CN107110861A - 作为诊断性生物标志物的抗淋巴细胞的自身抗体 - Google Patents

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Abstract

提供用于诊断或监护个体中的系统性红斑狼疮的方法、系统和药盒。在特定方面，在来自个体的包含白血细胞的血液样本中，定量在样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的自身抗体。

Description

作为诊断性生物标志物的抗淋巴细胞的自身抗体
关于联邦政府资助研究的声明
本发明的作出得到由(ⅰ)国立卫生研究院授予的合同RO1AI077591，和(ⅱ)美国国防部授予的研究资助W81XWH-06-2-0038的政府支持。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2014年8月8日提交的，标题为“应用抗淋巴细胞自身抗体作为系统性红斑狼疮指标的方法”的美国临时专利申请号62/035073的权益，通过引用将所述临时申请的公开内容以其全部合并入本文。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)，原型自身免疫性疾病，它的特征在于无数的免疫异常，包括过量的自身抗体产生、补体系统的激活、淋巴细胞功能障碍和淋巴细胞减少。当补体系统激活时，C3和C4的蛋白水解切割最终导致C3d和C4d片段的产生，这些片段包含高反应性硫酯部分并且可以共价结合到病原体、细胞或免疫复合物的表面。本发明人最近报道了患有SLE的患者的红细胞、网织红细胞、血小板和淋巴细胞表面上特异性地存在显著水平的C4d。最近的多中心研究证实细胞结合的补体激活产物(CB-CAPs)作为狼疮的诊断性生物标志物，并且附加的报道已经证明它们作为狼疮疾病活动性和分层的生物标志物的显著潜力。
CB-CAPs除了它们作为狼疮生物标志物的作用，已经显示出赋予循环细胞例如红细胞和T淋巴细胞以功能异常，表明在狼疮发病机理中的作用。对由此产生CB-CAPs的细胞和分子事件的阐明，可以导致通过预防、破坏或中和CB-CAP产生的下游效应中的任何一种来识别潜在的治疗靶标。在CB-CAPs和狼疮发病机理之间最引起兴趣的潜在联系之一是长期存在但了解甚少的观察结果，即患有SLE的患者庇护循环抗淋巴细胞抗体。
在20世纪70年代发现了患有SLE的患者中的抗淋巴细胞抗体(ALA)，特别是对T细胞特异性的抗淋巴细胞抗体。从那时起，已经进行了很多努力来表征这些ALA。然而，它们在疾病发病机理中的作用仍然不确定。先前已经描述了SLE中抗T细胞抗体的两种主要类型。首先，在4℃时与T细胞最佳结合的冷反应性IgM抗体已被报道在患有SLE的患者中常见。然而，由于在体外试验以及体内致病分子和细胞机理之间的热差异，这些抗体的体内意义是不清楚的。第二，狼疮中的温热反应性IgG抗T细胞抗体已经被报道。已经显示这些抗体对各种T细胞表面分子，包括CD3、CD4、CD45和IL-2R，具有多样化的特异性。
这些IgM对IgG抗T细胞抗体在狼疮发病机理中的两种不同的作用已经被提出，两者都涉及细胞靶标的破坏。IgM在经典补体途径的激活中有效500倍，表明T细胞可能的溶解性攻击。然而，如果这些冷反应性IgM分子的结合仅发生在低温，将在体内消除这种可能性。此外，IgM抗T细胞抗体的存在未显示与SLE中的淋巴细胞减少相关。IgG是较低效的补体激活剂，然而它们的温热反应性使得这样的体内机理至少是可行的。抗T细胞IgG的其他潜在作用已经被提出，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)以及T细胞信号传导和基因表达的调节。
一些报道已经表明狼疮中的T淋巴细胞功能障碍可能是由循环IgM和IgG抗T细胞自身抗体引发的而不是由于内在缺陷，尽管这两种可能性不是相互排斥的。总而言之，这些现有报道表明抗T细胞抗体存在于一些患有SLE的患者中，并且它们在疾病发病机理中的潜在作用的阐明应该考虑同种型、结合和细胞毒性的热幅度以及抗原特异性。
发明内容
在某些方面，提供用于在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法和系统，该方法和系统包括在来自个体的包含白血细胞的血液样本中定量在样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的个体的自身抗体的水平。
在某些方面，提供药盒，所述药盒包括：(a)特异性地识别结合至T淋巴细胞的自身抗体的荧光标记的抗体，其中所述抗体是抗IgG或抗IgM单克隆抗体；(b)可选地，与谱系特异性T淋巴细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，以区分CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞；(c)可选地，一种或更多种生化试剂；以及，(d)可选地，所述药盒和所述组分(a)、(b)和(c)在系统性红斑狼疮的诊断中的应用的说明书。
附图简述
图1A-F说明C4d可以与SLE患者中的CD4对CD8T细胞有区别地结合。使用在研究访视当天获得的单个血液样本同时测量结合至携带CD3、CD4或CD8的T细胞的C4d的水平。显示了来自6个代表性SLE患者的流式细胞直方图，以说明在给定时间在同一患者中CD4d T和CD8T细胞上的类似的(组A和B)或不同的(组C-F)水平的C4d的存在。闭合直方图代表Ig同种型对照染色；开放直方图代表C4d特异性的染色。
图2A-C说明C4d和Ig同时存在于SLE患者中T细胞的表面上，但不存在于患有其他疾病的患者或健康对照中。(A)从326名SLE患者制备的外周血CD3T细胞通过流式细胞术表征表面结合的Ig(T-Ig)和C4d(T-C4d)。指出了4个不同的SLE患者组，C4d-/Ig-(蓝色菱形符号)，C4d+/Ig+(红色正方形符号)，C4d+/Ig-(绿色三角形符号)和C4d-/Ig+(水绿色圆形符号)。(B)通过流式细胞术测量来自SLE患者(n＝326)、患有其他疾病的患者(n＝185)和健康对照(n＝48)的CD3T细胞上的T-Ig水平。红色水平线表示T-Ig阳性的经验确定的截止值。(C)使用在研究访视当天获得的单个血液样本，通过流式细胞术测量结合在T细胞上的C4d和Ig的水平。显示了10名SLE患者的代表性结果。
图3A-B说明T-C4d和T-Ig的水平随时间波动，但通常与SLE患者中特异性T细胞子集的水平相关。(A)使用在不同的研究访视时获得的单个血液样本，通过流式细胞术测量结合在T细胞上的C4d(浅色柱)和Ig(暗色柱)的水平。(B)使用多色流式细胞分析测量SLE患者的CD4(浅色柱)和CD8(暗色柱)T细胞表面上存在的C4d和Ig。
图4A-D说明血浆和免疫球蛋白将供体的TC4d标识(signature)转移至正常T细胞。从健康对照制备的PBMC未处理(组A；基线表型)，或与两个T-C4d+SLE患者的血浆(组B1和C1)或纯化的Ig(组B2和C2)温育。作为阴性对照，将细胞与健康对照的血浆(组D1)或者纯化的Ig(组D2)温育。
图5A-B说明来自SLE患者的抗T细胞自身抗体可以在正常T细胞上产生供体的T-C4d标识。(A)从SLE患者(SLE102086、SLE101606和SLE102763，具有高的T-C4d水平)、SLE患者(SLE102771，具有低的T-C4d水平)和健康对照(HC2009和HC2034)的血浆中纯化IgG和IgM。纯化的Ig用于体外转移。(B)患者SLE102086、SLE101919和SLE128305的血浆清除IgG和IgM，或者使用从健康对照制备的大量白细胞预吸收以清除淋巴细胞反应性Ig。然后将Ig清除的或白细胞预吸收的血浆用于体外表型转移实验。
图6A-B显示区分SLE和健康对照中的ROC比较。图6A显示与所测量的所有生物标志物的ROC比较。图6B显示用CB-CAP生物标志物(TC4d、EC4d、RC4d和BC4d)的子集区分SLE和健康对照的ROC比较。
图7A-B显示区分SLE和其他疾病的ROC比较。图7A显示与所测量的所有生物标志物的ROC比较。图7B显示用CB-CAP生物标志物(TC4d、EC4d、RC4d和BC4d)子集区分SLE和其他疾病的ROC比较。
详细描述
以下专利申请的公开内容通过引用并入本文；(1)2013年12月10日提交的，题目为“应用补体标记的分子作为疾病的生物标志物的方法和系统”的专利合作条约专利申请号PCT/US13/73983；以及(2)2014年2月6日提交的，题目为“细胞结合的补体激活产物作为狼疮前期的诊断性生物标志物”的专利合作条约专利申请号PCT/US14/015032。
如本文中使用的，“炎性疾病或病况”指引起个体中增加的炎症的任何免疫疾病或病况。炎性疾病或病况也指任何引起个体中增加的炎症的感染性疾病或病况。在一些实施方案中，炎性疾病或病况是“慢性炎性疾病或病况”。慢性炎性疾病或病况是在数周、数月或更长时间后不能消退的炎性病况。慢性炎性病况可以跟随急性炎性病况，或者对于一些疾病或病况，可以在不存在急性炎性疾病或病况的情况下发生。炎性疾病或病况包括下述疾病或病况：SLE、类风湿性关节炎、脉管炎(及其特定形式如韦格纳肉芽肿病)、硬皮病、特发性炎症性肌炎、斯耶格伦综合征、血清病、移植排斥、镰状细胞性贫血、痛风、怀孕的并发症如先兆子痫、多发性硬化、心血管疾病、传染病如丙型肝炎病毒感染、未分化或重叠结缔组织疾病、雷诺氏病、骨关节炎、牛皮癣关节炎、原发性抗磷脂综合征、皮肤狼疮等。这些疾病或病况中的每一种也可以被描述为慢性炎性疾病或病况。
如本文中使用的，“系统性红斑狼疮”、“SLE”或“狼疮”是一种导致多器官受损的原型自身免疫疾病。这种抗自身反应的特征在于针对多种细胞核和细胞质的细胞组分的自身抗体。这些自身抗体与它们各自的抗原结合，形成免疫复合物，该免疫复合物进行循环并最终沉积在组织中。这种免疫复合物的沉积以及随之发生的补体系统的激活引起慢性炎症和组织损伤。
如本文中使用的，“非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况”、“非SLE炎性疾病或病况”或“非狼疮炎性疾病或病况”是任何不是系统性红斑狼疮、SLE或狼疮的炎性疾病或病况，包括但不必须限于类风湿性关节炎、脉管炎(及其特定形式如韦格纳肉芽肿病)、硬皮病、特发性炎症性肌炎、斯耶格伦综合征、血清病、移植排斥、镰状细胞性贫血、痛风、怀孕的并发症如先兆子痫、多发性硬化、心血管疾病、传染病如丙型肝炎病毒感染、未分化或重叠结缔组织疾病、雷诺氏病、骨关节炎、牛皮癣关节炎、原发性抗磷脂综合征、皮肤狼疮等。
如本文中使用的，“白血细胞”指不是红细胞或网织红细胞的循环血细胞，例如T和B淋巴细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、巨核细胞、浆细胞、循环内皮细胞和干细胞。
外周血单核细胞(PBMC)可以对应于任何具有圆形核的血细胞。已知这样的细胞在免疫应答中起作用。PBMC包括比如淋巴细胞，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞、单核细胞以及巨噬细胞。
优选地用于实施本发明的PBMC对应于T淋巴细胞。在本文中，术语“T淋巴细胞”指在任何分化阶段的T淋巴细胞，包括原初CD4+或CD8+T淋巴细胞和成熟CD4+或CD8+淋巴细胞，例如CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞(在它们的细胞表面上表达CD4的辅助T细胞)和CD8+细胞毒性细胞(在它们的细胞表面上表达CD8的细胞毒性T淋巴细胞)。为此，可以通过使用特异性地识别这种基于细胞的标志物的抗体来检测任何这样的细胞亚群。更具体地，作为实施例但不作为限制，术语“特异性地识别外周血单核细胞(PBMC)的抗体”涉及任何特异性地识别存在于PBMC群上的这种标志物的抗体，包括但不限于抗CD3抗体，如果待检测的PBMC群是T细胞群或抗CD8抗体，如果待检测的PBMC群是细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)群。
如本文中使用的，如本文中分别定义的，“对照白血细胞”或“对照PBMC”或“对照T淋巴细胞”指从个体分离的白血细胞、PBMC或T淋巴细胞，该个体没有炎性疾病或病况、没有SLE或显示较低水平的炎性疾病或病况(包括SLE)，由此当与任何这样的“对照”T淋巴细胞相比较时，与具有SLE的个体的比较显示自身抗体与T淋巴细胞的结合或缔合的统计学地相关的增加。当在患者中诊断或监护炎性疾病或病况时，对照白血细胞、对照PBMC或对照T淋巴细胞也可以指在较早时间，例如数周、数月或数年前，从同一患者分离的相应细胞类型。
如本文中使用的，“补体途径组分”包括蛋白C1、C4、C2、C3及其片段，例如，C1q、C1r、C1s、C4a、C4b、C2a、C2b、C4b2a、C3a、C3b、C4c、C4d、iC3b、C3d、C3i、C3dg。还包括C5、C5b、C6、C7、C8、C9、C1inh、MASP1、MASP2、CR1、DAF、MCP、CD59、C3aR、C5aR、C1qR、CR2、CR3和CR4，以及本文没有具体列出的其他补体途径组分、受体和配体。
在某些实施方案中可以用于包含或实施各种过程和系统的某些硬件。硬件可以包括处理器，例如CPU，该处理器操作以执行编程指令。编程指令可以存储在非瞬态的计算机可读的介质例如只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、光盘、数字磁盘、闪存、存储卡、USB驱动器、光盘存储介质、例如基于云的架构的分布式计算机存储平台和/或其它记录介质中。
当在本文中使用时，术语“处理器”可以指单个处理器或多个处理器，它们共同实施过程的各种步骤。类似地，“存储装置”或“数据库”可以指分布有编程指令和/或数据的单个装置或数据库或多个装置或数据库。
缩写
ALA—抗淋巴细胞自身抗体
ADCC—抗体依赖性细胞的细胞毒性
CB—CAPs—细胞结合的补体激活产物
C4d—补体C4激活产物C4d
Ig—免疫球蛋白
SLE—系统性红斑狼疮
T-C4d—T细胞结合的C4d
携带C4d的T细胞是补体激活产物，其作为SLE的诊断性生物标志物已经显示为高度敏感和特异性的。携带C4d的T细胞也是功能异常的，表明其在狼疮发病机理中起细胞结合的补体激活产物(CB-CAPs)的作用。然而，对产生携带C4d的T细胞(T-C4d)负有责任的机理先前没有被确定。本发明人已经进行了横断式和前瞻性研究以调查抗T细胞自身抗体在SLE中产生T-C4d标识的潜在作用。通过流式细胞术表征来自患有SLE的患者、患有其他炎性疾病的患者和健康对照的T细胞的C4d和/或免疫球蛋白(Ig)的表面沉积。通过流式细胞术直接分析从患者新鲜分离的淋巴细胞细胞表面上的免疫球蛋白(即，ALAs)的存在，而不在患者血清或血浆中预先温育。进行体外表型转移实验以表征来自SLE患者的Ig在体外产生T-C4d标识的能力。结果证明，患有SLE的个体患者庇护反映他们的T细胞和T细胞子集上存在C4d和/或Ig的特异性标识。此外，SLE患者特异性标识可以通过暴露于从标识供体纯化的Ig而在体外转移至正常T细胞。补体激活不通过产生C5b-9(膜攻击复合物)或细胞裂解进行，并且T-C4d与淋巴细胞减少不相关。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但这些结果表明，患者特异性T-C4d标识由引发亚溶量补体激活的抗T细胞自身抗体产生。这是在狼疮发病机理中自身抗体和补体激活之间的复杂相互影响中的一个重要但先前未被识别的关联。据信，T-Ig和T-C4d之间的因果关系，由此T-Ig引起T-C4d沉积，不仅对于狼疮诊断而且对于监护狼疮患者的疾病活动性都是重要的。
基于细胞上抗T淋巴细胞抗体和CB-CAPs的沉积的两个重要特征，据信组合试验可以特别用于监护患有SLE的患者的疾病活动性。首先，由于本发明人已经证明抗T细胞抗体引起细胞表面上CB-CAPs的沉积，在细胞表面上不同时存在CB-CAPs的情况下，抗T细胞抗体的发现可以用于预测CB-CAPs随后将被沉积并且有助于增加的疾病活动性。相反，在不存在抗T细胞抗体的情况下，CB-CAPs的存在可以指出抗T细胞抗体先前沉积并且相应地提供对疾病活动性的洞察。据信，抗T细胞抗体和CB-CAPs的同时存在或同时缺席也可以反映当前的疾病活动性或预测未来的活动性。第二，本发明人先前已经证明CB-CAPs共价结合至细胞表面，并且一旦它们沉积，可能终细胞之一生保持永久结合。相反，抗T细胞抗体不是共价结合的，并且因此可以在结合后的任何时间从细胞释放。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但据信抗T细胞抗体相对于通过CB-CAPs的细胞的永久标记的这种“打了就跑(hit andrun)”特征可以提供关于何时发生细胞靶向的洞察并且对于监护和预测患者的疾病活动性是有用的。
本发明的一个实施方案公开了用于在个体中特异性诊断和/或监护系统性红斑狼疮(“SLE”)的方法，所述个体不同于可能患有不同炎性疾病或病况的并发症的个体(即，非SLE炎性疾病或病况)。这种方法学包括定量个体的自身抗体的水平，所述个体的自身抗体在从所述个体的血液样本获得的T淋巴细胞表面上沉积、与T淋巴细胞表面接触或以某种形式与T淋巴细胞表面稳定缔合；包含白血细胞的样本包括T淋巴细胞群。为此，关于从个体获得的用于分析的血液样本，本发明的另一个实施方案公开了方法学，其中T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的个体的自身抗体的水平由从个体的血液样本获得的外周血单核细胞群测量。
在回顾本说明书后将会理解，任何代表性的T淋巴细胞细胞类型均被涵盖在本公开的方法学的范围内，即从个体的血液样本获得的T淋巴细胞，其可以是所代表的的T淋巴细胞并且因此选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞、CD8+细胞毒性淋巴细胞以及其他CD4+淋巴细胞，包括但不限于CD4+Th9辅助细胞、CD4+Th17辅助细胞、CD4+T滤泡辅助(Tfh)细胞和CD4+调节性T(Treg)细胞，组成的组。
虽然这些实施方案涉及作为与非SLE炎性疾病或病况相反的SLE的特异性确定物的个体中存在的抗T细胞自身抗体的单一且集中的检测和定量，本发明进一步的实施方案包括定量的重点，附加定量存在于个体中的这些抗T细胞自身抗体，检测和定量SLE的诊断性生物标志物的水平，所述SLE的诊断性生物标志物也在从血液样本获得的T淋巴细胞(例如PBMCs)表面上沉积或与T淋巴细胞表面接触，其中该二级诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组。在实施方案中，优选的二级诊断性生物标志物是C4d。
另一个实施方案公开了用于在个体中特异性诊断和/或监护SLE的方法，所述个体不同于可能患有不同炎性疾病或病况(即，非SLE炎性疾病或病况)的并发症的个体，其中一个步骤包括定量个体的自身抗体的水平，所述个体的自身抗体在从所述个体的包含白血细胞群的血液样本，(包括但不限于从所述个体分离的PBMCs的制备物)，获得的T淋巴细胞表面上沉积、与T淋巴细胞表面接触或处于与T淋巴细胞表面稳定缔合的某种形式；并且与涉及获得相似“对照”样本(如本文中所定义的并且包含T淋巴细胞群，例如从对照血液样本获得的外周血单核细胞群制备的T淋巴细胞群)的附加的步骤相组合，并且将来自检验个体的水平与对照T淋巴细胞群表面上沉积的或与对照T淋巴细胞群表面接触的自身抗体的水平进行比较，其中来自所检验个体中的样本的升高的自身抗体的水平识别为该个体中的SLE。再一次地，应当理解，该特定实施方案意在作为代表性T淋巴细胞细胞类型，可以从个体的血液样本获得的任何这样的T淋巴细胞选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞、CD8+细胞毒性淋巴细胞以及其他CD4+淋巴细胞，包括但不限于CD4+Th9辅助细胞、CD4+Th17辅助细胞、CD4+T滤泡辅助(Tfh)细胞和CD4+调节性T(Treg)细胞，组成的组。
此外，本文考虑和公开，包含T淋巴细胞群的检验(即，个体的)样本和包含对照T淋巴细胞群的“对照”样本两者的测量，还可以包括，如上述公开的，附加的测量定量与SLE相关联的附加的或一组附加的诊断性生物标志物的水平，所述附加的或一组附加的诊断性生物标志物也已知在T淋巴细胞表面上沉积或与T淋巴细胞表面接触，其中这样的诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组。在实施方案中，优选的生物标志物是C4d。
本文所公开的另一个实施方案涵盖了在不同于非SLE炎性疾病或病况的个体中特异性地诊断或监护SLE的方法，该方法包括以下步骤：从所述个体获得包含白血细胞的血液样本，从血液样本分离外周血单核细胞群，用可检测试剂温育所述外周血单核细胞群，所述可检测试剂特异性地结合到已结合至在所述外周血单核细胞群中的T淋巴细胞的细胞表面的自身抗体，形成T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物，并且测量所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平。该方法学很适合通过本领域中与流式细胞术相关的任何已知方法学来测量、识别或定量例如T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物。如上文公开的关于相较于对照样本比较来自检验个体的任何这种复合物的水平，本实施方案还考虑将从个体获得的T细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平与从对照血液样本获得的类似的T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平进行比较。检验和对照样本之间的这种测量比较在诊断或连续监护特定个体内的SLE中将是附加地提供有用信息的。
本文还公开了可检测试剂可以是荧光标记的抗人Ig抗体，该荧光标记的抗人Ig抗体是由流式细胞术可检测的，特别地，如本说明书全文所公开的，可以包括，但不限于，荧光标记的抗人Ig抗体选自由荧光标记的抗人IgG抗体和荧光标记的抗人IgM抗体组成的组。
另一个实施方案提供用于个体中SLE的特异性的诊断或监护的药盒。药盒可以包括特异性地识别结合至T淋巴细胞(包括但不限于抗IgG或抗IgM单克隆抗体)的自身抗体的荧光标记的抗体，可选地包括与谱系特异性T淋巴细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，以区分CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞，可选地包括一种或更多种生化试剂；以及，可选地包括药盒和药盒组分在SLE的诊断或监护中的应用的说明书。如本文所公开的，任何这种药盒还适合于识别一种或附加的生物标志物(超出被发现结合T淋巴细胞的个体的自身抗体)，其可以包括但绝不限于包含在药盒内的与特异性的T淋巴细胞细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，该特异性的T淋巴细胞细胞表面标志物选自由CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、Crth2、CCR6、CXCR5和CD25组成的组。
用于通过至少T细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的测定，以及可能地补体途径组分的附加的测量(包括但不限于C4d和/或C3d)来特异性地诊断或监护不同于非SLE炎性疾病或病况的个体中的SLE的测定，并且结合上述诊断和疾病活动性监护方法可以手动进行，但经常使用自动化系统和/或设备方便地进行，其中血液样本(或例如，分离的PBMC级分)被自动分析以进行必要的测定或多种测定，并且使用适合于该目的的计算机软件自动进行与基础值或参考值的比较。
因此，本发明的一个实施方案包括用于在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的基于计算机的系统，所述系统包括处理器和包含编程指令的非瞬态计算机可读存储介质，该编程指令被配置以在被执行时指示处理器在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中定量在样本中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的个体的自身抗体的水平，并且然后将所述个体的水平与在对照T淋巴细胞表面上的沉积的或与对照T淋巴细胞表面接触的自身抗体的水平进行比较，其中来自所述个体的样本的自身抗体的增加的水平识别为所述个体中的SLE。为此，用于本发明的方法中的任何这样的计算机软件或计算机可读介质可以包含计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于接收对应于在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平的数据的代码，所述个体的自身抗体的水平被测量自从血液样本获得的外周血单核细胞群，其中样本中的T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，包括但不限于，代表性T淋巴细胞，该代表性T淋巴细胞选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞、CD8+细胞毒性淋巴细胞以及其他CD4+淋巴细胞，包括但不限于CD4+Th9辅助细胞、CD4+Th17辅助细胞、CD4+T滤泡辅助(Tfh)细胞和CD4+调节性T(Treg)细胞，组成的组。此外，用于本发明的方法中的任何这样的计算机软件或计算机可读介质可以包含计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于接收对应于与SLE相关联的附加的生物标志物的水平的数据的代码，该生物标志物也已知沉积在T淋巴细胞的表面上或与T淋巴细胞的表面接触，其中诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组，其中单一优选是C4d。另一方面涉及用于本发明的方法的这样的计算机软件或计算机可读介质包含计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于接收对应于个体使用任何附加的药盒组分的水平的数据的代码，如本文所述的，例如与特异性的T淋巴细胞细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，该特异性的T淋巴细胞细胞表面标志物选自由CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、Crth2、CCR6、CXCR5和CD25组成的组。
本发明人先前已证实补体激活产物，特别是C4d，以高水平特异性地结合患有SLE的患者中的循环细胞，从而产生对狼疮诊断高度敏感并且特异性的CB-CAP标识。大多数患有狼疮的患者庇护以个体患者独有的细胞特异性模式携带有C4d和/或C3d的红细胞、淋巴细胞、血小板和其他循环细胞。对产生这些CB-CAP标识负有责任的机理先前没有被识别。本发明人假设抗细胞特异性的自身抗体可能是CB-CAP沉积的原因并且特异性地关注于抗T细胞自身抗体的潜在作用。本文提供的证据支持抗T细胞自身抗体在通过亚溶量补体激活产生TCD3-C4d、TCD4-C4d和TCD8-C4d标识中的作用，并且表明这是先前未被识别的狼疮致病机理。
首先，先前已经证明，超过80％患有狼疮的患者携带CB-CAP标识，该CB-CAP标识是高度患者特异性的。对这些标识负有责任的机理以前没有被确定。自身抗体是在细胞表面上产生C4d沉积的特异性的模式的天然嫌疑，然而细胞表面上抗体介导的补体的激活通常被认为导致细胞的破坏，如在溶血性贫血和在使用例如利妥昔单抗(rituximab)的药物的单克隆抗体介导的B细胞耗竭治疗中所观察到的。本发明人在本文中证明了抗T细胞自身抗体存在于狼疮患者的循环T细胞上，并且T-Ig/T-C4d模式在个体患者中随时间是一致的。此外，从T细胞上携带Ig和C4d的狼疮患者纯化的IgM和IgG可以将T-C4d标识转移至健康T细胞。总而言之，这些观察结果支持T细胞表面上的经典补体途径的激活通常发生在患有SLE的患者中。T-C4d标识和淋巴细胞减少之间缺乏相关性，并且在这些T细胞上缺乏膜攻击复合物证明经典途径的激活不通过C5转化酶的显著产生而进行。
第二，在患有SLE的患者中的抗T细胞自身抗体首次被发现于40多年前，但尚未定义在疾病发病机理中的明确作用。一个挑战是调和冷反应性IgM在体内热条件下可能是如何致病的。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但从本文所述的研究表明，低浓度的IgM自身抗体能够在体内结合T细胞，导致C4d的沉积而不引起细胞裂解。
第三，本研究的结果可以解释在迄今为止的CB-CAPs的所有报道中描述的奇异的观察。携带异常水平的C4d的特异性的细胞类型在给定患者中几乎总是一致地阳性，如流式细胞术直方图所反映的。比如，如果患者的CB-CAP标识包括TCD3-C4d，则该患者中的所有CD3细胞将是C4d阳性，并且每个细胞上的C4d水平将是相似的。这与通过细胞上的循环免疫复合物沉积产生的模式形成对比，其可能仅结合携带Fc或补体激活产物的受体的细胞的子集。虽然不希望受任何操作理论的束缚，据信患有狼疮的患者中的循环抗T细胞自身抗体具有识别所有循环T淋巴细胞的能力，从而在每个细胞上产生C4d沉积。该模型解释了在T细胞和可能的其他细胞上观察到的均质CB-CAP模式。
第四，虽然不希望受任何操作理论的束缚，但本文所述的观察结果进一步支持假设：CB-CAP标识不是通过无辜旁观细胞上的系统补体激活和沉积而是通过细胞特异性靶向机理产生的。
虽然不希望受任何操作理论的束缚，但是在疾病发作期间Ig以可逆的方式与靶T细胞结合，催化T细胞上C4d的沉积，解释了T-Ig单阳性患者。一旦C4d产生并且共价结合至T细胞表面，即使当初始自身抗体已经从T细胞分离时，C4d也可以保持稳定。某些IgG亚类(例如，IgG2和IgG4)的抗T细胞自身抗体可能在引发补体系统的激活方面效率低，从而产生不含C4d的Ig结合的表型。存在附加的不依赖ALA的机理，由此CAPs产生并沉积在T细胞上是可能的。然而，鉴于患有SLE的患者的特征性自身抗体过度产生，据信ALA介导的机理可能在培养细胞和患者特异性T-C4d表型中起主导作用。
本发明人已经显示C4d在T细胞和T细胞子集上的沉积是由患有SLE的患者中的抗T细胞自身抗体引发的亚溶量补体激活产生的。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但此先前未认识到的途径可能是致病恶性循环，由此自身抗体以亚溶量能力激活经典补体途径。C4d的沉积助长这些靶细胞的功能障碍，该C4d的沉积保留在循环中并驱动进一步的免疫失调、自身抗体产生、补体激活和组织损伤。
以下实施例用于进一步说明本发明。
实施例
实施例1
材料和方法
研究参与者
SLE患者最初募集并遵循符合美国风湿病学会分类标准的明确的SLE的三百二十六名患者。
患有其他疾病的患者在与SLE患者组群相同的时间段期间募集了总共185名患有各种非SLE自身免疫疾病的患者，例如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、特发性炎性肌病、原发性抗磷脂综合征和未分化的结缔组织疾病。
健康对照通过当地广告募集总共48个健康个体。为了确认他们的健康状况，参与者完成了对既有的医疗状况的简短调查问卷。
血浆和血清制备、免疫球蛋白分离和免疫球蛋白清除
在每个参与者访视时，收集4.5-ml血液样本至含有EDTA作为抗凝剂(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)的中。在抽血后24小时内处理EDTA-抗凝血液样本。通过在800xg离心10分钟分级血浆，并在4℃(立即，短期使用)或-80℃(用于将来，长期使用)下储存。从收集至没有抗凝血剂的血清分离管中的健康对照的血液制备正常人血清，等分，并且在-80℃下储存直至使用。根据制造商的说明书使用Pierce (A/G)IgG纯化药盒(Thermo Scientific，Rockford，IL)分离血浆中存在的免疫球蛋白G(IgG)。在收集IgG后，使用Pierce NabTM Protein L Spin纯化药盒(Thermo Scientific)按照制造商的说明书进一步分级来自蛋白A/G亲和柱的流出液以富集IgM。将从各个亲和柱洗脱的IgG和IgM级分脱盐，缓冲液变成磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并使用离心过滤器(分子量截留30kD；EMD Millipore，Billerica，MA)通过离心进行浓缩。为了清除Ig，血浆样本顺序通过蛋白A/G柱和蛋白L柱两次。收集最终的流出液，用PBS透析，并使用装置浓缩回到原始体积。为了清除淋巴细胞反应性Ig，将血浆样本(50μl)与外周血淋巴细胞(107个细胞；从个体健康对照中分离)在4℃下温育30分钟，然后通过离心去除细胞来回收。
分离外周血单核细胞
在抽取血液后24小时内通过梯度离心从EDTA-抗凝血液样本中分离外周血单核细胞(PBMC)。简短地说，离心血液样本以分离血浆和细胞。将细胞级分用3体积的PBS稀释，在Ficoll-PaqueTM Plus溶液(GE Healthcare Bio-Sciences，Piscataway，NJ)上分层，并在室温下以400xg离心20分钟。将位于血浆和Ficoll溶液之间的界面处的单核细胞小心地转移到新管中，用PBS充分洗涤以除去污染的血小板，并重悬于PBS中。
用于T细胞结合的C4d(T-C4d)和T细胞结合的免疫球蛋白(T-Ig)测量的流式细胞术试验
将从EDTA-抗凝血液制备的PBMC分成等体积的等分样品，用于CB-CAP检测。使用最近开发的多色流式细胞术试验测量结合至T细胞的C4d和Ig的水平，所述的多色流式细胞术试验有一些修改。基于特征表面分子的表达及其正向(大小)/侧向(粒度)散射的独特特征来区分淋巴细胞、单核细胞和残余粒细胞。与谱系特异性细胞表面标志物(T细胞的CD3、CD4和CD8；BD Biosciences，San Diego，CA)反应的藻红蛋白(PE)-、PE-Cy5-或别藻蓝蛋白(APC)-共轭的小鼠单克隆抗体(mAb)与使用Zenon抗体标记药盒(Life Technologies，Carisbad，CA)用Alexa Fluor染料标记的小鼠单克隆抗人C4d mAb(小鼠IgG1；与C4的包含C4d的片段反应；Quidel，San Diego，CA)、抗人IgG(小鼠IgG1；BD Biosciences)或抗人IgM(小鼠IgG1；BD Biosciences)中的任何一个结合使用。二者择一地，将PE共轭的抗人Igκ链或PE共轭的抗人Igλ链(BD Biosciences)与抗C4d和抗细胞表面标志物抗体组合使用，以识别T细胞结合的Ig的轻链亚类。染色之后，使用FACSCaliburTM流式细胞仪和CELLQuest软件(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)对细胞进行分析。为了确保所检测到的抗体染色的特异性，照例在所有实验中包括用合适同种型的小鼠IgG染色的每一个患者的白细胞等分样品。为了确保LB-CAP测量的逐日可靠性，使用CaliBrite 3珠和FACSComp软件(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)每天校准FACSCalibur流式细胞仪。细胞结合的C4d和Ig的水平表示为特定中位数荧光强度(SMFI)，其按照C4d(或Ig)-特定中位数荧光强度减去同种型对照中位数荧光强度计算。
体外表型转移实验
从个体健康对照或具有低T-C4d水平的SLE患者分离的PBMC(50μl PBS中的106个细胞)与50μl从个体SLE患者制备的血浆温育，所述个体SLE患者已被识别为具有基于上述流式细胞分析的高的T-C4d/T-Ig表型。在一些实验中，用不同量的纯化的IgG或IgM(100-1000μg)、Ig清除的血浆或淋巴细胞预吸收的血浆替换SLE血浆。在4℃温育30分钟后，用PBS洗涤PBMC悬浮液两次，重悬于50μl GVB2+缓冲液(1％明胶、5mM Na佛罗拿、142mM NaCl，pH7.3)中，并与50μl正常人血清(作为补体的来源)温育。在一些情况下，热灭活的正常人血清或C1q清除的人血清(Quidel)用作阴性对照血清。在37℃温育40分钟后，用PBS洗涤细胞悬浮液两次，并进行上述的多色流式细胞术试验。
实施例2
TCD3-C4d、TCD4-C4d和TCD8-C4d患者特异性标识在SLE中产生
进行横断式研究以识别T细胞上的C4d水平在CD4和CD8子集之间相似或不同的患者。在一些患者中，CD3+T(TCD3)细胞的C4d染色直方图反映单个细胞群，并且CD4+T(TCD4)细胞和CD8+T(TCD8)细胞的C4d染色直方图不可区分，反映出结合至两个细胞子集中的每一个的C4d的相等水平(图1，组A和B)。然而，在许多SLE患者中观察到双相TCD3-C4d直方图(图1，组C-F)。TCD4-C4d和TCD8-C4d试验证明这些双相直方图是由于个体患者中这两个细胞子集中C4d水平的差异。在一些患者中，与TCD8细胞相比，在TCD4细胞上检测到相当多的升高的C4d的水平(图1，组C和D)。相反，与其他患者中的TCD4细胞相比，在TCD8细胞上可以存在显著更高水平的C4d(图1，组E和F)。通常，给定患者的TCD4-C4d/TCD8-C4d特异性优先结合分析谱或标识似乎随时间保持稳定，尽管细胞上存在的C4d的实际水平可能随时间波动(表1)。这种模式有例外。在某些患者的疾病过程中(例如，患者SLE56525和SLE102357，表1)确实发生了结合模式的“转化”。如先前报道的，在T细胞上未检测到补体C5b-9(膜攻击复合物)。虽然不希望受任何操作理论的束缚，但是可以识别出的T细胞子集可以优先被C4d沉积和患者特异性T-C4d标识靶向的观察结果表明，特异性机理可能对产生这些表型负有责任。T-C4d标识与淋巴细胞减少无关联(未示出)。
表1
C4d与SLE患者的T细胞子集随时间的差异性结合
实施例3
免疫球蛋白和C4d同时存在于SLE的T细胞上
对T-C4d标识负有责任的机理应解释为在一些患者中TCD4对TCD8细胞上C4d的差异沉积，并且最可能的解释是通过针对TCD4对TCD8细胞特异性的自身抗体。这种机理是通过流式细胞分析来检查并且关联患有SLE的患者中T细胞表面上的C4d(T-C4d)和免疫球蛋白(T-Ig)的存在来研究的。结果证明，在研究访视时，来自SLE患者组群的显著份额(～30％)的T细胞确实同时用C4d和Ig两者进行了修饰(图2A)。注意到每个个体患者中T-C4d/T-Ig表型和水平的相当大的变化。在一些但不是所有患者中，注意到T-C4d和T-Ig水平之间的良好相关性。每个直方图内的插图显示了相应的相关性分析。蓝色柱：T-C4d；紫色柱：T-Ig。其余的SLE患者对于C4d或Ig是单一阳性的，或者他们是双阴性。相比之下，患有其他疾病的患者和健康对照的T细胞对于表面结合的Ig和C4d两者都是阴性的(图2B；仅显示T-Ig的数据)。在185名患有其他自身免疫性疾病的患者中，只有两名均具有斯耶格伦综合征的患者T细胞表面上存在显著升高的Ig水平。这两个患者中的一个还具有显着升高的T-C4d水平。
在任何给定时间，可在不同的SLE患者中检测到携带C4d和Ig两者(图2C，组a)、仅C4d(图2C，组c)或仅Ig(图2C，组e)的T细胞。注意到，在不同患者中T细胞上和在相同患者中的T细胞子集上的C4d和Ig伴随或单独存在。在一些情况下，在同一患者中可同时检测到携带不同Ig和C4d水平的不同亚群的T细胞(图2C，组b和d)。后一发现表明这些亚群可以代表动态Ig/C4d结合过程中从一个阶段到下一个阶段的转变中的细胞。
跟随一组选择的SLE患者，并且在9至33个月的时间范围内定期检查他们的T细胞上C4d和Ig的存在。如图3A所示，在个体患者中，T-C4d和T-Ig的水平两者以及携带C4d和/或Ig的T细胞的频率和比例随时间相当大的变化。在一些患者中，在贯穿所有研究访视中(例如，患者#SLE 102763，R2＝0.7063；患者#SLE 101592，R2＝0.9551)，T-C4d和T-Ig水平是强相关的。然而，在一些患者中，T-C4d和T-Ig水平之间的一般相关性局限于研究访视的子集(例如，患者#SEL102326的访视1、3和5)。这些结果进一步表明动态Ig/C4d结合过程可在个体患者中变化。
此外，注意到，T细胞的特异性的子集上表面结合的Ig的存在与该特定T细胞亚群上C4d的增加的水平相关。比如，TCD4细胞上的选择性较高的T-C4d水平与给定患者中TCD4细胞上选择性增加的T-Ig水平相对应(图3B，组a和b)，反之亦然(图3B，组c和d)。注意到，当在一些患者中检测到TCD4细胞上相较于在TCD8细胞上较高的Ig水平时(组a)，还检测到在TCD4细胞上相较于在TCD8细胞上更高水平的C4d(组b)。对于TCD8细胞，观察到C4d(组c)和Ig水平(组d)的增加水平之间的相似相关性。这些观察结果表明在SLE患者中T细胞上的Ig的结合和C4d沉积之间的因果关联，最有可能通过经典补体途径的激活。
实施例4
T-C4d表型可以通过血浆从SLE患者转移
因为在一些SLE患者的循环T细胞的表面上同时检测到Ig和C4d，所以假设了一种模型，其中特异性的抗T自身抗体的结合可激活补体系统并产生沉积在这些细胞表面上的C4d。因此，研究了SLE患者的血浆是否可以在体外结合并将T-C4d表型“转移”到正常T细胞。来自SLE患者、患有其他疾病的患者和健康对照的研究组群的不同血浆样本针对从健康个体或具有可忽略的T-C4d水平的SLE患者分离的T细胞进行检验。通过流式细胞术分析经处理的细胞群中的T细胞。如图4中代表性所示，在用由已知具有升高的T-C4d和T-Ig水平的供体SLE患者制备的血浆处理后，T-C4d阴性的正常T细胞(组A)在其表面上获得了C4d的显著水平(组B1和C1)。在健康受体细胞上产生的T-C4d的模式与每个实验中存在于狼疮供体细胞上的模式非常相似。相比之下，健康对照的血浆不能在正常T细胞上产生C4d沉积(组D1)。注意用T-C4d+SLE血浆和Ig，而不是健康对照血浆和Ig处理后，在细胞表面上沉积的高水平的C4d。结果一致地显示，仅显示升高的T-Ig/T-C4d表型的SLE患者供体的血浆，而不是显示低T-Ig/T-C4d表型的SLE患者的血浆或健康对照的血浆，可以将T-C4d表型转移至正常T细胞上。用来自狼疮患者的血浆转移TC4d表型不会导致C5b-9的产生或细胞数目的显著减少(数据未显示)。
实施例5
T-C4d表型可以通过SLE患者的免疫球蛋白转移
使用从SLE患者的血浆中纯化的Ig进行表型转移实验。结果证明，从具有高T-C4d水平的SLE患者的血浆中纯化的Ig能够在体外将T-C4d表型转移至正常T细胞(图4，组B2和C2；参见图4A)。从健康对照(图4，组D2)或从具有可忽略的T-C4d水平的SLE患者(未显示)纯化的Ig不能转移T-C4d标识。与IgG相比，等浓度的IgM在产生T-C4d标识中更有效，这支持了经典补体途径激活的机理性的作用(图5A)，其中与IgG相比，IgM是经典补体途径的更强有力的激活剂，因此在结合后在细胞表面上产生T-C4d更有效。来自供体SLE血浆的Ig的清除完全消除了其在体外诱导补体激活和C4d与T细胞结合的能力(图5B)。此外，如果通过血浆与淋巴细胞的预温育去除潜在的淋巴细胞反应性体液因子，则SLE血浆的这种能力显著降低(图5B)。用人血小板或成纤维细胞进行吸收没有效果(未显示)。这些结果支持了患有SLE的患者中的T-C4d标识由抗T细胞和-T细胞子集自身抗体产生的假设。
实施例6
SLE、其他疾病(OD)和健康对照(HC)的比较
使用如下所述的患者数据进行附加的分析(表2)。连续数据被报道为平均值±标准偏差(SD)和中位数和四分位数范围(IQR)，按SLE、OD和HC分层。方差分析(ANOVA)用于检验三组之间的总体差异。事后检验用于提供成对比较的信息。通过使用OD和HC患者，分别在SLE受试者中测定CB-CAP生物标志物的灵敏度和特异性。接受者操作曲线(ROC)被适当地用于每个标志物以及子集。
表2
SLE、其他疾病(OD)和健康对照(HC)的CB-CAP组比较
表3
T-Ig和CB-CAP试验的ANOVA和事后分析
表4显示了根据T-Ig阳性和每个个体CB-CAP生物标志物阳性的SLE的敏感性和针对其他疾病(OD)或健康对照(HC)的特异性(阳性定义为如上HC中的最大值，因此针对HC的特异性为100％)。
表4
T-Ig和个体CB-CAP试验的诊断性能
SLE的敏感性 针对OD的特异性 针对HC的特异性
T-Ig 33.2％(108/325) 98.4％(182/185) 100％(48/48)
TC4d 48％(156/325) 91.9％(170/185) 100％(48/48)
ECR1(n＝508) 13.5％(40/296) 91.0％(152/167) 100％(45/45))
EC4d(n＝509) 22.3％(66/296) 94.6％(159/159) 100％(45/45)
PC4d(n＝505) 12.6％(37/294) 97.6％(162/166) 100％(45/45)
RC4d(n＝492) 29.6％(84/284) 90.2％(147/163) 100％(45/45)
BC4d(n＝536) 44.8％(141/315) 91.4％(160/175) 100％(46/46)
MC4d(n＝544) 12.7％(41/322) 97.2％(171/176) 100％(46/46)
GC4d(n＝544) 20.2％(65/322) 93.4％(165/176) 100％(46/46)
为了找到增加敏感性但保持最高特异性的生物标志物或其组合，首先用每个单独的CB-CAP生物标志物确定T-Ig阴性受试者的敏感性/特异性。发现TC4d是最好的，将SLE的整体敏感性从33.2％(表4)增加到55.1％(表5)。
表5
通过添加CB-CAP试验改善T-Ig阴性受试者中的诊断性性能和整体性能
随后，识别出具有阴性T-Ig和TC4d两者的个体中的次最佳生物标志物。如表6所示，发现组合T-Ig和TC4d将使整体灵敏度从33.2％提高到55.1％，同时保持针对其他疾病和健康对照的近乎完美的特异性，分别为90.8％和100％。将B-C4d加入TC4d可进一步将SLE的敏感性提高至61.1％，然而针对OD的整体特异性降低至86.4％。
表6
通过逐步添加多个CB-CAP试验来改善诊断性性能
+表示从列的顶部到底部顺序添加。比如，+TC4d表示T-Ig和TC4d的组合。
使用接受者操作特征(ROC)曲线绘制数据，因为接受者操作特征曲线的鉴别阈值是变化的，故所绘制的数据是说明二元分类器系统的性能的图形曲线。这些分析证明了T-Ig结合CB-CAP试验作为诊断工具的附加价值。
图6A显示了在区分SLE和健康对照中，用所有生物标志物的ROC比较。比较SLE和健康对照的ROC分析揭示，BC4d(AUC＝0.853)和TC4d(AUC＝0.840)是最佳预测因子，随后是RC4d(AUC＝0.80)和EC4d(AUC＝0.80)。这与上述表6中所示的结果一致。
图6B显示了在区分SLE和健康对照中，用CB-CAP生物标志物的子集(TC4d、EC4d、RC4d和BC4d)的ROC比较。
图7A显示了在区分SLE和其他疾病中的ROC比较。
比较SLE和其他疾病的ROC分析揭示，BC4d(AUC＝0.755)和TC4d(AUC＝0.750)是最佳预测因子。与仅T-Ig(0.76)相比，整体ROC从0.76增加到0.80，并且该差异接近统计学显著性(p＝0.07)。
图7B显示了在区分SLE和其他疾病中，用CB-CAP生物标志物子集(TC4d、EC4d、RC4d和BC4d)的ROC比较。
上述的特征和功能，以及替代方案，可以组合成许多种其他不同的系统或应用。本领域技术人员可以进行目前无法预见的或不可预期的替代方案、修改、变化或改进，其中每一个都要被包括在所公开的实施方案中。
在本发明的特征或方面以马库什组或其他替代方案组为措辞描述时，本领域技术人员将认识到，由此本发明也以马库什组或其他组的任何单独的成员或亚组的成员的措辞来描述。
除非相反指出，本文所述的所有数值范围包括其中包含的范围和特定整数的所有组合和子组合。这样的范围也在所述发明的范围内。
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括：
在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中定量在所述样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平；以及
在来自所述个体的血液样本中，测定一种或更多种选自由TC4d、ECR1、EC4d、PC4d、RC4d、BC4d、MC4d和GC4d组成的组的生物标志物的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
4.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括：
(a)在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中，定量在所述样本中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平；
(b)将(a)中的所述水平与在对照T淋巴细胞表面上的沉积的或与对照T淋巴细胞表面接触的自身抗体的水平进行比较；以及
(c)在来自所述个体的血液样本中，测定一种或更多种选自由TC4d、ECR1、EC4d、PC4d、RC4d、BC4d、MC4d和GC4d组成的组的生物标志物的水平,
其中(a)中来自所述样本的升高的自身抗体的水平和一种或更多种生物标志物的异常的水平识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th1淋巴细胞。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th2淋巴细胞。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD8+细胞毒性淋巴细胞。
10.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括：
(a)获得所述个体的包含白血细胞血液样本；
(b)从所述血液样本分离外周血单核细胞群；
(c)用可检测试剂温育所述外周血单核细胞群，所述可检测试剂特异性地结合到已结合至在所述外周血单核细胞群中的T淋巴细胞的细胞表面的自身抗体，形成T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物；
(d)测量所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平；以及
(e)在来自所述个体的血液样本中，测定一种或更多种选自由TC4d、ECR1、EC4d、PC4d、RC4d、BC4d、MC4d和GC4d组成的组的生物标志物的水平。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物由流式细胞术测量。
12.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括将从所述个体获得的所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的所述水平与从对照血液样本获得的相似的T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平进行比较，其中相较于对照血液样本，从所述个体的血液样本的T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的所述水平的升高，以及一种或更多种生物标志物相较于健康对照的异常的水平，识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述可检测试剂是荧光标记的抗人Ig抗体，所述荧光标记的抗人Ig抗体是由流式细胞术可检测的。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述荧光标记的抗人Ig抗体选自由荧光标记的抗人IgG抗体和荧光标记的抗人IgM抗体组成的组。
15.一种药盒，所述药盒包括：
(a)特异性地识别结合至T淋巴细胞的自身抗体的荧光标记的抗体，其中所述抗体是抗IgG或抗IgM单克隆抗体；
(b)可选地，与谱系特异性T淋巴细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，以区分CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞；
(c)适用于一种或更多种生物标志物的定量中使用的一种或更多种生化试剂，所述生物标志物选自由TC4d、ECR1、EC4d、PC4d、RC4d、BC4d、MC4d和GC4d组成的组；以及，
(d)可选地，所述药盒和所述组分(a)、(b)和(c)在系统性红斑狼疮的诊断中的应用的说明书。
16.如权利要求15所述的药盒，其中所述氟共轭单克隆抗体对特异性的T淋巴细胞表面标志物是反应性的，所述特异性的T淋巴细胞表面标志物选自由CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、Crth2、CCR6、CXCR5和CD25组成的组。
17.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的系统，所述系统包括：
处理器；以及
包含被配置以在被执行时指示所述处理器进行下述步骤的编程指令的非瞬态计算机可读存储介质：
(a)在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中，定量在所述样本中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平；
(b)将(a)中的所述水平与在对照T淋巴细胞表面上的沉积的或与对照T淋巴细胞表面接触的自身抗体的水平进行比较；以及
(c)在来自所述个体的血液样本中，测定一种或更多种选自由TC4d、ECR1、EC4d、PC4d、RC4d、BC4d、MC4d和GC4d组成的组的生物标志物的水平，
其中(a)中来自所述样本的升高的自身抗体的水平和一种或更多种生物标志物的异常的水平识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
18.如权利要求17所述的系统，其中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的所述水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
19.如权利要求18所述的系统，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
20.如权利要求18所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th1淋巴细胞。
21.如权利要求18所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th2淋巴细胞。
22.如权利要求18所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD8+细胞毒性淋巴细胞。

Claims (27)

1.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中定量在所述样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括附加地定量在所述样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的系统性红斑狼疮的诊断性生物标志物的水平，其中所述诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述诊断性生物标志物是C4d。
6.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括：
(a)在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中，定量在所述样本中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平，以及，
(b)将(a)中的所述水平与在对照T淋巴细胞表面上的沉积的或与对照T淋巴细胞表面接触的自身抗体的水平进行比较，其中(a)中所述样本的升高的自身抗体的水平识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th1淋巴细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th2淋巴细胞。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述T淋巴细胞是CD8+细胞毒性淋巴细胞。
12.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括附加地定量在所述样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的系统性红斑狼疮的诊断性生物标志物的水平，其中所述诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述诊断性生物标志物是C4d。
14.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的方法，所述方法包括：
(a)获得所述个体的包含白血细胞血液样本；
(b)从所述血液样本分离外周血单核细胞群；
(c)用可检测试剂温育所述外周血单核细胞群，所述可检测试剂特异性地结合到已结合至在所述外周血单核细胞群中的T淋巴细胞的细胞表面的自身抗体，形成T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物；
(d)测量所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物由流式细胞术测量。
16.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括将从所述个体获得的所述T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的所述水平与从对照血液样本获得的相似的T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的水平进行比较，其中相较于对照血液样本，从所述个体的血液样本的T淋巴细胞-自身抗体-可检测试剂复合物的所述水平的升高，识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述可检测试剂是荧光标记的抗人Ig抗体，所述荧光标记的抗人Ig抗体是由流式细胞术可检测的。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述荧光标记的抗人Ig抗体选自由荧光标记的抗人IgG抗体和荧光标记的抗人IgM抗体组成的组。
19.一种药盒，所述药盒包括：
(a)特异性地识别结合至T淋巴细胞的自身抗体的荧光标记的抗体，其中所述抗体是抗IgG或抗IgM单克隆抗体；
(b)可选地，与谱系特异性T淋巴细胞表面标志物反应的氟共轭单克隆抗体，以区分CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞；
(c)可选地，一种或更多种生化试剂；以及，
(d)可选地，所述药盒和所述组分(a)、(b)和(c)在系统性红斑狼疮的诊断中的应用的说明书。
20.如权利要求19所述的药盒，其中所述氟共轭单克隆抗体对特异性的T淋巴细胞表面标志物是反应性的，所述特异性的T淋巴细胞表面标志物选自由CD3、CD4、CD8、CXCR3、CCR4、Crth2、CCR6、CXCR5和CD25组成的组。
21.一种在与非系统性红斑狼疮炎性疾病或病况不同的个体中特异性地诊断或监护系统性红斑狼疮的系统，所述系统包括：
处理器；以及
包含被配置以在被执行时指示所述处理器进行下述步骤的编程指令的非瞬态计算机可读存储介质：
(a)在来自所述个体的包含白血细胞的血液样本中，定量在所述样本中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的水平，以及，
(b)将(a)中的所述水平与在对照T淋巴细胞表面上的沉积的或与对照T淋巴细胞表面接触的自身抗体的水平进行比较，其中来自(a)中所述样本的升高的自身抗体的水平识别为在所述个体中的系统性红斑狼疮。
22.如权利要求21所述的系统，其中在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的所述个体的自身抗体的所述水平被测量自从所述血液样本获得的外周血单核细胞群。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述样本中的所述T淋巴细胞由至少一种T淋巴细胞细胞类型代表，所述T淋巴细胞细胞类型选自由CD4+Th1淋巴细胞、CD4+Th2淋巴细胞和CD8+细胞毒性淋巴细胞组成的组。
24.如权利要求22所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th1淋巴细胞。
25.如权利要求22所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD4+Th2淋巴细胞。
26.如权利要求22所述的系统，其中所述T淋巴细胞是CD8+细胞毒性淋巴细胞。
27.如权利要求21所述的系统，其中所述指令还包括被配置以当执行时指示所述处理器附加地定量在所述样本中的在T淋巴细胞表面上沉积的或与T淋巴细胞表面接触的系统性红斑狼疮的诊断性生物标志物的水平，其中所述诊断性生物标志物选自由C4d、C3d、补体途径的C4组分和补体途径的C3组分组成的组。
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