RU2386609C2 - Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием - Google Patents
Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием Download PDFInfo
- Publication number
- RU2386609C2 RU2386609C2 RU2008101555/13A RU2008101555A RU2386609C2 RU 2386609 C2 RU2386609 C2 RU 2386609C2 RU 2008101555/13 A RU2008101555/13 A RU 2008101555/13A RU 2008101555 A RU2008101555 A RU 2008101555A RU 2386609 C2 RU2386609 C2 RU 2386609C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- rheumatoid arthritis
- peptides
- diagnosing rheumatoid
- diagnosing
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами, используемым для диагностики ревматоидного артрита. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина и имеющие аминокислотные последовательности, представленные в формуле изобретения. Изобретение раскрывает способ диагностики ревматоидного артрита путем выявления аутоиммунных антител с использованием указанного пептида(ов) путем взаимодействия последнего(их) с сывороткой крови пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Присутствие аутоиммунных антител в исследуемом образце диагносцируют по наличию сформированных комплексов пептида с антителом. Пептид по изобретению обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина. Изобретение относится также к способу детекции аутоиммунных антител при ревматоидном артрите путем взаимодействия с аутоиммунными антителами от пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее распространенных заболеваний человека. Этим заболеванием по данным ВОЗ страдает 1-2% населения Земли. В России официально зарегистрировано более 1 млн больных РА. РА характеризуется хроническим воспалением суставов. Это приводит к страданиям, ухудшению качества жизни, снижению и потере трудоспособности.
Развитие РА характеризуется чрезвычайным многообразием клинических проявлений и биохимических нарушений. Это существенно затрудняет раннюю диагностику, а следовательно, проведение адекватной терапии, которая особенно эффективна в дебюте болезни. Современная диагностика РА основана на клинических проявлениях заболевания в сочетании с лабораторным определением в крови пациента так называемого ревматоидного фактора (РФ). Однако РФ не является достаточно специфичным маркером. Двумя другими серологическими маркерами РА являются антиперинуклеарный фактор (АПФ) и антикератиновые антитела (АКА), распознающие антигенные детерминанты цитруллинсодержащего белка филаггрина. Несмотря на высокую специфичность АПФ и АКА для диагностики РА эти аутоантитела не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей. В последние годы был разработан иммуноферментный (ИФА) метод определения антител к филаггрину (АФ), который обладает высокой специфичностью. АФ обнаруживаются в крови еще до появления клинических признаков РА, что демонстрирует важную роль этих антител в патогенезе этого заболевания и возможность проводить раннюю диагностику по этому показателю. Основой этой методики является антигенный комплекс в виде полипептидов (участков молекулы филаггрина) или сам белок (рекомбинантный).
Из предшествующего уровня техники известны пептиды, которые используются в способе диагностики ревматоидного артрита и описаны US 2004241767, US 2004253644, US 6890720, US 7288634, US 6858438.
Изобретение посвящено созданию нового антигенного комплекса, обладающего большей специфичностью и чувствительностью.
Исходя из теории гетерогенности популяции АФ, отражающей природную вариабельность антигенов, на которые они вырабатываются (наличие АПФ, АКА, АФ), и полиморфизма молекулы филаггрина можно предположить, что существует несколько цитрулинизированных структурных участков этой молекулы, обладающих антигенными свойствами. Компьютерный анализ молекулы подтвердил это.
На основе предсказательного анализа антигенных эпитопов твердофазным методом с использованием f-moc техники было синтезировано четыре пептида, воспроизводящих фрагменты молекулы белка филаггрина: Ф-1, Ф-2, Ф-3, Ф-4.
ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ - Ф-1,
CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ - Ф-2,
QSHQESAXGXSGETSGHSGS - Ф-3,
CSHQESAXGXSGETSCHSGS - Ф-4,
где Х - Cit,
которые иммунологически реактивны в иммунологическом исследовании, направленном на выявление РА, и могут применяться в способе диагностики РА, включающей в себя детекцию аутоиммунных антител в сыворотке пациента, путем взаимодействия, по крайней мере, одного из вышеуказанных пептидов с сывороткой пациента и детекции наличия сформированных комплексов между упомянутым пептидом и антителом.
Все препараты пептидов соответствовали 95% чистоте по данным ВЭЖХ и масс-спектроскопии и содержали 20 амикислот с заменой двух остатков Arg на Cit.
ИФА-методика измерения антигенной активности пептидов по отношению к АФ.
1. Иммобилизация ИФА-планшет.
На полистироловые планшеты (Costar США) наносили растворы пептидов в 0,01 М карбонатно-фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 1 мкг/100 мкл. В каждую лунку планшета вносили 100 мкл раствора. Сорбцию пептида проводили при 2-4°С в течение 16 часов.
По окончании сорбции раствор пептида стряхивали и в каждую лунку вносили 2% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США). Инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.
2. Проведение анализа и детекция иммунных комплексов (антиген-антитело).
Исследуемые пробы разводили в 100 раз раствором 2% БСА и полученный раствор вносили в лунки по 100 мкл. Инкубировали 1,5 часа при 37°С. По окончании инкубации планшет промывали трехкратно фосфатно-солевым раствором с 0,05% твин-20 (ФСР) по 250 мкл в лунку. Затем для образования специфических иммунных комплексов в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (1:1000) конъюгата IgG антител кролика к IgG человека с пероксидазой хрена или конъюгат белка А с пероксидазой хрена в 2% БСА и инкубировали 1 час при 37°С. После инкубации раствор стряхивали и планшет промывали трижды раствором ФСР. Для осуществления детекции иммунных комплексов в каждую лунку вносили 100 мкл раствора ТМБ с гидроперитом и инкубировали в темноте при комнатной температуре 5-15 мин до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 50% соляной кислоты. Интенсивность окраски измеряли на фотометре вертикального сканирования при 450 нм. Положительными считали сыворотки, у которых величина оптической плотности (ОП) превышала значение 0,2.
При испытании иммунохимических свойств пептидов Ф-3 и Ф-4 выявили их высокую чувствительность по отношению АФ (таблицы 2, 3).
Таблица 2 | |||
Выявление антител к филаггрину (пептид Ф-3, Ф-4) в сыворотках больных РА | |||
Общее количество | Выявлено больных с AT к Ф-3 | Выявлено больных с AT к Ф-4 | |
Больные РА | 78 | 66 | 73 |
Чувствительность | 85% | 93,6% |
При сравнении иммунохимических свойств Ф-3 и Ф-4 между собой и со свойствами уже известного активного циклического пептида ЦЦП (HQCHQESTXGRSRCGRSGS, где X-Cit) оказалось, что есть пациенты, у которых АФ определяются одним из этих пептидов, а другим нет. Наибольшей чувствительностью обладает Ф-4 (Таблица 3, чертеж). На основе этих данных создается антигенный комплекс для выявления АФ из смеси пептидов (Ф-3; Ф-4).
Таблица 3 | |||||
Данные измерения оптической плотности образцов сыворотки доноров и больных РА | |||||
Пациенты | ЦЦП(ОП450 нм) | Ф-3(ОП450 нм) | Ф-4 (ОП450) | ||
1 | 0,147 | 0,239 | 0,329 | 0,333 | 0,791 |
2 | 2,136 | 0,241 | 0,525 | 0,309 | 0,329 |
3 | 0,222 | 0,258 | 0,61 | 0,349 | 0,525 |
4 | 0,28 | 0,242 | 0,276 | 0,271 | 0,61 |
5 | 0,463 | 0,197 | 0,295 | 0,264 | 0,276 |
6 | 0,401 | 0,217 | 0,588 | 0,187 | 0,295 |
7 | 0,743 | 0,339 | 0,56 | 0,283 | 0,588 |
8 | 0,224 | 0,27 | 0,342 | 0,411 | 0,56 |
9 | 0,206 | 0,251 | 0,393 | 0,32 | 0,342 |
10 | 0,972 | 0,223 | 0,469 | 0,274 | 0,393 |
11 | 0,209 | 0,21 | 0,861 | 0,193 | 0,469 |
12 | 0,263 | 0,229 | 0,641 | 0,249 | 0,861 |
13 | 0,364 | 0,232 | 0,291 | 0,233 | 0,641 |
14 | 0,395 | 0,215 | 0,101 | 0,243 | 0,291 |
15 | 0,476 | 0,245 | 0,279 | 0,209 | 0,101 |
16 | 0,331 | 0,3 | 0,243 | 0,403 | 0,279 |
17 | 0,16 | 0,263 | 0,31 | 0,259 | 0,243 |
18 | 0,304 | 0,21 | 0,347 | 0,243 | 0,31 |
19 | 0,195 | 0,215 | 0,437 | 0,266 | 0,347 |
20 | 0,192 | 0,191 | 0,711 | 0,188 | 0,437 |
21 | 0,274 | 0,203 | 0,172 | 0,175 | 0,711 |
22 | 0,626 | 0,255 | 0,273 | 0,202 | 0,172 |
23 | 0,294 | 0,184 | 0,323 | 0,198 | 0,273 |
24 | 0,184 | 0,221 | 0,276 | 0,218 | 0,323 |
25 | 0,272 | 0,31 | 0,465 | 0,184 | 0,276 |
26 | 0,2 | 0,234 | 0,472 | 0,334 | 0,465 |
27 | 0,166 | 0,217 | 0,421 | 0,212 | 0,472 |
28 | 0,158 | 0,18 | 0,516 | 0,316 | 0,421 |
29 | 0,223 | 0,236 | 0,255 | 0,249 | 0,516 |
30 | 0,253 | 0,161 | 0,213 | 0,197 | 0,255 |
31 | 0,357 | 0,229 | 0,306 | 0,23 | 0,213 |
32 | 0,154 | 1,548 | 0,251 | 0,204 | 0,306 |
33 | 1,024 | 1,334 | 0,441 | 0,177 | 0,251 |
34 | 0,17 | 0,221 | 0,849 | 0,366 | 0,441 |
Д1 | 0,117 | 0,168 | 0,123 | 0,135 | 0,08 |
Д2 | 0,122 | 0,135 | 0,118 | 0,165 | 0,216 |
Д3 | 0,084 | 0,139 | 0,174 | 0,173 | 0,219 |
Д4 | 0,105 | 0,093 | 0,105 | 0,131 | - |
Д5 | 0,145 | 0,114 | 0,115 | 0,083 | - |
Д6 | 0,115 | 0,099 | 0,102 | 0,114 | - |
Д7 | 0,103 | 0,117 | 0,109 | 0,091 | - |
Д8 | 0,104 | 0,112 | 0,116 | 0,119 | - |
Примечание: в графе «пациенты» индексом «Д» помечены сыворотки доноров. |
Claims (4)
1. Пептид, имеющий аминокислотную последовательность и структуру, выбранную из:
ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ,
CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ,
QSHQESAXGXSGETSGHSGS,
CSHQESAXGXSGETSCHSGS,
где Х - Cit, предназначенный для диагностики ревматоидного артрита.
ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ,
CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ,
QSHQESAXGXSGETSGHSGS,
CSHQESAXGXSGETSCHSGS,
где Х - Cit, предназначенный для диагностики ревматоидного артрита.
2. Пептид по п.1, иммунологически реактивный в иммунологическом исследовании, направленном на выявление ревматоидного артрита.
3. Способ диагностики ревматоидного артрита, включающий взаимодействие по меньшей мере одного из пептидов по п.1 или смеси пептидов, представленных в п.1, с сывороткой (плазмой) крови больного и диагностирование ревматоидного артрита по наличию сформированных комплексов между пептидом и антителом.
4. Способ по п.3, в котором детектирование включает использование иммуноферментного анализа (ИФА).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008101555/13A RU2386609C2 (ru) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008101555/13A RU2386609C2 (ru) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008101555A RU2008101555A (ru) | 2009-07-27 |
RU2386609C2 true RU2386609C2 (ru) | 2010-04-20 |
Family
ID=41047869
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008101555/13A RU2386609C2 (ru) | 2008-01-22 | 2008-01-22 | Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2386609C2 (ru) |
-
2008
- 2008-01-22 RU RU2008101555/13A patent/RU2386609C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008101555A (ru) | 2009-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5711449B2 (ja) | 膵島細胞抗原分子及び又はインスリンに反応する自己抗体の検出 | |
CN113024640B (zh) | 基于新冠病毒rbd与ace2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒 | |
US10234453B2 (en) | Method for increasing specificity of diagnostic tests for autoimmune diseases | |
JPWO2020141608A1 (ja) | 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法 | |
CN108948153B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用 | |
JP2014516155A (ja) | 早期関節リウマチの診断のための方法 | |
US20140106381A1 (en) | Method for the diagnosis of rheumatoid arthritis | |
WO2013103628A1 (en) | Peptides and methods for detecting mpo-anca | |
RU2386609C2 (ru) | Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием | |
WO2019081692A1 (en) | METHOD AND MEANS FOR DIAGNOSING AUTOIMMUNE HEPATITIS USING SELF-ANTIBODY MARKERS | |
CN108948174B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
CN108948173B (zh) | 一种瓜氨酸修饰肽及其应用 | |
KR20210011273A (ko) | 지카 바이러스 외피 단백질 도메인 ⅲ에 대해 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
US9915662B2 (en) | Protein microarray for characterizing the specificity of the monoclonal immunoglobulins of MGUS or myeloma patients | |
EP4237853A1 (en) | Proteins for the detection of schistosoma infection | |
BR102020019899B1 (pt) | Antígeno peptídeo sintético p.mt.pd.7 para diagnóstico da tuberculose e seu uso, composição imunogênica e método para imunodiagnóstico da tuberculose | |
KR20200093198A (ko) | 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법 | |
KR20200091658A (ko) | 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법 | |
JP2012526088A (ja) | 自己免疫疾患を検出するためのバイオマーカー抗体と診断装置 | |
JP2010285416A (ja) | Adm抗体エピトープペプチドおよびその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100123 |