BR112017002575B1 - Método para diagnosticar especificamente lúpus sistêmico eritematoso em um indivíduo - Google Patents

Método para diagnosticar especificamente lúpus sistêmico eritematoso em um indivíduo Download PDF

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Abstract

método para diagnosticar ou monitorar especificamente lupus sistêmico eritematoso em um indivíduo, kit e sistema para diagnosticar ou monitorar especificamente lupus sistêmico eritematoso em um indivíduo. são providos métodos, sistemas e kits para diagnóstico ou monitoramento de lupus sistêmico eritematoso em um indivíduo. em um aspecto particular, em uma amostra de sangue contendo células brancas do sangue obtidas do indivíduo, auto-anticorpos depositados sobre ou contatando com a superfície de um linfócito t na amostra são quantificados.

Description

Antecedentes da invenção
[0001] O lúpus sistêmico eritematoso (SLE), a doença autoimune sistêmica prototípica, é caracterizada por anomalias imunes miríades incluindo produção excessiva de auto-anticorpos, ativação do sistema complemento, disfunção dos linfócitos, e linfopenia. Durante a ativação do sistema complemento, a clivagem proteolítica de C3 e C4 resulta por fim na geração de fragmentos C3d e C4d que contém a porção altamente reativa de tioéster e pode se ligar covalentemente às superfícies de patógenos, células, ou complexos imunes. Os presentes inventores reportaram recentemente que níveis significativos de C4d estão presentes especificamente sobre a superfície de eritrócitos, reticulócitos, plaquetas, e linfócitos de pacientes com SLE. Um estudo multi-centro recente validou os produtos e a ativação do complemento ligado às células (CB-CAPs) como biomarcadores de diagnóstico para lúpus e relataram, adicionalmente ter demonstrado seu potencial significante como biomarcadores para a atividade da doença de lúpus e estratificação.
[0002] Em adição a suas regras como biomarcadores de lúpus, os CB-CAPs tem demonstrado conferir anormalidade funcional ás células circulantes, tais como eritrócitos e linfócitos T, sugerindo uma regra na patogênese do lúpus. A elucidação dos eventos celulares e moleculares, onde os CB-CAPs gerados podem conduzir á identificação de alvos terapêuticos potenciais tanto para a prevenção, interrupção, quanto para neutralização dos efeitos derivados da produção de CB-CAP. Um dos muitos links potenciais intrigantes entre CB-CAPs e a patogênese do lúpus é a observação do entendimento ainda muito pobre da duração de que os pacientes com SLE abrigam anticorpos anti-linfócitos circulantes.
[0003] Os anticorpos anti-linfócitos (ALA) em pacientes com SLE, particularmente aqueles específicos para células T, foram descobertos em 1970. Desde então, os numerosos esforços tem sido feitos para caracterizar estes ALAs. Entretanto, sua regra na patogênese da doença ter permanecido indeterminada. Dois tipos primários de anticorpos de célula anti-T em SLE foram descritos anteriormente. Primeiro, os anticorpos IgM reativos a frio, que se ligam otimamente às células T a 4°C, foram reportados como comuns em pacientes com SLE. Entretanto, a significância in vivo destes anticorpos não é clara, pois a diferença térmica entre os mecanismos celulares e moleculares patogênicos nos ensaios IN VITRO e em IN VIVO. Segundo, os anticorpos de células anti-T IgG reativos ao calor em lúpus foram relatados. Estes anticorpos demonstraram ter especificidade heterogênea contra uma variedade de moléculas de superfície da célula T incluindo CD3, CD4, CD45, e IL-2R.
[0004] Duas regras distintas para estes anticorpos IgM versus anticorpos de célula anti-T IgG na patogênese do lúpus tem sido sugeridas, ambas envolvem a destruição dos alvos celulares. A IgM é 500 vezes mais efetiva na ativação da rota do complemento clássico, sugerindo possível ataque lítico das células T. Entretanto, se a ligação destas moléculas IgM reativas ao frio ocorrer apenas em baixas temperaturas, isto eliminaria esta possibilidade IN VIVO. Em adição, a presença dos anticorpos de célula anti-C IgM não tem demonstrado correção com a linfopenia em SLE. A IgG são ativadores do complemento menos potentes, entretanto, sua reatividade no calor torna tal mecanismo IN VIVO menos viável. Outra regra potencial para a IgG de célula anti-T têm sido sugerida incluindo a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC0 e modulação das sinalização da célula T e da expressão do gene.
[0005] Alguns relatos têm sugerido que a disfunção do linfócito T no lupus pode ser acionada pela circulação dos auto-anticorpos de célula anti-T IgM e IgG ao invés de devido aos defeitos intrínsecos apesar das duas possibilidades não serem mutualmente exclusivas. Coletivamente, estes relatos anteriores têm sugerido que as células dos anticorpos anti-T estão presentes em alguns pacientes com SLE e elucidam que sua regra potencial na patogênese da doença deveria considerar o isotipo, a amplitude térmica de ligação e a citotoxicidade, e a especificidade antigênica.
Sumário da invenção
[0006] Em determinados aspectos, os métodos e sistemas são providos para diagnosticar ou monitorar, especificamente, o lúpus sistêmico eritematoso em um indivíduo, distinto da doença ou condição inflamatório de lúpus não-sistêmico eritematoso, os quais compreendem a quantificação, em uma amostra de sangue contendo células brancas do sangue de um indivíduo, do nível de auto-anticorpos do indivíduo depositados sobre ou contatando com a superfície de um linfócito T na amostra.
[0007] Em determinados aspectos, kits são providos compreendendo (a) um anticorpo marcado fluorescentemente especificamente para reconhecer um auto-anticorpo que se liga a um linfócito T, sendo que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal anti-IgG ou anti-IgM; (b) opcionalmente, anticorpos monoclonais flúor-conjugados reativos com os marcadores superficiais da linhagem da célula de linfócito T especifica para distinguir entre CD3+CD4+ e CD3+CD8+lingócitos T; (c) opcionalmente um ou mais reagentes bioquímicos; e (d) opcionalmente, instruções para uso do kit e os componentes de (a), (b), e (c) no diagnóstico do lúpus sistêmico eritematoso.
Breve descrição dos desenhos
[0008] As figuras 1A-1F ilustram que C4d pode se ligar diferentemente com as células T CD4 versus CD8 em pacientes SLE. Os níveis de C4d ligados às células T carregando CD3, CD4 ou CD8 foram medidos simultaneamente usando uma amostra de sangue única obtida no dia da visita de estudo. Os histogramas de citometria de fluxo de 6 pacientes SLE representativos estão mostrando a ilustração da presença de níveis similar (painéis A e B) ou distintos (painéis C-F) de C4d sobre células T CD4 e CD8 no mesmo paciente em um determinado período. Os histogramas fechados representam a coloração do controle isotipo Ig, os histogramas abertos representam a coloração do C4d-específico.
[0009] As figuras 2A-2C ilustram que C4d e Ig estão simultaneamente presente sobre a superfície das células T nos pacientes SLE, mas não em pacientes com outras doenças ou controles saudáveis. (A) células T CD3 do sangue periférico, preparadas a partir de pacientes SLE 326 foram caracterizadas por citometria de fluxo quanto a Ig ligada à superfície (TIg) e C4d (T-C4d). Os 4 grupos distintos de pacientes SLE indicaram, C4d-/Ig- (símbolos diamantes azuis), C4d+/Ig+ (símbolos quadrados vermelhos), C4d+/Ig- (símbolos triângulos verde), e C4d-/Ig+ (símbolos do círculo verde-água). (B) níveis T-Ig sobre células T CD3 a partir de pacientes SLE (n = 326), pacientes com outras doenças (n = 185), e controles saudáveis (n = 48) foram medidos através de citometria de fluxo. A linha horizontal vermelha indica o corte empiricamente determinado para positividade de T-Ig. (C) níveis de C4d e Ig ligado sobre as células T foram medidas através de citometria de fluxo usando uma amostra de sangue única obtida sobre o dia da visita de estudo. Os resultados representativos estão mostrados para os 10 pacientes SLE;
[0010] As figuras 3A-3B ilustram que os níveis T-C4d e T-Ig flutuam em função do tempo, mas geralmente correlaciona com níveis de subconjuntos específicos de célula T em pacientes SLE. (A) níveis de C4d (colunas claras) e Ig (colunas escuras) ligadas sobre as células T medidas por citometria de fluxo usando uma amostra de sangue única obtida em diferentes visitas de estudo. (B) C4d e Ig presentes sobre a superfície CD4 (colunas claras) e CD8 (colunas escuras) das células T de pacientes foram medidos usando a análise citométrica de fluxo muti-colorido;
[0011] As figuras 4A-4D ilustram que o plasma e as imunoglobulinas transferem a assinatura TC4d do doador para as células T normais. O PBMC preparado a partir do controle saudável não foi tratado (painel A; fenótipo linha de base), ou incubada com o plasma (painéis B1 e C1) ou Ig purificados (painéis B2 e C2) de dois pacientes SLE T-C4d+. Como um controle negativo, as células foram incubadas com o plasma (painel D1) ou Ig purificada (painel d2) de um controle saudável;
[0012] As figuras 5A - 5B ilustram que os auto-anticorpos de célula anti-T a partir de pacientes SLE podem gerar assinaturas T-C4d de doadores sobre as células T normais. (A) IgG e IgM foram purificados a partir do plasma de pacientes SLE (SLE 102086, SLE101606, e SLE102763, com altos níveis de T-C4d), um paciente SLE (SLE102771, com baixo nível de T-C4d) e controles saudáveis (HC2009 e HC2024). A Ig purificada foi utilizada na transferência IN VITRO. (B) o plasma dos pacientes SLE102086, SLE101919, e SLE128305 foram reduzidos e IgG e IgM, ou pré-absorvidos usando um grande número de leucócitos preparados a partir de um controle saudável para reduzir a Ig linfócito reativa. A Ig reduzida ou plasma pré- absorvido de leucócito foram então utilizados no experimento de transferência de fenótipo IN VITRO;
[0013] As figuras 6A - 6B mostram as comparações ROC na discriminação SLE e controle saudável. A figura 6 A mostra a comparação ROC com todas as medidas dos biomarcadores. A figura 6B mostra a comparação ROC na discriminação SLE e controles saudáveis com um subconjunto de biomarcadores CB- CAP (TC9d, EC4d, RC4d e BC4d); e
[0014] As figuras 7A - 7B mostram a comparação ROC na discriminação SLE e outras doenças. A figura 7A mostra a comparação ROC com todos os biomarcadores medidos. A figura 7B mostra a comparação ROC na discriminação SLE e outras doenças, com um subconjunto de biomarcadores CB-CAP (TC4d, EC4d, RC4d e BC4d).
Descrição detalhada da invenção
[0015] A descrição a seguir dos pedidos de patente foram incorporadas aqui por referência; (1) Pedido de Patente Internacional No. PCT/US13/73983, depositado em 10 dezembro 2013, intitulado “Methods and Systems for Using Complement - Tagged Molecules as Biomarkers of Disease”, e (2) Pedido de Patnete Internacional No. PCT/US14/015032; depositado em 06 fevereiro 2014, intitulado “Cell-Bound Complement Activation Products as Diagnostic Biomarkers for Pre-Lúpus”.
[0016] Como utilizado aqui, uma “condição ou doença inflamatória” refere-se a qualquer doença ou condição auto- imune que causa inflamação aumentada em um indivíduo. Uma doença ou condição inflamatória também se refere a qualquer doença infecciosa ou condição que induz inflamação aumentada em um individual. Em algumas concretizações, a doença ou condição inflamatória é uma “condição ou doença inflamatória crônica”. Uma doença ou condição inflamatória crônica é uma condição inflamatória que não resolve após o período de semanas, meses, ou mais tempo. As condições inflamatórias crônicas podem seguir uma condição inflamatória aguda, ou algumas doenças ou condições podem ocorrer na ausência de uma doença ou condição inflamatória aguda. Uma doença ou condição inflamatória inclui as a seguir: SELE, artrite reumatoide, vasculite (e sua forma específica, tal como granulomatose de Wegener), escleroderma, miosite inflamatória idiopática, síndrome de Sjogren, doença do soro, rejeição de transplante, anemia falciforme, gota, complicações da gravidez, tal como pré-eclampsia, esclerose múltipla, doença cardiovascular, doença infecciosa, tal como infecção do vírus da hepatite C, doença de tecido conectiva não diferenciado ou de sobreposição, Raynaud, osteoartrite, artrite psoriática, síndrome primária anti-fosfolipídica, lúpus cutâneo, etc.. Cada uma destas doenças ou condições também pode ser descrita como doença ou condição inflamatória crônica.
[0017] Como utilizado aqui, “lúpus eritematoso sistêmico”, “SLE”, ou “lúpus” é a doença autoimune prototípica resultando em um envolvimento de múltiplos órgãos. Esta anti-auto resposta é caracterizada pelos auto-anticorpos é caracterizada apor auto-anticorpos dirigidas contra uma variedade de componentes celulares nucleares e citoplasmáticos. Estes auto-anticorpos se ligam a seus antígenos respectivos, formando complexos imunes, que circulam e eventualmente depositam nos tecidos. Esta deposição do complexo imune e ativação sequencial do sistema complemento causam inflamação crônica e danos no tecido.
[0018] Como utilizado aqui, a “doença ou condição inflamatória do lúpus eritematoso não-sistêmico”, “doença ou condição não-SLE inflamatória”, ou “doença ou condição não- lúpus inflamatório” é qualquer doença ou condição inflamatória que não é lúpus sistêmico eritematoso, SLE ou lúpus, incluindo mas não necessariamente limitado à artrite reumatoide, vasculite (e sua forma específica tal como granulomatose de Wegener), escleroderma, miosite inflamatória idiopática, síndrome Sjogren, doença do soro, rejeição ao transplante, anemia falciforme, gota, complicações de gravidez tal como pré-eclampsia, esclerose múltipla, doença cardiovascular, doença infecciosa tal como infecção do vírus da hepatite C, doença de tecido conectivo sobreposto ou não- diferenciado, Raynaud, osteoartrite, artrite psoriática, síndrome primária antifosfolipídica, lúpus cutâneo, etc.
[0019] Como utilizado aqui, uma “célula branca do sangue” refere-se à células do sangue circulante que não são eritrócitos ou reticulócitos, por exemplo, linfócitos T e B, células NK, eosinófilos, basófilos, granulócitos, neutrófilos, monócitos, macrófagos, mega-cariócitos, células do plasma, células endoteliais circulantes, e células tronco.
[0020] A célula mononuclear do sangue periférico (PBMC) pode corresponder a qualquer célula do sangue tendo um núcleo redondo. Tais células são conhecidas por particular uma regra na resposta imune. A PBMC inclui, por exemplo, linfócitos tais como linfócitos T, linfócitos B e células NK, monócitos e macrófagos.
[0021] A PBMC utilizou preferivelmente a praticar a invenção corresponde a um linfócito T. O termo “linfócito T” refere-se aqui aos linfócitos T em qualquer estágio de diferenciação, incluindo os linfócitos T CD4+ ou CD8+ naive, e linfócitos CD4+ ou CD8+ maduros, tal como linfócitos CD4+ Th1, linfócitos CD4+ Th2 (células T auxiliares expressando cD4 em sua superfície celular), e células citotóxicas CD8+ (linfócitos T citotóxicos expressando CD8 em sua superfície celular). Para este fim, qualquer de tais subpopulações de células pode ser detectada através do uso de um anticorpo especificamente reconhecendo tais marcadores a base de células. E mais especificamente, como um exemplo, mas não pretende ser limitativo, o termo “anticorpo reconhecendo especificamente uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC)” refere-se a qualquer anticorpo reconhecendo especificamente tal marcador presente em uma população PBMC, incluindo, mas não limitado aos anticorpos anti-CD3 se a população PBMC a ser detectada é a população celular T ou anticorpos anti-CD8 se a população PBMC a ser detectada é a população do linfócito T citotóxico (CTLs).
[0022] Como utilizado aqui, uma “célula branca do sangue controle” ou um “PBMC controle” ou uma “célula de linfócito T controle” refere-se a uma célula branca do sangue, PBMC ou linfócito T, como definido respectivamente aqui, ou seja, isolado a partir de um indivíduo que não tem uma doença ou condição inflamatória, não tem SLE, ou mostra níveis inferiores de uma doença inflamatória ou condição (incluindo SLE) sendo a comparação com um indivíduo tendo SLE mostra aumento estatisticamente relevante na ligação ou associação dos auto-anticorpos para os linfócitos T quando comparado a qualquer um dos “linfócitos T controle”. Quando uma doença ou condição inflamatória estiver sendo diagnosticada ou monitorada em um paciente, um controle de célula branca do sangue, um PBMC controle ou uma célula linfócito T controle pode também referir-se a um tipo respectivo de célula isolada a partir do mesmo paciente em um período anterior, por exemplo, semanas, meses, ou anos recentes.
[0023] Como utilizado aqui, um “componente da rota complemento” inclui proteínas C1, C4, C2, C3 e fragmentos dos mesmos, por exemplo, C1q, C1r, C1s, C4a, C4b, C2a, C2b, C4b2a, C3a, C3b, C4c, C4d, iC3b, C3d, C3i, C3dg. Ademais estão incluídos C5, C5b, C6, C7, C8, C9, C1inh, MASPi, MASP2, CR1, DAF, MCP, CD59, C3aR, C5aR, C1qR, CR2, CR3, e CR4, bem como outros componentes da rota do complemento, receptores e ligantes não listados especificamente aqui.
[0024] Determinados hardware que podem ser utilizado por conter ou implementar vários processos e sistemas em determinadas concretizações. O hardware pode incluir um processador tal como um CPU que opera a execução das instruções da programação. As instruções de programação podem ser armazenadas em um meio de leitura em computador não- transitório tal como leitura apenas na memória (ROM), memória de acesso aleatória (RAM), um disco compacto, um disco digital, memória flash, um cartão de memória, um dispositivo USB, um meio de disco de armazenamento óptico, uma plataforma de distribuição de armazenamento em computador, tal como uma arquitetura baseada nas nuvens, e/ou outro meio de registro.
[0025] Quando utilizado neste documento, o termo “processador” pode referir-se a um processador único ou a processadores múltiplos que juntos implemento várias etapas de um processo. Similarmente, um “dispositivo de memória” ou “banco de dados” pode se referir a um dispositivo único ou banco de dados ou dispositivos múltiplos ou banco de dados através das instruções de programação e/ou dados são distribuídos. Abreviações: ALA - auto-anticorpos anti-linfócitos ADCC - citotoxicidade celular dependente do anticorpo CB-CAPs - produtos de ativação do complemento ligada à célula C4d - produto de ativação C4 complemento C4d Ig - imunoglobulina SLE - lúpus sistêmico eritematoso T-C4d - C4d ligado à célula T
[0026] As células influenciando C4d, um produto de ativação complemento, demonstraram ser altamente sensíveis e específicas como biomarcadores de diagnóstico para SLE. As células T influenciando C4d são também funcionalmente anormais, sugerindo uma regra para produtos de ativação do complemento ligados à célula (CB-CAPs) na patogênese do lúpus. Entretanto, o mecanismo responsável para a produção de células T influenciando C4d (T-C4d) não foi previamente determinada. Os presentes inventores foram conduzidos em um estudo seção transversal e prospectivo para investigar a regra potencial de auto-anticorpos anti-célula T na produção das assinaturas T-C4e em SLE. As células T a partir de pacientes com SLE, pacientes com outras doenças inflamatórias, e controles saudáveis foram caracterizados para deposição superficial de C4d e/ou imunoglobulina (ig) através de citometria de fluxo. Os linfócitos frescos isolados a partir de um paciente foram diretamente analisados para a presença da imunoglobulina (ou seja, ALAs) sobre as superfícies celulares através de citometria de fluxo, sem incubação anterior em soro dos pacientes ou plasma. Os experimentos de transferência do fenótipo IN VITRO foram realizados para caracterizar Ig a partir de pacientes SLE quanto à capacidade em gerar a assinatura T-C4d IN VITRO. Os resultados demonstram que os pacientes individuais com SLE abrigam assinaturas específicas refletindo a presença de C4d e/ou Ig sobre suas células T e subconjuntos de célula T. Em adição, as assinaturas específicas de pacientes SLE podem ser transferidas in vitro para células T normais através da exposição à Ig purificada a partir da assinatura do doador. A ativação do complemento não prossegue através da produção de C5b-9 (ataque do complexo de membrana) ou lise celular e T- C4d não correlaciona com linfopenia. Embora não pretenda ser ligado a qualquer teoria de operação, estes resultados sugerem que a assinatura paciente-específica T-C4d são geradas através dos auto-anticorpos da célula anti-T que busca a ativação do complemento sublítico disparado. Isto é importante, mas um link não previamente reconhecido no complexo de interação entre os auto-anticorpos e na ativação do complemento na patogênese do lúpus. Acredita-se que uma relação de causa e efeito entre T-Ig e T-C4d induzindo assim a deposição T-C4d por T-Ig pode ser importante não apenas para o diagnóstico de lúpus, mas também para monitoramento da atividade da doença em um paciente com lúpus.
[0027] Com base em duas características importantes de deposição dos anticorpos linfócitos anti-T e CB-CAPs sobre as células, acredita-se que os ensaios combinados podem ser particularmente úteis para monitoramento da atividade da doença em um paciente com SLE. Primeiro, os presente inventores demonstraram que os anticorpos anti-células T causam a deposição de CB-CAPs sobre a superfície celular, detecção dos anticorpos da célula anti-T sem a presença simultânea de CB-CAPs sobre a superfície celular pode ser utilizado para prever que CB-CAPs será subsequentemente depositado e contribuírem para a atividade aumentada da doença. Em contraste, a presença de CB-CAPs na ausência de anticorpos de célula anti-T pode indicar que os anticorpos de célula anti-T foram depositados previamente e proveem percepção sobre a atividade da doença consequentemente. Acredita-se que a presença simultânea ou a ausência simultânea de ambos os anticorpos de célula anti-T e CB-CAPs podem também refletir na atual atividade da doença ou prever a atividade futura. Em segundo, os inventores da presente invenção demonstraram previamente que CB-CAPs são covalentemente ligados à superfície de células e igualmente permanecem ligados permanentemente na longevidade da célula uma vez que elas são depositadas. Em contraste, os anticorpos anti-célula T não são covalentemente ligados e, portanto, podem ser liberados a partir da célula em qualquer tempo após a ligação. Embora não pretende estar ligado a qualquer teoria de operação, acredita-se que tal característica de “ataque e fuga” dos anticorpos de célula anti-T versus o alvo permanente de uma célula por CB-CAPs pode prover a percepção de quando o alvo da célula ocorreu é útil para o monitoramento e prevenção da atividade da doença no paciente.
[0028] Uma concretização d apresente invenção descreve os métodos para diagnóstico e/ou monitoramento específico do lúpus sistêmico eritematoso (“SLE”) em um indivíduo, o qual é distinto de um indivíduo que pode ter complicações a partir de uma doença ou condição inflamatória diferente (ou seja, uma doença ou condição inflamatória não-SLE). Tal metodologia compreende a quantificação do nível do auto-anticorpo do indivíduo que são depositados durante, contatando, ou em alguma forma de associação estável com a superfície de um linfócito T obtido a partir de uma amostra de sangue do indivíduo, uma amostra contendo células brancas do sangue, incluindo uma população de linfócitos T. Para este fim, e com relação a amostra de sangue obtida a partir do indivíduo para análise, uma outra concretização da presente invenção descreve a metodologia, onde o nível dos auto-anticorpos do indivíduo depositados sobre ou contatando com a superfície de um linfócito T é medido a partir de uma população das células mononucleares do sangue periférico obtida de uma amostra de sangue do indivíduo.
[0029] Será entendido durante a revisão deste pedido que qualquer tipo de célula de linfócito T representativa é coberta pelo escopo e proteção desta metodologia descrita, denominado linfócito T, obtido de uma amostra de sangue do indivíduo que pode ser um linfócito T representado e, portanto, selecionado a partir do grupo consistindo de uma célula de linfócito CD4+ Th1, uma célula de linfócito CD4+ Th2, uma célula de linfócito citotóxico CD8+, bem como outras células de linfócitos CD4+ incluindo, mas não limitados as células auxiliares CD4+ Th9, células auxiliares CD4+ Th17, células auxiliares foliculares CD4+ T (Tft), e células regulatórias T CD4+ (Treg).
[0030] Embora estas concretizações refiram-se a uma detecção única e focada e a quantificação dos auto-anticorpos de célula anti-T presentes dentro do indivíduo como um determinante específico de SLE quando oposto a uma doença ou condição inflamatória não-SLE, uma concretização adicional da invenção compreende o foco da quantificação, em adição à quantificação destes auto-anticorpos de célula anti-T presentes dentro do indivíduo, detectando e quantificando o nível de um biomarcador de diagnóstico de SLE, também depositado sobre ou contatando com uma superfície da célula de linfócito T obtida a partir da amostra de sangue (tal como PBMCs), onde este biomarcador de diagnóstico secundário é selecionado a partir do grupo consistindo de C4d, C3d, um componente C4 da rota do complemento e um componente C3 da rota do complemento. Em uma concretização, um biomarcador de diagnóstico secundário preferido é C4d.
[0031] Uma outra concretização descreve métodos para o diagnóstico específico e/ou monitoramento de SLE em um indivíduo que é distinto de um indivíduo que pode ter complicações a partir de uma doença ou condição inflamatória diferente (ou seja, doença ou condição inflamatória não-SLE) onde uma etapa compreende a quantificação do nível de auto- anticorpos do indivíduo que são depositados durante, contatando, ou de alguma forma em associação estável com uma superfície de um linfócito T obtido a partir da amostra de sangue do indivíduo que contém uma população de células brancas de sangue, (incluindo, mas não limitado a preparação de PBMCs isolados a partir do indivíduo), e combinado com uma etapa adicional que envolve a obtenção de uma amostra “controle” similar (como definido aqui e contendo uma população de linfócitos T, tal como preparado a partir de uma população de células mononucleares de sangue periférico obtidas a partir da amostra de sangue controle) e comparando o nível do indivíduo testado contra o nível dos auto- anticorpos depositados sobre ou contatando com uma superfície de uma população controle de linfócitos T, sendo que um nível aumentado de auto-anticorpos a partir da amostra nos indivíduos testados identifica SLE dentro daquele indivíduo. Novamente, será entendido que esta concretização particular pretende como um tipo de célula de linfócito T representativo qualquer um dos linfócitos T que podem ser obtidos a partir de uma amostra de sangue do indivíduo selecionado a partir do grupo consistindo de uma célula de linfócito CD4+ Th1, uma célula de linfócito CD4+ Th2, uma célula de linfócito citotóxico CD8+, bem como outras células de linfócito CD4+, incluindo, mas não limitado a células auxiliares CD4+ Th9, as células auxiliares CD4+ Th17, as células auxiliares foliculares CD4+ (Tfh), e as células regulatórias CD4+ T (Treg).
[0032] Adicionalmente, é contemplado, e descrito aqui, que medidas de ambas as amostras de testes (ou seja, do indivíduo) contendo a população de linfócitos T e uma amostra “controle” contendo uma população de linfócitos T controle pode abranger adicionalmente, como descrito acima, a medida adicional da quantificação do nível de um biomarcador adicional ou um conjunto de biomarcadores de diagnóstico adicional associado com SLE que também são conhecidos por depositar ou contatar a superfície de um linfócito T, sendo que tal biomarcador de diagnóstico é selecionado a partir do grupo consistindo de C4d, C3d, um componente C4 da rota do complemento e um componente C3 da rota do complemento. Em concretizações, um biomarcador preferido é C4d.
[0033] Uma outra concretização, como descrita acima cobre um método de diagnóstico ou monitoramento especifico para SLE em um indivíduo, distinto daquela doença ou condição inflamatória não-SLE, que compreende a etapa de obter uma amostra de sangue contendo células brancas do sangue a partir de um indivíduo, isolando uma população de célula mononuclear do sangue periférico a partir da amostra de sangue, incubando a população de célula mononuclear do sangue periférico com um reagente detectável que se liga especificamente a um auto- anticorpo de ligação à superfície celular de um linfócito T dentro da população celular mononuclear do sangue periférico, e medir o nível do complexo reagente detectável-auto- anticorpo de linfócito T. Esta metodologia é bem apropriada para medir, reconhecer, ou quantificar tal como complexo reagente detectável- auto-anticorpo -linfócito T através de qualquer metodologia conhecida descrita no estado da técnica relacionado à citometria de fluxo. Como descrito acima, com relação à comparação do nível de qualquer um dos complexos a partir de um indivíduo de teste quando comparado a uma amostra controle, esta concretização também contempla a comparação do nível do complexo reagente detectável-auto- anticorpo- célula T obtido a partir do indivíduo com um nível de um tipo de complexo de reagente detectável-auto-anticorpo- linfócito T obtido a partir de uma amostra de sangue controle. Tal medida de comparação entre uma amostra de teste e uma amostra controle será adicionalmente informativo no diagnóstico ou no monitoramento continuado SLE dentro de um indivíduo particular.
[0034] É adicionalmente descrito aqui que um reagente detectável pode ser um anticorpo Ig anti-humano marcado fluorescentemente que é detectável por citometria de fluxo e, em particular, como descrito durante este relatório, pode incluir, mas não ser limitado, a um anticorpo Ig anti-humano marcado fluorescentemente selecionado a partir do grupo consistindo de um anticorpo IgG anti-humano selecionado a partir do grupo consistindo de um anticorpo IgG anti-humano marcado fluorescentemente e um anticorpo IgM anti-humano marcado fluorescentemente.
[0035] Uma outra concretização provê um kit para o diagnóstico específico ou monitoramento específico SLE em um indivíduo. O kit podem incluir um anticorpo marcado fluorescentemente para reconhecer especificamente um auto- anticorpo que se liga a um linfócito T (incluindo, mas não limitado a, um anticorpo monoclonal anti-IgG ou anti-IgM), opcionalmente incluindo um anticorpo monoclonal flúor- conjugado reativo com a linhagem específica de marcadores de superfície celular de linfócito T para distinguir entre CD3+CD4= e CD3+CD8+linfócitos T, opcionalmente incluindo um ou mais reagentes bioquímicos e, opcionalmente, incluindo instruções par auso do kit e os componentes do kit no diagnóstico ou no monitoramento de SLE. Qualquer kit pode também ser apropriado para, como descrito aqui, a identificação de um biomarcador ou biomarcadores adicionais (além dos auto-anticorpos do indivíduo encontrados para ligar os linfócitos T), que podem incluir, mas não estão limitados a, inclusão dentro do kit dos anticorpos monoclonais de flúor-conjugado reativos a um marcador da superfície celular do linfócito T selecionado a partir do grupo consistindo de CD3, CD4, CD8, CXCR3, CCR4, Crth2, CCR6, CXCR5 e CD25.
[0036] As determinações sutilizadas para diagnosticar ou monitorar especificamente SLE em um indivíduo, distinto daquele de uma doença ou condição inflamatória não-SLE através da medida de pelo menos um complexo reagente detectável auto-anticorpo-célula-T, e possivelmente a medida adicional dos componentes da rota do complemento (incluindo, mas não limitado a C4d e/ou C3d), e em conjunto com os métodos de diagnóstico e de monitoramento da atividade da doença descritos acima, podem ser realizados manualmente, mas frequentemente são convenientemente realizados utilizado um sistema e/ou equipamento automatizado, nos quais a amostra de sangue (ou, por exemplo, a fração PBMC isolada) é analisada automaticamente para fazer a determinação necessária ou determinações, e a comparação com a base ou o valor de referência é realizada automaticamente, usando um software de computador apropriado aquele propósito.
[0037] Assim, uma concretização da invenção compreende um sistema a base de computador para diagnosticar ou monitorar especificamente o lúpus sistêmico eritematoso em um indivíduo, distinto daquele de uma doença ou condição inflamatória de lúpus não-sistêmico eritematoso, o sistema compreendendo um processador e um meio de armazenamento legível por computador não-transitório contendo instruções de programação configuradas a, quando executado, instruir o processador a quantificar, em uma amostra de sangue contendo as células brancas do sangue a partir de um indivíduo, um nível dos auto-anticorpos do indivíduo depositados sobre ou contatando com uma superfície de um linfócito T na amostra, e então comparar o nível do indivíduo com o nível dos auto- anticorpos depositados sobre ou contatando com uma superfície de um linfócitos T controle, sendo que um nível aumentado de auto-anticorpos a partir da amostra do indivíduo identifica SLE no indivíduo. Para este fim, qualquer um dos softwares de computador, ou um meio legível por computador para uso nos métodos desta invenção podem incluir um meio legível por computador compreendendo um código para recebimento de dados correspondente ao nível dos auto-anticorpos do indivíduo depositados sobre ou contatando com uma superfície de um linfócito T é medido a partir de uma população de células mononucleares do sangue periférico obtido a partir de uma amostra de sangue, sendo que o linfócito T é representado na amostra por pelo menos um tipo de célula de linfócito T incluindo, mas não limitado a, um linfócito T representativo selecionado a partir do grupo consistindo de uma célula de linfócito CD4+ Th1, uma célula de linfócito CD4+ Th2, uma célula de linfócito citotóxico CD8+, bem como outras células de linfócito CD4+ incluindo, mas não limitado as células auxiliares CD4+ Th9, células auxiliares CD4+ Th17, células auxiliares foliculares CD4+ T (Tfh), e células T regulatórias CD4+ (Treg). Adicionalmente, qualquer um dos softwares de computador, ou meio legível por computador para uso nos métodos desta invenção podem incluir um meio legível por computador compreendendo o código de recebimento dos dados correspondentes ao nível de um biomarcador adicional associado com SLE que também são conhecidos ao depósito ou contato com a superfície de um linfócito T, sendo que o biomarcador de diagnóstico é selecionado a partir do grupo consistindo de C4d, C3d, um componente C4 da rota do complemento e um componente C3 da rota do complemento, com uma única preferência sendo C4d. Um outro aspecto relacionado de tal software de computador, ou meio legível de computador par auso nos métodos desta invenção para incluir um meio legível por computador compreendendo um código para receber os dados correspondentes ao nível do uso do indivíduo de qualquer componente do kit adicional, tal como anticorpos monoclonais flúor conjugado reativo a um marcador de superfície celular linfócito T específico selecionado a partir do grupo consistindo de CD3, CD4, CD8, CXCR3, CCR4, Crth2, CCR6, CXCR5 e CD25, como descrito aqui.
[0038] Os presentes inventores demonstraram previamente que os produtos de ativação do complemento, particularmente C4d, se liga aos níveis elevados especificamente para circular as células nos pacientes com SLE, gerando, assim assinaturas de CB-CAP que são altamente sensíveis e específicas para um diagnóstico de lúpus. A maioria de pacientes com lúpus abrigando eritrócitos, linfócitos, plaquetas e outras células circulantes carregando c4d e/ou C3d no padrão específico celular que são únicos aos pacientes individuais. O mecanismo responsável para produção destas assinaturas CB-CAP não foram previamente identificados. Os inventores da presente invenção supuseram que os auto-anticorpos específicos anti-célula podem ser responsáveis pela deposição de CB-CAP e focaram especificamente sobre a regra potencial dos auto-anticorpos de célula anti-T. A evidencia é provida aqui para suportar a regra dos auto-anticorpos de célula anti-T na geração de assinaturas TCD3-C4d, TCD4-C4d e TCD8-C4d através da ativação do complemento sublítico e sugeriu que isto é um mecanismo patogênico não-reconhecido previamente em lúpus.
[0039] Primeiro, foi demonstrado previamente que mais do que 80% dos pacientes com lúpus carrega a assinatura CB-CAP, que são altamente específicos ao paciente. O mecanismo responsável por estas assinaturas não foram previamente determinadas. Os auto-anticorpos seriam suspeitos naturais para a produção de padrões específicos da deposição de C4d sobre a superfície celular, entretanto a ativação mediada pelo anticorpo do complemento sobre as superfícies celulares é geralmente através do resultado na destruição da célula, como observado em anemia hemolítica e em terapias de depleção de célula B mediada por anticorpos monoclonais com agentes tais como rituximab. Os presentes inventores demonstraram aqui que os auto-anticorpos de célula anti-T estão presentes sobre as células T circulantes em pacientes com lúpus, e os padrões T-Ig/T-C4d são consistentes entre os pacientes individuais em um período de tempo. Além disso, a IgM e IgG purificada dos pacientes de lúpus carregando Ig e C4d sobre suas células T podem transferir a assinatura T-C4d para as células T saudáveis. Coletivamente, estas observações suportam que a ativação da rota do complemento clássico sobre as superfícies de células T comumente ocorrem nos pacientes com SLE. A perda da correlação entre as assinaturas T-C4d e linfopenia e a perda do completo de ataque de membrana sobre estas células T demonstra que a ativação da rota clássica não prossegue através da geração significante de convertases C5.
[0040] Segundo, os auto-anticorpos de célula anti-T em pacientes com SLE foram primeiro descobertos a mais de 40 anos atrás e ainda não ficou muito bem definida a regra na patogênese da doença. Um desafio foi reconciliar como a IgM reativa ao frio pode ser patogênica em condições térmicas IN VIVO. Embora não pretende estar ligado a qualquer teoria de operação, foi sugerido a partir de estudos descritos aqui que as baixas concentrações do auto-anticorpos IgM são capazes de se ligar as células T IN VIVO conduzindo a deposição de C4d sem causar a lise celular.
[0041] Terceiro, os resultados do presente estudo pode explicar uma observação curiosa descrita em todos os relatos de CB-CAPs até hoje. Os tipos específicos de células influenciando os níveis anormais de C4d são quase sempre uniformemente positivos em um determinado paciente, como refletido pelos histogramas de citometria de fluxo. Por exemplo, se a assinatura CB-CAP de um paciente inclui TCD3- C4d, todas as células CD3 naquele paciente serão C4d- positivas e os níveis e C4d em cada célula serão similares. Isto está em contraste com os padrões gerados pela deposição do complexo imune circulante sobre as células, que podem se ligar apenas a um subconjunto de células influenciando os receptores para Fc ou produtos de ativação do complemento. Embora não pretende estar ligado a qualquer teoria de operação, acredita-se que os auto-anticorpos de célula anti-T circulantes em pacientes com lúpus tem a capacidade de reconhecer todos os linfócitos T circulantes e assim gerar a deposição de C4d sobre cada célula. Este modelo explica o padrão CB-CAP homogêneo observado sobre as células T e possivelmente outras células.
[0042] Quarto, embora não pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação, as observações descritas aqui suportam adicionalmente a hipótese de que a assinatura CB-CAP não são geradas pela ativação do complemento sistêmico e a deposição sobre as células espectadoras inocentes, mas sim através de um mecanismo alvo de células específicas.
[0043] Embora não pretende estar ligado a qualquer teoria de operação, os pacientes positivos-simples T-Ig podem ser explicados pela ligação Ig às células T alvos de uma maneira reversível durante a crise da doença, deposição por catalisação de C4d sobre as células T. C4d, uma ver gerado e ligado covalentemente a superfície celular, pode permanecer estável mesmo quando os auto-anticorpos de iniciação foram destacados das células T. Os auto-anticorpos de célula anti-T de determinadas subclasses de IgG (por exemplo, IgG2 e IgG4) podem ser ineficientes no gatilho da ativação do sistema complemento, criando, assim, um fenótipo de ligação de Ig sem C4d. A presença de mecanismos ALA-independente adicionais, em que CAPs são gerados e depositados sobre as células T é possível. Entretanto, em vista das características de superprodução dos auto-anticorpos em pacientes com SLE, acredita-se que o mecanismo mediado por ALA participe igualmente de uma regra dominante no cultivo de célula- e fenótipos T-C4d específicos de pacientes.
[0044] Os inventores da presente invenção demonstraram que a deposição de C4d em células T e subconjuntos de célula T é gerada pela ativação do complemento sublítico ativado pelos auto-anticorpos de célula anti-T em pacientes com SLE. Embora não pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação, esta rota não reconhecida previamente pode ser um círculo patogênico vicioso, em que os auto-anticorpos ativam a rota do complemento clássica em uma capacidade sub-lítica. A deposição de C4d contribui à disfunção destas células alvo, que permanece na circulação e direcionamento adicional da desregulação imune, produção de auto-anticorpo, ativação do complemento e danos de tecidos.
[0045] Os exemplos a seguir servem para ilustrar, adicionalmente, a presente invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1 Materiais e Métodos - Participantes do Estudo:
[0046] Pacientes SLE. Trezentos e vinte e seis pacientes que preencheram os critérios de classifica da Reumatologia do colégio Americano para definir SLE foram incialmente recrutados e seguidos.
[0047] Pacientes com outras doenças. Um total de 185 pacientes com várias doenças autoimunes não-SLE tais como artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, escleroderma, miopatia inflamatória idiopática, síndrome anti-fosfolídica primária, e doença de tecido conectivo não-diferenciado foram recrutados durante o mesmo período, que os pacientes SLE de corte.
[0048] Controles saudáveis. Um total de 48 indivíduos saudáveis foi recrutado através de anúncios locais. Para confirmar seu status de saudável, os participantes completaram um questionário resumido com relação a existência de condições médicas.
Preparação de plasma e soro, isolamento de imunoglobulina, e depleção da imunoglobulina.
[0049] No período de cada visita do participante, uma amostra de 4-5 ml de sangue foi colhida dentro de um tubo Vacutainer® contendo EDTA como um anticoagulante (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). As amostras de sangue anti- coaguladas com EDTA foram processadas dentro de 24 horas após a coleta do sangue. O plasma foi fracionado por centrifugação a 800 xg por 10 minutos e armazenado a 4°C (para uso imediato, em um período curto) ou -80°C (para uso futuro, de longa duração). O soro humano normal foi preparado a partir do sangue de um controle saudável colhido dentro de um tubo de separação de soro sem anticoagulante, aliquotado, e armazenado a -80°C até o uso. A imunoglobulina G (IgG) presente no plasma foi isolado suando o kit de purificação de IgG Pierce ImmunoPure® (A/G) (Thermo Sicentific, Rockford, IL) seguindo as instruções do fabricante. Após a coleta de IgG, o fluxo através da coluna de afinidade A/G da proteína foi adicionalmente fracionada para enriquecer a IgM usando o kit de purificação de proteína L de fuso Pierce NabTM (Thermo Scientific) seguindo as instruções do fabricante. As frações IgG e a IgM eluídas a partir da respectiva coluna de afinidade foram dessalinizada, carregadas com tampão dentro da salina tamponada com fosfato (PBS), e concentradas por centrifugação usando filtros de centrífuga Microcon® (peso molecular de corte 30 kD; Millipore EMD, Billerica, MA). Para esgotar Ig, a amostra de plasma foi passada através de colunas de proteína A/G sequenciais e coluna de proteína L duas vezes. A passagem através do fluxo final foi colhida, dialisada contra PBS, e concentrada novamente para o volume original usando o dispositivo Microcon®. Para esgotar a Ig reativa do linfócito, a amostra de plasma (50 μ l) foi incubada com linfócitos do sangue periférico (107 células, isolada a partir de controles saudáveis individuais) a 4°C durante 30 minutos e então recuperados pela remoção das células através de centrifugação. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico:
[0050] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir das amostras de sangue anticoagulado em EDTA dentro de 24 horas após a coleta do sangue por centrifugação do gradiente. Resumidamente, as amostras do sangue foram centrifugadas para separar o plasma e células. A fração celular foi diluída com 3 volumes de PBS, postas em camadas no topo de uma solução PLUS FIcoll-PlaqueTM (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ), e centrifugadas a 40 x g em temperatura ambiente por 20 minutos. As células mononucleares localizadas na interface entre o plasma e a solução Ficoll foram cuidadosamente transferidas dentro de um tubo fresco, lavados extensivamente com PBS para remover as plaquetas contaminantes, e ressuspender em PBS.
Ensaio de citometria de fluxo para medida da ligação da célula T ao C4d (T-C4d) e imunoglobulina ligada à célula T (T-Ig):
[0051] O PBMC preparado a partir do sangue anti-coagulado com EDTA foram divididos dentro de alíquotas de volume iguais para detecção CB-CAP. Os níveis de C4de e Ig se ligam as células T foram medidos usando um ensaio de citometria de fluxo multicolorido recentemente desenvolvido, com algumas modificações. Os linfócitos, monócitos, e granulócitos residuais foram distinguidos com base na expressão das caraterísticas das moléculas superficiais e suas características únicas de seguir na dispersão de (tamanho)/ lado(granulometria). A ficoeritrina (PE)-, PE-Cy5-, ou aloficocianina dos anticorpos monoclonais de camundongos conjugados-(APC) (mAb) reativos com marcadores de superfície celular específicos de linhagem (CD3, CD4, e CD8 para células T; BD Biosciences, San Diego, CA) foram utilizados em conjunção tanto com monoclonais de camundongo anti-humano C4d mAb (IgG1 de camundongo; reativo com fragmentos contendo c4d de C4; Quidel, San Diego, CA), IgG anti-humano (IgG1 de camundongo; BD Biosciences), ou IgM anti-humano (IgG1 de camundongo; BD Biosciences) que foram marcados com corantes Alexa Fluor usando o kit de marcação do anticorpo Zenon (Life Technoloies, Carisbad, CA). Alternativamente, a cadeia kapa Ig anti-humano conjugado ao PE ou cadeia lambda Ig anti- humano conjugado ao PE (BD Bioscencies) fi utilizado combinação com o anti-C4d e anticorpo com marcador superficial anti-célula para identificar os subtipos de cadeia leve da Ig ligado a célula T. Após a coloração, as células foram analisadas usando um citometria de fluxo FACSCaliburTM e software CELLQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Para garantir a especificidade da coloração do anticorpo detectado, alíquotas de leucócitos a partir de cada paciente corado com a IgG de camundongo de isotipos apropriados foram rotineiramente incluídos em todos os experimentos. Para garantir a confiabilidade do dia a dia da medida de LB-CAP, a citometria de fluxo FACSCalibur foi calibrada diariamente usando Calibrite 3 contas e software FACSComp (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Os níveis de C4d ligado à célula e Ig foram expressos como intensidade de fluorescência mediana específica (SMFI), que foi calculado como C4d intensidade de fluorescência mediana de (ou Ig)-específico mínima da intensidade da fluorescência mediana do controle isotipo.
Experimentos de transferência do fenótipo in vitro:
[0052] PBMC (106 de células em 50 μ l de PBS), isolado a partir dos controles saudáveis individuais ou pacientes SLE com baixos níveis T-C4d, foram incubados com 50 μ l do plasma preparado a partir dos pacientes SLE individual que foram identificados como tendo um alto fenótipo T-C4d/T-Ig cm base na análise de citometria de fluxo descrita acima. Em alguns experimentos, o plasma SLE foi substituído com diferentes quantidades de IgG ou IgM purificado (100 - 100 μg), plasma com Ig esgotada, ou plasma pré-absorvido de linfócito. Após a incubação a 4°C durante 30 minutos, a suspensão PBMC foi lavada com PBS duas vezes, ressuspensas em 50 ml de tampão GVB2+ (1% de gelatina, 5 mM Na veronal, 142 mM de NaCl, pH 7,3), e incubado com 50 ml de soro humano normal (como uma fonte de complemento). Em alguns casos, o soro humano normal inativado pelo calor ou soro humano esgotado de C1q (Quidel) foi utilizado como um soro controle negativo. Após a incubação a 37°C durante 40 minutos, a suspensão celular foi lavada com PBS duas vezes e submetidos ao ensaio de citometria de fluxo multicolorida descrito acima.
Exemplo 2 - assinaturas especificas do paciente TCD3-C4d, TCD4-C4d, e TCD8-C4d são gerados em SLE:
[0053] Um estudo cruzado foi conduzido para identificar os pacientes em cujos níveis de C4d sobre as células T foram tanto similares quanto distintos entre os subconjuntos de CD4 e CD8. Em alguns pacientes, o histograma de coloração C4d de células CD3+ T(TCD3) refletindo uma população única de células e os histogramas de coloração C4d de células CD4+ T (TCD4) e células CD8+ T (TCD8) foram indistinguíveis, refletindo níveis iguais de ligação ao C4d para cada um dos dois subconjuntos de célula (Figura 1, painéis A e B). Entretanto, os histogramas TCD3-C4d bifásico foram observados em muitos dos pacientes SLE (Figura 1, painéis C-F). Os ensaios TCD4-C4d e TCD8-C4d demonstraram que estes histogramas bifásicos foram devidos às diferenças nos níveis de C4d sobre estes dois subconjuntos celulares dentro dos pacientes individuais. Em alguns pacientes, os níveis consideravelmente elevados de C4d foram detectados sobre as células TCD4, comparados às células TCD8 (Figura 1, painéis C e D). Inversamente, os níveis significativamente maiores de C4d poderiam estar presentes sobre as células TCD8 comparadas às células TCD4 em outros pacientes (Figura 1, painéis E e F). Em geral, o perfil de ligação preferencial específico TCD4-C4d/TCD8-C4d, ou assinatura, de um determinado paciente apareceu para permanecerem estável sobre o tempo, apesar dos níveis atuais de C4d presentes sobre as células podem flutuar sobre o tempo (Tabela 1). Existem exceções para este padrão. Uma “conversão” do padrão de ligação não ocorre em alguns pacientes durante seu curso de doença (por exemplo, pacientes SLE56525 e SLE102357, Tabela 1). Como previamente reportado, o complemento C5b-9 (complexo de ataque da membrana) não foi detectado sobre as células T. Embora não pretenda estar ligado por qualquer teoria de operação, esta observação que os subconjuntos de célula T poderiam ser preferivelmente alvos pela deposição de C4d e assinaturas T-C4d específica de pacientes poderia ser identificada sugerido que mecanismos específicos podem ser responsáveis para gerar estes fenótipos. As assinaturas T-C4d não foram associadas com linfopenia (não mostrado). Tabela 1 Ligação diferencial de C4d aos subconjuntos de célula T em pacientes SLE em relação ao tempo
Exemplo 3 - Imunoglobulina e C4d são simultaneamente presente sobre as células T em SLE:
[0054] Um mecanismo responsável para assinaturas T-C4d poderia contar para deposição diferencial de C4d sobre TCD4 versus as células TCd8 em alguns pacientes e a explicação mais provável seria via auto-anticorpos específico para TCD4 versus células TCD8. Isto foi investigado pela análise de citometria de fluxo para examinar e correlacionar na presença de C4d (T-C4d) e imunoglobulina (T-Ig) sobre a superfície das células T em pacientes com SLE. Os resultados demonstraram que as células T a partir de uma fração significante (~30%) do corte do paciente SLE foram ao contrário decoradas simultaneamente com ambos C4d e Ig na visita de estudo (Figura 2 A). As mudanças consideravelmente no fenótipo T- C4d/T-Ig e níveis dentro de cada paciente individual foram notados. Uma boa correlação entre T-C4d e níveis T-Ig foram observados em alguns, mas não todos os pacientes. A inserção dentro de cada histograma mostra a análise de correlação correspondente. Colunas Azuis: T-C4d; colunas púrpuras: T-Ig. O remanescente dos pacientes SLE foi tanto positivos únicos tanto para C4d ou Ig, ou eles foram duplamente negativos. Em comparação, as células T dos pacientes com outras doenças e controles saudáveis foram negativas para ambos, Ig de ligação superficial e C4d (Figura 2B; dados mostram apenas para TIg). Dos 185 pacientes com outras doenças auto-imunes, apenas dois pacientes, ambos com síndrome de Sjogren, tiveram níveis significativamente elevados de Ig presente sobre a superfície de suas células T. Um destes dois pacientes também tiveram níveis significativamente elevados de T-C4d.
[0055] Em qualquer determinado período, as células influenciam ambos C4d e Ig (Figura 2C, painel a), C4d sozinho (Figura 2C, painel c), ou Ig sozinho (Figura 2C, painel e), poderia ser detectado em pacientes SLE diferentes. A presença concomitante ou individual de C4d e Ig sobre as células T em pacientes diferentes e em subconjuntos de célula T nos mesmos pacientes foram observados. Em alguns casos, as subpopulações distintas das células T influenciam níveis diferentes de Ig e C4d poderia ser detectada simultaneamente dentro do mesmo paciente (Figura 2C, painéis b e d). Esta última descoberta sugeriu que estas subpopulações podem representar as células na transição de um estágio para o próximo em um processo de ligação dinâmico Ig/C4d.
[0056] Um grupo selecionado de pacientes SLE foi seguido e a presença de C4d e Ig sobre suas células T foi examinada periodicamente sobre o tempo variando de 9 a 33 meses. Como mostrado na figura 3A, entre os pacientes individuais, ambos os níveis de T-C4d e T-Ig, bem como as frequências e proporções de células influenciando C4d e/ou Ig variando consideravelmente sobre o tempo. Em alguns pacientes, T-C4d e níveis T-Ig foram fortemente correlacionados através de todos as visitas de estudos (por exemplo, paciente #SLE 102763, R2 = 0,7063; paciente #SLE 101592, R2 = ,9551). Entretanto, em alguns pacientes, uma correlação geral entre T-C4d e níveis T-Ig foi limitada a um subconjunto de visitas de estudo (por exemplo, visitas 1, 3, e 5 do paciente $ SEL102326). Estes resultados sugerem ainda um processo de ligação dinâmico Ig/Cd4 que pode variar entre pacientes individuais.
[0057] Além disso, foi observado que a presença de Ig ligada a superfície sobre um subconjunto específico de células T correlacionada com níveis aumentados de C4d sobre aquela subpopulação de célula T particular. Por exemplo, níveis seletivamente maiores de T-C4d sobre as células TC4 corresponderam com níveis aumentados T-Ig seletivamente sobre as células TCD4 em um paciente determinado (Figura 3B, painéis a e b), e vice-versa (Figura3B, painéis c e d). Observar que quando níveis maiores de Ig forem detectados sobre as células TCD4 em relação às células TCD8 em alguns pacientes (painel a), níveis maiores de C4d foram também detectados sobre as células TCD4 ao invés de células TCD8 (painel b). As correlações similares entre níveis aumentados de C4d (painel c) e níveis Ig (painel d) foram observados para as células TCD8. Estas observações sugeriram uma ligação causal entre a ligação de Ig e a deposição de C4d sobre as células T em pacientes SLE, mais igualmente através da ativação quase igual da rota do complemento clássico.
Exemplo 4 - fenótipo T-C4d pode ser transferido pelo plasma a partir dos pacientes SLE:
[0058] Devido a Ig e C4d serem simultaneamente detectadas sobre a superfície das células T circulantes de alguns pacientes SLE, um modelo foi hipotetizado no qual a ligação dos auto-anticorpos anti-T específicos pode ativar o sistema complemento e gerar C4d que deposita sobre a superfície destas células. Portanto, foi investigado se o plasma dos pacientes SLE pode ligar e “transferir” o fenótipo T-C4d para células T normais IN VITRO. As amostras de plasma diferentes derivadas a partir do estudo de corte dos pacientes SLE, pacientes com outras doenças, e controles saudáveis foram testados contra as células T isoladas tanto de indivíduos saudáveis quanto pacientes SLE que tiveram níveis negligentes de T-C4d. As células T dentro da população de célula tratada foram analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado representativamente na figura 4, as células T normais que foram negativas T-C4d (painel A) adquiriram níveis significantes de C4d sobre sua superfície após serem tratadas com o plasma preparado a partir do doador dos pacientes SLE que foram conhecidos por ter elevado T-C4d e níveis T-Ig (painéis B1 e C1). O padrão de T-C4d gerado sobre as células do receptor saudável foram notavelmente similares aqueles presentes sobre as células do doador com lúpus em cada experimento. Em contrapartida, o plasma de um controle saudável não foi capaz de gerar a deposição C4d sobre as células T normais (painel D1). Notar que os níveis altos de C4d depositados sobre a superfície celular após o tratamento com plasma T-C4d+SLE e Ig, mas não o plasma do controle saudável e Ig. Os resultados mostraram consistentemente que apenas o plasma dos pacientes SLE doadores que apresentaram o fenótipo elevado T-Ig/T-C4d, mas não o plasma dos pacientes SLE que apresentaram fenótipo baixo de T-Ig/t-C4d ou o plasma dos controles saudáveis, pode transferir o fenótipo T-C4d sobre as células T normais. A transferência do fenótipo TC4d com o plasma de pacientes com lúpus não conduz a produção de C5b-9 ou a uma diminuição significante em número de células (dados não mostrados).
Exemplo 5 - Fenótipo T-C4d pode ser transferido por imunoglobulina de pacientes SLE:
[0059] O experimento de transferência de fenótipo foi realizado usando Ig purificada a partir do plasma de pacientes SLE. Os resultados demonstraram que Ig purificada a partir do plasma de pacientes SLE com altos níveis T-C4d foram capazes de transferir o fenótipo T-C4d pra células normais T IN VITRO (figura 4, painéis B2 e C2; conforme figura 4A). Ig purificada tanto a partir de controles saudáveis (Figura 4, painel D2), quanto de pacientes SLE com níveis negligentes de T-C4d (não mostrado) não poderiam transferir a assinatura T-C4d. As concentrações iguais de IgM, quando comparado com IgG foram mais efetivos na produção da assinatura T-C4d, suportando uma regra mecanicista da ativação da rota do complemento clássica (Figura 5 A), na qual a IgM é um ativador muito mais potente da rota do complemento clássica quando comparado a IgG e é, portanto, muito mais eficaz na produção de T-C4d sobre a superfície celular após a ligação. O esgotamento de Ig a partir do plasma do doador SLE aboliu completamente sua capacidade de induzir a ativação do complemento e a ligação C4d às células T IN VIVO (Figura 5B). Além disso, esta capacidade do plasma SLE foi significativamente diminuída se os fatores humorais reativos ao linfócito potencial foram removidos por pré- incubação do plasma com linfócitos (Figura 5B). A absorção com plaquetas humanas ou fibroblasto não teve efeito (não mostrado). Estes resultados suportam a hipótese que a assinatura T-C4d em pacientes com SLE são geradas por célula anti-T e pelos auto-anticorpos do subconjunto de célula T.
Exemplo 6 - Comparação entre SLE, outras doenças (OD) e controles saudáveis (HC):
[0060] Análises adicionais foram realizadas usando os dados do paciente como descrito abaixo (tabela 2). Os dados contínuos foram reportados como média + desvio padrão (SD) e a média e o intervalo interquartílico (IQR), estratificado por SLE, OD e HC. A análise da variante (ANOVA) foi utilizada para testar a diferença total entre os três grupos. Os testes post-hoc foram utilizados para prover a informação sobre a comparação em pares. A sensibilidade e a especificidade de biomarcadores CB-CAP foram determinadas em indivíduos SLE pelo uso de pacientes OD e HC, respectivamente. As curvas de operação receptora (ROCs) foram utilizadas quando apropriada para cada um dos marcadores e também para os subconjuntos. Tabela 2 Comparação do painel CB-CAP entre SLE, Outras Doenças (OD) e Controles saudáveis (HC) Tabela 3 Análise Anova e post-hoc de T-Ig e ensaio CB-CAP
[0061] A tabela 4 mostra a sensibilidade para SLE e a especificidade contra outras doenças (OD) ou controle saudável (HC) de acordo com a positividade T-IG e cada uma da positividade do biomarcador individual CB-CAP (positividade foi definida como acima do valor máximo em HC, assim a especificidade contra HC foi 100%). Tabela 4 Desempenho de diagnóstico de T-Ig e ensaio CB-CAP individual
[0062] Para encontrar os biomarcadores ou suas combinações que aumentam a sensibilidade, mas mantém a alta especificidade, a sensibilidade/especificidade em indivíduos negativos para T-Ig foi primeiro determinada com cada biomarcador CB-CAP individual. Foi descoberto que TC4d foi o melhor, aumentou completamente a sensibilidade para SLE de 33,2% (tabela 4) para 55,1% (Tabela 5). Tabela 5 A melhora do desempenho de diagnóstico entre os indivíduos T- Ig negativos através da adição do ensaio CB-CAP e desempenho total
[0063] Sequencialmente, o próximo melhor biomarcador entre os indivíduos com ambos, T-Ig negativo e TC4d foi identificado. Como mostrado na Tabela 6, foi descoberto que a combinação T-Ig e TC4d aumentaria totalmente a sensibilidade de 33,2% para 55,1%, enquanto mantém próximo da especificidade perfeita contra outras doenças e os controles saudáveis, 90,8% e 100%, respectivamente. A adição B-C4d para TC4d poderia ainda aumentar a sensibilidade para SLE para 61,1%, entretanto a especificidade total contra OD diminuiu para 85,6%. Tabela 6 Melhora do desempenho de diagnóstico através da adição etapa por etapa de múltiplos ensaios CB-CAP + indica sequencialmente a adição de cima par abaixo da coluna. Por exemplo, +TC4d significa a combinação de T-Ig e TC4d.
[0064] Os dados foram plotados usando as curvas (ROC) características de operação do receptor, as quais são gráficos que ilustram o desempenho de um sistema classificatório binário quando sua discriminação limite é variada. Estas análises demonstram que o valor adicionado de T-Ig combinado com o ensaio CB-CAP como ferramenta de diagnóstico.
[0065] A figura 6A mostra a comparação ROC na discriminação de SLE e controles saudáveis, com todos os biomarcadores. A análise ROC comparando SLE e controles saudáveis revelou que BC4d (AUC = 0,853) e TC4d (AUC = 0,840) foram os melhores previsões seguidos por RC4d (AUC = 0,80) e EC4d (AUC = 0,80). Isto foi consistente com os resultados mostrados acima na tabela 5.
[0066] A figura 6B mostra a comparação ROC na discriminação de SLE e controles saudáveis, com um subconjunto de biomarcadores CB-CAP (TC4d, EC4d, RC4d e BC4d).
[0067] A figura 7A mostra a comparação ROC na discriminação SLE e outras doenças.
[0068] A análise ROC comparando SLE e outras doenças revelou que BC4d (AUC = 0,755) e TC4d (AUC=0,750 foram as melhores previsões. Comparado ao T-Ig apenas (0,76) o ROC total aumentou de 0,76 para 0,80, e esta diferença aborda uma significância estatística (p=0,07).
[0069] A figura 7B mostra a comparação ROC na discriminação SLE e outras doenças, com um subconjunto de biomarcadores CB- CAP (TC4d, EC4d, RC4d e BC4d).
[0070] As características e funções descritas acima, bem como alternativas, podem ser combinadas dentro de muitos outros sistemas diferentes ou aplicações. Várias alternativas atualmente imprevisíveis ou não antecipadas, modificações, variações ou aperfeiçoamentos podem ser feitos pelos técnicos no assunto, cada uma das quais também se pretende abranger pelas concretizações descritas.
[0071] Quando características ou aspectos da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outros agrupamentos alternativos, os técnicos no assunto irão reconhecer que a invenção também é, assim, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush ou outros grupos.
[0072] A menos que indicado ao contrário, todas as faixas numéricas descritas aqui incluem todas as combinações e sub- combinações de faixas e números inteiros abrangidos aqui. Tais faixas também estão dentro proteção da invenção aqui descrita.
[0073] Todas as referências citadas aqui são por referência em sua íntegra.

Claims (22)

1. Método para diagnosticar especificamente lúpus sistêmico eritematoso em um indivíduo, distinto de uma doença ou condição inflamatória de lúpus não-sistêmico eritematoso, dito método sendo caracterizado pelo fato de compreender: - obter uma amostra de sangue a partir de um indivíduo; - incubar a amostra de sangue IN VITRO, sendo que a incubação resulta em auto-anticorpos na amostra estando em associação estável com uma superfície de um linfócito T na amostra, sendo que C4d está ligada à superfície do linfócito T; - quantificar, um nível de auto-anticorpos do indivíduo depositados sobre ou contatando com uma superfície de um linfócito TC4d na amostra; - comparar o nível de auto-anticorpos na amostra de sangue do indivíduo com um nível de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito T controle; - quantificar um nível de um biomarcador do lúpus eritematoso sistêmico depositado sobre ou em contato com uma superfície de um linfócito T na amostra, sendo que o biomarcador de diagnóstico é C4d; e - comparar o nível de biomarcador de diagnóstico TC4d na amostra de sangue do indivíduo com o nível do biomarcador de diagnóstico depositado sobre ou em contato com uma superfície de um linfócito T controle; sendo que um nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e um nível aumentado do biomarcador de diagnóstico TC4d na amostra de sangue de um indivíduo quando comparado aos níveis para o linfócito T controle identifica o lúpus eritematoso sistêmico no indivíduo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o nível dos auto-anticorpos do indivíduo depositado sobre ou contatando com a superfície do linfócito T ser medido a partir de uma população de células mononucleares do sangue periférico obtida da amostra de sangue.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o linfócito T ser representado na amostra por pelo menos um tipo de célula de linfócito T selecionado a partir do grupo consistindo de uma célula linfócito CD4+ Th1, uma célula de linfócito CD4+ Th2 e uma célula de linfócito citotóxico CD8+.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o linfócito T ser uma célula de linfócito CD4+ Th1.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o linfócito T ser uma célula de linfócito CD4+ Th2.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o linfócito T ser uma célula de linfócito citotóxico CD8+.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender: - obter uma amostra de sangue contendo células brancas do sangue a partir de um indivíduo; - incubar a amostra de sangue IN VITRO, sendo que a incubação resulta em auto-anticorpos na amostra estando em associação estável com uma superfície de um linfócito T na amostra, sendo que C4d está ligado à superfície do linfócito T; - isolar uma população de célula mononuclear da amostra de sangue; - incubar a população de célula mononuclear do sangue periférico com um reagente detectável que se liga especificamente a um auto-anticorpo ligado à superfície celular de um linfócito TC4d dentro da população de célula mononuclear do sangue periférico, formando um complexo reagente detectável linfócito T-auto-anticorpo; e - medir o nível do complexo reagente detectável linfócito T- auto-anticorpo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o complexo de reagente detectável-linfócito T- auto-anticorpo ser medido através de citometria de fluxo.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - comparar o nível do complexo de reagente detectável-célula T-auto-anticorpo obtido a partir do indivíduo com um nível de um tipo de complexo de reagente detectável-linfócito T-auto- anticorpo obtido a partir de uma amostra de sangue controle; sendo que um aumento no nível de um complexo de reagente detectável-linfócito T - auto-anticorpos medido a partir da amostra de sangue do indivíduo, quando comparado ao controle da amostra de sangue, e um nível aumentado de TC4d na amostra, quando comparado com a amostra de sangue controle, identifica o lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de o reagente detectável ser um anticorpo Ig anti- humano marcado com fluorescência que é detectável através da citometria de fluxo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o anticorpo Ig anti-humano marcado fluorescentemente ser selecionado do grupo consistindo de um anticorpo IgG anti-humano marcado fluorescentemente e um anticorpo IgM anti-humano marcado fluorescentemente.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar um nível de C4d ligado aos linfócitos B (BC4d); e - comparar o nível de BC4d na amostra de sangue de um indivíduo com um nível de BC4d em uma amostra de sangue de um controle saudável; sendo que o nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e um nível aumentado de TC4d na amostra de sangue de um indivíduo, quando comparado com os níveis para o linfócito T controle, combinado com um nível aumentado de BC4d na amostra do indivíduo, quando comparado à amostra controle, identifica o lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a sensibilidade do método para lúpus sistêmico eritematoso ser de pelo menos 61,1% e a especificidade contra outras doenças ser de pelo menos 86,4%.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar o nível de C4d ligado aos reticulócitos (RC4d);e - comparar o nível de RC4d na amostra de sangue de um indivíduo com um nível de RC4d em uma amostra de sangue de um controle saudável; sendo que o nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e um nível aumentado de TC4d na amostra de sangue de um indivíduo, quando comparado aos níveis para o linfócito T controle, combinado com um nível aumentado de BC4d e RC4d na amostra do indivíduo, quando comparado à amostra controle, identificar o lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a sensibilidade do método para lúpus sistêmico eritematoso ser de pelo menos 67,7% e a especificidade contra outras doenças ser de pelo menos 80,2%.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar o nível de C4d ligado ao eritrócito (EC4d);e - comparar o nível de EC4d na amostra de sangue de um indivíduo com um nível de EC4d em uma amostra de sangue de um controle saudável; sendo que o nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e um nível aumentado de TC4d na amostra de sangue de um indivíduo, quando comparado aos níveis para o linfócito T controle, combinado com níveis aumentados de BC4d, RC4d e EC4d na amostra do indivíduo, quando comparado à amostra controle, identificar o lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a sensibilidade do método para lúpus sistêmico eritematoso ser de pelo menos 68,4% e a especificidade contra outras doenças ser de pelo menos 79,1%.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a sensibilidade do método para lúpus sistêmico eritematoso ser de pelo menos 55,1% e a especificidade contra outras doenças ser de pelo menos 90,8%.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o linfócito T controle ser um linfócito T isolado de uma amostra de sangue obtida a partir do mesmo indivíduo em um período anterior; e o nível aumentado dos auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e um nível aumentado de TC4d na amostra, quando comparado à amostra controle obtida do mesmo individuo em um período anterior também indicar um nível aumentado da atividade da doença de lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar o nível de BC4d; e - comparar o nível de BC4d na amostra de sangue de um indivíduo com um nível de BC4d em uma amostra de sangue obtida de um indivíduo em um período anterior; e sendo ainda que o nível aumentado de auto-anticorpos depositado sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e o nível aumentado de TC4d na amostra de sangue, quando comparado à amostra controle obtida do mesmo indivíduo no período anterior, combinado com um nível aumentado de BC4d na amostra, quando comparado à amostra controle obtida a partir do mesmo indivíduo em um período anterior, identificar o nível aumentado da atividade da doença de lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar o nível de RC4d; e - comparar o nível de RC4d na amostra de sangue de um indivíduo com um nível de RC4d em uma amostra de sangue obtida de um indivíduo em um período anterior; sendo ainda que o nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e o nível aumentado de TC4d na amostra, quando comparado à amostra controle obtida do mesmo indivíduo em um período anterior, combinado com níveis para BC4d e RC4d na amostra, quando comparada a amostra obtida do mesmo indivíduo em um período anterior, identificar o nível aumentado da atividade da doença de lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente: - avaliar o nível de cada um de EC4d, RC4d e BC4d; e - comparar o nível para cada um de EC4d, RC4d e BC4d na amostra de sangue obtida do indivíduo com um nível para cada um de EC4d, RC4d e BC4d em uma amostra de sangue obtida do mesmo indivíduo em um período anterior; sendo ainda que o nível aumentado de auto-anticorpos depositados sobre ou em contato com a superfície de um linfócito TC4d e o nível aumentado de TC4d na amostra, quando comparado à amostra obtida do mesmo indivíduo em um período anterior, combinado com um nível aumentado para cada um de EC4d, RC4d e BC4d na amostra, quando comparado à amostra obtida a partir do mesmo indivíduo em um período anterior, identificar o nível aumentado da atividade da doença de lúpus sistêmico eritematoso no indivíduo.
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