形態の、ラミニン−511及びインテグリンα6β1の組み合わせ。
(41)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、ラミニンと免疫学的に反応する抗体。
(42)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、ラミニン。
(43)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、インテグリンと免疫学的に反応する抗体。
(44)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法に使用するための、インテグリン。
(45)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、ラミニンと免疫学的に反応する抗体の使用。
(46)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、ラミニンの使用。
(47)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、インテグリンと免疫学的に反応する抗体の使用。
(48)IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製するための試薬の製造における、インテグリンの使用。
本発明においてIgG4関連疾患とは、血清IgG4高値とIgG4陽性形質細胞の組織浸潤または腫瘤形成を特徴とする疾患群であり、具体的には、自己免疫性膵炎(AIP)、IgG4関連腎疾患、IgG4関連涙腺唾液腺炎、IgG4関連硬化性胆管炎、IgG4関連眼疾患、IgG4関連動脈周囲炎、IgG4関連下垂体炎、IgG4関連肺疾患、IgG4関連後腹膜線維症が例示できる。
<2.IgG4関連疾患の検査方法>
本発明は第一に、
IgG4関連疾患の検査方法であって、
IgG4関連疾患の指標として、検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は
IgG4関連疾患の指標として、検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法に関する。
<3.IgG4関連疾患の検査試薬>
本発明は第二に、
ラミニンを含む、IgG4関連疾患を検査するための検査試薬、
インテグリンを含む、IgG4関連疾患を検査するための検査試薬、或いは、
ラミニン及びインテグリンを含む、IgG4関連疾患を検査するための検査試薬
に関する。
<4.IgG4関連疾患に対する治療の効果を評価する方法>
本発明は第三に、
IgG4関連疾患に対する治療の効果を評価する方法であって、
IgG4関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は、
IgG4関連疾患に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法に関する。
<5.IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法1>
本発明は第四に、
IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、IgG4関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法に関する。
<6.IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法2>
本発明は第五に、
IgG4関連疾患の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、IgG4関連疾患の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法に関する。
<7.IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法1>
本発明は第六に、
IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニンを抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法に関する。
<8.IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法2>
本発明は第七に、
IgG4関連疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、インテグリンと免疫学的に反応する抗体を投与する抗インテグリン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、インテグリンを抗原として免疫するインテグリン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法に関する。
実験1では、IgG4関連疾患患者の血清から精製したIgGを健常マウス新生仔に投与し、投与後の膵臓への影響を観察した。その結果、IgG4関連疾患患者の血清から精製したIgGは、膵臓に対して病原性を示すことが明らかとなった。
1.1.血清
IgG4関連疾患と診断された10名の患者から血清試料を取得した。
1.2.ヒトIgGの調製
上記の血清試料から、Ab−Rapid PuRe Ex(P−015,Porte Nova製)を用い、製品の指示書に沿った手順により、ヒトIgGを調製した。IgGはpH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により透析し、Amicon Ultra(UFC805024,Millipore製)を用いた限外濾過により濃縮し、使用時まで−20℃で保存した。精製されたIgGの濃度は、Human IgG EIA Kit(MK136,Takara製)を用いて測定した。IgG画分の純度を、Human IgA ELISA Kit(E88−102, Bethyl Laboratorires製)、Human IgM ELISA Kit(E88−100, Bethyl Laboratorires製)、Human IgE ELISA Kit(E88−108, Bethyl Laboratorires製)、及び、クーマシーブリリアントブルー染色をそれぞれ用いてIgA、IgM、IgE及びタンパク質の混入を求め、確認した。
1.3.動物試験
マウスとしてBALB/cマウスの雄の新生仔を用いた。
1.4.結果と考察1(図1A〜図1C)
患者IgG又は対照IgGの皮下投与から12時間後に、マウスの膵臓の組織切片を採取し、H&E(ヘマトキシリン&エオシン)染色及び免疫組織化学的染色により染色し、観察した。免疫組織化学的染色では、骨髄細胞分化抗原Gr1に対する抗体を一次抗体として用い、Gr1陽性細胞を染色した。
1.5.結果と考察2(図2A及び図2B)
図2A及びBに結果を示す試験は、患者IgGの病原性が、膵臓組織への直接的な結合により生じるのか否かを確認する試験である。
<2.実験2:IgG4関連疾患のIgG1、IgG4のマウスへの投与>
実験2では、IgG4関連疾患患者の血清からIgGのサブクラスIgG1とIgG4を精製し、健常マウス新生仔に投与し、投与後の膵臓への影響を観察した。その結果、IgG4関連疾患患者の血清から精製したIgG1とIgG4はどちらも膵臓に対して病原性を示すこと、IgG1の病原性はIgG4の病原性よりも大きいこと、IgG1とIgG4を併用して投与するとIgG1の病原性は抑制されることが確認された。
2.1.ヒトIgGの調製
上記1.1.得たIgG4関連疾患の患者の血清試料及び対照血清試料から、IgG1及びIgG4を精製した。IgG1及びIgG4の精製は、それぞれ、Capture Select IgG1(Hu) affinity matrics(191303005,Invitrogen製)、及び、Capture Select IgG4(Hu) affinity matrics(290005,Invitrogen製)を用い、製品の指示書に沿った手順により行った。手順の概要は、ヒト血清試料を前記製品のカラムに負荷し、PBSで洗浄した。目的とするサブクラス(IgG1又はIgG4)の画分を0.1Mグリシン(pH2.8)により溶出させ、1.5M Tris(pH7.5)により中和した。溶出したサブクラス(IgG1又はIgG4)の画分を、PBS(pH7.2)により十分に洗浄しながら、Amicon Ultra(UFC805024,Millipore製)を用いた限外濾過により濃縮した。精製されたIgGサブクラスの濃度を、Human IgG1 Platinum ELISA(BMS2092,eBioscience製)、Human IgG2 Platinum ELISA(BMS2093,eBioscience製)、Human IgG3 Platinum ELISA(BMS2094,eBioscience製)、Human IgG4 Platinum ELISA(BMS2095,eBioscience製)を製品の指示書に従って用い、定量した。サブクラスの純度を、上記と同様の手順によりIgA、IgM、IgE、他のIgGサブクラス及びタンパク質の混入を求め、確認した。
2.2.動物試験
マウスとしてBALB/cマウスの雄の新生仔を用いた。
2.3.結果と考察(図3A〜図3C)
患者IgG1及び患者IgG4の一方又は両方、或いは、対照IgG1及び対照IgG4の一方又は両方の皮下投与から12時間後に、マウスの膵臓の組織切片を採取し、H&E(ヘマトキシリン&エオシン)染色及び免疫組織化学的染色により染色し、観察した。免疫組織化学的染色では、骨髄細胞分化抗原Gr1に対する抗体を一次抗体として用い、Gr1陽性細胞を染色した。免疫組織化学的染色ではまた、ヒトIgG1又はヒトIgG4に対する抗体を一次抗体として用い、マウス膵臓組織中のヒトIgG1又はヒトIgG4を染色した。
<3.実験3:AIP患者の膵臓の観察>
上記の実験1及び2から、IgG4関連疾患の患者のIgG1及びIgG4が、膵臓組織に結合して病原性を示すことが判明した。そこで実験3では、自己免疫性膵炎(AIP)患者の膵臓において、IgG4が蓄積しているかどうかを観察した。観察では、H&E染色によりヒト膵臓組織を染色し、病変がある部分と、病変のない部分を判別した、また、免疫組織化学的染色及び免疫蛍光染色によりヒト膵臓組織中のIgG4、コラーゲンIV、アミラーゼを可視化した。免疫組織化学的染色及び免疫蛍光染色の手順は実験2と同様である。
<4.実験4:AIP患者が有する抗体の、抗原の特定>
上記実験1〜3から、AIP患者では、膵臓組織での細胞外マトリクスに特異的に結合するIgG1及びIgG4が増加し、それが膵臓の病変を誘導していることが推定された。
4.1.抗原の候補
抗原候補として、膵臓で発現している細胞外マトリクスタンパク質として既知の以下のタンパク質を試験した。
ヒトコラーゲンIV(ab7536,abcam)
ヒトフィブロネクチン
GFP(緑色蛍光タンパク質)(MB−0752、VECTOR LABORATORIES)
ヒトNotch1(ab68580,abcam)
ヒトAnnexin A2(ab93005,abcam)
ヒトSDF2L1(TP313102,OriGene Technologies) ヒトBile salt−activated lipase(ab167963、abcam)
4.2.血清試料
AIPと診断された9名の患者から血清試料を取得した。
4.3.手順
以下の試験では、特に明示しない場合は、ELISA Starter Accessory Kit(E101,Bethyl Laboratories)を用いた。
4.3.1.抗原候補によるコーティング
(1)上記の抗原候補の1つを前記キットのELISA用コーティングバッファーに希釈して2μg/ml濃度溶液とした。この溶液を、前記キットのマイクロウェルプレートに、1つのウェルあたり100μlとなるように加えた。
4.3.2.ブロッキング
(1)前記キットのELISA用ブロッキングバッファー200μlを各ウェルに添加した。
4.3.3.一次抗体
(1)前記AIP患者血清試料(n=9)又は前記対照血清試料(n=10)を、前記キットのコンジュゲート希釈剤(Conjugate Diluent)により1:50の割合で希釈した。
4.3.4.HRPコンジュゲート二次抗体
(1)HRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)とコンジュゲートされた二次抗体(abcam6759,ウサギ抗ヒトIgG H&L(HRP),ポリクローナル)を、前記キットのコンジュゲート希釈剤(Conjugate Diluent)により1:2000の割合で希釈した。
4.3.5.酵素基質反応
(1)製造元の推奨条件に従ってTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)溶液を調製した。
4.4.結果と考察
結果を図5A(抗ヒトラミニン−511活性断片抗体)、図5B(抗ヒトコラーゲンIV抗体)、図5C(抗ヒトフィブロネクチン抗体)、図5D(抗GFP抗体)に示す。ヒトラミニン−511活性断片を抗原とした試験では、試験するAIP患者血清試料及び対照血清試料の母数を更に増やし、図5Aに示すように、AIP患者血清試料ではn=40、対照血清試料ではn=40とした。同様に、ヒトコラーゲンIVを抗原とした試験では、試験するAIP患者血清試料及び対照血清試料の母数を更に増やし、図5Bに示すように、AIP患者血清試料ではn=40、対照血清試料ではn=40とした。
<5.実験5:ラミニン−511によるマウスの免疫>
上記の実験4の結果は、ヒトラミニン−511に対する抗体がAIPの原因物質であると推定される。そこでこの推定を裏付けるべく、実験5では、ヒトラミニン−511によりマウスを免疫し、マウスの膵臓での病変の有無を確認した。
5.1.手順
8週齢の雄マウス(B6マウス、及び、BALB/cマウス)を麻酔した。PBSと完全フロイントアジュバント(CFA)(263810,Difco製)との等量混合液100μl中で乳化させた、120μgのラミニン−511−E8(ヒトラミニン−511活性断片)(892012,株式会社ニッピ製)で、実験を開始した日(第0日)に、麻酔された前記マウスの両方の後足蹠に皮下投与により投与して免疫し、第28日及び第56日に、第0日の免疫に用いたのと同じ量の、CFA中のラミニン−511−E8によりブーストを行った。
5.2.結果と考察
H&E染色により染色した膵臓の組織切片の観察像を図6に示す。図6左が対照群の観察像、図6右がヒトラミニン−511活性断片(i511ラミニン)により免疫した試験群の観察像である。ヒトラミニン−511活性断片により免疫した試験群のマウスでは膵臓に細胞浸潤の病変が形成されたのに対して、対照群のマウスでは膵臓に異常は見られなかった。ヒトラミニン−511活性断片により免疫した試験群のマウスでも、膵臓以外の部位には異常は見られなかった。図6に示す観察像を得たマウス個体以外のマウス個体においても、同様の傾向であった。
<6.実験6:IgG4関連腎疾患の患者が有する抗ラミニン抗体の分析>
実験4に記載のAIP患者からの血清試料又は対照血清試料を用い、抗原候補としてヒトラミニン−521を用いて、実験4に記載の手順により抗ヒトラミニン−521抗体の血清中濃度を求めた。
<7.実験7:IgG4関連腎疾患患者IgGのマウスへの投与>
実験6において抗ヒトラミニン−521抗体陽性であることが確認されたIgG4関連腎疾患患者の血清から、実験1と同様の手順でIgGを調製した。このIgGを「IgG4関連腎疾患患者IgG」とした。
<8.実験8:AIP患者の血清中の抗ラミニン511−E8自己抗体の測定>
8.1.試料
IgG4−RD 2011の診断基準又はAIPの診断基準を満たす51名の治療中のAIP患者からの血清試料を取得した。25名の健常者及び86名の疾患患者(49名の、組織学的に確認された癌患者、及び、39名の、癌以外の疾患患者)から、対照の血清試料を取得した。AIP患者51名のうち10名からの血清試料と、対照者112名のうち10名からの血清試料をそれぞれトレーニング群として用い、残りをバリデーション群として用いた。全ての血清試料は−80℃にて保存した。
8.2.ELISAの手順
抗原の候補物質であるヒトラミニン511−E8として、ヒト由来リコンビナントラミニン−511−E8(892012,株式会社ニッピ製)を用いた。ラミニン511−E8は、ラミニンのα鎖、β鎖及びγ鎖のC末端領域がヘテロ三量体を形成した活性フラグメントであり、インテグリンへの結合能力を有する。ヒトラミニン−511−E8に対する血清抗体を、ELISA Starter Accessory Kit(E101,Bethyl Laboratories)を該キットの指示の通り用いるELISA(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)により定量した。定量方法の概要は以下の通りである。
8.3.結果
トレーニング群である10名のAIP患者、及び、10名の対照(膵臓癌患者3名、原発性硬化性胆管炎患者2名、健常者5名)からの血清試料の、抗ヒトラミニン−511−E8 IgG抗体レベルの測定結果を図9Aに示す。カットオフ値(光学密度単位[OD])は、前記対照からの血清試料での抗ヒトラミニン−511−E8 IgG抗体レベルの平均値に、標準偏差(SD)の3倍の値を加えた値である。10名のAIP患者のうち6名からの血清試料が、ヒトラミニン−511−E8に対するIgG抗体が陽性であったのに対して、10名の対照者の全員がヒトラミニン−511−E8に対するIgG抗体が陰性であった。
<9.実験9:抗ラミニン511−E8自己抗体陰性のAIP患者における抗インテグリン自己抗体の測定>
膵臓においてラミニン511は、インテグリンα6β1又はインテグリンα3β1と結合することが知られている。本発明者らは、AIP患者では、インテグリンα6β1又はインテグリンα3β1も自己抗原となるという仮説を立てた。
9.1.試料
実験8と同じ、51名のAIP患者及び112名の対照からの血清試料を用いた。
9.2.ELISA
抗原候補物質としてインテグリンα6β1又はインテグリンα3β1を用いた以外は、実験8と同じ手順で、ELISAにより、血清試料中の抗インテグリンα6β1抗体及び抗インテグリンα3β1抗体を定量した。
9.3.結果
26名の抗ラミニン511−E8抗体陽性AIP患者、25名の抗ラミニン511−E8抗体陰性AIP患者、及び、112名の対照からの血清試料での、抗インテグリンα6β1 IgG抗体レベルの測定結果を図10に、抗インテグリンα3β1 IgG抗体レベルの測定結果を図11に、それぞれ示す。カットオフ値(光学密度単位[OD])は、前記対照からの血清試料での抗インテグリンα6β1 IgG抗体レベル又は抗インテグリンα3β1 IgG抗体レベルの平均値に、標準偏差(SD)の3倍の値を加えた値である。
<10.実験10:膵画像の比較>
図12上段は、抗ラミニン511−E8抗体陽性AIP患者の造影CTによる膵画像である。図12下段は、抗インテグリンα6β1抗体陽性AIP患者の造影CTによる膵画像である。各画像中の矢印は病変箇所を指す。
<11.実験11:抗ラミニン511−E8抗体力価の治療による低減>
11.1.手順
実験8で抗ラミニン511−E8抗体陽性であった26名のAIP患者のうち5名について、ステロイドを用いたAIP治療の前後での、血清中の抗ラミニン511−E8抗体レベルを調べた。抗体レベルの測定は実験8と同様の方法で行った。
11.2.結果
5名の抗ラミニン511−E8抗体陽性AIP患者の、ステロイド治療前後での、血清中の抗ラミニン511−E8抗体レベルを図13に示す。ステロイド治療により各AIP患者の血清中の抗ラミニン511−E8抗体力価はカットオフ値未満に低減された。また、図示しないが、各AIP患者の血清中の抗ラミニン511−E8抗体力価の低減に伴い膵画像所見も改善した。このことは、血清中の抗ラミニン511−E8抗体は、AIP治療の効果の指標としても有用であることを裏付ける。
Claims (15)
- 自己免疫性膵炎の検査方法であって、
自己免疫性膵炎の指標として、検体中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び/又は
自己免疫性膵炎の指標として、検体中の、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。 - 前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニン−511を抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- IgG4関連腎疾患の検査方法であって、
IgG4関連腎疾患の指標として、検体中の、ラミニン−521と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程
を含む方法。 - 前記抗ラミニン抗体検出工程が、ラミニン−521を抗原として用いて前記抗体を検出することを含む、請求項3に記載の方法。
- 自己免疫性膵炎の検査方法であって、
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程、及び
自己免疫性膵炎の指標として、検体の血液試料中の、インテグリンα6β1と免疫学的に反応する抗体を検出する抗インテグリン抗体検出工程
を含む方法。 - ラミニン−511を含む、自己免疫性膵炎を検査するための検査試薬。
- 前記ラミニン−511を、固相に固定された形態で含む、請求項6に記載の検査試薬。
- ラミニン−521を含む、IgG4関連腎疾患を検査するための検査試薬。
- 前記ラミニン−521を、固相に固定された形態で含む、請求項8に記載の検査試薬。
- インテグリンα6β1を含む、自己免疫性膵炎を検査するための検査試薬。
- ラミニン−511とインテグリンα6β1とを固相に固定された形態で含む、自己免疫性膵炎の検査試薬。
- 自己免疫性膵炎に対する治療の効果を評価するための指標を取得する方法であって、
自己免疫性膵炎に対する治療が施された被検動物から得た検体中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程
を含む方法。 - 自己免疫性膵炎の治療薬の候補物質をスクリーニングする方法であって、
試験物質を作用させた動物から得た検体中の、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を検出する抗ラミニン抗体検出工程と、
前記試験物質を作用させたことにより前記検体中の前記抗体が減少した場合に、前記試験物質を、自己免疫性膵炎の治療薬の候補物質として選抜する選抜工程と
を含む方法。 - 自己免疫性膵炎の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニン−511と免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニン−511を抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。 - IgG4関連腎疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
非ヒト動物に、ラミニン−521と免疫学的に反応する抗体を投与する抗ラミニン抗体投与工程、及び
非ヒト動物を、ラミニン−521を抗原として免疫するラミニン免疫工程
のうち少なくとも一方を含む方法。
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