JP2017528734A - 診断用バイオマーカーとしての抗リンパ球自己抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、(i)国立衛生研究所により付与された契約第RO1 AI077591号及び(ii)米国国防総省により付与された研究認可第W81XWH−06−2−0038号の下の政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本出願は、2014年8月8日出願の米国仮特許出願第62/035073号、表題「Methods of Using Anti−Lymphocyte Autoantibodies as Indicators for Systemic Lupus Erythematosus」の利益を主張し、この出願の開示は、引用を以てその全体が本明細書に組み込まれる。
ALA−抗リンパ球自己抗体(anti-lymphocyte autoantibodies)
<材料及び方法>
[研究参加者]
SLE患者:確定的SLEについて米国リウマチ学会の分類基準を満たす326人の患者を最初に集め、追跡した。
各参加者の来院時に、抗凝固剤としてEDTAを含むVacutainer(登録商標)チューブ(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)に、4.5mlの血液サンプルを収集した。EDTAで凝固を阻止した血液サンプルを、採血後24時間以内に処理した。10分間の遠心分離によって800×gで血漿を分画し、4℃(即時の短期使用用)又は−80℃(将来の長期使用用)で保存した。抗凝固剤のない血清分離チューブに収集した健康なコントロールの血液から、正常なヒト血清を調製し、分注し、使用するまで−80℃で保存した。Pierce ImmunoPure(登録商標)(A/G)IgG精製キット(Thermo Scientific,Rockford,IL)を用いて、メーカーの説明書に従って、血漿中に存在する免疫グロブリンG(IgG)を単離した。IgGの収集後、タンパク質A/Gアフィニティカラムからのフロースルーを、Pierce Nab(商標)Protein L Spin精製キット(Thermo Scientific)を用いて、メーカーの説明書に従ってさらに分画して、IgMを富化した。各アフィニティカラムから溶出したIgG画分及びIgM画分を脱塩し、バッファをリン酸緩衝食塩水(PBS)に変え、Microcon(登録商標)遠心フィルタ(分子量カットオフ30kD;EMD Millipore,Billerica,MA)を用いて、遠心分離によって濃縮した。Igを欠乏させるために、血漿サンプルを、タンパク質A/Gカラム及びタンパク質Lカラムに2回連続して通した。最終フロースルーを収集し、PBSに対して透析し、Microcon(登録商標)装置を用いて元の体積に濃縮し直した。リンパ球反応性Igを欠乏させるために、血漿サンプル(50μl)を、末梢血リンパ球(107個の細胞;健康なコントロール個体から単離した)と4℃で30分間インキュベートしてから、遠心分離による細胞の除去によって回収した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、EDTAで凝固を阻止した血液サンプルから、採血後24時間以内に勾配遠心分離によって単離した。簡潔に、血液サンプルを遠心分離して、血漿及び細胞を分離した。細胞画分を、3つの分量のPBSで希釈し、Ficoll−Paque(商標)Plus溶液(GE Healthcare Bio−Sciences,Piscataway,NJ)の上に重ね、室温で20分間、400×gで遠心分離した。血漿とFicoll溶液間の界面に配置された単核細胞を、フレッシュなチューブ中に慎重に移して、PBSで充分に洗浄して、混入する血小板を除去し、そしてPBS中に再懸濁させた。
EDTAで凝固を阻止した血液から調製したPBMCを、CB−CAP検出のために等分量のアリコートに分割した。最近開発された多色フローサイトメトリーアッセイを一部変更して用いて、T細胞に結合したC4d及びIgのレベルを測定した。リンパ球、単球、及び残留する顆粒球を、特徴的な表面分子の発現と、前方(サイズ)/側方(粒度)スキャッタリングにおけるそれらに固有の特徴とに基づいて識別した。系統特異的細胞表面マーカー(T細胞についてのCD3、CD4、及びCD8;BD Biosciences,San Diego,CA)との反応性を有するフィコエリトリン(PE)−、PE−Cy5−、又はアロフィコシアニン(APC)−結合マウスモノクローナル抗体(mAb)を、Zenon抗体ラベリングキット(Life Technologies,Carisbad,CA)を用いてAlexa Fluor色素で標識されている、マウスモノクローナル抗ヒトC4d mAb(マウスIgG1;C4のC4d含有フラグメントとの反応性を有する;Quidel,San Diego,CA)、抗ヒトIgG(マウスIgG1;BD Biosciences)、或いは、抗ヒトIgM(マウスIgG1;BD Biosciences)と併せて使用した。或いはまた、PE結合抗ヒトIgカッパ鎖、又はPE結合抗ヒトIgラムダ鎖(BD Biosciences)を、抗C4d及び抗細胞表面マーカー抗体と併用して、T細胞結合Igの軽鎖サブタイプを同定した。染色後、FACSCalibur(商標)フローサイトメータ及びCELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)を用いて、細胞を分析した。検出される抗体染色の特異性を確実にするために、適切なアイソタイプのマウスIgGで染色した各患者由来の白血球アリコートを、全ての実験にルーチン的に含めた。LB−CAP測定の日々の信頼性を確実にするために、CaliBrite 3ビーズと、FACSCompソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)とを用いて、FACSCaliburフローサイトメータを毎日較正した。細胞結合C4d及び細胞結合Igのレベルを、特有の平均(median)蛍光強度(SMFI)として表した。これは、アイソタイプコントロールの平均蛍光強度を引いたC4d(又はIg)−特有の平均蛍光強度として算出された。
健康なコントロール、又はT−C4dレベルが低いSLE患者から個別に単離したPBMC(50μlのPBS中106個の細胞)を、先に記載したフローサイトメトリー分析に基づいて高T−C4d/T−Ig表現型を有すると同定した個々のSLE患者から調製した血漿の50μlを用いて、インキュベートした。一部の実験においては、SLE血漿を、様々な量の精製IgG又はIgM(100〜1000μg)で、Ig欠乏血漿で、又はリンパ球を吸収済みの血漿で置換した。4℃にて30分間インキュベーションした後、PBMC懸濁液をPBSで2回洗浄して、GVB2+バッファ(1%ゼラチン、5mMベロナールNa、142mM NaCl、pH7.3)の50μl中に再懸濁させ、(補体の源として)正常なヒト血清の50μlを用いてインキュベートした。一部のケースにおいては、熱不活化した正常なヒト血清又はC1q欠乏ヒト血清(Quidel)を、ネガティブコントロール血清として用いた。37℃にて40分間インキュベーションした後、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄し、先に記載した多色フローサイトメトリーアッセイにかけた。
[TCD3−C4d、TCD4−C4d、及びTCD8−C4dの患者特異的シグネチャが、SLEにおいて生じる]
横断研究を行なって、T細胞上のC4dのレベルがCD4サブセットとCD8サブセットで類似する、又は異なる患者を同定した。一部の患者において、CD3+T(TCD3)細胞のC4d染色ヒストグラムは、細胞の単一集団を反映し、CD4+T(TCD4)細胞及びCD8+T(TCD8)細胞のC4d染色ヒストグラムは区別できず、2細胞サブセットのそれぞれへのC4d結合レベルが等しいことを反映している(図1、パネルA及びパネルB)。しかしながら、二相性TCD3−C4dヒストグラムが、SLE患者の多くで観察された(図1、パネルC〜パネルF)。TCD4−C4d及びTCD8−C4dアッセイは、これらの二相性ヒストグラムが、個々の患者内のこれらの2つの細胞サブセットにおけるC4dレベルの差異に起因することを実証した。一部の患者において、TCD8細胞と比較してかなり高いレベルのC4dが、TCD4細胞で検出された(図1、パネルC及びパネルD)。逆に、他の患者におけるTCD4細胞と比較して有意に高いレベルのC4dが、TCD8細胞に存在し得た(図1、パネルE及びパネルF)。概して、所定の患者のTCD4−C4d/TCD8−C4d特異的な選択的結合プロファイル又はシグネチャは、経時的に安定したままであるように見えたが、細胞に存在するC4dの実際のレベルは、経時的に変動し得た(表1)。このパターンに対する例外が存在した。結合パターンの「変換」が、疾患の経過中に、一部の患者において起こった(例えば、患者SLE56525及びSLE102357、表1)。以前に報告されたように、補体C5b−9(膜攻撃複合体)は、T細胞で検出されなかった。いかなる動作理論にも拘束されることを意図するものではないが、T細胞サブセットがC4d付着によって選択的にターゲットとなって、患者特異的T−C4dシグネチャが同定できるというこの結果は、特定の機構がこれらの表現型の生成の原因であり得ることを示唆した。T−C4dシグネチャは、リンパ球減少と関連しなかった(図示せず)。
[免疫グロブリン及びC4dは、SLEにおいてT細胞に同時に存在する]
T−C4dのシグネチャの原因である機構は、一部の患者においては、TCD8細胞に対してTCD4細胞でのC4dの特異的付着の原因であるはずであり、最も可能性が高い説明は、TCD8細胞に対してTCD4細胞に特異的な自己抗体を介するというものであろう。これは、SLE患者におけるT細胞の表面でのC4d(T−C4d)及び免疫グロブリン(T−Ig)の存在を調査し、かつ相関させるフローサイトメトリー分析によって、調査された。その結果は、SLE患者群の有意な画分(約30%)由来のT細胞が、実際に、来院時にC4d及びIgの双方で同時にデコレートされていることを実証した(図2A)。各患者のT−C4d/T−Ig表現型及びレベルの相当な変化に注目した。全員ではないが一部の患者におけるT−C4dレベルとT−Igレベルとの良好な相関に注目した。各ヒストグラム内の挿入図は、対応する相関分析を示している。青色のカラム:T−C4d;紫色のカラム:T−Ig。残りのSLE患者は、C4d若しくはIgの何れかについてシングルポジティブであり、又はダブルネガティブであった。比較すると、他の疾患の患者及び健康なコントロールのT細胞は、表面結合Ig及びC4dの双方について、ネガティブであった(図2B;T−Igについてのみデータを示す)。他の自己免疫疾患患者185人のうち、2人の患者(両者ともシューグレン症候群)のみが、T細胞の表面に存在するIgのレベルが有意に高かった。2人の患者のうち1人はまた、T−C4dレベルも有意に高かった。
[T−C4d表現型は、SLE患者由来の血漿によって移される]
Ig及びC4dが、一部のSLE患者の循環T細胞の表面で同時に検出されたので、特定の抗T自己抗体の結合が、補体系を活性化して、当該細胞の表面に付着するC4dを生じさせるというモデルを仮定した。それ故に、SLE患者の血漿が、T−C4d表現型に結合してこれを正常なT細胞にインビトロで「移す」ことができるか否かを調査した。SLE患者の研究群、他の疾患患者、及び健康なコントロールに由来する様々な血漿サンプルを、健康な個体から、又はごく僅かなレベルのT−C4dしか有していないSLE患者から単離したT細胞に対して試験した。処理した細胞集団内のT細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。図4に典型的に示すように、T−C4dネガティブである正常なT細胞(パネルA)は、T−C4d及びT−Igレベルが高いことが知られているドナーSLE患者から調製した血漿で処理した後の表面で、有意なレベルのC4dを獲得した(パネルB1及びC1)。健康なレシピエント細胞上で生じたT−C4dのパターンは、注目すべきことに、各実験において、狼瘡ドナー細胞に存在するものと類似していた。比較すると、健康なコントロールの血漿は、正常なT細胞でC4d付着を生じさせることができなかった(パネルD1)。高いレベルのC4dが、健康なコントロールの血漿及びIgではなく、T−C4d+SLEの血漿及びIgによる処理後の細胞表面に付着した点に留意のこと。それらの結果は、低いT−Ig/T−C4d表現型を示したSLE患者の血漿でも、健康なコントロールの血漿でもなく、T−Ig/T−C4d表現型の高まりを示したSLE患者ドナーの血漿のみが、T−C4d表現型を正常なT細胞に移すことができることを一貫して示した。
狼瘡患者由来の血漿によるTC4d表現型の移行は、C5b−9の生成にも、細胞数の有意な減少にも至らない(データは示さず)。
[T−C4d表現型は、SLE患者の免疫グロブリンによって移される]
SLE患者の血漿から精製したIgを用いて、表現型移行実験を実行した。その結果は、T−C4dレベルが高いSLE患者の血漿から精製したIgが、正常なT細胞にインビトロでT−C4d表現型を移すことができることを実証した(図4、パネルB2及びパネルC2;図4A参照)。健康なコントロールから(図4、パネルD2)、又はT−C4dレベルがごく僅かなSLE患者から(図示せず)精製したIgは、T−C4dシグネチャを移すことができなかった。IgGと比較して、等濃度のIgMが、T−C4dシグネチャをより効果的に生じさせたことから、古典的補体経路活性化の機械的役割が裏付けられた(図5A)。IgMは、IgGと比較して、古典的補体経路のかなり強力な活性化剤であることから、結合後に細胞表面でT−C4dをかなり効果的に生じさせる。ドナーSLE血漿からのIgの減少により、補体活性化とT細胞へのC4d結合をインビトロで誘導する能力は完全に無効となった(図5B)。さらに、SLE血漿のこの能力は、潜在的なリンパ球反応性液性因子を、リンパ球との血漿のプレインキュベーションによって除去すると、有意に減少した(図5B)。ヒト血小板又は線維芽細胞による吸収は、効果が無かった(図示せず)。これらの結果は、SLE患者中のT−C4dシグネチャが、抗T細胞自己抗体及び抗T細胞サブセット自己抗体によって生じるという仮説を裏付けている。
[SLEと、他の疾患(OD)と、健康なコントロール(HC)間での比較]
以下に記載する患者データを用いて、更なる分析を実行した(表2)。連続したデータを、SLE、OD、及びHCで階層化して、平均±標準偏差(SD)、並びにメジアン及び四分位範囲(IQR)として報告した。分散分析(ANOVA)を用いて、3群間の全体的差異を検定した。相互比較に関する情報を与えるために、事後検定を用いた。CB−CAPバイオマーカーの敏感度及び特異度を夫々、OD患者及びHC患者を用いることによって、SLE患者において判定した。マーカー、そしてまたサブセットのそれぞれに応じて、受信者動作曲線(ROC)を用いた。
Claims (27)
- 非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程を含む方法。 - Tリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項1に記載の方法。
- サンプル中のTリンパ球は、CD4+Th1リンパ球、CD4+Th2リンパ球、及びCD8+細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも1つのTリンパ球型によって表される、請求項2に記載の方法。
- サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化する工程を更に含んでおり、診断用バイオマーカーは、C4d、C3d、補体経路のC4構成要素、及び補体経路のC3構成要素からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 診断用バイオマーカーは、C4dである、請求項4に記載の方法。
- 非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
(a)個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
(b)(a)におけるレベルを、コントロールTリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程とを含んでおり、
(a)におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加が、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する方法。 - Tリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルは、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定される、請求項6に記載の方法。
- サンプル中のTリンパ球は、CD4+Th1リンパ球、CD4+Th2リンパ球、及びCD8+細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも1つのTリンパ球型によって表される、請求項7に記載の方法。
- Tリンパ球は、CD4+Th1リンパ球である、請求項7に記載の方法。
- Tリンパ球は、CD4+Th2リンパ球である、請求項7に記載の方法。
- Tリンパ球は、CD8+細胞障害性リンパ球である、請求項7に記載の方法。
- サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化する工程を更に含んでおり、診断用バイオマーカーは、C4d、C3d、補体経路のC4構成要素、及び補体経路のC3構成要素からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 診断用バイオマーカーは、C4dである、請求項12に記載の方法。
- 非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察する方法であって、
(a)個体から白血球を含む血液サンプルを得る工程と、
(b)血液サンプルから末梢血単核細胞集団を単離する工程と、
(c)末梢血単核細胞集団を、末梢血単核細胞集団内のTリンパ球の細胞表面に結合した自己抗体に特異的に結合する検出可能試薬を用いてインキュベートすることで、Tリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体を形成する工程と、
(d)Tリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを測定する工程と、
を含む方法。 - Tリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体は、フローサイトメトリーによって測定される、請求項14に記載の方法。
- 個体から得たT細胞−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルを、コントロール血液サンプルから得た類似のTリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルと比較する工程を更に含んでおり、コントロール血液サンプルと比較した個体の血液サンプル由来のTリンパ球−自己抗体−検出可能試薬の複合体のレベルの増加が、個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、請求項14に記載の方法。
- 検出可能試薬は、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光標識抗ヒトIg抗体である、請求項14に記載の方法。
- 蛍光標識抗ヒトIg抗体は、蛍光標識抗ヒトIgG抗体及び蛍光標識抗ヒトIgM抗体からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- キットであって、
(a)Tリンパ球に結合する自己抗体を特異的に認識する蛍光標識抗体であって、抗IgGモノクローナル抗体又は抗IgMモノクローナル抗体である抗体と、
(b)随意選択的に、CD3+CD4+Tリンパ球とCD3+CD8+Tリンパ球とを識別する系統特異的Tリンパ球表面マーカーと反応性のフルオロ結合モノクローナル抗体と、
(c)随意選択的に、1又は複数の生化学試薬と、
(d)随意選択的に、全身性紅斑性狼瘡の診断におけるキットと(a)、(b)及び(c)の構成要素の使用についての説明書と、
を含むキット。 - フルオロ結合モノクローナル抗体は、CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、Crth2、CCR6、CXCR5、及びCD25からなる群から選択される特定のTリンパ球表面マーカーに反応性を有する、請求項19に記載のキット。
- 非全身性紅斑性狼瘡炎症性疾患又は非全身性紅斑性狼瘡炎症病態とは異なる個体において全身性紅斑性狼瘡を確定的に診断又は観察するためのシステムであって、
プロセッサと、
プログラム命令を含む非一時的なコンピュータ読出可能記憶媒体と、
を備えており、
プログラム命令は、実行されると、
(a)個体由来の白血球を含む血液サンプルにおいて、サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している個体の自己抗体のレベルを定量化する工程と、
(b)(a)におけるレベルを、コントロールTリンパ球の表面に付着又は接触している自己抗体のレベルと比較する工程であって、(a)におけるサンプル由来の自己抗体のレベルの増加が個体の全身性紅斑性狼瘡を同定する、工程と、
行うようにプロセッサに命令するように構成されている、システム。 - Tリンパ球の表面に付着又は接触している、個体の自己抗体のレベルを、血液サンプルから得た末梢血単核細胞の集団から測定する、請求項21に記載のシステム。
- サンプル中のTリンパ球は、CD4+Th1リンパ球、CD+Th2リンパ球、及びCD8+細胞障害性リンパ球からなる群から選択される少なくとも1つのTリンパ球型によって表される、請求項22に記載のシステム。
- Tリンパ球は、CD4+Th1リンパ球である、請求項22に記載のシステム。
- Tリンパ球は、CD4+Th2リンパ球である、請求項22に記載のシステム。
- Tリンパ球は、CD8+細胞障害性リンパ球である、請求項22に記載のシステム。
- 命令は更に、実行されると、サンプル中のTリンパ球の表面に付着又は接触している全身性紅斑性狼瘡の診断用バイオマーカーのレベルを更に定量化するようにプロセッサに指示するように構成された命令を含んでおり、診断用バイオマーカーは、C4d、C3d、補体経路のC4構成要素、及び補体経路のC3構成要素からなる群から選択される、請求項21に記載のシステム。
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