PL162445B1 - Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania autoprzeciwciał tyreoglobuliny w surowicy krwi - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania autoprzeciwciał tyreoglobuliny w surowicy krwi, znamienny tym, że nośnik polistyrenowy otrzymuje się na drodze wodnoemulsyjnej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu i kwasu di-p-toluilo-karbinolo-orto- fenylenokarboksylowego, a następnie produkt poddaje się dodatkowemu naświetlaniu promieniami gamma do całkowitej konwersji monomeru na polimer, po czym do zawiesiny wodnej tak otrzymanego nośnika wprowadza się albuminę ludzką w ilości 1-10 mg/ml w środowisku buforowego roztworu fosforanowego o pH 7,4, po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glutarowego i wprowadza ludzką tyreoglobulinę w ilości 0,2-10 mg/ml, po czym przemywa się buforem glicynowym i ewentualnie konserwuje.

Description

Przedmiotem ^nalazku jest sposób otrzymywała preparatu diagnostycznego do wykrywania w surowicy krwi autoprzeciwciał ty^ogi^m!^ /ATG/, których obecność świadczy o występowaniu procesu patologicznego związanego z autniimιmolngicznym schorzeniem tarczycy.

W medycynie klinicznej mają obecnie duże znaczenie testy aglutynacyjne polegające na wykorzystaniu zjawiska aglutynacji, czyli zlepiania się cząstek lateksu wskutek reakcji zachodzących pomiędzy składnikami preparatu diagnostycznego i surowicy krwi chorego człowieka. Zjawisko

J;i Jest obserwowane wizualnie Jako ^trącanie się kłaczkowatego osadu z emlssi.

Do otrzymywane preparatów diagnostycznych, między innymi do wikrywnia czynnika reumatologic;nrgn, ciąży, niektórych infekcji, wykorzystuje się mikrosfery polistyrenowe Jako nośniki białka uczestniczącego w reakcji antygen-przeciwciało. Mikrosfery polistyrenowr stanowi polistyren w postaci bardzo drobnego ziarna o kształcie kulistym.

Z opisu patentowego USA nr 3653982 znany Jest preparat zawierający mikrosfery polistyrenowe o wielkości ziarna 0,15/^ na powierzchni toóry^ ⁱmmobilizowana Jest Y^- globulina w lodowisku buforu instmowegn o pH 8,6. W opisie patenoowyu USA nr 3781414 opisano preparat zawierający na nośniku pnlyttyreny^tm o wielkości ziarna 0,15,- 0,25uum Sunonilizowaną orgoteinę wobec buforu glJtynowegn o pH 8,2. Z Japońskiego opisu patentowego JG 0036-966 A znane Jest zastosowanie lateksu polistsrenowegn lub polibutadrenowrgn o wielkości ziarna 0,01 - 1 /um 1 posiadającego na powierzchni grupy funkcyjne do unieruchomienia na cząsteczkach nośnika i.mmmnonlsnilint G za pomocą wiązań kowalencyjnych lub adeGo-peci fizycznej. Według patentu Japońskiego 5 9192-962 A w preparatach diagnostycznych Jako mikrosfery polimerowe stosuje się lateks pnlistyrenowy, kopolimer styrenowo-butadienowy, przy czym Jako stabilizator środka diagnostycznego stosuje się gaIM]iakonidtnę. Preparat Jest przeznaczony do oznaczania fetoproteiny, ^^r^€^£^)tyywm^ego białka, fbbrynogenu, czynnika reumatoidalnego. W patencie holenderskim nr 7508139 opisano sposób obróbki nośników polistsrenowyJh o wielkości ziarna 0,8yum okstetyeenowtmym, nie^now^ym środkiem powwerzchnlowo-czynnym. Reakcja aglutynacji mikrosfer poli3trrenyytych nie zachodzi w rozcieńczonych roztworach surowicy krwi. Z Japońskiego patentu nr 8034361 znany Jest preparat, który zawiera nośnik otrymany z monomerów winylowych, zawierający na powierzchni n^^nowe środki po^^w^r^iz^^J.owo-czynne. W charakterze reagenta i.mimnonogicznrgo zastosowano mieszaninę poiaadenozyny i dwifosfo ranu rybozy. Nanoszenie białka przeprowadzono w obecności metylowanej albuminy surowicy krwi bydlę cej.

162 445

Zastosowanie nośników poimnycznych do wytwarzania tego rodzaju preparatów Jest niemożliwe bez dokładnego sprawdzenia i określenia wymagań Jakie muszą odpowiadać stosowane środki.

Zatem cząstki powinny charakteryzować się określoną wielkością ziarna, odpowiednią dla danego obszaru zastosowań Jednorotdrością, dulą trwałością podczas przechowywania, a takle wykazywać odporność na działanie elektrollóów w określonym obszarze pH oraz oddziaływań ładunków elektrycznych środowiska na granicy faz. Cząstki nośnika powinny rówiiel posiadać specyficzną powierzchnię tj. zawierać na powierzchni grupy funkcyjne.

Nieoczekiwanie okazało się, le można otrzymać bardzo stabilny diagnostyczny aparat do oznaczania autoprzeclwciał tyreoglobuLiny, Jeżeli Jako nośnik mikrosferoidalny zastosuje się nośnik polisyyreoowy otrzymany na drodze emmlsyjnej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu, Jako inicjatora polimeryzacJi i estru alkanolu i kwasu di-p-toluiśokaΓberś)lo-OΓto-eenylenokarboksylowego Jako emulatora, a następnie poddany dodatkowemu naświetlaniu promieniami gamma dla uzyskania całkow^ej konwe^J! monomeru na polimer. Do zawiesiny wodnej tak otrzmanego nośnika, korzystnie o stę^niu 1o% wprowadza się albuminę ludzką w ilości 1 - 1o mg/m, za pomocą buforowego roztworu fosformowego o pH 7,4. Po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glutaoowego i wprowadza ludzką tyreoglobuLinę w ilości 0,2 - 1o mg/m, po czym przemywa się buforem gi-cenowym o pH 8,2 i ^eunu^Hie konserwuje się^korzystnie roztworem azydku sodowego. Jako bufor fosfoaanowy korzystnie Je6t stosować PBS, który zawiera w 1 lirzze roztworu wodnego 8 g NatC, 0,2 g KHjPO^, 0,2g KC i 1J5 g Na2HP0₄.

Otrzymany sposobem według wynalazku preparat charakteryzuje się wysoką specyficznością, dzięki wykorzystaniu polimerowych cząstek o marach ziaren zawartych w ^skim zakresie 0,3 - 0,9um.

Odznacza się ponadto dużą stabilnością oraz pozwala na przeprowadzenie w sposób szybki określenia autoprzeciwciał tyΓeśglśb^l.iee w surowicy krwi. Jest to mmtoda szybka 1 bardzo wygodna w stosunku do dotychczas stosowanej skommPikoeanej metody imeuneohenelzre^ j ^śmigającej wielu odczynników i stosowania specjalnych urządzeń. W tym celu miesza się otrzymany preparat z taką samą ilością pełnej surowicy krwi pacjenta: po 3 - 4 minutach stwierdza się obecność, względnie brak aglutynacji.

Przykład I. W przykładzie ulyto 10% zawiesinę wodną nośnika pśllseyreśowego otrzymanego na drodze e3dneśrelsJenej polimeryzacji styrenu w obecności nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu i kwasu d'Wil---ollilo-kaΓbenoO-oyrtfeeenreeno-kaΓśoJelśewego jako emuugatora, a tak otrzyman^y produkt poddano nastanie w czasie ¹7 ^godzin naświetlaniu promieniami ~o moc^{y 1} M-ad/h.

pm pow/ższej zawiesiny przemyto trzykrotnie 50 pl wody destylowanej i wprowadzono do roztworu wodnego buforowego PBS (pH 7,4) zawierającego 8 g NaC,, KCL, 0,2g Kb^PO^ i 1.15 g NajHPO^. Ilość zawiesiny nośnika w roztworze buforowym doprowadzono do 25,0 pl. Do otrzymanej zawiesiny wprowadzono 100/ug albuminy ludzkiej w roztworze P3S w ilości 25 pl.Po 45 minutach przemywano trzykrotnie 500 pl PBS doprowadzając do objętości 50 pl. Następnie dodano 1,0 pl 25% roztworu aldehydu glutarowego. Po godzinie trzykrotnie przemyto 500 pl PBS doprowadzając ilość zawiesiny do 25,0 pl. Następnie wprowadzono w roztworze 25 pl PBS zawierającego 25 /lg teΓeoglobuliee. Po godzinie zawiesinę przemyto trzykrotnie 500 pl buforowego roztworu alieen^wraś o pH 8,2 doprowadzając ilość do 50 /ii z dodatkiem 5 ^pl 0,5% roztworu az^^ sodowego. ft-epea-at ^przechow^ano w temperaturze +⁴C^C. roztworze 25 ul PBS zawierającego 25 /ug tereoglśbtUίine. Po godzinie zawiesinę przemyto trzykrotnie 500 ul buforowego roztworu glieenowrgś o pH 8,2 doprowadzając ilość do 50Al z dodatkiem 5 Al 0,5% roztworu az^ydku sodorego. fteparat ^zechowwano w temperaturze +4°^C.

Oznaczenie autoprzeciecl^Jł teΓeśglśbιU.ine polega na wProwadzeinLu do 50/Ul tak otrzymanego preparatu takiej samej ilości nie^zcte^^ozone j surowicy krwi ludzkiej. W przypadku obecności ATG w ciągu 3 minut zachodzi aglutynacja w badanej slyświcy krwi.

Claims (3)

1. Zastrzelenia patentowe

   1 . Sposób otrzymywania preparatu diagnostycznego do wykrywania autoprzeciwciał tyreoglobuliny w surowicy krw^z namienny tym, że nośnik polisyyennowy otrzymuje się na drodze wodnoomulsyynej polimeryzacji styrenu w obecmości nadsiarczanu potasu oraz estru alkanolu i kwasu dl-p-toluilo-ka:'blnolo-onto-fenylerk)karnkysyOo^egn, a następnie proddst poddaje się dodatkowemu naświetlaniu promieniami gamma do całkowitej kontrerssi monomeru na polimer, po czym do zawiesiny wodnej tak otrzymanego nośnika wprowadza 3ię albuminę ludzką w ilości 1-1o mg/uł w środowisku buforowego roztworu fnsίotMn^wrgn o pH 7,4, po przemyciu dodaje roztwór aldehydu glut arowego i wprowadza ludzką t^^oglob^-inę w ilości 0,2-10 mg/ml, po czym przemywa się buforem g^Cyyowy^m i eweni^nie konserw Je.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że Jako środek' konserwujący stosuje się azydek sodowy.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do wprowadzenia albuminy stosuje się roztwór buforowy zawierający w Jednym litrze roztworu wodnego 8 g chlorku sodowego, 0,2 g chlorku potasowego, 0,2 g kwaśnego fosforanu potasowego 1 1,15 g kwaśnego fosforanu sodo^go.