BRPI1105423A2 - Métodos para detectar um anticorpo de alta avidez anti-amilóide presente em uma amostra biológica - Google Patents

Abstract

Métodos para detectar um anticorpo de alta avidez anti-amilóide presente em uma amostra biológica a presenie invenção fornece metodos aperfeiçoados de imunoafinidade para a detecção de anticorpos ant-amilóide de alta avidez presentes em amostras biológicas. Em outros aspectos. A presente invenção fornece métodos para diagnóstico de doencas associadas com proteínas amilóides. Também fornecidos pela presente i nvenção são métodos para identificação de candidatos com probabilidade de resposta a tratamento que consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Description

“MÉTODOS PARA DETECTAR UM ANTICORPO DE ALTA AVIDEZ ANTI-AMILÓIDE PRESENTE EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, PARA IDENTIFICAR UM PACIENTE CANDITATO A TRATAMENTO, PARA DIAGNOSTICAR UMA DOENÇA E PARA PROPORCIONAR UM PROGNÓSTICO PARA A PROGRESSÃO E PARA TRATAMENTO DE UMA DOENÇA” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Introdução Os dobramentos incorretos (desnaturação) e a agregação do peptídeo beta-amilóide (Αβ) são fundamentais para a patogênese da Mal de Alzheimer (DA). O repertório da imunoglobulina G (IgG) humana contém anticorpos endógenos contra o peptídeo Αβ que aparecem na ausência de vacinação ou imunização passiva. Foi detectada atividade endógena de anticorpos anti-Αβ no sangue de adultos normais de várias idades e de pacientes com DA (Weksler et al., Exp Gerontol., 37:943-948 (2002); Hyman et al., Ann NeuroL, 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging., 25:1023-1032 (2004); Nath et al., Neuromolecular Med., 3:29-39 (2003); Sohn et al., Frontiers in Bioscience., 14:3879-3883 (2009)). Foi relatado que a preparação de anticorpos derivados do plasma humano conhecida como imunoglobulina intravenosa (IGIV) contém níveis elevados de anticorpos anti-amilóides endógenos e que está em estudo como um tratamento potencial para DA (Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry., 75:1472-1474 (2004); Hyman et al., Ann Neurol., 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging., 25:1023-1032 (2004)).

Os estudos publicados fornecem estimativas muito díspares das concentrações relativas de anticorpos anti-Αβ em pacientes com DA versus idosos normais de controle. Estudos iniciais de amostras de plasma intacto por métodos ELISA padrão atribuiram concentrações de anticorpos endógenos contra monômeros Αβ mais baixas para pacientes com DA em comparação com adultos normais (sem demência) de idade similar, de controle (Weksler et al., Exp GerontoL, 37:943-948 (2002)). Estudos subseqüentes relataram concentrações iguais ou maiores de anticorpos contra monômeros anti-Αβ em circulação em pacientes com DA (Mruthinti et al., Neurobiol Aging, 25:1023-1032 (2004)) com base em testes ELISA realizados na imunoglobulina plasmática eluída em colunas de Proteína G em pH baixo (Akerstrõm et al., J Biol Chem., 261:10240-10247 (1986)). As maiores concentrações obtidas por este método supostamente refletiam a presença de um conjunto de anticorpos anti-amilóides ligados que não eram detectados em ensaios com o plasma integral, mas se tomavam mensuráveis quando livres do antígeno pela acidificação durante o decorrer da purificação com proteína G. No entanto, em modelos murinos, a exposição da IgG policlonal a valores baixos de pH resulta na desnaturação parcial dos anticorpos e gera aumentos grandes sistematicamente errados na concentração aparente de anticorpos anti-Αβ (Li et al., BMC Neurosci., 8:22 (2007)). Ensaios que utilizam IgG isolada do plasma humano por cromatografía em proteína G e eluição ácida podem, portanto, resultar em medidas elevadas da atividade anti-amilóide sistematicamente erradas.

A medição da atividade de anticorpos endógenos anti-Αβ se toma ainda mais complicada devido a existência de múltiplas classes de anticorpos humanos que reconhecem neo-epítopos lineares, bem como conformacionais em formas agregadas do Αβ. Relatórios até a presente data identificaram anticorpos endógenos humanos contra fibrilas Αβ (0'Nuallain et al., J Immunol., 176:7071-7078 (2006)), oligômeros Αβ (Moir et al., J Biol Chem., 280:17458-17463 (2005); Relkin et al., Alzheimer’s and Dementia, 3:S196, X (2008); 0’Nuallain et al., Biochemistry, 47:12254-12256 (2008)) e epítopos conformacionais de monômeros Αβ (Baumketner A et al., Prot Sei., 15:420-428 (2006)). Foram relatados outros tipos de anticorpos que se ligam com amilóides e mesmo anticorpos catalíticos contra Αβ (Taguchi H et al., J

Biol Chem., 284:4714-4722 (2008)). Testes ELISA convencionais podem sub- ou superestimar a atividade anti-amilóide total caso eles não levem em consideração a diversidade dos tipos de anticorpos presentes, assim como fenômenos como a reatividade cruzada e a polivalência.

Anticorpos polivalentes tanto para antígenos estranhos como para auto-antígenos são parte do repertório natural de anticorpos humanos (Djoumerska et al., Scand Jof Immunol., 61: 357—363 (2005)). A maioria dos anticorpos polivalentes tem regiões germinais hipervariáveis, demonstram menor afinidade pelos seus antígenos em comparação com anticorpos monovalentes maturados por afinidade e têm locais de ligação com antígeno mais flexíveis. Acredita-se que eles funcionem como um mecanismo de defesa contra agentes patogênicos. Uma característica interessante de alguns anticorpos polivalentes é que eles podem ser gerados a partir de anticorpos monovalentes por tratamentos levemente disruptivos, por exemplo, exposição a um pH inferior a 4 ou a agentes disruptivos (Bouvet et ah, J Autoimmun., 16:163-172 (2001); Dimitrov et ah, Molec Immunol, 44:1854-1863 (2007)). Métodos para aumentar a sensibilidade e a relação sinal-ruído em ensaios para anticorpos anti-Αβ têm sido descritos, incluindo um ensaio de imunoprecipitação por radiação (Brettschneider et ah, Biol Psychiatry., 57:813-816 (2005)) e um método novo de microarranjo de peptídeo que foi usado recentemente para caracterizar anticorpos anti-Αβ humanos endógenos no plasma em função da idade e da DA (Britshgi et ah, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 106:12145-12150 (2009)). Apesar desta última abordagem ter resultado em melhores relações sinal-ruído em comparação com os testes ELISA, o seu uso com plasma integral pode ser problemático devido aos efeitos das outras proteínas plasmáticas e macromoléculas nas medições dos anticorpos anti-Αβ.

Estes e outros fatores que podem confundir as medições dos níveis de anticorpos anti-Αβ endógenos têm implicações importantes para os estudos de tratamento da mal de Alzheimer pela IGIV (preparação de imunoglobulina intravenosa). Primeiramente foi relatado que a IGIV continha anticorpos do monômero anti-Αβ (Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry., 75:1472-1474 (2004)) em níveis relativamente baixos. A escassez de anticorpos anti-Αβ relatada trouxe à tona a questão do potencial da IGIV de exercer efeitos anti-amilóide em pacientes com DA. Apesar disso, testes clínicos da IGIV com pacientes com DA resultaram em desfechos clínicos positivos, bem como em níveis alterados do Αβ no plasma e no fluido cérebro-espinhal (líquido cefaloraquidiano) (Dodel et al., JNeurol Neurosurg Psychiatry., 75:1472-1474 (2004); Relkin et al., Neurobiol. of Aging, 30:1728-1736 (2009)). Apesar da atividade dos anticorpos endógenos anti-amilóide ter sido a razão original para os testes com IGIV em pacientes com DA, não se sabe ao certo se este é o principal ou único mecanismo de ação da IGIV nesta doença. Ainda está para ser respondida a questão de se anticorpos endógenos anti-Αβ verdadeiros estão presentes no plasma humano em níveis suficientes para exercer efeitos biologicamente significativos.

Desta forma, são necessários métodos de ensaio da atividade anti-amilóide no plasma humano aperfeiçoados para uma melhor compreensão do possível papel dos anticorpos endógenos na patogênese e tratamento da mal de Alzheimer e outras doenças associadas a amilóide (amiloidoses). A presente invenção fornece métodos de detecção aprimorados que resolvem os problemas associados com a detecção e quantificação de anticorpos anti-amilóide específicos e, conseqüentemente, com a detecção de amilóide. A invenção fornece, assim, um diagnóstico mais preciso das doenças associadas com proteínas amilóides, seleção de pacientes para tratamentos relacionados a amilóide, e outras aplicações relacionadas a amilóide.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece métodos aprimorados para a preparação e ensaio de anticorpos endógenos anti-amilóide no plasma humano e de preparações de imunoglobulina. Estes novos métodos mostram que o plasma humano contém anticorpos polivalentes que se ligam ao Αβ com avidez mais baixa, bem como anticorpos endógenos anti-amilóide com avidez moderada à alta pelo Αβ e seus agregados.

Em um aspecto, a invenção fornece um método para determinação de anticorpos anti-amilóide com alta avidez presentes em uma amostra. Em algumas configurações, o método consiste das etapas de (a) colocar a amostra biológica em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução constituída de um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (c) a detecção da presença ou o do nível dos complexos remanescentes.

Em algumas configurações, a amostra biológica é sangue ou uma fração do mesmo (p. ex., plasma ou soro). Em algumas configurações, a amostra biológica é preparada usando cromatografia tiofílica antes da etapa (a). Em algumas configurações, a cromatografia tiofílica é usada para a remoção de substancias que não são imunoglobulina da amostra biológica, de modo a resultar em uma preparação de imunoglobulina enriquecida.

Em um segundo aspecto, a invenção fornece um método de detecção da presença de anticorpo anti-amilóide de alta avidez numa amostra biológica, sendo que o método compreende as etapas (a) de passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; e (d) detecção da presença ou do nível do complexo.

Em algumas configurações, a amostra biológica é sangue ou uma fração do mesmo (p. ex., plasma ou soro). Em algumas configurações, o complexo formado entre o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide é lavado com uma solução contendo um sal caotrópico antes da detecção da presença ou do nível do complexo.

Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona um método de identificação de paciente candidato ao tratamento de uma amiloidose ou condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção da concentração de complexos remanescentes; e (d) determinação se o paciente irá se beneficiar de um tratamento que consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle. Em uma configuração, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em algumas configurações dos aspectos descritos aqui, o controle é feito com um indivíduo ou um grupo de indivíduos que não têm amiloidose (doença relacionada a amilóide), de tal modo que uma concentração elevada dos complexos remanescentes com relação ao grupo/indivíduo de controle é indicativa de um candidato ao tratamento. Em algumas configurações, o controle é feito com um indivíduo ou um grupo de indivíduos que têm amiloidose (doença relacionada a amilóide), de tal modo que uma concentração dos complexos remanescentes similar à do controle é indicativa de um candidato ao tratamento. A pessoa qualificada saberá como selecionar pelo menos um controle apropriado e interpretar os resultados de acordo.

Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método para identificar um paciente candidato ao tratamento da amiloidose ou de uma condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide presente na amostra; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; e (d) detecção da presença ou concentração do complexo; e (e) determinação se o paciente se beneficiaria de um tratamento compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina através da comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com uma concentração de controle. Em uma configuração, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina. Conforme explicado acima, pessoa qualificada saberá selecionar pelo menos um controle apropriado para o diagnóstico de uma amiloidose ou condição relacionada a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um quinto aspecto, a invenção fornece um método para diagnóstico de doença associada à proteína amilóide, em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições apropriadas para formação de: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção da concentração de complexos remanescentes; e (d) diagnóstico do paciente pela comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com a concentração de controle. Em algumas configurações, a invenção fornece um método para diagnóstico da mal de Alzheimer, ou da probabilidade de desenvolvimento da doença, num paciente. Conforme explicado acima, pessoa qualificada saberá selecionar pelo menos um controle apropriado para o diagnóstico da amiloidose ou de uma condição relacionada a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método para diagnóstico de doença associada à proteína amilóide, em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide presente na amostra; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou concentração do complexo; e (e) diagnóstico do paciente pela comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com a concentração de controle. Conforme explicado acima, pessoa qualificada saberá selecionar pelo menos um controle apropriado para o diagnóstico da amiloidose ou de uma condição relacionada a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico sobre a progressão de uma doença associada à proteína amilóide em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições apropriadas para formação de: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção da concentração de complexos remanescentes; e (d) fornecimento de um prognóstico para a progressão da mal de Alzheimer no paciente. Conforme explicado acima, pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado para o fornecimento de prognóstico de um distúrbio relacionado a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um oitavo aspecto, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico da progressão de uma doença associada à proteína amilóide em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide presente na amostra; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou concentração do complexo; e (e) fornecimento de um prognóstico para a progressão da doença através da comparação da concentração dos anticorpos anti-amilóide com a concentração de controle. Em algumas configurações, a invenção fornece métodos para fornecimento de prognóstico da progressão da mal de Alzheimer em um paciente. Conforme explicado acima, pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado para o fornecimento de prognóstico de um distúrbio relacionado a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um nono aspecto, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico para um tratamento de doença associada à proteína amilóide, por exemplo, uma terapia conhecida ou uma estratégia preventiva para a DA. Em algumas configurações, o tratamento pode consistir na administração de uma preparação de imunoglobulina em um paciente, tal como uma IGIV. Em algumas configurações o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições apropriadas para formação de: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção da concentração dos complexos remanescentes; e (d) fornecimento de prognóstico para tratamento da doença através da comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com a concentração de controle. Em algumas configurações, a invenção fornece métodos de fornecimento de prognóstico para o tratamento da mal de Alzheimer em um paciente. Conforme explicado acima, pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado para o diagnóstico de um distúrbio relacionado a amilóide e interpretar os resultados de acordo.

Em um décimo aspecto, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico para tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide, por exemplo, uma terapia conhecida ou uma estratégia preventiva para a DA. Em algumas configurações, o tratamento pode consistir na administração de uma preparação de imunoglobulina em um paciente, tal como uma IGIV. Em algumas configurações o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou concentração do complexo; e (e) fornecimento de um prognóstico para tratamento da doença através da comparação da concentração dos anticorpos anti-amilóide com a concentração de controle. Em algumas configurações, a invenção fornece métodos para fornecimento de prognóstico para tratamento da mal de Alzheimer em um paciente. Conforme explicado acima, pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado para o diagnóstico de um distúrbio relacionado a amilóide e interpretar os resultados de acordo..

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. IgG no plasma humano se liga significativamente com poços de ELISA vazios assim como com ο Αβ. A ligação relativa com o Αβ e com placas em branco varia conforme o indivíduo. Amostras de plasma humano (n=23) foram submetidas a ensaios ELISA usando placas com poços em branco e placas contendo o monômero do peptídeo Αβ. Os valores de absorbância resultantes (A45onm) foram plotados como histogramas para cada indivíduo (poços em branco - preto, poços contendo Αβ - cinza).

Figura 2. A ligação com poços vazios ocorre através da região de ligação com o antígeno (Fab) da molécula de IgG. Fragmentos Fab, Fab2’ e Fc comercialmente disponíveis, isolados de um pool de IgG de cinco indivíduos foram ligados à placas em branco e a placas contendo amilóide, segundo a metodologia padrão ELISA. Os fragmentos Fab e Fab2’ ligados foram detectados usando um anticorpo anti-humano secundário capa; os fragmentos Fc foram detectados usando um anticorpo anti-humano IgG secundário específico para a porção Fc da molécula. A ligação com placas em branco é claramente mediada pelas regiões Fab e Fab2’ da molécula de IgG ao invés da região Fc.

Figura 3. A reatividade cruzada dos anticorpos anti-Αβ na IGIV é exemplificada pelos efeitos da tiroglobulina nas propriedades de ligação de anticorpos anti-Αβ (a = placa com Αβ, b = placa Αβ com competição com a tiroglobulina, c = placa com tiroglobulina, d = placa com tiroglobulina com competição com a tiroglobulina). Foram feitas medidas ELISA usando 3 diluições em série de IGIV, começando com 1 mg/ml com e sem a adição de 40 pg/ml de tiroglobulina em placas contendo tanto tiroglobulina (triângulos) como monômeros do peptídeo Αβ (círculos). Esta concentração de tiroglobulina elimina completamente a ligação de anticorpos anti-tiroglobulina na IGIV às placas com tiroglobulina e reduz a ligação às placas com Αβ em aproximadamente 50%.

Figura 4. A avidez dos anticorpos da IGIV ligados às placas de ELISA contendo oligômeros Αβ42 é maior do que a daqueles ligados aos poços de ELISA vazios. Para medição da avidez, IGIV foi ligada à placas de ELISA contendo oligômeros Αβ42 ou a placas em branco sem qualquer antígeno. Poços quadruplicados foram então incubados com concentrações cada vez maiores do sal caotrópico tiocianato de amônio, conforme indicado, e a quantidade de anticorpo humano ligado foi determinada por métodos ELISA padrão. Os resultados exibidos são as médias e os desvios padrão de duas determinações independentes. Anticorpos que se ligam com oligômeros Αβ têm uma avidez maior por seu ligante do que aqueles que se ligam com poços vazios.

Figura 5. O tratamento com 4M tiocianato melhora a proporção de ligação com poços contendo oligômeros Αβ42 versus ligação com poços vazios. A Figura 5 mostra uma experiência ELISA padrão na qual os triângulos sólidos indicam a ligação com as placas contendo oligômeros Αβ42 e os círculos sólidos, a ligação com as placas em branco. Símbolos abertos indicam a mesma experiência de ligação seguida pela incubação com 4M tiocianato. A proporção de ligação com oligômero Αβ42 para ligação com placa em branco usando IgG humana purificada (1 mg/ml) de pacientes de controle é substancialmente aumentada de aproximadamente 3, sem o tratamento com 4M tiocianato, para entre 7 a 10 após este tratamento. Assim, o tratamento com o agente caotrópico permite a medição dos anticorpos do oligômero anti-Αβ de maior avidez em misturas de IgG humana purificada, independentemente dos anticorpos de baixa avidez que se ligam com poços de ELISA vazios.

Figura 6. Gel 10% SDS:NuPage manchado com Coomassie de amostras de proteínas reduzidas com β mercaptoetanol e carregado em massas iguais mostra que a IgG purificada por cromatografia em Adsorvente Tiofílico é quase completamente livre de proteínas plasmáticas contaminantes. As faixas são (a) IGIV, (b) IgG purificada por cromatografia em proteína G, (c) IgG purificada por cromatografia em Adsorvente Tiofílico e (d) amostra plasmática original. Também estão indicados os marcadores de peso molecular (M0 e seus tamanhos em kD.

Figura 7. Ligação de plasma integral e anticorpos isolados do plasma por cromatografia Tiofílica ou de Proteína G a um sensor de ressonância plasmática de superfície (RPS) de oligômero Αβ. O sensograma RPS mostra unidades de resposta arbitrárias (eixo-y) como função do tempo, usando um sensor de oligômero Αβ42. A injeção da amostra foi iniciada em 0 e terminou em 125 segundos; o fluxo de solução-tampão de RPS continuou até 250 segundos antes da limpeza e reconstituição do sensor. A linha vermelha indicativa da resposta de ligação do plasma está perto de zero como resultado da interferência de outras proteínas plasmáticas e macromoléculas. A linha de baixo (rosa) mostra a resposta do IgG isolado usando proteína G e eluição ácida. O resultado parece negativo por causa da polivalência induzida e do resultante aumento da ligação ao sensor de controle. A linha superior (azul) é a resposta da IgG preparada usando o Adsorvente Tiofílico. Os 125 segundos iniciais refletem a atividade total de ligação de anticorpos anti-oligômeros (alta e baixa afinidade), enquanto que a porção do sensograma após a lavagem com solução-tampão (após 125 segundos) é atribuída principalmente aos anticorpos com atividade de ligação de alta afinidade.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Introdução O diagnóstico da mal de Alzheimer é difícil devido ao fato de que a doença, especialmente nos estágios iniciais, apresenta sintomas comuns à diversas outras condições psicológicas. O diagnóstico definitivo pode ser alcançado pela visualização de emaranhados e placas de Αβ que se formam no cérebro. Da mesma forma, outras doenças e condições relacionadas a amilóide são comumente diagnosticadas com o auxílio de biópsia de tecidos, na qual os depósitos de amilóide podem ser marcados (manchados) usando o procedimento do vermelho de Congo (Linke, R.P. (2006) “Protein misfolding, aggregation and conformational diseases” (V.N. Uversky and A.L. Fink, eds.), Protein Reviews, Volume 4, (M.Z. Atassi, ed.); Chapter 11.1, pp. 239-276; Springer). No entanto, devido aos riscos e complicações envolvidos na execução de biópsias em órgãos tais como o cérebro e o coração, esta não é uma solução prática para o diagnóstico de várias doenças relacionadas a amilóide, incluindo a mal de Alzheimer, doença de Creutzfeldt-Jakob e amiloidose cardíaca.

Vantajosamente, a presente invenção fornece métodos não-invasivos para o diagnóstico, ou para auxiliar no diagnóstico de doenças relacionadas a amilóide, através da detecção específica e/ou quantificação de proteínas amilóides em amostras de sangue e plasma. Em algumas configurações, os métodos fornecidos aqui são úteis para auxiliar no diagnóstico de distúrbios relacionados a amilóide, onde o método compreende adicionalmente o uso de um segundo método de diagnóstico. Por exemplo, os métodos fornecidos aqui podem ser usados em combinação com outras ferramentas de diagnóstico para fornecer um diagnóstico ou prognóstico de uma doença relacionada com proteína amilóide. Em uma configuração, os métodos fornecidos aqui podem ser usados em combinação com testes e avaliações usadas para diagnosticar a mal de Alzheimer, que incluem, sem limitação, testes cognitivos, históricos psicossociais, exames do estado mental, testes neuropsicológicos, histórico familiar, tomografias computadorizadas, eletroencefalografia (EEG), Tomografias por Emissão de Pósitrons (PET), Tomografias Computadorizadas por Emissão de Fóton Único (SPECT), Imagens por Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRSI), testes para exclusão de outras doenças (por exemplo, exame físico, radiografia de tórax, ressonância magnética, eletrocardiograma (ECG)), e outros do gênero. Estes métodos superam obstáculos significativos associados com a detecção dessas proteínas, como a ligação não específica de anticorpos de baixa avidez e/ou polivalentes com proteínas amilóides.

Da mesma forma, a presente invenção também fornece métodos para auxiliar em decisões sobre tratamentos. Os métodos não-invasivos aqui fornecidos para a detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez permitem a indicação e/ou administração de uma terapia para tratamento de um distúrbio de relacionado a amilóide. Por exemplo, a presente invenção fornece métodos para a identificação de um paciente com probabilidade de se beneficiar com um tratamento para um distúrbio relacionado a amilóide, com o diagnóstico de um distúrbio relacionado a amilóide, com o fornecimento de um prognóstico para um distúrbio relacionado a amilóide. Assim, em certas configurações, os métodos compreendem ainda uma etapa de indicação e/ou administração de um tratamento para um distúrbio relacionado a amilóide (por exemplo, a administração de IGIV ou outra terapia conhecida) ao paciente. O repertório da imunoglobulina G humana (IgG) contém anticorpos endógenos contra o beta-amilóide (Αβ) que surgem na ausência de imunização. Esses anticorpos podem ser usados para o diagnóstico e tratamento das doenças relacionadas a amilóide, tal como a mal de Alzheimer (DA). A presente invenção trata de problemas que dificultam a mensuração desses anticorpos no plasma e em preparações de imunoglobulinas tal como IGIV (preparação de imunoglobulina a partir de uma combinação de plasma). Esses problemas incluem a ligação relativamente elevada a poços de ELISA vazios, a interferência no ensaio atribuível a outras proteínas plasmáticas, e os efeitos de confusão da polivalência. A abordagem das questões de confusão que questionam a especificidade do anticorpo também melhora a confiabilidade da detecção do amilóide utilizando anticorpos amilóide-específicos. A presente invenção fornece, entre outros aspectos, métodos que melhoram a medição de anticorpos anti-Αβ no plasma. Um fator que pode confundir a medição exata de anticorpos anti-Αβ é a presença de IgG polivalente no plasma humano que se liga às placas de ELISA em branco (bem como a áreas não preenchidas em placas Αβ). A ligação a placas em branco varia entre indivíduos e não é eficazmente eliminada por agentes de bloqueio ELISA padrão ou pela eliminação de interferências. A quantificação de anticorpos anti-Αβ no plasma ou soro humanos foi realizada, na maioria dos casos, em placas de ELISA contendo peptídeo Αβ tanto monomérico como agregado (oligomérico ou fíbrilar). Amostras de plasma de doadores humanos normais analisadas por este método se ligam de forma significativa com poços de ELISA em branco (poços que não contêm qualquer antígeno). Ligações não-específicas consideráveis com placas em branco ocorrem apesar do uso de agentes bloqueadores tradicionais, tais como leite desnatado, soro fetal bovino, albumina e preparações comerciais de bloqueio (Klaver et al. J. Neurosci. Meth. 187, 263-269). A presença de anticorpos que têm a capacidade de se ligar aos poços de ELISA em branco complica a mensuração de anticorpos de oligômeros anti-Αβ em indivíduos, uma vez que os valores de absorbância observados obtidos para os poços vazios podem ser comparáveis ou até mesmo superiores aos obtidos para as placas contendo o amilóide (Figura 1). r E demonstrado aqui que a ligação com placas em branco pode ser significativamente reduzida pela exposição do complexo antígeno-anticorpo a uma solução de sal caotrópico de molaridade adequada para desalojar os anticorpos polivalentes fragilmente ligados, sem redução significativa da ligação de anticorpos anti-Αβ específicos.

Outra fonte potencial de imprecisão nas medições de anticorpos anti-Αβ é a interferência na ligação por outras proteínas e macromoléculas presentes no plasma integral. O isolamento da IgG do plasma pode eliminar essa interferência, mas a exposição a baixos valores de pH durante o isolamento por cromatografia de Proteína G gera polivalência que infla de forma sistematicamente errada as concentrações de anticorpos anti-Αβ medidas.

Usando os métodos aperfeiçoados fornecidos aqui, medições de Ressonância Plasmática de Superfície (RPS) confirmam que o sangue humano (e IGIV) contém anticorpos polivalentes com avidez relativamente baixa para Αβ, bem como anticorpos com avidez de moderada a alta para epítopos conformacionais em monômeros e agregados Αβ (por exemplo, oligômeros, filamentos). E demonstrado aqui que podem ser obtidas medições mais precisas das ligações se for evitada a exposição da IgG a condições desnaturantes durante o isolamento. Ensaios com IgG submetida a cromatografia tiofílica gerou concentrações de anticorpos anti-amilóide que são, essencialmente, inalteradas em relação ao material inicial, o que indica que não foi criada uma polivalência artificial. Em contraste, IgG submetida a eluição ácida em uma coluna de proteína G tem ganhos artificiais de atividade anti-amilóide da ordem de uma magnitude ou mais. IgG produzida pela passagem através de colunas com absorvente tiofílico pode incluir anticorpos ligados ao antígeno. Assim, a concentração medida é aquela do anticorpo livre. A cromatografia tiofílica remove a maioria das proteínas plasmáticas, algumas das quais interferem com as medições de anticorpos anti-amilóide no plasma integral. Medidas como o método de microarranjos utilizando plasma integral podem ser confundidas pela presença de outras proteínas que podem variar entre indivíduos de diferentes idades e estados de doença (Britshgi M et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 106:12145-12150 (2009)).

Conforme explicado acima, as complexidades envolvidas na medição dos anticorpos anti-amilóide humanos geraram incerteza com relação a existência real de IgG endógena específica para amilóide ou se tais anticorpos representam anticorpos polivalentes que ocorrem naturalmente ou que são induzidos artificialmente. Os resultados apresentados aqui mostram que anticorpos humanos endógenos anti-amilóide podem ser, de fato, isolados de IGIV por cromatografia por afinidade. Estes anticorpos mostram especificidade tanto para epítopos lineares como para epítopos conformacionais da proteína beta amilóide com constantes de ligação na faixa de centenas de nanomolar. Isso está na faixa da ordem de grandeza do Kd medido para anticorpos anti-amilóide monoclonais de murino utilizando os mesmo sensores de RPS, e representa uma avidez de ligação consideravelmente maior do que a que seria esperada se esta atividade tivesse surgido da interação de um antígeno-anticorpo polivalente não-específico.

Além disso, os anticorpos anti-fibrilas isolados pela passagem seqüencial em colunas de afinidade de beta-amilóide e fibrila IAPP apresentam menor reatividade cruzada com antígenos amilóides monoméricos e oligoméricos, bem como com placas em branco. Estes resultados sugerem que neo-epítopos conformacionais que diferem ao longo de etapas de agregação de amilóides são reconhecidos pelo repertório da IgG humana. É mostrado aqui que anticorpos anti-amilóide endógenos de alta avidez representam menos de 0,1% da massa total da IgG humana derivada do plasma. A maior capacidade de ligação a amilóide da IGIV relativamente às amostras de plasma individuais podería refletir a diversidade clonal da IGIV inerente à sua derivação de milhares de doadores de plasma. Outra fonte de atividade anti-Αβ mais elevada pode ser a ligação menos específica que ocorre como consequência dos processos químicos e físicos envolvidos na produção da IGIV.

Auto-anticorpos que ocorrem naturalmente podem regular a absorção de antígenos próprios e promover respostas específicas da célula T CD4+ (Nielsen, Eur J Immunol., 31:2660-2668 (2001)). Auto-anticorpos polivalentes anti-Αβ e/ou aqueles gerados pela exposição a condições ligeiramente desnaturantes podem ter efeitos sobre os níveis de peptídeo Αβ em circulação ou no sistema nervoso central. Assim, anticorpos anti-Αβ endógenos podem ser responsáveis pelos benefícios terapêuticos da IGIV em pacientes com DA.

Vantajosamente, os métodos aqui fornecidos permitem a detecção específica e a quantificação de anticorpos anti-amilóide de alta avidez. Especificamente, os métodos fornecidos aqui permitem a detecção e quantificação de uma população heterogênea de anticorpos que se ligam com alta afinidade a uma proteína amilóide que interessa, por exemplo, com um Kd na faixa de um anticorpo monoclonal que foi especificamente evocado contra a proteína amilóide de interesse.

Definições Conforme usado aqui, um “agente caotrópico” se refere a um composto químico que desestabiliza a estrutura tridimensional de proteínas. Em certas configurações, um agente caotrópico pode se referir a um caotropo iônico (por exemplo, um íon caotrópico ou um sal caotrópico) ou, altemativamente, a um caotropo não-iônico. Exemplos não limitantes de sais caotrópicos incluem: sais de guanidínio, p. ex., cloreto de guanidínio, nitrato de guanidínio, tiocianato de guanidínio; sais de tiocianato, p. ex., tiocianato de amônio, tiocianato de potássio, tiocianato de sódio, tiocianato de lítio, tiocianato de cálcio, tiocianato de guanidínio; sais de perclorato, p. ex., perclorato de amônio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, perclorato de magnésio, perclorato de cálcio; sais de iodato, p. ex., iodato de amônio, iodato de potássio, iodato de sódio, iodato de lítio, iodato de magnésio, iodato de cálcio; sais de clorato, p. ex., clorato de sódio, clorato de lítio, clorato de magnésio, clorato de cálcio; e similares. Caotropos não-iônicos incluem, sem limitação, uréia e tiouréia. “Tiofílico” em referência à cromatografia e outros métodos semelhantes baseados na afinidade, se refere à seleção de um ligante contendo enxofre por afinidade a uma proteína, em particular para imunoglobulinas, em altas concentrações de determinados sais. A proteína pode ser eluída pela remoção dos sais. A Cromatografia Tiofílica de Afinidade (TAC) tem uma ampla especificidade para imunoglobulinas de diferentes classes e espécies, e oferece vantagens sobre a purificação com proteína A ou G, devido às condições relativamente suaves, o custo reduzido dos materiais, e a ampla gama de especificidade. Exemplos de sais para uso em TAC incluem o sulfato de amônio, sódio e potássio, embora outros sejam comumente usados. Reagentes TAC e géis estão disponíveis comercialmente, por exemplo, na Millipore®. Para uma avaliação, ver Matejtschuk (2004) Methods in Mol. Biol. 244:195-204.

Os termos “anticorpo”, “imunoglobulina” e outros termos semelhantes referem-se a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou por genes de imunoglobulinas, ou fragmentos destes, que se ligam especificamente e reconhecem um analito (antígeno). Os genes da imunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões constantes capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como a miríade de genes das regiões variáveis da imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas ou como capa ou como lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, que por sua vez, definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Um exemplar da unidade estrutural de (anticorpos) imunoglobulina é composto de dois pares de cadeias polipeptídicas, cada par com uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD). A terminação-N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, responsáveis principalmente pelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável de (VH) referem-se a essas cadeias leves e pesadas, respectivamente. A terminação-C de cada extremidade da cadeia pesada são dissulfetos ligados, e formam a região constante do anticorpo. O termo "ligar-se especificamente" se refere a uma molécula (por exemplo, agente de endereçamento, anticorpo) que se liga a um alvo (antígeno, epítopo, etc) com afinidade pelo menos 2 vezes maior do que os compostos não-alvo, por exemplo, com afinidade pelo menos 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior.

Os termos "antígeno", "analito", "alvo de anticorpos", etc. são utilizados aqui altemadamente. Em alguns casos, o sítio de interação de um anticorpo com seu alvo é definido, p. ex., o sítio-alvo, o sítio de ligação, ou "epítopo". Em alguns casos, o epítopo é uma parte da molécula ou um grupo funcional tridimensional. Assim, por exemplo, onde o alvo é uma proteína, o epítopo pode ser composto de aminoácidos consecutivos, ou aminoácidos de diferentes partes da proteína que são trazidos para perto pelo dobramento da proteína (por exemplo, um epítopo descontínuo). O mesmo é verdade para outros tipos de moléculas-alvo que formam estruturas tridimensionais.

Assim, o termo “antígeno amilóide” pode se referir a um monômero amilóide, um oligômero amilóide ou uma fibrila ou, em vez disso, pode se referir a um fragmento de amilóide ou a um único epítopo. A pessoa qualificada avaliará que uma determinada proteína ou agregado amilóide será composta tipicamente de uma pluralidade de antígenos amilóides ou epítopos. A afinidade do anticorpo é a força da reação entre um único determinante antigênico e um único local de combinação no anticorpo. É a soma das forças atrativas e repulsivas que operam entre o determinante antigênico e o sítio de combinação do anticorpo. Afinidade é normalmente expressa em termos de uma constante de dissociação (KD, Kd, etc.). Quanto maior a afinidade de um anticorpo por um antígeno, menor o Kd.

Conforme usado aqui, os termos "baixa afinidade" e "não-específico" são termos relativos. Os pontos de corte entre a afinidade alta, média, baixa e sem afinidade podem ser definidos pelo usuário em função do rigor desejado, e do intervalo das medições de afinidade obtidas em um indivíduo em particular. Normalmente, um anticorpo de alta afinidade terá um Kd inferior a cerca de 10 nM. Em algumas configurações, um anticorpo de alta afinidade terá um Kd inferior a cerca de 10 nM ou inferior a cerca de 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, nM 3, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 PM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, ou inferior. Normalmente, um anticorpo de baixa afinidade terá um Kd maior que cerca de 100 nM. Em algumas configurações, um anticorpo de baixa afinidade terá um Kd maior que cerca de 100 nM ou maior que cerca de 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 μΜ, 2 μΜ, 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, ou maior.

Avidez é uma medida da força total de ligação de um antígeno com vários determinantes antigênicos e anticorpos multivalentes. Avidez é influenciada tanto pela valência do anticorpo como pela valência do antígeno. Avidez, entretanto, é mais do que a soma das afinidades individuais. Ou seja, a afinidade se refere à força da ligação entre um único determinante antigênico e um sítio de combinação de um anticorpo individual, ao passo que a avidez se refere à força total de ligação entre os antígenos e anticorpos multi valentes. Em configurações dos métodos fornecidos aqui, um anticorpo anti-amilóide sendo detectado tem alta avidez pela proteína amilóide alvo. Em algumas configurações, um anticorpo anti-amilóide sendo detectado tem tanto avidez alta como afinidade alta pelo epítopo amilóide alvo. Em outras configurações, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado tem alta avidez pela proteína amilóide alvo, no entanto tem baixa afinidade por um epítopo amilóide individual.

Conforme usado aqui, “proteína amilóide” se refere a um polipeptídio capaz de se polimerizar para formar uma estrutura beta-cruzada in vivo ou in vitro. Estas proteínas se depositam anormalmente em órgãos e/ou tecidos de pacientes que sofrem de condições caracterizadas por amiloidoses (p. ex., mal de Alzheimer, mal de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob, etc). Assim, um anticorpo anti-amilóide é um anticorpo que reconhece especificamente uma proteína amilóide. Os anticorpos anti-amilóide reconhecem especificamente um ou mais estados oligoméricos de uma determinada proteína amilóide, por exemplo, uma proteína amilóide monomérica, dimérica ou oligomérica. Exemplos não-limitantes de proteínas amilóide incluem porteína beta-amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (Apo-Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína do fator de transformação do crescimento beta induzido ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3) e imunoglobulina de cadeia leve (AL). Qualquer uma destas ou outras proteínas amilóides podem ser detectadas usando os métodos fornecidos aqui.

Conforme usado aqui, uma “amostra biológica” se refere a uma célula ou população de células ou uma quantidade de tecido ou fluido de um paciente. Mais freqüentemente, a amostra foi removida de um animal, p. ex., um ser humano. “Amostra biológica’ inclui sangue e frações do sangue (p. ex. plasma, soro, etc), outros fluidos biológicos (p. ex. urina, saliva, fluidos linfáticos, líquido cefaloraquidiano(CSF), etc.) seções de tecido tal como amostras de biópsias ou autópsias, seções congeladas retiradas para fins histológicos, tecidos linfáticos, cultura de células, e afins.

Conforme usado aqui, o termo “cerca de” denota uma faixa aproximada de mais ou menos 10% de um valor específico. Por exemplo, “cerca de 20%” inclui uma faixa de 18-22%. Conforme usado aqui, “cerca de” também inclui a quantidade exata. Sendo assim, “cerca de 20%” significa “cerca de 20%” e também “20%”. Conforme usado aqui, “cerca de” se refere a uma faixa próxima ou exatamente ao valor especificado.

Os termos “dose” e “dosagem” são usados altemadamente neste documento. Uma dose se refere à quantidade de ingrediente ativo dada a um indivíduo em cada administração. A dose pode variar dependendo de vários fatores, incluindo a frequência de administração; o tamanho e a tolerância do indivíduo; a gravidade da condição; o risco de efeitos colaterais; e a via de administração. Pessoa qualificada irá reconhecer que a dose pode ser modificada dependendo dos fatores acima, ou com base no progresso terapêutico. O termo "dosagem" refere-se ao formato específico do fármaco, e depende da via de administração. Por exemplo, uma forma de dosagem pode ser em líquido, por exemplo, uma solução salina para injeção.

Uma quantidade ou dose “terapeuticamente eficaz” ou uma quantidade ou dose "suficiente/eficaz", é uma dose que produz os efeitos para os quais ela é administrada. A dose exata vai depender da finalidade do tratamento, e será determinável por pessoa qualificada através de técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Conforme usado aqui, o termo "prevenção" se refere a um risco diminuído ou uma menor freqüência de sintomas cognitivos ou placas amilóides em um paciente. A prevenção pode ser completa ou parcial, de tal forma que menos sintomas são observados em um paciente do que seriam observados sem a presente invenção.

Os termos "terapia", "tratamento" e "melhora" se referem a qualquer redução na gravidade dos sintomas ou na quantidade de agregados amilóides, ou melhora na função cognitiva. Conforme usado aqui, os termos "tratar" e "prevenção/prevenir" não stóem a intenção de serem termos absolutos. O tratamento pode se referir a qualquer atraso no início da doença, melhora dos sintomas, melhora na sobrevida dos pacientes, aumento no tempo ou taxa de sobrevida, etc. O efeito do tratamento pode ser comparado com um indivíduo ou grupo de indivíduos que não recebem o tratamento.

Uma amostra ou valor de "controle" se refere a uma amostra que serve como referência, normalmente uma referência conhecida, para comparação com uma amostra de teste. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser tomada de um paciente com um status desconhecido de amilóide e comparada com amostras de controle de um paciente com diagnóstico de amiloidose (por exemplo, a mal de Alzheimer, mal de Parkinson, doença de Creutzfeldt-Jakob, etc.) e/ou com um indivíduo que não sofre de amiloidose ou que sabidamente tem uma baixa concentração de anticorpo anti-amilóide. Um controle também pode representar um valor médio calculado para uma população de indivíduos semelhantes, por exemplo, pacientes com mal de Alzheimer, pacientes com mal de Parkinson, pacientes com doença de Creutzfeldt-Jakob, etc., com um histórico médico similar, ou da mesma idade, peso, etc. Um valor de controle também pode ser obtido a partir de um mesmo indivíduo, por exemplo, a partir de uma amostra obtida previamente, antes dos sintomas, ou antes ou em diferentes momentos ao longo da terapia. Em alguns casos, os controles podem incluir comparações dos dados de um mesmo indivíduo ou entre indivíduos, por exemplo, a comparação das concentrações de anticorpos anti-amilóide com a concentração de um ou mais anticorpos conhecidos.

Pessoa qualificada entenderá quais controles são importantes em uma dada situação e será capaz de analisar os dados com base nas comparações com os valores de controle. Os controles também são importantes para a determinação da significância dos dados. Por exemplo, se os valores de um determinado parâmetro são amplamente variáveis nos controles, a variação nas amostras de teste não será considerada significativa. Mal de Alzheimer e outros Distúrbios Relacionados a Amilóide Proteínas amilóides e agregados anormais de proteínas têm papel importante em várias doenças e condições diferentes. A invenção fornece métodos para identificação de auto-anticorpos de alta avidez específicos contra várias formas de proteínas amilóides ou determinados agregados de proteínas que podem ser úteis no diagnóstico e na determinação de um curso terapêutico.

Doenças relacionadas a amilóide incluem não só a mal de Alzheimer (DA), mas também a mal de Parkinson, a polineuropatia amiloidótica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), várias formas de amiloidoses (p. ex., sistêmica senil, do tipo finlandês, do tipo islandesa, leptomeningea, visceral familiar, cutânea, relacionada à diálise, etc), e amiloidose aórtica mediai. Outros distúrbios relacionados à agregação anormal de proteínas incluem diabetes mellitus Tipo II, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, aterosclerose, artrite reumatóide, prolactinoma, demência fronto-temporal, síndrome de Down, demência com corpos de Lewy, e doenças similares.

Da mesma forma, a invenção pode ser usada para identificar e/ou isolar auto-anticorpos contra formas específicas de amilóides e agregados amilóides encontrados em distúrbios relacionados a amilóide. Além disso, os métodos divulgados aqui podem ser aplicados para detecção de anticorpos contra agregados anormais de proteínas formados a partir de beta-amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (Apo-Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite; MFG-E8), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína do fator de transformação do crescimento beta induzido ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3) e imunoglobulina de cadeia leve (AL), proteínas com repetições poliQ, proteína Tau (Tau) e outras proteínas amilóide. A identificação de auto-anticorpos específicos, p. ex., para fibrilas Αβ no caso de DA e mal de Parkinson, pode ser usada no diagnóstico ou na avaliação de risco. Os métodos de diagnóstico da invenção podem ser aplicados em indivíduos considerados de risco para desenvolvimento de distúrbios relacionados a amilóide, p. ex., baseado em idade, histórico familiar, sintomas cognitivos, etc., conforme pode ser determinado por pessoa qualificada em medicina.

Os fatores de risco e sintomas de distúrbios relacionados a amilóide serão melhor determinados por um médico habilidoso. O risco de desenvolver estas doenças aumenta com a idade, e tem correlação com o histórico familiar. Em muitos casos, um diagnóstico absolutamente definitivo é considerado inviável. Sintomas observáveis da DA incluem perda inquietante de memória, diferenças na capacidade de resolver problemas, confusão com relação ao tempo ou lugar, dificuldade para completar tarefas de rotina, isolamento social e alterações de humor. Estes se relacionam com as manifestações físicas da doença, tais como o aumento na formação de placas amilóides e a diminuição global do volume cerebral.

Detecção e Isolamento de Imunoglobulinas Anti-Amilóide Baixas concentrações de auto-anticorpos podem ser encontradas no sangue de indivíduos que não foram inoculados com um determinado antígeno. Por exemplo, preparações de plasma extraído de um conjunto de indivíduos inclui uma pequena fração de anticorpos IgG que se ligam a proteínas amilóides, tal como Αβ. Como foi explicado aqui, os métodos pouco precisos de determinação da especificidade do anticorpo e os métodos severos de isolamento de anticorpos causaram incerteza se anticorpos específicos para amilóide realmente existem, ou se, em vez disso, representam artefatos ou interações não-específicas. A presente invenção fornece métodos de identificação e/ou isolamento de anticorpos que são específicos para várias formas de amilóide, inclusive proteínas amilóide monoméricas, oligoméricas e fibrilares. (i.e., Αβ). Por exemplo, a pequena população de IgGs Αβ-específicas que pode ser isolada de uma amostra biológica pela remoção de anticorpos de baixa afinidade e não-específicos usando uma lavagem levemente caotrópica. Em algumas configurações os métodos incluem, primeiramente, a separação da IgG de outras proteínas na amostra usando métodos baseados na afinidade tiofílica, e remoção dos anticorpos de baixa afinidade e não-específicos usando uma lavagem levemente caotrópica. Estas etapas podem ser realizadas em qualquer ordem. Tipicamente, a amostra biológica é plasma ou soro sanguíneo.

Pessoa qualificada saberá avaliar que o agente caotrópico deve estar presente em uma quantidade suficiente para romper as fracas interações de ligação dos anticorpos de baixa afinidade e não-específicos sem prejudicar significativamente a especificidade de ligação dos anticorpos de alta afinidade. Por exemplo, enquanto a uréia é um agente caotrópico, uma elevada concentração de uréia pode gerar polivalência. Isto não é fatal para os métodos de identificação da invenção, já que qualquer afinidade específica para amilóide gerada pelo agente caotrópico será, tipicamente, baixa.

Os anticorpos podem ser detectados usando métodos padrão, por exemplo, usando um agente de ligação com anticorpo marcado que seja detectável tal como um anticorpo anti-humano secundário, antígeno (p.ex., Αβ), Proteína A, proteína G, etc. Tais métodos incluem ELISA, métodos Western blot, imunofluorescência, e outros métodos de detecção de proteínas conhecidos (ver, p. ex., U.S. Patents 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; and 4,837,168). Para uma revisão dos imunoensaios em geral, ver também Methods in Cell Biology, Vol. 37, Asai, ed. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991). Ensaios imunológicos (ou imunoensaios) normalmente utilizam um ligante (por exemplo, amilóide, Αβ, ou uma forma particular de Αβ) para se ligar especificamente e, muitas vezes, imobilizar um anticorpo.

Imunoensaios também muitas vezes utilizam um marcador que se liga e marca especificamente o complexo formado pelo ligante e anticorpo. O marcador pode ser, ele próprio, uma das partes (grupamentos funcionais) que compreendem o complexo anticorpo/analito, p. ex., analito marcado detectável. Altemativamente, o marcador pode ser uma terceira parte tal como outro anticorpo, que se liga especificamente ao complexo anticorpo/analito.

Pode ser utilizado um ensaio competitivo, onde o marcador é um segundo anticorpo anti-amilóide marcado. Os dois anticorpos então competem pela ligação com o antígeno amilóide imobilizado. Altemativamente, em um formato não-competitivo, o anticorpo anti-amilóide não é marcado, mas um segundo anticorpo específico a anticorpos da espécie da qual o anticorpo anti-amilóide é derivado, por exemplo, humana, e que se liga o anticorpo anti-amilóide, é marcado.

Outras proteínas capazes de ligarem especificamente as regiões constantes da imunoglobulina, como a proteína A ou proteína G, também podem ser usadas como marcadores (ver, de modo geral Kronval, et al., J. Immunol. 111:1401-1406 (1973); e Akerstrom, et al., J. Immunol. 135:2589-2542(1985)).

Ao longo dos ensaios, podem ser necessárias etapas de incubação e/ou de lavagem após cada combinação de reagentes. As etapas de incubação podem variar de cerca de 5 segundos a várias horas, p. ex., de cerca de 5 minutos até cerca de 24 horas. No entanto, o tempo de incubação dependerá do formato de ensaio, anticorpo, volume da solução, concentrações, e coisas a fim. Normalmente, os ensaios serão realizados à temperatura ambiente, embora eles possam ser realizados em um intervalo de temperatura, tal como 10°C a 40°C.

Caso seja desejado, o usuário pode definir um intervalo de corte para afinidade/avidez alta, média ou baixa, e detectar anticorpos que se enquadram dentro dessas faixas. Ensaios de afinidade podem ser usados para determinação da constante de dissociação (Kd) do anticorpo. A frase "constante de dissociação" se refere a afinidade de um anticorpo por um antígeno. A especificidade de ligação entre um anticorpo e um antígeno existe se a constante de dissociação (KD = 1/K, onde K é a constante de afinidade) do anticorpo é <1 μΜ, com anticorpos com especificidade e afinidade maiores freqüentemente tendo um KD <100 nM ou <10 nM. KD = [Ab-Ag]/[Ab][Ag], onde [Ab] é a concentração do anticorpo no equilíbrio, [Ag] é a concentração do antígeno no equilíbrio, e [Ab-Ag] é a concentração no equilíbrio do complexo anticorpo-antígeno. Tipicamente, as interações de ligação entre antígeno e anticorpo incluem associações não-covalentes reversíveis tal como atração eletrostática, forças de Van der Waals e pontes de hidrogênio. Este método de definição de especificidade de ligação se aplica a cadeias simples pesadas e/ou leves, CDRs, proteínas de fusão ou fragmentos de cadeias pesadas e/ou leves. A população resultante de anticorpos anti-Αβ específicos é heterogênea, mas se liga com Αβ com alta afinidade, p. ex., com um Kd na faixa de um anticorpo monoclonal que surgiu especificamente contra ο Αβ. Terapias para Distúrbios Relacionados a Amilóide e Mal de Alzheimer Tratamentos para doenças e condições relacionadas a amilóide, tal como DA, normalmente se concentram nos sintomas cognitivos e de humor da doença. O tratamento precoce e os regimes de prevenção incluem atividade física e social, jogos de memória e quebra-cabeças e resolução de problemas. Terapias farmacêuticas para indivíduos sintomáticos incluem inibidores da colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina) e medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina).

Também foi observado que preparações de pool de imunoglobulina podem ser eficientes para a melhoria de sintomas de DA. Tais preparações, chamadas de IGIV (imunoglobulina intravenosa) são preparadas conforme descrito, p. ex., em USSN 12/789.345 (arquivada em 27 de Maio de 2010) e USSN 12/789.365 (arquivada em 27 de Maio de 2010). Métodos para tratamento de DA, mal de Parkinson e outros distúrbios de agregação de proteínas usando IGIV são divulgados em US Pub. Nos. 2009/0148463 e 2009/0221017.

Resumidamente, a IGIV é formada pela associação de sangue intravenoso de mais de um indivíduo, separação da fração de plasma, e enriquecimento para imunoglobulina IgG utilizando uma combinação de cromatografia, ultrafiltração e diafiltração. IGIV é normalmente administrada por infusão intravenosa. Métodos para a Detecção de Anticorpos Anti-Amilóide Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos aperfeiçoados para detecção de anticorpos anti-amilóide em uma amostra biológica. Por exemplo, são fornecidos aqui métodos para a medição de anticorpos anti-amilóide de alta avidez presentes no sangue de um mamífero. Em uma configuração, a presente invenção fornece métodos para a quantificação exata de anticorpos contra proteínas amilóides agregadas ou não-agregadas presentes em fluidos biológicos. Estes anticorpos estão emergindo como ferramentas importantes para a previsão, diagnóstico e tratamento de amiloidoses humanas, incluindo a mal de Alzheimer (DA) e outros distúrbios neurodegenerativos. Os anticorpos também podem se desenvolver em outras espécies de mamíferos, em particular aqueles utilizados como modelos dessas doenças. Como tal, a presente invenção melhora a quantificação e caracterização de anticorpos contra proteínas amilóides agregadas, bem como monômeros amilóides desagregados quando a concentração de monômeros no líquido a ser estudado é baixa.

Assim, a presente invenção fornece métodos para a detecção de anticorpos anti-amilóide, por exemplo, a partir de uma amostra biológica de um indivíduo. Normalmente, os anticorpos anti-amilóide serão solúveis na amostra biológica, por exemplo, soro, plasma, líquido cefalorraquidiano, linfa, urina ou outros fluidos biológicos ou fração. No entanto, os anticorpos and-amilóide também podem ser detectados em biópsias de tecidos.

Em métodos preferenciais, uma amostra biológica (por exemplo, amostra de sangue, soro ou plasma) é coletada ou uma biópsia é realizada e a amostra biológica coletada é testada in vitro. Em certas configurações, as imunoglobulinas presentes na amostra são enriquecidas antes da detecção. Em outras configurações, as imunoglobulinas não são enriquecidas antes da detecção. O tecido ou fluido é, então, colocado em contato com um antígeno amilóide e quaisquer complexos imunes resultantes indicam a presença de um anticorpo anti-amilóide na amostra. Para facilitar tal detecção, o antígeno amilóide pode ser radioativo ou acoplado a uma molécula efetora que é uma marcação detectável, tal como uma etiqueta fluorescente.

Os anticorpos anti-amilóide e proteínas e/ou agregados amilóides, podem ser detectados usando os métodos padrão de imunoensaios. Métodos padrão incluem, por exemplo, radio-imunoensaio, imunoensaios tipo sanduíche (inclusive ELISA), ensaios de imunofluorescência, ensaios tipo Western blot, cromatografia por afinidade (um ligante de afinidade ligado a uma fase sólida) e a detecção in situ com anticorpos marcados. Marcadores detectáveis adequados para tal uso incluem qualquer composição detectável por espectroscopia, fotoquímica, bioquímica, imunoquímica, ou meios elétrico, ótico ou químico. Marcadores úteis na presente invenção incluem contas magnéticas (p. ex., DYNABEADS), corantes fluorescentes (p. ex., isotiocianato de fluoresceína, vermelho do Texas, rodamina, proteína fluorescente verde e similares), marcadores radiativos (p. ex., 3H, 125I, 35S, 14C ou P), enzimas (p. ex., peroxidase de rábano, fosfatase alcalina e outras comumente usadas nos testes ELISA) e marcadores colorimétricos tal como ouro coloidal ou contas de vidro ou plástico colorido (p. ex., poliestireno, polipropileno, látex). Em algumas configurações, é utilizado um agente de detecção secundário para a detecção da ligação de anticorpos anti-amilóide (p. ex., IgG caprino anti-humano marcado com FITC - isotiocianato de fluoresceína). Uma visão geral da tecnologia aplicável pode ser encontrada em Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988). Métodos empregados atualmente para a medição de anticorpos anti-amilóide extraídos de espécimes biológicos sofrem ganhos ou perdas artificiais de atividade anti-amilóide como resultado da exposição à condições desnaturantes. Por exemplo, alguns métodos utilizam acidificação tanto durante o enriquecimento de anticorpos (Ig) usando cromatografia por afinidade com Proteína A ou G o para liberação de anticorpos dos antígenos ligados. A exposição a pH baixos faz com que certas imunoglobulinas de mamíferos se desnaturem parcial ou completamente. Isto leva ou a uma perda de função ou a um aumento da polivalência, ambos os fenômenos tendo efeitos deletérios na medição de níveis de anticorpos anti-amilóide específicos. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui separam a Ig do plasma e dissociam moléculas de antígeno fracamente ligadas dos anticorpos anti-amilóide sem a exposição a ácidos ou outras condições desnaturantes.

Em uma configuração, a presente invenção fornece métodos para a quantificação das concentrações de anticorpos contra as proteínas formadoras de amilóide no plasma de mamíferos e outros fluidos biológicos. Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Por exemplo, ensaios prévios que empregavam o plasma integral para medir a atividade anti-amilóide endógena são alterados artificialmente pela interferência de outras macromoléculas não identificadas do plasma. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui eliminam a interferência destas macromoléculas plasmáticas não identificadas de maneira tal que preserva os anticorpos anti-amilóide que interessam.

Medições feitas em substratos convencionais de vidro, metal ou plástico são afetadas pela ligação não-específica de anticorpos à proteína amilóide e às placas do ensaio. O plasma humano contém uma quantidade relativamente grande de anticorpos polivalentes que têm baixa avidez por agregados amilóides. A presença de tais anticorpos, assim como de anticorpos que se ligam de maneira não-específica aos substratos do ensaio, alteram artificialmente a medida da atividade anti-amilóide em vários métodos de ensaio. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui distinguem anticorpos específicos de não-específicos com base nas diferenças na avidez de ligação. Métodos que Utilizam uma Etapa de Lavagem Caotrópica Em uma configuração, a presente invenção fornece métodos para a quantificação das concentrações de anticorpos contra as proteínas formadoras de amilóide no plasma de mamíferos e outros fluidos biológicos. Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Por exemplo, medições feitas em substratos convencionais de vidro, metal ou plástico são afetadas pela ligação não-específica de anticorpos à proteína amilóide e às placas do ensaio. O plasma humano contém uma quantidade relativamente grande de anticorpos polivalentes que têm baixa avidez por agregados amilóides. A presença de tais anticorpos, assim como de anticorpos que se ligam de maneira não-específica aos substratos do ensaio, altera artificialmente a medida da atividade anti-amilóide em vários métodos de ensaio. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui distinguem anticorpos específicos de não-específicos com base nas diferenças na avidez de ligação.

Assim, em um aspecto, a invenção fornece um método para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez presentes em uma amostra. Em algumas configurações, o método compreende as etapas de (a) combinar a amostra biológica com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução constituída de um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (c) a detecção da presença ou da concentração dos complexos remanescentes.

Em uma configuração, a amostra biológica é um fluido biológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, linfa, líquido sinovial, etc. Em outras configurações, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido ou biópsia. Em uma configuração preferencial, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou fração do mesmo (por exemplo, plasma ou fração de plasma). Em outra configuração preferencial, a amostra biológica é uma preparação de imunoglobulina ou uma preparação de imunoglobulina enriquecida. Em uma configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia tiofílica. Em outra configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia por afinidade de modo misto com ligantes.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N- acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína anti-amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína anti-amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em outra configuração ainda, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas anti-amilóide.

Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para Beta amilóide (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez. A etapa de lavagem caotrópica empregada nos métodos fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído ou por um ânion de efeito caotrópico igual ou superior a um íon clorato (C103~ ) ou por um cátion com efeito caotrópico maior que um íon cálcio.

Em uma configuração, o sal caotrópico é um sal de guanidina. Exemplos não limitantes de sais de guanidina, que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui, incluem cloreto de guanidina, nitrato de guanidina e tiocianato de guanidina.

Em outra configuração, o sal caotrópico é um sal de tiocianato.

Exemplos não limitantes de sais de tiocianato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem tiocianato de amônio, tiocianato de potássio, tiocianato de sódio, tiocianato de lítio, tiocianato de cálcio e tiocianato de guanidina. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem de cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem de cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem de cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de perclorato. Exemplos não limitantes de sais de perclorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem perclorato de amônio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, perclorato de magnésio, e perclorato de cálcio.

Em outra configuração ainda, o sal caotrópico é um sal de iodato. Exemplos não limitantes de sais de iodato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem iodato de amônio, iodato de potássio, iodato de sódio, iodato de lítio, iodato de magnésio e iodato de cálcio.

Em outra configuração ainda, o sal caotrópico é um sal de clorato. Exemplos não limitantes de sais de clorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem clorato de sódio, clorato de lítio, clorato de magnésio, e clorato de cálcio. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e antígenos amilóide, mas que não rompa as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). Pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, imunoglobulinas encontradas na amostra biológica (i. e., sangue, plasma, urina, linfa, etc.) são enriquecidas antes da etapa de colocação da amostra biológica em contato com um ou mais antígenos amilóides. Preferencialmente, as imunoglobulinas são enriquecidas por um método que não desnature parcial ou completamente os anticorpos. Em uma configuração, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreende uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método cromatográfico que não resulte na desnaturação dos anticorpos. Em uma configuração, o método cromatográfico é realizado com resina tiofílica. Em outra configuração, o método cromatográfico é realizado com química de ligante de modo misto (Upffont Chromatography A/S). Em outras configurações, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreendem uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método não-cromatográfico que não resulta na desnaturação dos anticorpos. Métodos que Utilizam uma Etapa de Enriquecimento Tiofílico Em uma configuração, a presente invenção fornece métodos para quantificar os níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóides no plasma de mamíferos e outros fluidos biológicos. Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação da imunoglobulina durante a purificação.

Por exemplo, ensaios prévios que empregavam o plasma integral para medir a atividade anti-amilóide endógena são alterados artificialmente pela interferência de outras macromoléculas não identificadas do plasma. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui eliminam a interferência destas macromoléculas plasmáticas não identificadas de maneira tal que preserva os anticorpos anti-amilóide que interessam. Métodos empregados atualmente para a medição de anticorpos anti-amilóide extraídos de espécimes biológicos sofrem ganhos ou perdas artificiais de atividade anti-amilóide como resultado da exposição à condições desnaturantes. Por exemplo, alguns métodos utilizam acidificação tanto durante o enriquecimento de anticorpos (Ig) usando cromatografia por afinidade com Proteína A ou G o para liberação de anticorpos dos antígenos ligados. A exposição a pH baixos faz com que certas imunoglobulinas de mamíferos se desnaturem parcial ou completamente. Isto leva ou a uma perda de função ou a um aumento da polivalência, ambos os fenômenos tendo efeitos deletérios na medição de níveis de anticorpos anti-amilóide específicos. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui separam a Ig do plasma e dissociam moléculas de antígeno fracamente ligadas dos anticorpos anti-amilóide sem a exposição a ácidos ou outras condições desnaturantes.

Assim, em um aspecto, a invenção fornece um método de detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez presentes em uma amostra biológica, o método compreendendo as etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; e (d) detecção da presença ou concentração do complexo.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (Apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em ainda outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas de proteína amilóide.

Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para Beta amilóide (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, o complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide é lavado com um sal caotrópico antes da detecção da presença ou nível de tal complexo, de modo a dissociar as interações entre anticorpos não-específicos (i.e., anticorpos de baixa avidez) e o antígeno amilóide. A etapa de lavagem caotrópica empregada nos métodos fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído por um ânion de efeito caotrópico igual ou superior a um íon clorato (C103") ou por um cátion com efeito caotrópico maior que um íon cálcio. Em uma configuração, o agente caotrópico é selecionado dentre uréia, tiouréia, um sal de guanidina, um sal de tiocianato, um sal de perclorato, um sal de iodato e um sal de clorato. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e antígenos amilóide, mas que não rompa as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). Pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M. Métodos de Diagnóstico e Prognóstico Em alguns aspectos os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide podem ser usados para diagnóstico de, e prognóstico de indivíduos com risco de sofrerem ou que sofrem de doenças relacionadas com amilóide conforme descrito acima. Por exemplo, níveis elevados de amilóide, em particular, Αβ, no soro e em alguns tecidos podem indicar uma maior probabilidade de desenvolvimento de placas de amilóide associadas com mal de Alzheimer. Níveis elevados de auto-anticorpos específicos para amilóide também indicam que um indivíduo tem risco de desenvolver DA, ou indicam uma piora nos sintomas relacionados à DA. Métodos para Diagnóstico e/ou Seleção de um Tratamento Adequado Assim, em algumas configurações, a invenção fornece métodos para diagnóstico e/ou seleção de um curso de tratamento para um paciente que tem ou que se suspeita que tenha um distúrbio relacionado a amilóide. Em algumas configurações, os métodos incluem a detecção e/ou medição de auto-anticorpos específicos para uma proteína amilóide. Métodos para detecção de anticorpos endógenos com alta avidez para proteínas amilóides são descritos aqui.

Em uma configuração, os métodos para detecção de anticorpos anti-amilóide podem compreender a obtenção de amostras contendo anticorpos de um paciente, convenientemente uma amostra de sangue ou plasma. A amostra pode ser ainda mais separada, por exemplo, em plasma e material celular, para isolamento da fração contendo anticorpos, embora esta etapa não seja necessária. A amostra também pode ser exposta à filtração por tamanho e/ou métodos cromatográficos. Em algumas configurações, a amostra é exposta à cromatografia tiofilica para remoção das proteínas que não são imunoglobulinas da amostra. A amostra, ou eluente, pode então ser combinada com um antígeno amilóide em um sistema projetado para detectar a interação entre o anticorpo e o antígeno, por exemplo, um antígeno conjugado a uma matriz conveniente, por exemplo, uma placa de ELISA ou uma matriz de cromatografia. O antígeno amilóide pode ser de qualquer forma, tanto um amilóide heterogêneo, como um monômero amilóide principalmente homogêneo, oligômero ou fibrila. Após um tempo de incubação suficiente para permitir a formação de complexos amilóide-anticorpo, os complexos amilóide-anticorpo são expostos a uma lavagem constituída de um agente caotrópico, para remoção de anticorpos de baixa afinidade e não-específicos. Após a lavagem caotrópica, a presença ou o nível de anticorpos complexados com antígeno amilóide é detectado. O anticorpo pode ser eluído do antígeno antes da detecção, caso seja desejado, ou pode ser competido com um antígeno amilóide marcado, para facilitar a detecção. Os anticorpos podem ser detectados como descrito acima.

Em algumas configurações, pelo menos um controle é feito juntamente com a amostra e comparado em termos de quantidade de anticorpo e/ou nível de ligação. Em outras configurações, os resultados do ensaio podem ser comparados com um nível de controle que tenha sido estabelecido previamente para o sistema de interesse. Por exemplo, um controle positivo pode incluir a mesma amostra biológica obtida de um indivíduo ou grupo de indivíduos que, sabidamente, têm doença relacionada a amilóide. Outro exemplo de um controle positivo adequado é um anticorpo monoclonal anti-amilóide conhecido, por exemplo, como um comparativo de alta afinidade e/ou avidez. Um exemplo de controle negativo pode incluir a mesma amostra biológica obtida de um indivíduo ou grupo de indivíduos que, sabidamente, tem baixo risco de desenvolverem a doença relacionada a amilóide. Outro exemplo de um controle negativo adequado é um anticorpo conhecido específico para um antígeno não-amilóide ou com baixa avidez pelo antígeno amilóide.

Utilizando tais métodos, e correlacionando um nível relativamente alto de anticorpos anti-amilóide com uma maior probabilidade ou um risco maior do paciente desenvolver uma doença relacionada a amilóide, a pessoa qualificada poderá diagnosticar uma doença relacionada a amilóide no paciente.

Os métodos acima podem ser aplicados na seleção de um grupo de pacientes para uma terapia para tratamento de doenças relacionadas a amilóide. Por exemplo, o nível de anticorpos anti-amilóide pode ser determinado em uma pluralidade de indivíduos. Como explicado acima, esses indivíduos determinados como tendo níveis relativamente altos de anticorpos anti-amilóide podem ser selecionados para o tratamento. Em algumas configurações, o nível de anticorpos anti-amilóide é detectado periodicamente durante o curso de tratamento. Em algumas configurações, o tratamento inclui a administração de IGIV. Métodos de Utilização da Etapa de Lavagem Caotrópica Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para a identificação de um paciente que é candidato para o tratamento de uma doença ou uma condição relacionada a amilóide, que inclui quantificar os níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóides no plasma e em outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de lavagem caotrópica é empregada para redução do sinal associado com a ligação de antígenos anti-amilóide não-específicos e de baixa avidez. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, a doença relacionada a amilóide é a mal de Alzheimer.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece métodos para diagnosticar uma doença associada a uma proteína amilóide, que inclui quantificar os níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóides no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de lavagem caotrópica é empregada para redução do sinal associado com a ligação de antígenos anti-amüóide não-específicos e de baixa avidez. Em uma modalidade preferida, o método é para diagnosticar a mal de Alzheimer.

Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação da imunoglobulina durante a purificação.

Por exemplo, medições feitas em substratos convencionais de vidro, metal ou plástico são afetadas pela ligação não-específica de anticorpos à proteína amilóide e às placas do ensaio. O plasma humano contém uma quantidade relativamente grande de anticorpos polivalentes que têm baixa avidez por agregados amilóides. A presença de tais anticorpos, assim como de anticorpos que se ligam de maneira não-específica aos substratos do ensaio, altera artificialmente a medida da atividade anti-amilóide em vários métodos de ensaio. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui são capazes de distinguir anticorpos específicos de não-específicos com base nas diferenças na avidez de ligação.

Assim, em uma configuração específica, a invenção fornece um método de identificação de paciente candidato ao tratamento de uma doença ou condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo amilóide de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção do nível de complexos remanescentes; e (d) determinação se o paciente irá se beneficiar de um tratamento para uma doença ou condição relacionada a amilóide pela comparação do nível de anticorpo anti-amilóide com um valor de controle. Em uma configuração preferencial, o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em algumas configurações dos métodos para identificar um paciente que é candidato ao tratamento, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um nível aumentado dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de um candidato ao tratamento. Em algumas configurações, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um nível similar dos complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de um candidato ao tratamento. Ainda em outra configuração, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que foram diagnosticados com uma doença relacionada a amilóide e que tiveram resposta favorável a um curso de tratamento em particular. Em outra configuração, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que foram diagnosticados com uma doença relacionada a amilóide e que não tiveram resposta favorável a um curso de tratamento em particular. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em algumas configurações, os métodos para a identificação de um paciente que é um candidato para tratamento compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou de administração de um tratamento ao paciente. Geralmente, este tipo de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica está acima de um limite de controle (por exemplo, um limite que indica que o paciente provavelmente tem uma condição relacionada a amilóide ou é susceptível a ter resposta a um determinado tratamento), ou está mais próximo do nível do controle positivo (por exemplo, o nível de controle de um grupo ou indivíduo que tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que teve resposta favorável a um tratamento em particular) do que do controle negativo (por exemplo, um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tenha tido resposta favorável a um tratamento em particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método inclui a identificação de um paciente que é um candidato para tratamento da mal de Alzheimer.

Em uma configuração relacionada, a presente invenção fornece um método para o diagnóstico de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação da amostra biológica em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (c) a detecção do nível dos complexos remanescentes; e (d) diagnóstico do paciente pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

Em algumas configurações dos métodos de diagnóstico de uma doença associada com uma proteína amilóide no paciente, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um aumento no nível dos complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade de que o paciente tenha uma condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um nível similar dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade de que o paciente tenha uma condição relacionada a amilóide. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em certas configurações, os métodos para o diagnóstico de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou a administração de um tratamento ao paciente. Geralmente, este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica está acima de um limite de controle (por exemplo, um limite que indica que o paciente provavelmente tem uma condição relacionada a amilóide ou é susceptível a ter resposta a um tratamento em particular), ou está mais próximo do nível do controle positivo (por exemplo, o nível de controle de um grupo ou indivíduo que tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que teve resposta favorável um tratamento em particular) do que do controle negativo (por exemplo, um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tenha tido resposta favorável a um tratamento em particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método inclui o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração dos métodos para a identificação de um paciente que é um candidato para tratamento ou método de diagnóstico de doença relacionada a uma proteína amilóide em um paciente, a amostra biológica é um fluido biológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, linfa, líquido sinovial, etc. Em outras configurações, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido ou de biópsia. Em uma configuração preferencial, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou fração do mesmo (por exemplo, plasma ou fração de plasma). Em outra configuração preferencial, a amostra biológica é uma preparação ou um enriquecimento de ímunoglobulina. Em uma configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia tiofílica. Em outra configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado cromatografia por afinidade de modo misto com ligantes.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em ainda outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas de proteína amilóide.

Em uma configuração, a doença ou condição associada com uma proteína amilóide é selecionada de um grupo que inclui mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinoma, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amloidose sistêmica não-meuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofia comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL). Em uma configuração preferencial, a condição ou doença é a mal de Alzheimer. Em uma configuração particularmente preferencial, a doença ou condição é a mal de Alzheimer e os anticorpos anti-amilóide sendo detectados são anticorpos anti-beta amilóides (Αβ; Abeta).

Em certas configurações dos métodos fornecidos aqui, a detecção da presença ou do nível de uma proteína amilóide em particular é útil pata o diagnóstico de uma doença em particular ou condição, ou para a seleção de um candidato ao tratamento de uma doença em particular ou condição. Exemplos não limitantes de combinações de amilóide/doenças amilóide que são adequadas para uso nos métodos fornecidos aqui estão listados na Tabela 1. Em algumas configurações, a detecção da presença ou do nível de anticorpos de alta avidez específicos para a proteína amilóide listada na Tabela 1 será o diagnóstico da doença correspondente listada. Tabela 1. Exemplos não limitantes de proteínas amilóide associadas com doenças específicas Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para amilóide beta (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez. A /"Ί 1 o i 70 rtaiv» r»n/\+t*A»Mr»n »α*·λ rr λί r» v»/\n ♦νίΛ+Λ/ί/Λη fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído ou por um ânion de efeito caotrópico igual ou maior a um íon clorato (CIO3') ou um cátion com efeito caotrópico maior que um íon cálcio.

Em uma configuração, o sal caotrópico é um sal de guanidina. Exemplos não limitantes de sais de guanidina que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem cloreto de guanidina, nitrato de guanidina e tiocianato de guanidina.

Em outra configuração, o sal caotrópico é um sal de tiocianato. Exemplos não limitantes de sais de tiocianato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem tiocianato de amônio, tiocianato de potássio, tiocianato de sódio, tiocianato de lítio, tiocianato de cálcio e tiocianato de guanidina. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de perclorato. Exemplos não limitantes de sais de perclorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem perclorato de amônio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, perclorato de magnésio, e perclorato de cálcio.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de iodato. Exemplos não limitantes de sais de iodato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem iodato de amônio, iodato de potássio, iodato de sódio, iodato de lítio, iodato de magnésio, e iodato de cálcio.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de clorato. Exemplos não limitantes de sais de clorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem clorato de sódio, clorato de lítio, clorato de magnésio, e iodato de cálcio. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e antígenos amilóide, mas, no entanto, não rompa as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). Pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, imunoglobulinas encontradas na amostra biológica (i. e., sangue, plasma, urina, linfa, etc.) são enriquecidas antes da etapa de colocação da amostra biológica em contato com um ou mais antígenos amilóides. Preferencialmente, as imunoglobulinas são enriquecidas por um método que não desnature parcial ou completamente os anticorpos. Em uma configuração, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreendem uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método cromatográfíco que não resulte na desnaturação dos anticorpos. Em uma configuração, o método cromatográfíco é realizado com resina tiofílica. Em outra configuração, o método cromatográfíco é realizado com química de ligante de modo misto (Upfront Chromatography A/S). Em outras configurações, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreendem uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método não-cromatográfico que não resulta na desnaturação dos anticorpos. Métodos de Utilização da Etapa de Enriquecimento Tiofílico Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para a identificação de um paciente que é candidato a um tratamento que compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina compreendendo a quantificação dos níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóide no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de enriquecimento tiofílico é utilizada para a redução do sinal associado com ligações de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio da desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece métodos para diagnosticar uma doença associada a uma proteína amilóide, compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina que inclui quantificar os níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóides no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de enriquecimento tiofílico é empregada para redução do sinal associado com a ligação de antígenos não-específicos, com a interferência de macromoléculas do plasma e com a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio da desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Por exemplo, ensaios prévios que empregavam o plasma integral para medir a atividade anti-amilóide endógena são alterados artificialmente pela interferência de outras macromoléculas não identificadas do plasma. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui eliminam a interferência destas macromoléculas plasmáticas não identificadas de maneira tal que preserva os anticorpos anti-amilóide que interessam. Métodos empregados atualmente para a medição de anticorpos anti-amilóide extraídos de espécimes biológicos sofrem ganhos ou perdas artificiais de atividade anti-amilóide como resultado da exposição à condições desnaturantes. Por exemplo, alguns métodos utilizam acidificação tanto durante o enriquecimento de anticorpos (Ig) usando cromatografia por afinidade com Proteína A ou G o para liberação de anticorpos dos antígenos ligados. A exposição a pH baixos faz com que certas imunoglobulinas de mamíferos se desnaturem parcial ou completamente. Isto leva ou a uma perda de função ou a um aumento da polivalência, ambos os fenômenos tendo efeitos deletérios na medição de níveis de anticorpos anti-amilóide específicos. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui separam a Ig do plasma e dissociam moléculas de antígeno fracamente ligadas dos anticorpos anti-amilóide sem a exposição a ácidos ou outras condições desnaturantes.

Assim, em uma configuração específica, a invenção fornece um método de identificação de paciente candidato ao tratamento de uma doença ou condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide presente na amostra; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; e (d) detecção da presença ou nível do complexo; e (e) determinação se o paciente se beneficiaria de um tratamento compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina através da comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com uma concentração de controle. E uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em algumas configurações dos métodos para identificar um paciente que é candidato ao tratamento, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um aumento no nível dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de um candidato ao tratamento. Em algumas configurações, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um nível similar dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de um candidato ao tratamento. Ainda em outra configuração, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que foram diagnosticados com uma doença relacionada a amilóide e que tiveram resposta favorável a um curso de tratamento em particular. Em outra configuração, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que foram diagnosticados com uma doença relacionada a amilóide e que não tiveram resposta favorável a um curso de tratamento em particular.A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em algumas configurações, os métodos para a identificação de um paciente que é um candidato para tratamento compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou de administração de um tratamento ao paciente que consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina. Geralmente, este tipo de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica está acima de um limite de controle (por exemplo, um limite que indica que o paciente provavelmente tem uma condição relacionada a amilóide ou é susceptível a ter resposta a um determinado tratamento), ou está mais próximo do nível do controle positivo (por exemplo, o nível de controle de um grupo ou indivíduo que tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que teve resposta favorável para um tratamento em particular) do que do controle negativo (por exemplo, um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tem uma condição relacionada a amilóide ou um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tenha tido resposta favorável a um tratamento em particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), e medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabioqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método consiste na identificação de um paciente que é um candidato para o tratamento da mal de Alzheimer.

Em uma configuração relacionada, a presente invenção fornece um método para o diagnóstico de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou nível do complexo; e (e) diagnóstico do paciente através da comparação da concentração de anticorpos anti-amilóide com uma concentração de controle.

Em algumas configurações dos métodos de diagnóstico de uma doença associada com uma proteína amilóide em um paciente, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um aumento no nível dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade de que o paciente tenha uma condição relacionada a amilóide. Em algumas configurações, o controle é derivado de um indivíduo ou grupo de indivíduos que têm uma doença relacionada a amilóide, de modo que um nível similar dos complexos remanescentes com relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade de que o paciente tenha uma condição relacionada a amilóide. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle apropriado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em certas configurações, os métodos para o diagnóstico de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou a administração de um tratamento ao paciente. Geralmente, este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica estiver acima de um limite de controle (por exemplo, um limite que indica que o paciente provavelmente tem uma condição relacionada a amilóide ou é susceptível a ter resposta a um tratamento em particular), ou está mais próximo do nível do controle positivo (por exemplo, o nível de controle de um grupo ou indivíduo que tem uma condição relacionada a amilóide ou o nível de controle de um grupo ou indivíduo que teve resposta favorável a um tratamento em particular) do que do controle negativo (por exemplo, o nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tem uma condição relacionada a amilóide ou o nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tenha tido resposta favorável a um tratamento em particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), e medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método compreende o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração dos métodos para a identificação de um paciente que é um candidato para tratamento ou método de diagnóstico de doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, a amostra biológica é um fluido biológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, linfa, líquido sinovial, etc. Em outras configurações, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido ou de biópsia. Em uma configuração preferencial, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou fração do mesmo (por exemplo, plasma ou fração de plasma). Em outra configuração preferencial, a amostra biológica é uma preparação ou um enriquecimento de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia tiofílica. Em outra configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado cromatografia por afinidade de modo misto com ligantes.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), Hsozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em ainda outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas de proteína amilóide.

Em uma configuração, a doença ou condição associada com uma proteína amilóide é selecionada de um grupo que inclui mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinomas, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amiloidose sistêmica não- neuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofia comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL). Em uma configuração preferencial, a condição ou doença é a mal de Alzheimer. Em uma configuração particularmente preferencial, a doença ou condição é a mal de Alzheimer e os anticorpos anti-amilóide sendo detectados são anticorpos anti-beta amilóides (Αβ; Abeta).

Em certas configurações dos métodos fornecidos aqui, a detecção da presença ou do nível de uma proteína amilóide em particular é útil para o diagnóstico de uma doença ou condição em particular, ou para a seleção de um candidato ao tratamento de uma doença ou condição em particular. Exemplos não limitantes de combinações de amilóide-doenças amilóide que são adequadas para uso nos métodos fornecidos aqui estão listados na Tabela 1. Em algumas configurações, a detecção da presença ou do nível de anticorpos de alta avidez específicos para a proteína amilóide listada na Tabela 1 será o diagnóstico da doença correspondente listada.

Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para amilóide beta (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, o complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide é lavado com uma solução contendo um sal caotrópico antes da detecção da presença ou nível de tal complexo, de modo a dissociar as interações entre anticorpos não-específicos (i.e., anticorpos de baixa avidez) e o antígeno amilóide. A etapa de lavagem caotrópica empregada nos métodos fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído ou por um ânion de efeito caotrópico igual ou maior que o de um íon clorato (CIO3 ) ou por um cátion com efeito caotrópico maior que um íon cálcio. Em uma configuração, o agente caotrópico é selecionado dentre uréia, tiouréia, um sal de guanidina, um sal de tiocianato, um sal de perclorato, um sal de iodato e um sal de clorato. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Ainda em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 Ma cerca de 2,5 M. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e os antígenos amilóide, mas não suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e os antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). Pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em ainda outra configuração, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M. Métodos de Fornecimento de Prognóstico Em algumas configurações, a detecção dos níveis de anticorpos anti-amilóide pode fornecer um prognóstico para um paciente. O paciente pode não ter recebido tratamento ou não ter sido diagnosticado, ou pode estar em tratamento, ou estar tomando medidas preventivas contra uma doença relacionada a amilóide. Assim, o nível de anticorpos anti-amilóide podem ser periodicamente detectados de modo a monitorar o paciente ao longo do tempo. Em uma configuração específica, a detecção de altos níveis de anticorpos anti-amilóide pode fornecer um prognóstico para o paciente.

Em algumas configurações, os métodos de detecção de anticorpos anti-amilóide pode ser usado para decidir qual o regime terapêutico. Em casos em que o risco de desenvolver uma doença relacionada a amilóide parece ser relativamente baixo, o paciente pode ser aconselhado a tomar medidas preventivas. Em alguns casos, no entanto, onde o risco de desenvolvimento de uma doença relacionada a amilóide é determinado como sendo mais elevado, pode ser prescrito um tratamento. O tratamento pode consistir na administração de uma preparação de imunoglobulina, p. ex., uma preparação de um pool de imunoglobulina, tal como uma IGIV ou outras formas de imunoterapia. Métodos para detecção de amilóide estão descritos acima. Por exemplo, o método pode incluir a obtenção de uma amostra biológica de um paciente, a colocação desta amostra em contato com uma proteína amilóide ou com o antígeno desta, a detecção da presença ou ausência de ligação de anticorpos anti-amilóide, e o diagnóstico de uma maior probabilidade de desenvolvimento de um distúrbio relacionado a amilóide com base nos níveis de anticorpos anti-amilóide de alta avidez presentes na amostra, em comparação com um controle. Em algumas configurações, o método compreende adicionalmente a seleção de um curso de tratamento apropriado para o paciente. Em algumas configurações, o tratamento consiste na administração de IGIV conforme descrito aqui, ao paciente. Métodos de Utilização de uma Etapa de Lavagem Caotrópica Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de fornecimento de prognóstico para a progressão de uma doença ou condição associada com uma proteína amilóide, compreendendo a quantificação dos níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóide no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de lavagem caotrópica é empregada para redução do sinal associado com a ligação de antígenos anti-amilóide não-específicos e de baixa avidez.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece métodos de fornecimento de prognóstico para tratamento de uma doença ou condição associada com uma proteína amilóide, compreendendo a quantificação dos níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóide no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de lavagem caotrópica é empregada para redução do sinal associado com a ligação de antígenos anti-amilóide não-específicos e de baixa avidez.

Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação da imunoglobulina durante a purificação.

Por exemplo, medições feitas em substratos convencionais de vidro, metal ou plástico são afetadas pela ligação não-específica de anticorpos à proteína amilóide e às placas do ensaio. O plasma humano contém uma quantidade relativamente grande de anticorpos polivalentes que têm baixa avidez por agregados amilóides. A presença de tais anticorpos, assim como de anticorpos que se ligam de maneira não-específica aos substratos do ensaio, altera artificialmente a medida da atividade anti-amilóide em vários métodos de ensaio. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui são capazes de distinguir anticorpos específicos de não-específicos com base nas diferenças na avidez de ligação.

Assim, em uma configuração específica, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico da progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide em um paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo amilóide de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção do nível de complexos restantes; e (d) fornecimento de um prognóstico para a progressão da doença pela comparação do nível de anticorpo anti-amilóide com um valor de controle.

Em algumas configurações dos métodos de prognóstico da progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que experimentaram progressão da doença, de modo que um aumento ou um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade ou de progressão da doença. Em algumas configurações, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não experimentaram progressão da doença, de modo que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma baixa probabilidade de progressão da doença. Em ainda outra configuração, o controle é derivado do mesmo paciente, tomado em um momento prévio, de modo que um nível maior de complexos remanescentes com em relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade ou de progressão da doença. Em algumas configurações, a amostras anteriores podem ter sido tomadas cerca de 1 mês antes, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 meses antes, ou 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos antes. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle adequado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em certas configurações, os métodos para fornecer um prognóstico para a progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou de administração de um tratamento ao paciente. Geralmente este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica estiver acima do valor limite do controle (p. ex., um limite indicativo de uma alta probabilidade ou de progressão da doença), ou mais próximo de um controle positivo (p. ex., o nível de controle de um indivíduo ou grupo de indivíduos que experimentaram progressão da doença) do que de um controle negativo (p. ex., o nível de controle de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não experimentaram progressão da doença). Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método compreende o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração relacionada, a presente invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico para tratamento de uma doença associada a uma proteína amilóide, por exemplo, uma terapia conhecida ou uma estratégia preventiva para DA. Em algumas configurações, o tratamento pode consistir na administração de uma preparação de imunoglobulina em um paciente, tal como uma IGIV. Em algumas configurações o método consiste nas etapas de (a) colocação de uma amostra biológica do paciente em contato com uma variedade de antígenos amilóides sob condições apropriadas para formação de: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; (b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um dos complexos compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não específico; (c) detecção do nível dos complexos remanescentes; e (d) fornecimento de prognóstico para tratamento da doença através da comparação da nível de anticorpos anti-amilóide no paciente com o nível de controle.

Em algumas configurações dos métodos de prognóstico para tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que tiveram resposta favorável a um tratamento particular, de modo que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de um bom prognóstico para o tratamento da doença. Em algumas configurações, o controle o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não tiveram resposta favorável a um tratamento particular, de modo que um que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de um prognóstico ruim para o tratamento da doença. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle adequado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em algumas configurações, os métodos de fornecimento de prognóstico para tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou a administração de um tratamento ao paciente. Geralmente, este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica for mais parecido com um controle positivo (p. ex., um nível de controle de um indivíduo ou grupo de indivíduos que tiveram resposta favorável a um tratamento particular) do que com um controle negativo (p. ex., um nível de controle de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não tiveram resposta favorável a um tratamento particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividades física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método compreende o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração dos métodos de fornecimento de prognóstico para a progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide ou para fornecimento de prognóstico para o tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide, a amostra biológica é um fluido biológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, linfa, líquido sinovial, etc. Em outras configurações, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido ou uma biópsia. Em uma configuração preferencial, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou fração do mesmo (por exemplo, plasma ou fração de plasma). Em outra configuração preferencial, a amostra biológica é uma preparação de imunoglobulina ou uma imunoglobulina enriquecida. Em uma configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia tiofílica. Em outra configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia por afinidade de modo misto com ligantes.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em ainda outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas de proteína amilóide.

Em uma configuração, a doença ou condição associada com uma proteína amilóide é selecionada de um grupo que inclui mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinomas, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amiloidose sistêmica não-neuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofia comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL). Em uma configuração preferencial, a condição ou doença é a mal de Alzheimer. Em uma configuração particularmente preferencial, a doença ou condição é a mal de Alzheimer e os anticorpos anti-amilóide sendo detectados são anticorpos anti-beta amilóides (Αβ; Abeta).

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, a detecção da presença ou do nível de uma proteína amilóide em particular é útil para fornecer um prognóstico da progressão de uma doença ou para fornecer um prognóstico para o tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide. Exemplos não limitantes de combinações de amilóide-doenças amilóide que são adequadas para uso nos métodos fornecidos aqui estão listadas na Tabela 1. Em algumas configurações, a detecção da presença ou do nível de anticorpos de alta avidez específicos para a proteína amilóide listada na Tabela 1 será o diagnóstico da doença correspondente listada.

Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para amilóide Beta (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez. A etapa de lavagem caotrópica empregada nos métodos fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído ou por um ânion de efeito caotrópico igual ou maior ao de um íon clorato (C103') ou por um cátion com efeito caotrópico maior que o de íon cálcio.

Em uma configuração, o sal caotrópico é um sal de guanidina. Exemplos não limitantes de sais de guanidina que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem cloreto de guanidina, nitrato de guanidina e tiocianato de guanidina.

Em outra configuração, o sal caotrópico é um sal de tiocianato. Exemplos não limitantes de sais de tiocianato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem tiocianato de amônio, tiocianato de potássio, tiocianato de sódio, tiocianato de lítio, tiocianato de cálcio e tiocianato de guanidina. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em ainda outra configuração, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de perclorato. Exemplos não limitantes de sais de perclorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem perclorato de amônio, perclorato de sódio, perclorato de lítio, perclorato de magnésio, e perclorato de cálcio.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de iodato. Exemplos não limitantes de sais de iodato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem iodato de amônio, iodato de potássio, iodato de sódio, iodato de lítio, iodato de magnésio, e iodato de cálcio.

Em ainda outra configuração, o sal caotrópico é um sal de clorato. Exemplos não limitantes de sais de clorato que podem ser usados em conjunto com os métodos fornecidos aqui incluem clorato de sódio, clorato de lítio, clorato de magnésio, e clorato de cálcio. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e antígenos amilóide, mas não suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). A pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, imunoglobulinas encontradas na amostra biológica (i. e., sangue, plasma, urina, linfa, etc.) são enriquecidas antes da etapa de colocação da amostra biológica em contato com um ou mais antígenos amilóides. Preferencialmente, as imunoglobulinas são enriquecidas por um método que não desnature parcial ou completamente os anticorpos. Em uma configuração, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreendem uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método cromatográfico que não resulte na desnaturação dos anticorpos. Em uma configuração, o método cromatográfico é realizado com resina tiofílica. Em outra configuração, o método cromatográfico é realizado com química de ligante de modo misto (Upfront Chromatography A/S). Em outras configurações, os métodos fornecidos aqui para detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez compreendem uma etapa de enriquecimento de imunoglobulinas por um método não-cromatográfico que não resulta na desnaturação dos anticorpos. Métodos de Utilização de uma Etapa de Enriquecimento Tiofílico Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de fornecimento de prognóstico para a progressão de uma doença ou condição associada com uma proteína amilóide, compreendendo a quantificação dos níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóide no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de enriquecimento tiofílico é utilizada para a redução do sinal associado com ligações de anticorpos não-específicos, com a interferência de macromoléculas do plasma e com a geração artificial de atividade de ligação por meio da desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece métodos para fornecimento de prognóstico para o tratamento de uma doença ou condição associada com uma proteína amilóide, compreendendo a quantificação dos níveis de anticorpos contra proteínas formadoras de amilóide no plasma e outros fluidos biológicos de mamíferos, onde uma etapa de lavagem caotrópica é empregada para redução do sinal associado com ligações de anticorpos não-específicos, com a interferência de macromoléculas do plasma e com a geração artificial de atividade de ligação por meio da desnaturação das imunoglobulinas durante a purificação.

Ao contrário dos métodos já existentes, a presente invenção contorna os efeitos de confusão da ligação de anticorpos não-específicos, a interferência de macromoléculas do plasma e a geração artificial de atividade de ligação por meio de desnaturação da imunoglobulina durante a purificação.

Por exemplo, ensaios prévios que empregavam o plasma integral para medir a atividade anti-amilóide endógena são alterados artificialmente pela interferência de outras macromoléculas não identificadas do plasma. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui eliminam a interferência da atividade destas macromoléculas plasmáticas não identificadas de maneira tal que preserva os anticorpos anti-amilóide que interessam. Métodos empregados atualmente para a medição de anticorpos anti-amilóide extraídos de espécimes biológicos sofrem ganhos ou perdas artificiais de atividade anti-amilóide como resultado da exposição à condições desnaturantes. Por exemplo, alguns métodos utilizam acidificação tanto durante o enriquecimento de anticorpos (Ig) usando cromatografia por afinidade com Proteína A ou G para liberação de anticorpos dos antígenos ligados. A exposição a pH baixos faz com que certas imunoglobulinas de mamíferos se desnaturem parcial ou completamente. Isto leva ou a uma perda de função ou a um aumento da polivalência, ambos os fenômenos tendo efeitos deletérios na medição de níveis de anticorpos anti-amilóide específicos. Vantajosamente, os métodos fornecidos aqui separam a Ig do plasma e dissociam moléculas de antígeno fracamente ligadas dos anticorpos anti-amilóide sem a exposição a ácidos ou outras condições desnaturantes.

Assim, em uma configuração específica, a invenção fornece um método para proporcionar um prognóstico da progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide no paciente. Em algumas configurações, o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo na resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou nível do complexo; e (e) fornecimento de um prognóstico para a progressão da doença através da comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

Em algumas configurações dos métodos para fornecimento de prognóstico da progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que experimentaram progressão da doença, de modo que um nível similar ou maior de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade ou de progressão da doença. Em algumas configurações, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não experimentaram progressão da doença, de modo que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma baixa probabilidade de progressão da doença. Em ainda outra configuração, o controle é derivado do mesmo paciente, tomado em um momento prévio, de modo que um nível maior de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de uma alta probabilidade ou de progressão da doença.

Em algumas configurações, a amostras anteriores podem ter sido tomadas cerca de 1 mês antes, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 meses antes, ou 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais anos antes. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle adequado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em certas configurações, os métodos para fornecer um prognóstico para a progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide compreendem ainda uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou a administração de um tratamento ao paciente. Geralmente este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica estiver acima de um limite de controle (p. ex., um limite que indica uma alta probabilidade ou progressão da doença), ou mais próximo de um controle positivo (p. ex., o nível de controle de um grupo ou indivíduo que experimentou progressão da doença) do que de um controle negativo (p. ex., de controle de um grupo ou indivíduo que não experimentou progressão da doença). Em uma configuração preferencial, o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento inclui a administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método compreende o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração relacionada, a presente invenção fornece um método para fornecimento de um prognóstico de tratamento de uma doença associada a uma proteína amilóide, por exemplo, uma terapia conhecida ou uma estratégia preventiva para DA. Em algumas configurações, o tratamento pode compreender a administração de uma preparação de imunoglobulina em um paciente, tal como uma IGIV. Em algumas configurações o método consiste nas etapas de (a) passagem da amostra biológica por uma resina tiofilica para ligação do anticorpo anti-amilóide; (b) eluição do anticorpo na resina tiofilica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; (c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; (d) detecção da presença ou nível do complexo; e (e) fornecimento de prognóstico para tratamento da doença pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

Em algumas configurações dos métodos para fornecimento de prognóstico para tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que tiveram resposta favorável a um tratamento particular, de modo que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de um bom prognóstico para o tratamento da doença. Em algumas configurações, o controle deriva de um indivíduo ou grupo de indivíduos que não tiveram resposta favorável a um tratamento particular, de modo que um que um nível similar de complexos remanescentes em relação ao controle é indicativo de um prognóstico ruim para o tratamento da doença. A pessoa qualificada entenderá como selecionar pelo menos um controle adequado e saberá interpretar os resultados de acordo.

Em algumas configurações, os métodos de fornecimento de prognóstico para tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide compreendem também uma etapa de atribuição de um curso de tratamento ou a administração de um tratamento ao paciente. Geralmente, este curso de tratamento será atribuído quando o nível de anticorpos anti-amilóide na amostra biológica for mais parecido com um controle positivo (p. ex., um nível de controle de um grupo ou indivíduo que tiveram resposta favorável a um tratamento particular) do que com um controle negativo (p. ex., um nível de controle de um grupo ou indivíduo que não tiveram resposta favorável a um tratamento particular). Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina.

Em certas configurações, o tratamento é selecionado dentre tratamentos cognitivos, como atividade física e/ou social, jogos de memória e quebra-cabeças e/ou resolução de problemas; uma terapia farmacêutica, tal como um inibidor de colinesterase (para tratar a diminuição de acetilcolina), antagonistas parciais de glutamato (por exemplo, memantina), medicamentos psiquiátricos (por exemplo, os antipsicóticos, auxiliares do sono, ansiolíticos e betabloqueadores). Os inibidores da colinesterase incluem, sem limitação, Aricept® (cloridrato de donepezil), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina), e Cognex® (tacrina) e combinações destes. Em uma configuração preferencial, o tratamento consiste na administração de uma preparação de imunoglobulina. Em uma configuração específica, o método compreende o diagnóstico da mal de Alzheimer.

Em uma configuração dos métodos para fornecimento de prognóstico para a progressão de uma doença associada com uma proteína amilóide ou para fornecimento de prognóstico para o tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide, a amostra biológica é um fluido biológico, por exemplo, sangue, plasma, urina, linfa, líquido sinovial, etc. Em outras configurações, a amostra biológica pode ser uma amostra de tecido ou uma biópsia. Em uma configuração preferencial, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou fração do mesmo (por exemplo, plasma ou fração de plasma). Em outra configuração preferencial, a amostra biológica é uma preparação de imunoglobulina ou uma imunoglobulina enriquecida. Em uma configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia tiofílica. Em outra configuração específica, o enriquecimento da imunoglobulina é realizado por cromatografia por afinidade de modo misto com ligantes.

Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para uma proteína amilóide selecionada dentre Beta amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (apo Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína beta induzida do fator de crescimento ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ. Em uma configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para monômeros de proteína amilóide. Em outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para oligômeros de proteína amilóide (i.e, dímeros, trímeros, etc). Em ainda outra configuração, o anticorpo anti-amilóide é específico para fibrilas amilóide.

Em uma configuração, a doença ou condição associada com uma proteína amilóide é selecionada de um grupo que inclui mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinomas, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amiloidose sistêmica não-neuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofia comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL). Em uma configuração preferencial, a condição ou doença é a mal de Alzheimer. Em uma configuração particularmente preferencial, a doença ou condição é a mal de Alzheimer e os anticorpos anti-amilóide sendo detectados são anticorpos anti-beta amilóides (Αβ; Abeta).

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, a detecção da presença ou do nível de uma proteína amilóide em particular é útil para fornecer um prognóstico da progressão de uma doença ou para fornecer o um prognóstico para o tratamento de uma doença associada com uma proteína amilóide. Exemplos não limitantes de combinações de amilóide-doenças amilóide que são adequadas para uso nos métodos fornecidos aqui estão listadas na Tabela 1. Em algumas configurações, a detecção da presença ou do nível de anticorpos de alta avidez específicos para a proteína amilóide listada na Tabela 1 será o diagnóstico da doença correspondente listada.

Em uma configuração preferencial, o anticorpo anti-amilóide sendo detectado é um anticorpo específico para amilóide Beta (Αβ; Abeta). Em uma configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para monômeros Αβ. Em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para oligômeros Αβ (i.e., dímeros, trímeros, etc). Ainda em outra configuração, o anticorpo anti-Αβ é específico para fibrilas Αβ.

Em uma configuração dos métodos fornecidos aqui, o anticorpo de baixa afinidade ou não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez. Em uma configuração específica, o anticorpo anti-amilóide de baixa avidez é um anticorpo anti-Αβ de baixa avidez.

Em algumas configurações dos métodos fornecidos aqui, o complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide é lavado com uma solução contendo um sal caotrópico antes da detecção da presença ou nível de tal complexo, de modo a dissociar as interações entre anticorpos não-específicos (i.e., anticorpos de baixa avidez) e o antígeno amilóide. A etapa de lavagem caotrópica empregada nos métodos fornecidos aqui pode ser realizada com qualquer agente caotrópico conhecido. Quando for empregado um sal caotrópico, o sal geralmente será constituído ou por um ânion de efeito caotrópico igual ou maior que o de um íon clorato (CIO3 ) ou por um cátion com efeito caotrópico maior que um íon cálcio. Em uma configuração, o agente caotrópico é selecionado dentre uréia, tiouréia, um sal de guanidina, um sal de tiocianato, um sal de perclorato, um sal de iodato e um sal de clorato. Em uma configuração específica, o sal caotrópico é tiocianato de amônio. Em uma configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0 M. Em outra configuração, o tiocianato de amônio é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em outra configuração ainda, o tiocianato de amônio é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M. A concentração do agente caotrópico utilizado na etapa de lavagem dos métodos fornecidos aqui deve ser tal de modo que seja suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide não-específicos (ou seja, de baixa avidez) e os antígenos amilóide, mas não suficiente para romper as interações entre anticorpos anti-amilóide específicos (ou seja, de alta avidez) e os antígenos amilóide. A concentração absoluta do agente caotrópico empregado dependerá de uma série de fatores, incluindo a força do agente caotrópico em particular e a força das interações anticorpo-antígeno amilóide formadas no sistema específico sendo utilizado (por exemplo, o anticorpo anti-Αβ no teste ELISA). Pessoa qualificada saberá determinar imediatamente a concentração ideal do agente caotrópico para uso no seu sistema em particular. Em uma configuração, o agente caotrópico é usado em uma concentração de lavagem entre cerca de 0,5 M a cerca de 4,0M. Em outra configuração, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,0 M a cerca de 3,0 M. Em ainda outra configuração, o agente caotrópico é usado numa concentração de lavagem entre cerca de 1,5 M a cerca de 2,5 M.

Composições Farmacêuticas e Dosagens Uma composição farmacêutica compreendendo imunoglobulina, p. ex., uma preparação de imunoglobulina enriquecida compreendendo anticorpos humanos heterogêneos pode ser administrada por diversos métodos conhecidos. A via e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados, mas será, normalmente, por via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea. A composição farmacêutica pode incluir um veículo aceitável adequado para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (p. ex., por injeção ou infusão). A fluidez adequada da composição pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimentos tal como lecitina, pela manutenção de um tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de surfactantes. Em alguns casos, é preferível a inclusão de agentes isotônicos na composição, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio. A absorção a longo prazo das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que atrase a absorção, por exemplo monoestearato de alumínio ou gelatina.

Composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas de acordo com os métodos amplamente conhecidos e rotineiramente empregados para tais fins. Ver, p. ex., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcei Dekker, Inc., New York, 1978. Composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas em condições GMP. Normalmente, uma dose terapeuticamente eficaz ou uma dose eficaz da preparação de imunoglobulina é utilizada nas composições farmacêuticas da invenção. A composição farmacêutica pode ser formulada em formas de dosagem por métodos convencionais conhecidos por pessoal qualificado no assunto. Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a reposta ideal desejada (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser feita uma administração em um único bolus, a administração de várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme indicação das exigências da situação terapêutica. Pode ser vantajosa a formulação de composições parenterais na forma de doses unitárias, para facilitar a administração e a uniformidade de dosagem. A forma de doses unitárias conforme usado aqui se refere a unidades fisicamente distintas adequadas a dosagens unitárias para pacientes a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do componente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. Níveis de dosagem podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada em paciente em particular, sem que esta seja tóxica para o paciente. Um médico poderá iniciar a administração de doses da composição farmacêutica a concentrações inferiores àquelas necessária para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente as doses até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, as doses eficazes variam de acordo com diversos fatores, incluindo a doença ou condição específica a ser tratada, sua gravidade, o estado fisiológico do paciente, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Um regime de tratamento exemplar envolve a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. A composição pode ser administrada em diversas ocasiões. Os intervalos entre doses únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares conforme a indicação das medições do progresso terapêutico do paciente. A dosagem e freqüência podem variar dependendo da meia-vida dos anticorpos do paciente.

No caso de uma preparação de imunoglobulina, normalmente é usado uma imunoglobulina intravenosa (IGIV). A formulação de IGIV é feita para administração por injeção. Devido à preparação de IgG desta invenção ter alcançado uma concentração de imunoglobulina excepcionalmente alta (10% peso/vol ou superior), o que reduz significativamente o volume de uma dose terapeuticamente eficaz, a composição da presente invenção é particularmente vantajosa para administração subcutânea e/ou intramuscular em um paciente, assim como também é mais comumente usada para administração intravenosa. O termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de uma preparação de imunoglobulina, particularmente IgG, que resulta em uma melhora ou recuperação de uma condição médica sendo tratada no paciente (p. ex., mal de Alzheimer, mal de Parkinson, etc.). A quantidade eficaz a ser administrada ao paciente poderá ser determinada por um médico com considerações de diferenças individuais de idade, peso, gravidade da doença, via de administração (p. ex., intravenosa versus subcutânea) e resposta à terapia. Em algumas configurações, uma preparação de imunoglobulina desta invenção pode ser administrada a um paciente na quantidade de cerca de 5 mg/kg até cerca de 2.000 mg/kg, a cada dia. Em configurações adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada em quantidades de, pelo menos, cerca de 10 mg/kg, pelo menos cerca de 15 mg/kg, pelo menos cerca de 20 mg/kg, pelo menos cerca de 25 mg/kg, pelo menos cerca de 30 mg/kg ou pelo menos cerca de 50 mg/kg. Em configurações adicionais, a preparação de imunoglobulina pode ser administrada a um paciente em quantidades de até cerca de 100 mg/kg, de até cerca de 150 mg/kg, de até cerca de 200 mg/kg, de até cerca de 250 mg/kg, de até cerca de 300 mg/kg, de até cerca de 400 mg/kg a cada dia. Em outras configurações, as doses da preparação de imunoglobulina podem ser maiores ou menores. Clínicos familiares com doenças tratadas com preparações de IgG podem determinar a dose apropriada para um paciente de acordo com o critérios conhecidos.

Em algumas configurações, uma preparação de IgG concentrada pode ser administrada a um paciente numa dose de cerca de 5 mg/kg até cerca de 2.000 mg/kg por administração. Em certas administrações, a dose pode ser de pelo menos cerca de 5 mg/kg, ou de pelo menos cerca de 10 mg/kg, ou de pelo menos cerca de 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2000 mg/kg.

De acordo com a presente invenção, o tempo necessário para completar o curso do tratamento pode ser determinado por um médico e pode variar de, tão curto quanto um dia até mais de um mês. Em algumas configurações, o curso de tratamento pode variar de 1 a 6 meses.

Kits A invenção também fornece kits (ou conjuntos) para a detecção e/ou isolamento de anticorpos anti-amilóide de alta afinidade. Estes kits podem ser usados para o diagnóstico de distúrbios relacionados a amilóide e seleção de um indivíduo para terapia apropriada, tal como com IGIV.

Os kits normalmente incluem instruções de uso escritas ou em formato eletrônico, reagentes padrão, soluções e tampões para o ensaio desejado. O kit pode, opcionalmente, incluir controles padrão ou vidraria, tal como placas de ELISA, ferramentas para cromatografla, embalagens e recipientes para reação. O kit também pode incluir dispositivos para coleta de uma amostra biológica, p. ex., seringas e dispositivos de fracionamento do sangue.

Os kits da invenção podem incluir materiais para a detecção de anticorpos endógenos de alta avidez que são específicos para amilóide. O kit pode incluir reagentes de cromatografla tiofílica e soluções de lavagem e tampões para eluição, para a separação da IgG de outras proteínas na amostra. O kit também pode incluir materiais para separação dos anticorpos específicos para amilóide de alta avidez dos de baixa avidez, ou dos anticorpos não-específicos. Tais materiais podem incluir um suporte sólido conjugado à forma de amilóide desejada, p. ex., amilóide monomérico, oligomérico (globular), ou fíbrilar (p. ex. Αβ). O suporte sólido pode ser uma conta, uma fase estacionária de cromatografla (p. ex., agarose, sílica, etc.), uma placa de ELISA, etc. Os materiais também podem incluir pelo menos um tampão de lavagem caotrópica, para a separação e remoção dos anticorpos de baixa afinidade do suporte conjugado com amilóide. O kit pode, vantajosamente, incluir um controle conhecido de alta avidez (positivo) e de baixa avidez (negativo), para comparação com a amostra de teste.

Os kits da invenção podem ainda incluir reagentes para a detecção de anticorpos anti-amilóide de alta avidez, conforme descrito aqui. Exemplos Exemplo 1 Coleta de plasma humano e preparação de IgG. Foram obtidas amostras de sangue de adultos saudáveis e de pacientes com DA sob os protocolos aprovados pelo Weill Medicai College Institutional Review Board e coletados em tubos de EDTA para a produção de plasma por métodos padrão. Foram conduzidos experimentos usando o plasma integral em amostras armazenadas a -80°C descongeladas uma vez por exposição à temperatura ambiente durante 30 minutos. IgG foi purificada do plasma através de dois métodos: (1) cromatografia padrão em sefarose de proteína G (Akerstrõm et al., J Biol Chem., 261:10240-10247 (1986) e (2) cromatografia preparativa em absorvente tiofílico, conforme especificado pelo o fabricante (Pierce, Rockford, IL). Para a cromatografia em proteína G, a IgG foi eluída com 0,1 M de glicina-HCl, pH 2,8, e coletada em tubos contendo Tris 2M básico para redução do tempo de exposição ao pH baixo. A IgG eluída de ambas as colunas foi dialisada com PBS (tampão fosfato-salino) antes da utilização.

Exemplo 2 Preparação de vários tipos de AB oligomérico. Monômero Αβ (Biosource International, Camarillo, CA) foi dissolvido em acetonitrila a 50%, incubado durante 30 minutos a 37°C e liofilizado. O pellet resultante foi dissolvido em 1,1,1,3,3,3- hexafluoro-2-propanol, HFIP, incubado a 37°C durante 20 a 30 minutos e depois seco usando argônio.

Oligômeros Αβ foram preparados conforme descrito previamente (Barghom et al., JNeurochem., 95:834-847 (2005)). O filme de peptídeo Αβ seco foi então dissolvido a 5 mM em DMSO (dimetil sulfóxido) seco e tratado com sonicação em um banho sonicador durante 30 minutos para garantir a completa ruptura das estruturas Αβ. Ο Αβ foi ajustado para 400 μΜ com PBS (tampão fosfato-salino) e foi adicionado 1/10 em volume de SDS a 2% (dodecil sulfato de sódio a 2%) à mistura, que então foi incubada a 37°C por 6 horas. A mistura foi então diluída com 3 volumes de água e incubada por 18 horas a 4°C. Os oligômeros globulares resultantes foram caracterizados por SDS:PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio) e SEC (cromatografia por exclusão de tamanho) e armazenados a 4°C por até quatro semanas.

Fibrilas Αβ foram preparadas pela modificação do método de 0’Nuallain (0'Nuallain et al., J Immunol., 176:7071-7078 (2006)), o monômero Αβ tratado com HFIP (hexafluoroisopropanol) foi dissolvido em solução fresca de NaOH a 2mM. Após agitação leve, a solução foi centrifugada a 10.000 x g durante 60 minutos para a remoção de grandes algomerados ou fibrilas. O sobrenadante foi então ajustado para 1 x PBS (tampão fosfato-salino) contendo 0,05% de azida de sódio e incubado com agitação a 37°C durante 10 a 14 dias. A estrutura fibrilar foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão das redes tingidas negativamente. Exemplo 3 Teste ELISA de anticorpos anti- AB humanos. Placas de ELISA da Maxisorp (Nunc, Roskilde, Denmark) foram revestidas com 0,1 ml de um tampão de NaHC03 a 0,1 M e pH 9,6 contendo 0,1 pg de Αβ total, tanto monômero (1 mg/ml em ácido fórmico) como globulômero Αβ preparado previamente, durante 1 hora a 37°C. Placas de fibrilas Αβ foram preparadas como descrito anteriormente (0'Nuallain et al., J Immunol., 176:7071-7078 (2006)). As placas foram usadas imediatamente ou annazenadas a 4°C. Após a remoção do tampão de revestimento Αβ, as placas foram lavadas 3 vezes com 0,2 ml de PBS (tampão fosfato-salino) (137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 10 mM NaíHPCT», pH 7,4) contendo 0,05% de Tween 20 (PBST). Após a última lavagem, as placas foram bloqueadas com 0,2 ml/poço de BSA (albumina sérica bovina) a 1% em PBST durante 1 hora a 37°C. A solução bloqueadora foi removida e as placas foram lavadas três vezes com PBST conforme descrito acima.

Cada placa de ELISA foi usada para testar 10 amostras de plasma, diluídas 1:10 com PBST, respectivamente, assim como um controle negativo de PBST e um controle positivo de uma IGIV a 10 mg/ml (Gammagard Liquid, Baxter). Depois que foram feitas titulações completas, cada amostra foi analisada como três diluições seriais em PB ST. As placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C, lavadas três vezes com 0,2 ml de PBST, e incubadas com 0,1 ml de uma diluição de 1:10.000 de peroxidase de rábano conjugada com anticorpo IgG anti-humano de cabra purificado por afinidade (Biosource International, Camarillo, CA) em PBST durante 30 minutos a 37°C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBST e desenvolvidas pela adição de 0,1 ml/poço de TMB (tetrametilbenzidina) (Invitrogen, Carlsbad, CA) por 15-30 minutos a temperatura ambiente. Na primeira indicação de que os poços de controle negativo estavam mudando de cor, foi adicionado 0,1 ml de HC1 a cada poço para encerrar a reação. A densidade ótica (OD) a 405 nm foi medida usando um leitor Synergy HT ELISA (Bio-Tek, Winooski, VT).

As concentrações de anticorpos anti-Αβ foram calculadas usando o software KC4 Signature para ajustar uma curva sigmóide de quatro parâmetros às densidades óticas obtidas das diluições seriais do plasma ou IG1V. Antes do ajuste à curva, a OD média dos controles secundários somente de anticorpos foi subtraída das OD dos poços com plasma ou IGIV. Se necessário, a diluição da amostra foi reduzida de modo que o valor máximo de OD da amostra com menor diluição fosse menor que a metade do valor máximo do padrão de IGIV. A concentração do anticorpo anti-Αβ em uma amostra foi considerada como a recíproca da diluição na qual a OD era igual à metade da OD máxima (geralmente 2,0-3,0) da IGIV padrão diluída a 10 mg/ml.

Exemplo 4 Medições de ressonância plasmática de superfície (RPS). Um sensor carboxilado foi carregado em um aparelho SensiQ RPS (ICX Nomadics, Oklahoma City, OK), lavado com uma injeção de 1 minuto de ácido fosfórico a 0,1 M para remoção dos contaminantes superficiais e ativado por injeção de EDC 2 mM, 0,5 mM de NHS tanto nos canais de controle como nos canais experimentais. Foi injetado neutravidina (25 pg/ml) em tampão acético a 10 mM, pH 4,7 no canal experimental seguido de uma solução a 50 pg/ml de monômero, oligômero ou fíbrila Αβ marcado com biotina, em 10 mM de tampão HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1,34 mM EDTA, e 1% de Tween 20. O acoplamento foi encerrado pela injeção de etanolamina 1 M (pH 8) em ambos os canais. Ensaios de RPS da ligação dos anticorpos foram realizados usando diluições duplas seriais do plasma ou de preparações de IgG purificadas. A análise da ligação foi feita utilizando o software Qdat (ICX Nomadics, Oklahoma City, OK).

Exemplo 5 Dissociação antígeno-anticorpo seletiva por um sal caotrópico. As condições para dissociação seletiva foram determinadas primeiramente pela medição da avidez dos anticorpos ligados à placas em branco e à placas revestidas com Αβ. Em seguida determinamos a molaridade do sal caotrópico (tiocianato de amônio) necessária para causar a dissociação ideal entre a ligação com as placas em branco e a ligação com as placas com amilóide (Pullen et al., J Immunol Methods., 86:83-87 (1986)). Resumidamente, uma placa de ELISA revestida com Αβ foi incubada com uma diluição de 1:10 do plasma humano ou com anticorpos monoclonais anti-Αβ de murinos(l ug/ml) diluído em PB ST, como descrito acima. Os poços foram esvaziados e 0,2 ml de tampão 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,0, ou este tampão contendo concentrações crescentes de tiocianato de amônio foram adicionados em quadruplicata para cada conjunto de poços. As placas foram incubadas durante 30 minutos a 25°C, lavadas três vezes com PB ST e processadas como descrito acima para o teste ELISA-padrão.

Exemplo 6 Isolamento de anticorpos anti-amilóide por purificação por afinidade. Resinas para purificação por afinidade de anticorpos de monômeros anti-Αβ que pareiam o peptídeo Αβ à resina pela terminação amino ou carboxila foram obtidas comercialmente (Alpha Diagnostic Intl., San Antonio, TX). Resinas para anticorpos de oligômeros anti-Αβ e fibrilas anti-Αβ foram preparadas pelo pareamento de oligômeros e fibrilas Αβ, preparados conforme descrito acima, com Sefarose 4 Fast Flow ativada com N-hidrosuccinimida conforme recomendado pelo fabricante (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). As colunas foram equilibradas com PBS (tampão fosfato-salino) e passou-se 5 g/ml de IGIV diluída a 10 mg/ml em PBS através das colunas a 0,5 ml/min até um total de pelo menos 5 passagens completas de 500 ml antes da lavagem com PBS e eluição padrão com glicina 0,1 M, pH 2,5. A IgG eluída foi imediatamente neutralizada, concentrada por centrifugação em colunas de ultrafíltração e dialisada contra PBS.

Exemplo 7 Ligação com placas em branco durante a medição de anticorpos anti-Αβ, A quantificação de anticorpos anti-Αβ no plasma ou soro humanos tem sido realizada, na maior parte das vezes, em placas de ELISA contendo peptídeo Αβ tanto monomérico como agregado (oligomérico ou fibrilar). Amostras de plasma de doadores humanos normais testadas por este método se ligam significativamente com poços de ELISA em branco (poços sem qualquer adição de antígeno). A ligação ampla, não específica, com placas em branco ocorre apesar do uso de agentes bloqueadores tradicionais como leite desnatado, soro fetal bovino, albumina e preparações comerciais de bloqueio (Klaver et al. J. Neurosci. Meth. 187, 263-269). A extensão da ligação às placas de ELISA em branco é variável entre os doadores de plasma (Figura 1). A ligação com placas de ELISA em branco também ocorre com IgG purificada isolada de amostras de plasma e preparações de pool de imunoglobulina como IGIV. A IGIV se liga de forma saturável, dependente da concentração a placas em branco, placas com monômero Αβ, placas com oligômero Αβ, e com fibrilas Αβ. Os valores de ligação máximos em unidades de Α45οηιη foram 4,54 (brancos), 2,7 (monômeros), 2,88 (oligômeros) e 2,82 (fibrilas), respectivamente. Com base no melhor ajuste das curvas de ELISA, a ligação máxima para IGIV em unidades de absorbância é aproximadamente 1,6 vezes maior em placas em branco do que em qualquer uma das placas contendo amilóide. Resultados similares foram obtidos para IgG isolada de plasma de indivíduos normais ou pacientes de DA. Os valores absolutos da ligação máxima foram diferentes, dependendo do indivíduo. A ligação substancial da IGIV à placa em branco indica um maior número de sítios potenciais de ligação de anticorpos nas placas em branco relativamente às placas contendo o amilóide.

Apesar da diferença na amplitude máxima de ligação, as concentrações aparentes de anticorpos que se ligam com poços de ELISA em branco foram, em geral, inferiores àquelas dos que se ligam com poços contendo peptídeos Αβ ou seus agregados. A metade dos valores máximos de concentração de ligação com placas em branco para IGIV foram 17,6, 3,9 e 6,5 vezes menor do que aqueles obtidos para os anticorpos do monômero anti-Αβ, do oligômero anti-Αβ e das fibrilas anti-Αβ, respectivamente. Típicos meio-valores máximos dos títulos foram de 2,44 (placa em branco), 42,84 (monômero), 9,42 (oligômero) e 15,85 (fibrilas). Resultados semelhantes foram obtidos com IgG isolada do plasma da maioria dos doadores individuais. A extensão da ligação com placas em branco variou entre os indivíduos, mas os valores máximos de ligação derivados dos ajustes das curvas de ELISA foram sempre superiores para placas em branco do que para as placas com os anticorpos anti-amilóide. Isto sugere que as medições dos níveis de anticorpos anti-amilóide com base em uma única diluição ao invés de uma curva de titulação possam ser superestimadas por causa dos efeitos adicionais da ligação com placas em branco. A presença de anticorpos que tem a capacidade de se ligar a poços de ELISA em branco complica a medição dos anticorpos de oligômeros anti-Αβ em indivíduos, já que os valores de absorbância observados para os poços vazios podem ser comparáveis ou mesmo maiores que aqueles obtidos para as placas contendo amilóide (Figura 1). Isto não significa que os anticorpos que se ligam à placa em branco sejam idênticos. Na realidade, a absorbância obtida com poços vazios nas concentrações utilizadas foram maiores do que aquelas dos poços contendo amilóide em seis de 22 indivíduos mostrados na Figura 1, sugerindo que nem todos os anticorpos têm as mesmas especificidades. A ligação com placas em branco reflete, portanto, a presença de anticorpos polivalentes que, em alguns casos, são capazes de se ligar tanto a placas em branco como a placas contendo amilóide.

Exemplo 8 Ligação com placas em branco é mediada por Fab (fragment antigen-binding - fragmento de ligação com o antígeno). Para determinar a natureza da interação da ligação com as placas, examinamos a ligação de um pool de IgG*s de cinco indivíduos comercialmente disponível, assim como fragmentos Fab, Fab2’e Fc isolados deste mesmo pool. Descobrimos que a ligação dos anticorpos com poços de ELISA em branco era o resultado da ligação com a região de ligação com o antígeno (Fab) da molécula de IgG, em oposição às interações não-específlcas envolvendo outras regiões. A Figura 2 mostra que a região de ligação com o antígeno (fragmentos Fab e Fab2’) da IgG é responsável pela ligação com os poços vazios em vez de uma interação não-específica através de outras regiões da molécula de imunoglobulina.

Exemplo 9 Depleção de anticorpos que se ligam com placas em branco. O isolamento da IgG de amostras de plasma não elimina a ligação dos anticorpos às placas de ELISA em branco. Foi testado se a passagem do IGIV através de colunas de poliestireno e/ou agarose causaria a depleção das moléculas de IgG que se ligam facilmente a estes substratos e se, possivelmente, reduziría a ligação da IGIV com poços de ELISA em branco. A depleção não foi específica para anticorpos que se ligam com placas em branco. A proporção absoluta da absorbância obtida com placas em branco e placas contendo Αβ permaneceu constante apesar da cromatografia em coluna. Um agravante para essa abordagem foi que a quantidade total de anticorpos que se ligam com anti-Αβ foi substancialmente reduzida em todos os procedimentos de depleção, o que sugere que alguns dos anticorpos que se ligam a Αβ também podem aderir à agarose ou ao poliestireno. O mais provável é que essa ligação seja atribuível a anticorpos polivalentes de baixa afinidade, que se ligam a epítopos múltiplos independentes, incluindo Αβ e poliestireno.

Evidência mais direta de polivalência de certos anticorpos anti-Αβ vem de um estudo de competição usando a proteína plasmática tiroglobulina (Figura 3). A ligação da IGIV aos poços de ELISA contendo peptídeo Αβ foi reduzida quando a tiroglobulina foi usada como competidor, confirmando que um grande pool de anticorpos anti-Αβ na IGIV são polivalentes e podem se ligar com ambas as proteínas. Conforme visto na Figura 3, uma concentração de tiroglobulina que elimina completamente a ligação da IGIV às placas de ELISA contendo tiroglobulina reduz a ligação da IGIV às placas Αβ a aproximadamente 50% dos valores de controle.

Exemplo 10 Redução das ligações com placas em branco por sal caotrópico. Foi examinado o potencial para separar anticorpos que tendem a se ligar com poços em branco daqueles que tendem a se ligar com Αβ com base na diferença de avidez. Foram feitas medidas de avidez usando concentrações cada vez maiores do sal caotrópico tiocianato de amônio para dissociar complexos antígeno/anticorpo formados em placas de ELISA. Foram comparadas as ligações da IGIV às placas de ELISA cujos poços eram ou em branco, ou revestidos com oligômero globular Αβ. A Figura 4 mostra uma experiência típica que indica que a avidez dos anticorpos de oligômeros Αβ anti-globulares na IGIV é claramente maior do que a observada nas ligações da IGIV com placas em branco. Nas placas em branco, 50% das ligações observadas para condições de controle de tampão de fosfato ocorrem quando as placas são incubadas em, aproximadamente, 2,5 M de tiocianato de amônio. Para as placas contendo oligômero Αβ, a redução para 50% de ligações não é alcançada, mesmo a uma concentração de 4 M de tiocianato de amônio, a maior concentração usada neste estudo. Oligômeros Αβ preparados por diversos métodos independentes, incluindo métodos de ligações cruzadas e métodos sem ligações cruzadas, (Barghom et al., JNeurochem., 95:834-847 (2005); Kayed et al., Molecular Neurodegeneration, 2:18-29 (2007)), forneceram, essencialmente, resultados idênticos.

Estes resultados sugerem que, pelo menos, algum dos anticorpos de oligômeros anti-Αβ podem sem diferenciados dos anticorpos que se ligam a placas em branco com base na avidez de ligação. Para testar esta hipótese ainda mais, foi feita a depleção dos anticorpos de oligômeros anti-Αβ de alta afinidade presentes na IGIV pela passagem através de colunas de afinidade contendo globulômeros Αβ. Para a IGIV que sofreu depleção dos anticorpos de oligômeros anti-Αβ, a concentração do sal caotrópico necessária para alcançar 50% de ligação máxima de oligômeros Αβ globulares foi reduzida de > 4M para 1,3 M de tiocianato de amônio. De modo semelhante, houve uma redução de 2,5 M para 0,9 M de tiocianato de amônio para os poços vazios. Estes resultados sugerem que alguns anticorpos no repertório humano interagem tanto com oligômeros Αβ como com poços vazios. No entanto, também existem anticorpos que têm, especificamente, alta avidez por oligômeros Αβ.

Exemplo 11 Para confirmar que a incubação com tiocianato de amônio em seguida a ligação dos anticorpos permitiría a discriminação entre anticorpos de oligômeros anti-Αβ de alta afinidade e aqueles que se ligam de modo mais promíscuo com poços de ELISA vazios, foi determinada a avidez da IgG no plasma e na IgG purificada de quatro indivíduos, dois controles mais novos e dois controles idosos (Figura 5). A IgG purificada, a 1 mg/ml, destes indivíduos exibiu consistentemente ligação com os poços vazios. A absorbância observada para a ligação com as placas em branco é reduzida em —80% após o tratamento com tiocianato 4 M; esse resultado é similar ao obtido com IGIV no Exemplo 10. No entanto, a ligação relativa com poços contendo oligômeros Αβ42 foi reduzida em apenas -20%. Do mesmo modo que com oligômeros Αβ, tanto anticorpos de monômeros anti-Αβ como de fibrilas anti-Αβ são mais resistentes à dissociação com tiocianato de amônio que os anticorpos que se ligam às placas em branco. Assim, parece possível definir um conjunto de condições que permita a medição de anticorpos anti-Αβ em misturas de anticorpos humanos purificados, com interferência mínima de anticorpos que têm a capacidade de se ligar a poços de ELISA vazios.

Exemplo 12 Geração de anticorpos polivalentes por ácidos e agentes desestabilizantes. A exposição de soro a condições até mesmo levemente ácidas mostrou causar o aumento da concentração de anticorpos polivalentes, muitos dos quais são alvo de auto-antígenos (Bouvet et al, J Autoimmun, 16:163-172 (2001); Djoumerska et al, Scand J de Immunol, 61:. 357-363 (2005)). Também foi relatada a geração de polivalência pela acidificação leve de um anticorpo monoclonal específico para o qual a alteração do pH resultou em uma maior ligação polivalente através da desnaturação parcial do sítio de ligação com o antígeno (Dimitrov et al., Molec Immunol, 44:1854-1863 (2007)). Testamos diversos lotes de IGIV (Gammaguard, Baxter) e descobrimos que a acidificação até ph 3,0 leva a um aumento nas concentrações de monômeros Αβ, na faixa de 3,7 a 9,8 vezes. Este aumento na concentração foi revertido por uma incubação de 24 horas de duração em um pH neutro e temperatura ambiente. A geração de polivalência pela incubação em ph 2,0 não foi totalmente reversível. Isto sugere que a incubação a valores de pH muito baixos altera irreversivelmente a integridade estrutural dos anticorpos que, no entanto, retêm a capacidade de se ligar de forma não-específlca a uma variedade de antígenos. A exposição a uréia 6 M, um tratamento de desnaturação mais rigoroso, também aumenta a concentração aparente de uma série de auto-anticorpos presentes na IGIV (Bouvet et al., J Autoímmun., 16:163-172 (2001)). IGIV a 10 mg/ml em PBS foi dialisada contra PBS puro ou com uréia a 6 Μ. O aumento na concentração de anticorpos foi calculada pela divisão da concentração de anticorpos após o tratamento com uréia e a concentração de anticorpos do controle de PBS (Wardemann et al., Science, 301:1374-1377 (2003)). Os resultados mostrados na Tabela 1 são uma média de um mínimo de dois experimentos para cada auto-antígeno. A Tabela 1 mostra que o tratamento com uréia a 6 M aumentou a ligação de anticorpos na IGIV com um conjunto de auto-antígenos, inclusive Αβ. Estes aumentos variaram na faixa de 4 a 23 vezes após o tratamento com uréia em comparação com preparação de IGIV de controle, sendo que o maior efeito foi observado para o peptídeo Αβ. Assim, a desnaturação parcial da IgG aumenta particularmente a concentração de anticorpos anti-Αβ séricos, presumidamente pela alteração no sítio de ligação com o antígeno de modo a permitir ligações mais promíscuas.

Tabela 1. Aumento na concentração de Auto-anticorpos na IGIV após Diálise com Uréia* 6 M A geração artificial de atividade de ligação Αβ pela exposição a ácidos ou outras condições desnaturantes tem importantes implicações na medida de concentrações de anticorpos anti-Αβ em preparações de IgG humanas purificadas. Por exemplo, em controles normais a metade do valor máximo da concentração de ligações com placas em branco pela IgG purificada avaliados pelo método da Proteína G foi, em média, >100 vezes maior do que a do plasma original. Nestes mesmos indivíduos, foi observado um aumento de 50 vezes após a acidificação para ligação com placas com oligômeros. A purificação de IgG humana por métodos que podem desnaturar, ao menos parcialmente, a IgG, p. ex., eluição ácida por resinas de Proteína G, resulta em concentrações mais altas artificialmente devido à indução ácida da polivalência.

Exemplo 13 Efeitos da purificação não-desnaurante da IgG. Investigamos então se o isolamento da IgG por cromatografia de absorção tiofílica evitaria a criação da polivalência associada com a eluição ácida. A cromatografia de absorção tiofílica explora a ligação da IgG com uma parte da molécula no qual um grupo sulfona está próximo a um grupo tioéter. Conforme mostrado na Figura 6, IgG preparada por cromatografia tiofílica remove a maioria das proteínas não-imunoglobulinas presentes no plasma. Enquanto que o absorvente tiofílico é um pouco menos eficiente na remoção de outros constituintes do plasma que a cromatografia por Proteína G, ele não sujeita a imunoglobulina a condições desnaturantes que podem promover a geração de polivalência. Consistente com essa afirmação, a re-purificação da IgG de IGIV usando absorvente tiofílico não altera a concentração de anticorpos que se ligam tanto a placas Αβ como a placas em branco.

Para comparar a ligação de anticorpos anti-Αβ no plasma integral com aqueles purificados por vários métodos, foi empregada ressonância plasmática de superfície (RPS), conforme descrito acima. Nós comparamos a ligação do plasma integral de um controle normal com uma IgG do mesmo plasma purificada tanto por Absorvente Tiofílico como por cromatografia por Proteína G. As medições foram feitas em um sensor de oligômero Αβ. O sensor de oligômero Αβ consistia em um oligômero Αβ biotinado ligado a Neutravidina, que foi pareada covalentemente com cadeias PEG (polietileno glicol) no sensor.

As curvas de resposta RPS para concentrações comparáveis de três preparações são mostradas na Figura 7. IgG purificada com reagente tiofílico rende uma deflexão mais positiva do que o plasma todo. Esta diferença provavelmente reflete a diminuição da interferência das proteínas plasmáticas nas ligações Αβ. Quando a IgG foi isolada por cromatografia tiofílica, o aumento das concentrações meio-max das ligações com placas em branco foi aproximadamente 3 vezes maior do que para o plasma, e quase 5 vezes maior para placas com ligação com oligômeros. Assim, a ligação específica com placas com oligômeros Αβ foi melhorada com o método de isolamento tiofílico, muito provavelmente refletindo a eliminação da interferência de proteínas plasmáticas. A IgG purificada por cromatografia com Proteína G mostrou uma resposta negativa surpreendentemente diferente, o que indica maior ligação ao sensor de controle do que à placa contendo antígeno. O sensor de controle tem um revestimento de PEG com alanina na terminação, e a resposta negativa após a cromatografia com proteína G muito provavelmente resulta da criação de novas especificidades polivalentes na IgG após a exposição ácida, sendo que pelo menos algumas delas reconhecem o revestimento de PEG do sensor de controle.

Exemplo 14 Medida da atividade anti-amilóide do plasma. Para determinar se a atividade anti-amilóide medida no plasma humano era exclusivamente o resultado da polivalência natural ou induzida, foi usada cromatografia por afinidade para separar da IGIV, anticorpos anti-amilóide humanos de variadas especificidades, incluindo anticorpos de monômero anti-Αβ, de oligômero Αβ e de fibrilas Αβ. No caso de anticorpos de monômero anti-Αβ, foram isolados dois tipos de anticorpos. O primeiro conjunto de anticorpos ligados a monômeros Αβ se parearam com a resina de afinidade na terminação amino (anti-ΑβΝ) e o segundo conjunto ligado a monômeros Αβ se pareou na terminação carboxila (anti-ApC).

Foram determinadas as constantes de dissociação para os dois tipos de anticorpos de monômero anti-Αβ e para os anticorpos anti-oligômeros por análise por RPS. A Tabela 2 mostra as medidas de IQ para os anticorpos anti-amilóide que nós isolamos, e para 6E10, um anticorpo anti-Αβ monoclonal, que se liga com um epítopo Αβ localizado perto da terminação amino. Os valores de Kd indicam que os anticorpos purificados por afinidade têm diferentes especificidades, já que as afinidades de ligação foram maiores com sensores contendo a mesma forma de amilóide que foi usada para a purificação por afinidade. Pode haver, no entanto, alguma sobreposição de especificidade. Todas as preparações de anticorpos purificados por afinidade apresentaram ligação com os poços de placas de ELISA em branco. O percentual de OD observado nas diversas placas amilóide que foi obtido para ligação com placas em branco variou conforme as diferentes preparações de anticorpos purificadas por afinidade. Por exemplo, no caso de anticorpo anti-ΑβΝ, a ligação com poços em branco foi igual a aproximadamente 28% da ligação com poços com monômeros, a 15% da ligação com poços com fibrilas e essencialmente a toda a ligação com poços com oligômeros.

Tabela 2. Kd’s de anticorpos de IGIV purificados por afinidade A Tabela 3 resume as propriedades de ligação com placas em branco dos anticorpos anti-Αβ purificados por afinidade isolados da IGIV. No caso de anticorpos anti-fibrilas, foram testadas duas preparações diferentes. A primeira preparação de anticorpos foi purificada por afinidade em uma coluna de fibrilas Αβ42, e inclui anticorpos para o peptídeo Αβ e neo-epítopos estruturais associados com a fibrilização. A segunda preparação de anticorpos de fibrilas anti-Αβ foi purificada por afinidade uma segunda vez em uma coluna de fibrilas IAPP (polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas) e, presumidamente, contém apenas aqueles anticorpos para os neo-epítopos associados com fibrilas (0'Nuallain et al., JImmunol, 176:7071-7078 (2006)). Essa última fração apresentou menor ligação com placas em branco.

Tabela 3. Ligação com placas em branco de anticorpos anti-Αβ purificados por afinidade. Proporção entre a ligação com placas em branco e com placas contendo amilóide. * Purificado por passagem em uma resina de afinidade com Αβ42 fibrilar ** Purificado em uma resina de afinidade com Αβ42 fibrilar seguido de re-purificação em uma resina de IAPP fibrilar Entende-se que os exemplos e configurações descritos aqui são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações nas mesmas serão sugeridas por pessoas qualificadas no assunto e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance desta aplicação e no escopo das reivindicações anexadas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes aqui citados são incorporados por referência, na sua totalidade, para todos os efeitos.

Claims (53)

1. Método para detectar um anticorpo anti-amilóide de alta avidez presente em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo não-específico; e c) detecção da presença ou do nível dos complexos remanescentes.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma composição de imunoglobulina preparada por cromatografia tiofílica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez.

4. Método para detectar um anticorpo anti-amilóide de alta avidez presente em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; e d) detecção da presença ou nível do complexo.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do complexo formado na etapa (c) com uma solução contendo um agente caotrópico.

6. Método para identificar um paciente candidato a tratamento de uma doença ou condição relacionada a amilóide, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo compreendendo um antígeno amilóide e um anticorpo não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez; c) detecção do nível dos complexos remanescentes; e d) determinação se o paciente se beneficiaria de um tratamento compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina.

8. Método das reivindicações 6 e 7, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende uma atividade física e/ou social.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um inibidor de colinesterase, antagonistas parciais de glutamato ou uma droga psiquiátrica.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma composição de imunoglobulina preparada por cromatografia tiofílica.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide de alta avidez é específico para uma proteína amilóide selecionada do grupo constituído por proteína Beta-amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (Apo-Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína do fator de transformação do crescimento beta induzido ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3) e imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide reconhece especificamente monômeros de proteína amilóide.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide reconhece especificamente oligômeros de proteína amilóide.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide reconhece especificamente fibrilas de proteína amilóide.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide é um anticorpo amilóide anti-Beta.

17. Método para identificar um paciente candidato a tratamento, compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide presente na amostra; b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; d) detecção da presença ou nível do complexo; e e) determinação se o paciente se beneficiaria de um tratamento compreendendo a administração de uma preparação de imunoglobulina pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende a administração de uma preparação de imunoglobulina.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende uma atividade física e/ou social.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um inibidor de colinesterase, antagonistas parciais de glutamato ou uma droga psiquiátrica.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do complexo formado na etapa (c) com uma solução contendo um agente caotrópico.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 21, caracterizado pelo fato de que o paciente foi diagnosticado com uma doença associada a uma proteína amilóide.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinomas, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amiloidose sistêmica não-neuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofía comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL).

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a doença é a mal de Alzheimer.

25. Método para diagnosticar uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo não-específico; e c) detecção do nível dos complexos remanescentes; e d) diagnóstico do paciente pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma composição de imunoglobulina preparada por cromatografia tiofílica.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez.

28. Método para diagnosticar uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; d) detecção da presença ou nível do complexo; e e) diagnóstico do paciente pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do complexo formado na etapa (c) com uma solução contendo um agente caotrópico.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 32, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em mal de Alzheimer, diabetes mellitus Tipo II, mal de Parkinson, encefalopatia espongiforme transmissível, doença de Huntington, carcinoma medular da tireóide, arritmias cardíacas, aterosclerose, artrite reumatóide, amiloidose aórtica mediai, prolactinomas, polineuropatia amilóidica familiar (ou polineuropatia amilóide familiar (PAF)), amiloidose sistêmica não-neuropática hereditária, amiloidose relacionada à diálise, amiloidose do tipo Finlandês, distrofia comeal lática, angiopatia amilóidica cerebral, angiopatia amilóidica cerebral (do tipo islandesa), e amiloidoses sistêmicas da imunoglobulina de cadeia leve (AL).

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a doença é a mal de Alzheimer.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a administração, ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma preparação de imunoglobulina.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 32, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende uma atividade física ou social.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 33, caracterizado pelo fato de que o tratamento compreende um inibidor de colinesterase, antagonistas parciais de glutamato ou uma droga psiquiátrica.

35. Método para proporcionar um prognóstico para a progressão de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo não-específico; e c) detecção do nível dos complexos remanescentes; e d) fornecimento de um prognóstico para a progressão da doença pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma composição de imunoglobulina preparada por cromatografia tiofílica.

37. Método de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez.

38. Método para proporcionar um prognóstico para a progressão de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; d) detecção da presença ou nível do complexo; e e) fornecimento de um prognóstico para a progressão da doença pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma etapa de lavagem do complexo formado na etapa (c) com uma solução contendo um agente caotrópico.

40. Método para proporcionar um prognóstico para tratamento de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica do paciente em contato com uma pluralidade de antígenos amilóides sob condições adequadas para formar: (i) um complexo constituído de um antígeno amilóide e um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e (ii) um complexo constituído por um antígeno amilóide e um anticorpo anti-amilóide de alta avidez; b) lavagem dos complexos de antígeno amilóide formados na etapa (a) com uma solução contendo um agente caotrópico para dissociar pelo menos um complexo compreendendo um antígeno amilóide em um anticorpo de baixa afinidade ou não-específico; e c) detecção do nível dos complexos remanescentes; e d) fornecimento de um prognóstico para tratamento da doença pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma integral ou uma fração do mesmo.

42. Método de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma composição de imunoglobulina preparada por cromatografia tiofílica.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não-específico é um anticorpo anti-amilóide de baixa avidez.

44. Método para proporcionar um prognóstico para tratamento de uma doença associada a uma proteína amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) colocação da amostra biológica em contato com uma resina tiofílica para ligação do anticorpo anti-amilóide; b) eluição do anticorpo da resina tiofílica em um pH tal que não cause a desnaturação, para formação de um eluado; c) colocação do eluado em contato com um antígeno amilóide para a formação de um complexo compreendendo o antígeno amilóide e o anticorpo anti-amilóide; d) detecção da presença ou nível do complexo; e e) fornecimento de um prognóstico para tratamento da doença pela comparação do nível de anticorpos anti-amilóide com um nível de controle.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do complexo formado na etapa (c) com uma solução contendo um agente caotrópico.

46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma integral ou uma fração do mesmo.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide é específico para uma proteína amilóide selecionada do grupo constituído por proteína Beta-amilóide (Αβ; Abeta), polipetídeo amilóide das ilhotas pancreáticas (IAPP; Amylin), α-sinucleína (SNCA), proteína priônica (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), fator natriurético atrial (FNA), apolipoproteína AI (Apo-Al), proteína amilóide A sérica (SAA), amilóide medina (fragmento da proteína EGF fator 8 do glóbulo de gordura do leite), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidase C), microglobulina Beta 2 (β2Μ), gelsolina (AGEL), proteína do fator de transformação do crescimento beta induzido ig-h3 (Beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3) e imunoglobulina de cadeia leve (AL) e uma proteína amilóide tendo repetições poliQ.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo amilóide anti-beta especifícamente reconhece monômeros de proteína beta amilóide.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo amilóide anti-beta especifícamente reconhece oligômeros de proteína beta amilóide.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 47, caracterizado pelo fato de que o anticorpo amilóide anti-beta especifícamente reconhece fibrilas de proteína beta amilóide.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-amilóide é um anticorpo amilóide anti-beta.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que amostra biológica é de um ser humano.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que o agente caotrópico é um sal de tiocianato.