JP2536995B2

JP2536995B2 - 酵素固定法

Info

Publication number: JP2536995B2
Application number: JP4125759A
Authority: JP
Inventors: クレーマーデイーター; ジオルヴエルナー; マルケルトゲルハルト; ジユターリンノルベルト; フアイルコルネリア
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1981-04-29
Filing date: 1992-05-19
Publication date: 1996-09-25
Anticipated expiration: 2011-09-25
Also published as: EP0065069B1; EP0065069A2; US4710525A; DE3116995A1; JPH0613611B2; JPH0723893B2; JPH03210476A; ATE19524T1; DK144382A; JPH05346430A; DK163668B; US4829101A; JPS585302A; EP0065069A3; MX160019A; DE3116995C2; DK163668C

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は外皮範囲に共有結合固定
に好適な官能基を有する核−外皮構造の、生物学的に作
用を有する物質を固定するために好適なラテックスを用
いる酵素の固定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生物学的に作用を有する物質の担体固定
化の問題は例えば生化学及び生物工学、医学、特に診断
医学等の技術分野において多くの観点下に考慮されてい
る。一般に固定すべき“生物学的に作用を有する物質”
とは生物学的システムとの相互作用に好適な化合物もし
くは機能単位、もしくはこの生物学的システム自体であ
る。この技術は、とりわけ触媒、殊に酵素の固定、更に
例えば親水性クロマトグラフィーに重要な基質固定に特
に重要である。次に、存在する技術上の問題を明らかに
するために、診断学的に評価することのできる“生物学
的に作用を有する物質”の固定に関してはより詳細にふ
れる。

【０００３】この種の診断学的に評価することのできる
反応においては、有機体中に存在するか又は有機体から
生成される診断学的に把握すべき状態に兆候的な物質
と、これら“兆候的”な物質にできるかぎり特異的に応
答する物質との相互作用の把握が問題である。免疫反応
は非常に高い特異性を有する、免疫反応は知られている
ように抗原及び抗体間で行なわれる：両方の反応対の一
方は公知でなければならない、こうして他の一方を体液
中で定性的又は定量的に測定するか又は細胞及び組織中
に位置決定することができる。

【０００４】抗原抗体反応の検出のために種々の分析法
がある。例えばラジオ免疫効力検定、酵素効力検定、免
疫蛍光、免疫拡散、特に免疫凝集反応がある。

【０００５】免疫凝集反応は、その固化が免疫反応を視
覚的又は測光的に把握可能とする粒子状担体を指示薬と
して使用することにより、自体低い濃度の免疫学的に活
性の物質の検出を可能とする。使用した担体の種類によ
りバクテリア凝集、尿凝集、白血球凝集、ベントナイト
凝集及びラテックス凝集に類別する。ラテックス凝集に
比較的多大な注目が向けられた。提案されているラテッ
クスは種々のポリマータイプに属する。スチロールもし
くはスチロール含有コポリマー（カルボキシル化ポリス
チロール、カルボキシル化ポリスチロール−ブタジェン
−コポリマー、スチロール−ジビニルベンゾール、スチ
ロール−アクリルアミド、アクリルニトリル−ブタジェ
ン−スチロール、スチロール−メタクリレート）をベー
スとするラテックス又はアニオン系フェノール樹脂、ジ
アゾ化アミノセルロースをベースとするラテックスが微
粒子等の形で、しばしば使用される。

【０００６】メタクリレートベース（アクリレートベー
ス）のラテックスも提案されている。米国特許第４１３
８３８３号明細書によれば−ＯＨ、−ＮＨ_２又は−ＣＯ
ＯＨ基を含有するアクリレートモノマーから架橋剤の存
在下に均一の直径≦２０００Åの微細球の懸濁液の形に
ポリマーを製造する。このラテックス微細球に、縮合剤
としてカルボジイミド又はグルタルアルデヒドの存在下
に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を共有結合させる。ラテ
ックス構造の改変の試みも行なわれた。こうして、西ド
イツ国特許公開第２８４０７６８号公報中には、ラテッ
クスに水溶性ポリヒドロキシ化合物が共有結合している
ラテックスが担持体として提案されている。この公開公
報は０．０１〜約０．９μｍの範囲の粒径及び水の比重
に近い比重である。

【０００７】ラテックス材料は免疫診断テストに関して
不活性であり、ポリヒドロキシ化合物との共有結合を可
能とする活性基を有すべきである。これらの条件が満た
される限り、任意のラテックス−ポリマーが好適であ
る。

【０００８】ベルギー特許第８７４５８８号明細書には
外皮構造を有する直径０．１５〜１．５μｍのラテック
ス粒子が勧められている。この際、核は“硬質”モノマ
ーの重合又は共重合により形成され、外側被覆は１種以
上の“硬質”モノマーと遊離エポキシ基を有するエチレ
ン系不飽和化合物との共重合により製造される。例え
ば、ポリスチロールラテックスの存在下にスチロールと
グリシジルメタクリレートとのラジカル重合は記載され
ている。そのように形成されたラテックスは例えば人−
クロリオンゴナドトロピン（Ｈｕｍａｎ−Ｃｈｌｏｒｉ
ｏｎｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を担持することができ
る。しかし、従来免疫−診断学においてラテックス−構
想の技術上の実現はある一定程度を越えない。限定する
ファクターには、例えば生物学的に作用を有する物質の
（例えば、抗体の）結合が属する。従来、生物学的に作
用を有する物質はラテックスに主に吸着的に結合され
た。僅かにルーズに結合したバイオマクロ分子の拡散の
ためにほとんど必然的に問題が生じた。

【０００９】すでに記載したように、いくつかの場合生
物学的に作用を有する物質の共有結合が利用される。こ
の際、一般にその導入が多数回の工程で行なわれなけれ
ばならない結合官能基が問題であり、多くの場合−ＣＯ
ＯＨ基又は−ＮＨ₂基のポリマー類似導入並びに引き続
く（可溶性の）カルボジイミド又はグルタルジアルデヒ
ドを用いての蛋白質とのカップリングに関する。例とし
て西ドイツ国特許公開第２８１２８４５号公報による多
工程共有結合固定をあげることができる。西ドイツ国特
許公開第２８３３５１０号公報からは核−外皮構造が公
知であり、ここでは核はビニル−及び／又はジエンポリ
マーとカルボン酸−及び／又はスルホン酸基とから製造
されており、外皮はビニルポリマーと末端位でアミン置
換のチオフェノールエーテル基とから製造されている。
ラテックスの活性化は例えばジアゾ化により行なわれ
る。

【００１０】多工程による共有結合固定のかわりに、永
久的反応性基、例えばオキシラン基を有するラテックス
を使用することも試みられた。しかし、これらは非常に
僅かな貯蔵安定性を示す。生物学的に作用を有するシス
テムを固定するために使用するラテックスの重大な欠点
としては、費用がかかり、かつ欠くことのできない精製
処理であろう。ラテックスへの蛋白質の共有固定の際
に、例えばすべての助剤（カルボジイミドカップリング
の場合には生じる尿素）及び特に結合しない蛋白質を長
い精製工程で、例えば超遠心分離により除去しなければ
ならない。この時間をとり、費用のかかる処理は高価
な、しかし生物学的に特に安定ではない材料の有意義な
使用をほとんど締め出す。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、その使用の際
に前記欠点を有さないか又はほとんど有さないラテック
スを提供することが課題である。いずれにせよ、ラテッ
クステクノロジーは物理的所与による一定の限界をもう
けている：ラテックス粒子は公知のように界面活性剤の
存在下にのみ自体準安定システムを形成し、限られた時
間の間のみ安定に保持される。特に高めた電解質濃度に
対してラテックス粒子は不安定である。しかし、電解質
含有溶液中（例えば０．９％食塩溶液中）生理学的に重
要な過程が経過するので、通常のラテックス粒子の取り
扱いは非常に困難であり、特に、診断作業に特徴的であ
る僅かな物質量に関する場合困難である。例えば上がわ
きが生じるか、又はただの濃縮がラテックス粒子の析出
に導びくやいなや、容易に凝集と見誤まるであろう。高
い乳化剤濃度による安定化は生物学的システムへの変性
作用のために勧めることはできない。強いイオン性の基
を取り込むことにより安定化効果をラテックス粒子にひ
き起こすこともできるが、これにより同時に生物特異性
相互作用のために決定されたラテックスの特性にあとか
ら影響を与える。

【００１２】次に、生物学的に作用を有する物質の固定
に予定するラテックスへの一連の要求を記載する：これ
らラテックスは生理学的条件下に生物学的に重要な分子
の共有結合を可能とする反応性基を有さなければならな
い。

【００１３】これらラテックスは貯蔵期間のあいだ反応
性基の含量を一定に保持するために無水の固体として貯
蔵することが可能でなければならない。

【００１４】ラテックスは完全に再分散性でなければな
らない。これにより取り扱いの際の上がわきは重大では
なくなる。

【００１５】ラテックスは遠心分離可能でなければなら
ない。この条件はラテックスの密度が担持媒体もしくは
連続相の密度と十分に異なっている時に満たされる。粒
子の密度がまわりの媒体の密度より高い場合には、沈殿
により粒子の分離を行なうことができ、逆に粒子の密度
がまわりの媒体の密度より低い場合には、浮選により粒
子の分離を行なうことができる。

【００１６】

【課題を解決するための手段】生物学的に作用を有する
物質もしくは構造を共有結合固定するためには、特に診
断学的使用に関して、核−外皮構造を有するポリマーラ
テックスが特に好適であることが判明した。

【００１７】本発明において、核−外皮ラテックス粒子
（Ｋ−Ｓ−Ｌａｔｅｘ）の外皮は水で膨潤性の材料から
なる。外皮材料はその組成により、これが核材料に結合
することがなく、かつ／又は架橋することがない場合に
は少なくとも部分的に水溶性である程度に親水性でなけ
ればならない。この際、外皮もそれ自体で架橋していて
よい。ラテックス外皮の周囲の水中への溶解性は例えば
グラフト及び／又は架橋によるラテックス核への結合に
より回避される。更に、外皮は生物学的に作用を有する
物質もしくは構造の共有結合固定に必要な官能基を有す
る。水溶液中で水より強い求核基と反応し、生理学的に
重要なｐＨ範囲、すなわち６．０〜９．０、特に６．５
〜８．０の範囲で全く水により攻撃されないか、又はほ
とんど攻撃されない自体公知の官能基を使用するのが有
利である。

【００１８】官能基の選択は、固定すべき材料、特に生
物由来の材料が求核基として一般に（遊離）アミノ基、
更に場合により、フェノール性基、ヒドロキシ基又はチ
オール基を有するという事実を考慮に入れる。従って、
本発明によるラテックスの外皮部分の構造はその反応形
において、概略的に次のような式で示すことができる：

【００１９】

【化１】

【００２０】この際、Ｘは共有結合固定のための官能基
を表わし、有利に前記条件を満たすものである。この
際、Ｒは官能基及び重合性基間の間隔を保持するもの
（スペーサー）を表わし、このスペーサーの大きさ及び
タイプは比較的重要ではない。一連の例においては基Ｒ
は全くなくてよく、すなわちｎは値０又は１であってよ
い。一般にＸは問題となる求核基により攻撃可能な基、
すなわち活性基を表わし、有利にスルホン酸ハロゲニド
基、チオイソシアネート基、活性化エステル、チオカル
ボニルジオキシ基、カルボニルイミドジオキシ基、ハロ
エトキシ基、ハロアセトキシ基、オキシラン基、アジリ
ジン基、ホルミル基、ケト基、アクリロイル基又はアン
ヒドリド基である。スルホン酸ハロゲニドとしてはクロ
リド及びブロミドであり、ハロアセトキシとしてはフル
オル−、クロル−及びブロム化合物であり、活性化エス
テルのエステル成分としてはヒドロキシアミン化合物、
例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド又はＮ−ヒドロキ
シフタルイミドからのもの、（電子吸引性基により）活
性化したフェノール、例えばハロゲン化フェノール例え
ばトリクロルフェノール又はニトロフェノールからのも
の、複素環系ラクタム、例えばピリドンからのものを挙
げることができる。

【００２１】特に有利であるのはオキシラン基、ケト
基、ホルミル基、スルホン酸クロリド基、チオイソシア
ネート基並びに活性化カルボン酸エステル並びにカルボ
ン酸無水物である。それゆえに、タイプＺ′−（Ｒ）ｎ
−Ｘのモノマーにおいて、Ｚ′は（ラジカル的に）重合
可能な単位であり、ｎは０又は１である。このようなラ
ジカル重合性の単位は例えばビニル基であり、ここで
Ｚ′は例えば

【００２２】

【化２】

【００２３】［式中、Ｒ₁は水素原子又はメチル基、も
しくは−ＣＨ₂−ＣＯＯＲ₂、−ＣＨ₂ＣＯＮＨＲ₂又は−
ＣＨ₂−ＣＯＮ（Ｒ₂）₂（ここでＲ₂は炭素原子数１〜４
のアルキル基を表わす）を表わす］である。更に、Ｚ′
はマレイン酸から誘導されていてよい。

【００２４】

【化３】

【００２５】反応性で、同時に重合性の単位としては更
にマレイン酸無水物及びイタコン酸無水物、並びにアク
ロレイン、メタアクロレイン、メチルビニルケトン及び
活性化ビニルエステルを挙げることができる。特に有利
であるのは（メタ）アクリル酸及びマレイイミドの誘導
体並びにマレイン酸無水物及びイタコン酸無水物であ
る。

【００２６】式Ｚ′−Ｒ−Ｘを明らかにするために次の
例を記載する：

【００２７】

【化４】

【００２８】（スペーサーを有する重合可能な活性化エ
ステル）

【００２９】

【化５】

【００３０】（グリシジルアクリレート）

【００３１】

【化６】

【００３２】［２−（クロルアセトキシ）−エチルメタ
クリルレート］（２，４，５−トリクロルフェニルメタクリレート）
Ｒ＝０ＣＨ₂＝Ｃ（ＣＨ₃）−ＣＯＯ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｂｒ（２−ブロムエチルメタクリレート）

【００３３】

【化７】

【００３４】（１，４ブタンジオールジグリシジルエー
テルへのメタクリル酸の付加生成物）ＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ −ＣＳＮＨ−（ＣＨ₂）₆−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ（１，６−ヘキサンジイソチオシアネートへのアクリル
酸−２−ヒドロキシエチルエステルの付加生成物）ＣＨ₂＝ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ₂−Ｃｌ（クロル酢酸ビニルエステル）

【００３５】

【化８】

【００３６】（４−マレイミド−酪酸−ペンタクロルフ
ェニルエステル）ＣＨ₂＝Ｃ（ＣＨ₃）−ＣＯＯ−Ｃ₆Ｈ₄−ＳＯ₂−ＣＨ₃ ［（４−メチルスルフィニルフェニル）−メタクリレー
ト］ＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＯＯ−ＣＨ₂−Ｃ≡Ｃ−Ｈ（プロパルギルアクリレート）外皮の構造に関与する通
常の単位（概略式におけるＡ及びＢ）は定義上外皮に必
要とされる特性、すなわち親水性及び硬度を付与するよ
うなものである。無水の状態での所望の硬度のための手
がかりとしてはＴλｍａｘ：２０〜２５０℃、特に５０
〜２００℃であってよい。ここでＴλｍａｘとはドイツ
工業規格（ＤＩＮ）７７２４もしくはドイツ工業規格
（ＤＩＮ）５３４４５による捩り振動テストにおいて得
られる動力学的ガラス転移温度である。他方外皮の構造
に関与するモノマーは自体有利に強い求核基（例えば−
ＮＨ₂、−ＳＨ）を含有していてはならない。更に、外
皮は有利に芳香族基を有していてはならない。更に外皮
の成分はなんらかの方法で自体架橋していなければなら
ない。この架橋のためにも、もしくは核との結合のため
にもＹはシンボルである。

【００３７】概略図の意味において、第１に外皮の親水
性に関与する成分をＢとしてあらわし、第１に結果的に
生じる全ポリマーの硬度にあわせて選択されるその他の
成分をＡとして表わす。本発明において使用されるラテ
ックスの外皮構造にあげられる条件は例えばメタクリレ
ート及び／又はアクリレートタイプのコポリマーにより
満たされ、この際定性的及び定量的部分がポリマーラテ
ックスの外皮のための前記基準を満たすように割り当て
られる。

【００３８】親水性成分Ｂとしては例えば場合により置
換された一般式Ｉ

【００３９】

【化９】

【００４０】［式中、Ｒ₁は水素又はメチル基を表わ
し、Ｒ₃及びＲ₄は相互に独立して水素又は炭素原子数１
〜４のアルキル基を表わす］のメタクリルアミド及びア
クリルアミド、すなわち未置換のアミド並びに第１級及
び第２級アミンで形成されたアミドを挙げることができ
る。特に有利であるのは（メタ）アクリル酸アミド、Ｎ
−メチル−（もしくはイソプロピル−又はブチル−)−
(メタ）アクリル酸アミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（メ
タ）アクリル酸アミド、更に(メタ)アクリル酸モルホリ
ド（特例、ここでは窒素はＲ₄及びＲ₃を介して環の１部
である）及びＮ−ビニル−ピロリドン−２である。更
に、タイプＢの親水性モノマーにはアクリレートタイプ
又はメタクリレートタイプのヒドロキシ基含有モノマ
ー、特にアクリル酸及びメタクリル酸のヒドロキシ含有
エステル又はアミド並びにアクリル酸及びメタクリル酸
のアルコキシアルキルエステル及び／又はアミド、例え
ば一般式ＩＩ

【００４１】

【化１０】

【００４２】［式中、Ｒ′₁は水素又はメチル基を表わ
し、Ｒ′₂は水素又は炭素原子数１〜４のアルキル基を
表わし、Ｑは酸素又は−ＮＲ″₂（ここで、Ｒ″₂は水素
又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表わす）を表わ
し、ｐは１〜３の整数、有利に２であり、ｍは１〜２５
の整数であり、但し、Ｑが酸素の場合ｐは１ではない］
の化合物がある。特に、ヒドロキシエチルアクリレー
ト、ヒドロキシメチルメタクリレート、２−ヒドロキシ
エチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピ
ル（メタ）アクリルアミド、グリセリン及び他のポリオ
ールの（メタ）アクリル酸のモノマエステルが挙げられ
る。モノマータイプＢにはスルホエチルアクリレート及
びスルエメチルメタクリレート並びにスルホエチルアク
リルアミド及びスルホエチルメタクリルアミドも属す
る。ラテックスの外皮中に親水性基として、重合性の
酸、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸又はマレイ
ン酸又は重合性のtert−アミン、例えば２−Ｎ，Ｎ−ジ
メチルアミノエチル−（メタ）アクリルアミド並びに２
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル−（メタ）アクリル酸
エステル又は３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル−
（メタ）アクリルアミドもしくは３−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノプロピル−（メタ）アクリル酸エステルを組み入
れることができる。ラテックス粒子が一方側に荷電する
ことを回避するためにこれら酸性もしくは塩基性基が同
時に１つの粒子中に存在しなければならない（例えば、
メタクリル酸及び２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメ
タクリレート）。

【００４３】タイプＡのモノマーとしては水溶性でない
モノマー又は少なくとも限定されて水溶性のモノマーを
挙げることができ、この際定性的及び定量的部分が生じ
たポリマーの硬度の前記基準を満たすように割り当てら
れる。

【００４４】ａ）アクリル及び／又はメタクリル酸の
Ｃ₁〜Ｃ₂₀−アルコールとのエステル、特にメタクリル
酸のメチル−、エチル−並びにプロピル−及びブチルエ
ステル、並びにアクリル酸のメチル−、エチル−、プロ
ピル−及びブチルエステル及び２−エチルヘキシルエス
テル、ｂ）ビニルアセテートのタイプの共重合性モノマー、
特にビニルアセテート、ビニルプロピオネート、ビニル
ブチレート及びビニルイソブチレート。

【００４５】タイプＡの言わゆる“軟質”モノマーは外
皮のポリマーに関し、下位の量でのみ、一般に５０重量
％より少量であってよいということは自明である。

【００４６】個々のモノマーからのポリマー膜の硬度、
もしくはその他の重要な特性は公知であり、コポリマー
の特性への寄与に関しても公知である［米国特許第２７
９５５６４号明細書；Ｈ．Ｒａｕｃｈ−Ｐｕｎｔｉｇａ
ｍ、Ｔ．Ｖｏｅｌｋｅｒ著“Ａｃｒｙｌ−ｕｎｄＭｅ
ｔｈａｃｒｙｌｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇ”、Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン１９６７年、第３０３
〜３０４頁；Ｔ．Ｇ．Ｆｏｘ著、Ｂｕｌｌ．Ａｍ．Ｐｈ
ｙｓ．Ｓｏｃ．第１巻、１２３頁（１９５６年）参
照］。

【００４７】架橋剤Ｙの配分はラテックス外皮の分離浮
遊がもはや可能でないように割り当てる。それには一般
に少なくとも０．１重量％が必要である。より多量の架
橋剤は妨害に作用せず、一般に０．１〜２０％、特に１
〜１０重量％を使用する。

【００４８】化学的な観点から、Ｙはすべての多官能性
アクリレート又はメタクリレートであってよい、例えば
グリコールジメタクリレート、ブタンジオールジアクリ
レート、トリエチレングリコールジメタクリレート、テ
トラエチレングリコールジアクリレート、ペンタエリト
リットテトラアクリレート等。この際、架橋剤の基礎と
なっているポリオールのすべての官能ＯＨ基が重合性酸
でエステル化されていなければならないということはな
い（例えば、ペンタエリトリットジメタクリレート、２
個の遊離ＯＨ基）、こうしてこの架橋剤もこれにより親
水性を示してよい。その他の、親水性架橋剤Ｙの例は、
Ｎ，Ｎ−メチレンビス（メタクリルアミド）である。そ
の他に、もちろん良好な重合性基の他に容易にグラフト
可能な単位を含有する、例えばアリルメタクリレートの
ようなモノマーを架橋剤として使用することもできる。

【００４９】本発明による核−外皮−ラテックスの核
は、生じたラテックス粒子が形状安定である、すなわち
十分な硬度を示すという条件を示すかぎり、あまり厳密
ではない。技術上の要求に関しては、核−外皮−ラテッ
クスシステムの再分散性が保証されなければならない。
核の重合材料はこの要求を、例えば軟質であるが強く架
橋したポリマーであるということにより、又は硬質（架
橋しているか又は架橋していない）ポリマーであるとい
うことにより満たすことができる。核−外皮構造の性質
において、核材料に由来する妨害性の相互作用はあまり
恐れる必要はなく、この観点においては比較的選択は自
由である。従って、核は物理的分離もしくは同定に好適
な特性の担体、例えば物理的方法で確認可能な標識の担
体であってよい。この際、例えば色素、蛍光色素等が考
えられる。更に、核は周囲の媒体と差のある重量により
物理的分離を可能とすることもできる。

【００５０】これにより、ラテックスの再分散性の要求
と適合するモノマーもしくはコモノマーからなる核材料
の構造が可能となる、例えばコポリマーに少なくとも０
℃のＴλｍａｘ（ＤＩＮ５３４４５による）を付与する
種々のビニルエステル、メタクリル酸及びアクリル酸の
誘導体からなるすべてのコポリマー組成；例えばメチル
メタクリレート、ブチルメタクリレート、メチルアクリ
レート等からなるコポリマーから核材料の構造が可能と
なる。外皮材料の範囲には芳香族基が存在しないことに
常に注意を払わなければならないが（潜在性ハプテン特
性）、ラテックスの核にはもちろんスチロールのタイプ
のモノマー、例えばスチロール、ビニルトルオール、ジ
ビニルベンゾールを使用してもよく、したがってスチロ
ール及びマレイン酸エステルもしくはフマール酸エステ
ルからのコポリマーも使用してよい。核ポリマーのガラ
ス転移温度が明らかに０℃を下まわるならば、少なくと
も１％の架橋剤、例えばグリコールジメタクリレート、
ジビニルベンゾール等を一緒に使用することが勧められ
ている。

【００５１】担持媒体もしくは連続相の密度と異なる全
システムの密度に対する要求と関連して、ラテックスに
高めた密度を付与するようなモノマーが特に重要であ
る。特に“重質”モノマー、すなわち１個以上のハロゲ
ンを有する、特にクロル化又はブロム化モノマーがよ
い。例えばビニルクロリドのようなビニル化合物、クロ
ルスチロール又はブロムスチロールのようなスチロール
誘導体、並びに側鎖に重い基を有する（メタ）アクリル
酸の誘導体、例えば２，４，６−トリブロムフェノキシ
エチルメタクリレートをあげることができる。更に、モ
ノマーの密度がポリマーとして担持媒体もしくは連続相
の密度とあまり差がないモノマーから核を構成すること
もできる。そのような場合には、それでも良好な分離性
を達成することができるように核を大きくする。

【００５２】本発明により使用可能な種類の核−外皮ラ
テックスの製造は従来公知の方法と同様に行なうことが
できる。（西ドイツ国特許公告第２７２２７５２号公報
参照）。有利な実施態様の例に関しては次に粗大もしく
は微細核−外皮−ラテックス材料の製法を記載する。ラ
テックスが粗大粒子になるか、又は微細粒子になるか
は、有利に核材料により決められる。例えば粗大粒子ポ
リマー核の製造は完全に乳化剤なしの重合により行なわ
れる。

【００５３】有利な実施形式は次のように行なう。０．
５〜４時間かけて、モノマー又はモノマー混合物を約５
０〜１００℃に加熱した、十分量の水溶性開始剤、例え
ばカリウムペルオキシジスルフェート、アンモニウムペ
ルオキシジスルフェート、過酸化水素又は４，４′−ア
ゾビス（シアノ吉草酸）の塩を含有する水中に滴下す
る。約５０〜１００℃の範囲の熱重合のかわりに、レド
ックス開始剤系により反応を低い温度で開始することも
できる。油溶性開始剤、例えばジベンゾイルペルオキシ
ド又はアゾイソ酪酸ジニトリルもポリマー開始剤として
好適である。この場合には少なくとも少量の乳化剤が有
利であるか、又は必要である。大きなラテックス粒子を
達成するための他の方法は種ラテックスを用いて多工程
法により行なわれる。この場合は予め任意に調整した種
ラテックス上に第２の工程で、又は更にいくつかの引き
続く工程で所望のモノマー又はモノマー混合物を重合さ
せる。方法としてはバッチ供給、多重バッチ供給及びよ
り有利にはモノマー供給もしくはエマルジョン供給を挙
げることができる。この実施方法に重要であるのは、種
ラテックスに関して引き続く工程において、全乳化剤濃
度をすべてのモノマーがこの種ラテックス粒子上に重合
し、新しい粒子形成が起こらない程低く保持することで
ある。特に大きなポリマー核は、種ラテックスとして最
初に記載した乳化剤なしで製造した粗大粒状ラテックス
を使用する時に得られる（ヨーロッパ特許公開第７９１
０１３９８．０号公報、もしくは西ドイツ国特許公開第
２８３３６０１号明細書参照）。ポリマーが非常に低い
分子重量である種ラテックスを第１工程で製造する時も
粗大粒状システムを得る。これらラテックス粒子はモノ
マー又はモノマー混合物と共に膨化し、重合して大きな
ラテックス粒子となる。完全に非水溶性物質の下位量を
モノマー又はモノマー混合物と一緒に使用することは低
分子ポリマーと同様の作用を有する（西ドイツ国特許公
開第２７５１８６７号公報、ヨーロッパ特許０００３９
０５号明細書参照）。核ポリマーの密度が担持媒体もし
くは連続相の密度と強く差を有していない場合、例えば
直径約０．５〜＞２μｍの粗大粒状核は有利である。

【００５４】微細粒状ポリマー核の製造は原則的に公知
の乳化重合の基準によるラテックスの合成より成り、こ
の際核−ラテックス粒子の所望の大きさは重合を開始す
るための乳化剤濃度により調節される。核材料の組成は
比較的重要でないので、原則的には前記要求、例えば形
状安定性及び高密度を満たすかぎり任意のラテックスを
核材料として使用することはここでも可能である。微細
粒子の核材料の製造のためには方法として１工程又は多
工程のバッチ式供給法、モノマー供給法、エマルジョン
供給法又は連続的な方法が好適である。開始剤としては
粗大粒子核ラテックスの製造のために前記した水溶性も
しくは油溶性開始剤を使用することができる。重合は前
記のように純粋に熱的に又はレドックスシステムの助け
により行なうことができる。乳化剤としては原則的にす
べてのアニオン系、カチオン系、非イオン系又は両性界
面活性剤を単一で又は組み合わせて使用するのが好適で
あり、アニオン系及び／又は非イオン系乳化剤が有利で
ある。微細粒状核−ラテックスを製造するための特に有
利な実施態様は、有利に緩衝剤（約ｐＨ７）及び乳化剤
含有溶液を所望の重合温度に加熱し、水溶性開始剤を一
定量まで加え、次いで０．５〜６時間の時間をかけてモ
ノマーエマルジョン（架橋剤を含めて）を滴加すること
である。例えば約０．１〜０．５μｍの直径の微細粒状
核は核ポリマーの密度が担持媒体もしくは連続相の密度
と強く異なる時に使用することができる。

【００５５】ラテックス核上への外皮の重合は核材料の
重合に直接に引き続き行なうことができる。この方法は
原則的に種ラテックスのために記載したと同様である。
有利にＺＲＫ−タイプのモノマーである外皮組成のモノ
マー混合物をそのままで又は水又は緩衝溶液中のエマル
ジョンとして０．５〜４時間かけて核−ラテックスに加
えるが、この時再び乳化剤濃度を粒子の新たな形成が回
避される程低く保持するように注意しなければならな
い。場合により二つの異なるモノマー供給を同時に配量
することが必要であり、この際一方は場合により水を包
含する。これは常にモノマーが相互に溶けないか、もし
くはモノマーの一部のみが水中にとけるが他の部分は水
に溶けない時に必要である。

【００５６】外皮モノマーをこれらの条件下に存在する
ポリマー核上に重合する。外皮モノマーを供給する前に
開始剤又は緩衝溶液を追加して装入するのが有利である
ことが判明し、特にラテックス核の重合が緩衝溶液中で
行なわれない時及び外皮モノマーをモノマー供給として
加える時に有利である。緩衝剤の添加は特に官能性モノ
マーＺ′−（Ｒ）ｎ−Ｘにおいて高反応性化合物が問題
である時、特に重要である。こうして、ラテックス粒子
の合成の間これら反応性基の分解（例えば加水分解によ
り）をできるかぎり僅かに保持するように緩衝剤混合物
を調節する。重合条件は限定された乳化剤濃度の他は核
の製造のために記載されている条件と同様である。単一
バッチ法又は多重バッチ法は方法としては可能である
が、モノマー供給法もしくはエマルジョン供給法が有利
である。重合は約５０〜１００℃の範囲で熱的に又はレ
ドックス−開始システムを用いて低い温度でも行なわれ
る。重合開始剤としては有利に乳化重合において常用の
水溶性開始剤をあげることができる。記載した温度範囲
に分解温度があるかぎり、原則的に油溶性開始剤を使用
することもできる。

【００５７】外皮密度対核の大きさの有利な比は、例え
ば核材料の重量対外皮材料の重量が１：３〜５：１であ
る時に生じるが、特別な核−外皮−比も原則的に可能で
ある。（１０：１）。ラテックス核が小さければ小さい
程、一般に外皮材料をより大きく選択するべきであると
いうことは明らかである。ラテックスは比較的低粘性の
水性分散液の形で生じる。ポリマー含量は根拠として例
えば１５〜３０重量％の範囲であってよい。しかしなが
ら、原則的には固体含量はわずかな重量％から約７０重
量％まで可能である。

【００５８】診断試薬を製造するために核−外皮ラテッ
クスを使用する。本発明による新規の試薬は新規核−外
皮ラテックスと生物学的に作用を有する物質もしくは構
造との反応により製造することができる。生物学的に作
用を有する物質もしくは構造とは例えば“免疫学的に活
性な”材料である。“免疫学的に活性な”材料としては
例えば免疫学的な対試薬が存在するかもしくはこれが生
じると仮定する場合生理学的液体、細胞抽出液及び組織
抽出液を挙げることができる。

【００５９】免疫学的に活性な材料の代表的な例として
は例えばアミノ酸、ペプチド、プロテイン、酵素、リポ
プロテイン、グリコプロテイン、リポイド、ヌクレイン
酸、多糖類、第１アミン、アルカロイド、ホルモン、ビ
タミン、ステリン及びステロイドを挙げることができ
る。免疫学的に活性の構造としては例えば微生物、例え
ばグラム陽性菌及びグラム陰性菌、スピロヘーター、ミ
コプラズマ、ミコバクテリア、ビブリオ、放線菌、原生
動物、例えば腸原生動物、アメーバ、鞭毛虫網、胞子虫
類、腸線中類及び組織線中類（虫）、吸虫類（躯幹破裂
体、蛭）、条虫目、トキソプラズマ、並びに真菌類、例
えばスポロトリカム、クリプトコエクス（Ｃｒｙｐｔｏ
ｃｏｅｃｕｓ）、分芽菌属、ヒストプラズマ属、コクシ
ジオイデス、カンジクタ（Ｃａｎｄｉｃｔａ）、ビール
ス及びリケッチャ、例えば犬肝炎、ショープ・パピロー
ネ、インフルエンザＡ＋Ｂ、家鶏ペスト、単純疱疹、ア
デノビールス、ポリアネ（Ｐｏｌｙａｎｅ）、ラウス肉
腫、接種痘、ポリオビールス、麻疹、犬温熱、白血病、
流行性耳下腺炎、ニューキャッスル病、センダイ（Ｓｅ
ｎｄａｉ）、ＥＣＨＯ、口蹄病、オウム病、狂犬病、エ
クストロメリア（Ｅｘｔｒｏｍｅｌｉａ）、バウムビー
ルス（Ｂａｕｍｖｉｒｅｎ）、等のビールス又はリケッ
チャ、更に組織抗原、ホルモン、例えば下垂体ホルモン
のインシュリン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、絨毛性
ゴナドトロフィン、絨毛性成長ホルモン−プロラクチ
ン、人−胎盤−ラクトーゲン、酵素、例えば膵臓ヒモト
リプシン形成素、プロカルボキシペプチダーゼ、グルコ
ース−オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウリカー
ゼ、アミノ酸−オキシダーゼ、ウレアーゼ、アスパラギ
ナーゼ、プロテアーゼ、血球−抗原、血液型物質及び他
の同種抗原、例えば血小板、白血球、血漿たん白質、乳
たん白質、唾液たん白質、尿たん白質、自己抗体を含め
た抗体を挙げることができる。

【００６０】核−外皮ラテックスを用いて酵素を固定す
るための方法。

【００６１】本発明によるラテックスと酵素との反応の
ためには簡単な方法で酵素を水性媒体中、有利にほぼ生
理学的条件で、例えば酵素のタイプに好適に決めた緩衝
液中、ラテックスの適当な量と共に有利にあまり室温を
こえず、適度な撹拌下に恒温保持することができ、官能
基としてエポキシ基を使用する時は例えばｐＨ範囲７〜
９中に限定することなく処理することができる。一般
に、反応のためには１日〜数日の期間、例えば３日間で
ある。共有結合していない酵素は多数回の遠心分離（約
５０００ｒ.ｐ.ｍ）及び緩衝液中での再分散により分離
することができる。活性の測定は公知の酵素特異的測定
と同様に行なうことができる。本発明の特別な利点は、
負荷したラテックスも再分散し、例えば凍結乾燥した粉
末の形で、場合により長期間貯蔵することができるとい
うことである。場合によっては限定するファクターは固
定生物学的材料の安定性である。

【００６２】本発明によるラテックスは他の、例えば工
業的に使用可能な酵素の担体としても好適な形で使用す
ることができる。例えばアシラーゼ、ペニシリナーゼ、
グルコース−イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ等を挙げ
ることができる。

【００６３】種々の観点下に、例えば免疫凝集を追跡す
るためには、すでに記載したようにラテックスに標識
剤、例えば蛍光色素を加えることができる。

【００６４】本発明のポリマーラテックスは一般に微生
物の固定に好適であり、この際反応条件はプロテインの
固定におけると同様である。公知技術に対し、基質分子
に関して固定化微生物の良好な入手可能性が本願方法に
より得られる。本願発明の固定方法に特有である僅かな
細胞毒性はきわだっている。

【００６５】前記の点はビールス及び成熟核細胞の固定
にもあてはまる。ポリマーラテックスの多官能基の性質
は一般に生物学的に作用を有する物質の架橋に使用する
ことも可能とする。このためには特に小さい直径（概略
約５００Å）のラテックス粒子が重要である。

【００６６】有機合成にも本発明のポリマーラテックス
は有利に使用することができ、この際水性媒体中で作業
する必要はなく、有機反応媒体を一緒に使用すること
も、有機反応媒体を使用することもできる。例えば、こ
の方法で保護基を導入することもできる。特に興味深い
点はメリーフィールドによるペプチド合成に使用するこ
とである。（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．第３２巻（１９６９年）、第２２１〜２９６
頁）。

【００６７】

【実施例】

例１ラテックス１の製法（粗大粒状ラテックスの例）ａ）母分散液の合成還流冷却器、撹拌機及び温度計を備える重合容器中に水
１６００ｇをあらかじめ入れ、８０℃に加熱する。

【００６８】イソブチルメタクリレート３ｇメチルメタクリレート３ｇエチレングリコールジメタクリレート０．３ｇからなるモノマー混合物を添加した後、水３６ｇ中に溶
かしたアンモニウムペルスルフェート４ｇを加える。更
に、同様に８０℃でイソブチルメタクリレート２００ｇメチルメタクリレート２００ｇエチレングリコールジメタクリレート２０ｇからなる混合物を２時間かけて滴加する。モノマー添加
の終了後、更に１時間８０℃で保持する。凝集物を有さ
ない、良好な濾過性の、低粘性、約２０％分散液が得ら
れる。

【００６９】ｂ）オキシラン基含有分散液の合成還流冷却器、撹拌機及び温度計を備える重合容器中に水
３５０ｍｌをあらかじめ入れる。これに燐酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７（ティトリゾール（Ｔｉｔｒｉｓｏｌ）メルク）１
０ｍｌ及び母分散液８０ｇを加える。８０℃に加熱した
後、水４ｍｌ中の４，４′−アゾビス−（４−シアノ吉
草酸）のナトリウム塩０．４ｇを加える。その後水１０００ｇナトリウムラウリルスルフェート１ｇ４，４′−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）のナトリウム塩２ｇメチルメタクリレート１５０ｇイソブチルメタクリレート１５０ｇエチレングリコールジメタクリレート１５ｇからなるエマルジョンを８０℃で３時間かけて加える。
引き続き、６０分かけて水３００ｇ中のメタクリル酸ア
ミド２０ｇ及び４，４′−アゾビス（４−シアノ吉草
酸）のナトリウム塩０．６ｇ並びにメチルメタクリレー
ト３５ｇ、グリシジルメタクリレート４０ｇ及びエチレ
ングリコールジメタクリレート４ｇからなるモノマー混
合物を同時に加える。その後、更に６０分８０℃で撹拌
する。約２０％の固体含量の凝集していない低粘性の分
散液が得られる。粒径約２μｍ。

【００７０】例２ラテックス２の製造（粗大粒状ラテックスの例）ａ）母分散液の合成例１による重合容器中に水１６００ｇを予め入れ、８０
℃に加熱する。

【００７１】スチロール６．２４ｇアリルメタクリレート０．０６ｇからなるモノマー混合物を添加した後、水３６ｇ中に溶
かしたアンモニウムペルスルフェート４ｇを加える。こ
れにスチロール４１５ｇアリルメタクリレート５ｇからなるモノマー混合物を８０℃で同様に２時間かけて
滴下する。モノマー添加の終了後、更に２時間８０℃で
保持する。凝集物を有さない、粗大、濾過可能な粘性の
約２０％分散液が得られる。

【００７２】ｂ）オキシラン基含有分散液の合成例１と同様に行なうが８５℃に加熱し、水１０ｍｌ中の
ナトリウム塩として４，４′−アゾビス(４−シアノ吉
草酸)ナトリウム塩１．０ｇを加える。これに水１０００ｇナトリウムラウリルスルフェート１ｇ４，４′−アゾビス−（シアノ吉草酸）のナトリウム塩４ｇスチロール３１２ｇアリルメタクリレート４ｇからなるエマルジョンを８５℃で３時間かけて配量す
る。引き続き９０分かけて、水３００ｇ中のメタクリル
酸アミド２０ｇ及び４，４′−アゾビス−（４−シアノ
吉草酸）のナトリウム塩０．６ｇの溶液並びにメチルメ
タクリレート３５ｇ、グリシジルメタクリレート４０ｇ
及びエチレングリコールジメタクリレート４ｇからなる
モノマー混合物を同時に加える。その後更に６０分８０
℃で撹拌する。固体含量約２０％の凝集物を有さない、
良好な濾過性の低粘性分散液が得られる。粒径：約２μ
ｍ。

【００７３】例３ラテックス３の製造（微細粒状ラテックスの例）前記の装備を有する重合容
器中で燐酸塩緩衝液（ｐＨ７、Ｔｉｔｒｉｓｏｌ、Ｍｅ
ｒｃｋ）５ｍｌ、ナトリウムラウリルスルフェート０．
０３ｇ及び４，４′−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）
のナトリウム塩０．２ｇを水１００ｍｌ中で溶かす。８
０℃に加熱し、ナトリウムラウリルスルフェート０．１
ｇ、４，４′−アゾビス（４−シアノ吉草酸）のナトリ
ウム塩０．５ｇ、メチルメタクリレート８０ｇ、（２−
エチル−［２，４，６−トリブロムフェノキシ］−エチ
ル）−メタクリレート１５ｇ、エチレングリコールジメ
タクリレート５ｇ及び水２００ｇからなるエマルジョン
を３時間かけて滴加する。引き続き、９０分かけて、水
７５ｇ中のメタクリル酸アミド５ｇの溶液及びグリシジルメタクリレート１０ｇエチレングリコールジメタクリレート１ｇメチルメタクリレート９ｇからなるモノマー混合物を同時に反応配合物中に加え
る。

【００７４】その後、更に約６０分間８０℃で保持す
る。約２５％の低粘性分散液が生じる。粒径：０．３μ
ｍ。オキシラン含量：使用したグリシジルメタクリレー
トの３１％（ナトリウムチオスルフェートでの滴定）。

【００７５】例４ラテックス４の製造４ａ）核分散液の製造例１に記載された装備の重合容器中に、ナトリウムテトラデシルスルフォネート０．３ｇアンモニウムペルスルフェート０．６ｇ蒸留水５００ｇを予め装入し、８０℃に加熱する。これに６時間かけ
て、ｐ−ブロムスチロール５００ｇフマル酸ジエチルエステル３００ｇナトリウムテトラデシルスルホネート４ｇアンモニウムペルスルフェート４ｇ蒸留水７１０ｇからなるエマルジョンを６時間かけて８０℃で滴加す
る。

【００７６】滴加終了後、更に２時間８０℃で撹拌し、
その後室温で冷却し濾過する。この分散液は約４０％の
固体含量の低粘性のものである。

【００７７】４ｂ）核−外皮分散液の製造４０％分散液４ａの５００ｇを燐酸塩緩衝液でｐＨ７．
０とし、蒸留水１０００ｍｌ中の４，４′−アゾビス−
（シアノ吉草酸）のナトリウム塩１ｇ及びナトリウムテ
トラデシルスルホネート０．５ｇからなる溶液で希釈し
全体で１０００ｍｌの容量とする。（＝ｐＨ７．０の２
０％分散液４ａ）。この溶液を重合容器中で８０℃に加
熱し、この温度に１５分間保持し、次いで次の二種の溶
液を８０℃で同時に滴加する：溶液Ａ２−ブロムエチルメタクリレート２０ｇグリコールジメタクリレート２．５ｇＮ−ｔ−ブチルメタクリレート１７．５ｇメチルメタクリレート１０ｇ溶液Ｂ蒸留水５０ｇ中の４，４′−アゾビス−（シアノ吉草
酸）のナトリウム塩１ｇ滴加時間：約２時間。配量速度は両者の供給物において
できるだけ同じ大きさでなければならない。供給終了
後、更に１時間８０℃に保持する。その後冷却し、濾過
する。約２３％の固体含量の微細粒状、低粘性分散液が
生じる。

【００７８】４ｃ）核−外皮分散液の製造例４ｂ（分散液４ａの希釈、中和等）におけると同様に
処理するが、次の溶液を配量した。

【００７９】溶液Ａ：酢酸ビニル１０ｇクロル酢酸ビニルエステル３０ｇメチレンビスアクリルアミド２．５ｇアクリルアミド７．５ｇ溶液Ｂ：蒸留水５０ｇ中の４，４′−アゾビス（シアノ
吉草酸）のナトリウム塩２ｇ滴加時間：約３時間、供
給終了後、更に２時間８０℃で保持する。冷却及び濾過
後、微細粒状低粘性分散液が生じる。

【００８０】例５ラテックス５の合成工程Ｉ例１による重合容器中の次の成分蒸留水１５５０ｇナトリウムラウリルスルフェート０．８ｇメチルメタクリレート３．２ｇイソブチルメタクリレート３．２ｇを予め装入し、撹拌下に８０℃に加熱する。引き続き水
４０ｍｌ中のアンモニウムペルスルフェート４ｇの溶液
を加える。引き続き、メチルメタクリレート１９０ｇイソブチルメタクリレート１９０ｇグリコールビスメタクリレート２０ｇからなるモノマー混合物を８０℃で配量する。

【００８１】モノマー供給時間：２時間。供給終了後、
更に２時間８０℃に保持する。冷却後、良好な濾過性の
凝集物を有さない分散液が生じる：固体含量：１９％、
ｐＨ２．２、粘度４ｍＰａ．ｓｅｃ。

【００８２】第ＩＩ工程例１による重合容器中に第Ｉ工程による分散液１６０ｇ
を装入し、これに燐酸塩緩衝液、ｐＨ７（テイトリゾール、メルク）１０ｇ４，４′−アゾビス−（シアノ吉草酸）のナトリウム塩０．４ｇ蒸留水３１０ｇを加える。この溶液を８０℃に加熱し、３時間かけて次
のエマルジョン：メチルメタクリレート１４３ｇイソブチルメタクリレート１４３ｇエチレングリコールビスメタクリレート１５ｇナトリウムラウリルスルフェート１ｇ４，４′−アゾビス（シアノ吉草酸）のナトリウム塩１．８ｇ蒸留水９７０ｇを加える。引き続きすぐに次の両方の混合物を同時に加
える（添加時間：１時間）。

【００８３】混合物Ａメチルメタクリレート４４ｇエチレングリコールビスメタクリレート４ｇグリシジルメタクリレート４２ｇ混合物Ｂ４，４′−アゾビス（シアノ吉草酸）のナトリウム塩０．６ｇメタクリルアミド１０ｇ蒸留水３２０ｇ添加終了後８０℃で更に１時間保持する。冷却後、凝集
物を有さない分散液が生じる：固体含量：約１９％。粒
径約０．４μｍ。

【００８４】例６例１によるラテックスの精製（合成に必要な助剤、乳化剤、開始剤の除去）分散液１
１０ｍｌを１５分間５０００ｒ.ｐ.ｍで遠心分離す
る。上澄漿液を注ぎ出し、引き続き粒子を１ＮＮａＣ
ｌ中に再分散させる（１ＮＮａＣｌ約５０ｍｌ中のポ
リマー固体１ｇ）。その後、１０分間５０００ｒ.ｐ.ｍ
で遠心分離し傾瀉する。１ＮＮａＣｌ中への再分散及
び遠心分離を更に２回繰り返す。引き続き粒子を０．０
５Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７．５中に再分散させる（０．
０５Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７．５、５０ｍｌ中のポリマ
ー固体１ｇ）。５０００ｒ.ｐ.ｍで１０分間遠心分離
し、上澄を注ぎ出す。この工程を１回繰り返す。こうし
て得られたラテックスの貯蔵を＋５℃で冷蔵庫中で行な
う。

【００８５】例７例３によるラテックスの精製例６におけるように行なうが、遠心分離時間をそれぞれ
３０分間に高めた（５０００ｒ.ｐ.ｍ）。

【００８６】例８トリプシンの固定のための反応例１による分散液１５ｍｌ（∧ポリマー固体３ｇ）にト
リプシン３００ｍｇ（１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７．５、
６ｍｌ中に溶かした）を加え、引き続き７２時間２３℃
で撹拌する。その後、共有結合していない酵素を３回の
遠心分離及び０．０５Ｍ燐酸緩衝塩中への再分散により
除去する（例６により実施）。

【００８７】例９固定酵素の活性測定ａ）３７℃及びｐＨ７．５（ｐＨ−スタット）におけ
るＮ．ベンゾール−アルギニン−エチルエステル（ＢＡ
ＥＥ）の加水分解遠心分離精製した例８によるラテックスの乾燥物質１ｇ
（水約１ｇを有する湿った物質約２ｇとして使用）を２
％ＢＡＥＥ溶液２０ｍｌ中に分散させる。

【００８８】＊）活性はそれぞれ担体１ｇに対するものであり、Ｕは
１マイクロモル／分に相応し、開始速度に基き測定し
た。

【００８９】ｂ）カゼインの加水分解（３７℃、ｐＨ
８．０）例８により遠心分離精製したラテックスの乾燥物質１ｇ
（約１ｇの水と共に約２ｇの湿った物質として使用）を
４％カゼイン溶液２０ｍｌ中に分散する。

【００９０】例１０反応性ラテックスの凍結速度例１による分散液１５ｍｌを例６に記載されているよう
に精製する。この際約５０％の残留水分を有するポリマ
ーが生じる。この遠心分離したラテックスを凍結乾燥
し、引き続き−２０℃で６ケ月貯蔵する。

【００９１】凍結乾燥ラテックスの再分散：再分散は、
０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７．５で行なわれる。こ
の際、約５分間強力に撹拌しなければならない。緩衝液
中に懸濁させた試料を短時間超音波で処理することもで
きる。

【００９２】引き続き、例８中に記載したように酵素と
の反応を行なう（使用したラテックスに関しトリプシン
１０％）。

【００９３】使用活性［Ｕ／ｇ］*) 活性［Ｕ／ｇ］*) （基質：ＢＡＥＥ）（基質：カゼイン）１．使用１３．３２．９２．使用１０．６２．２３．使用１０．６２．２＊）担体材料ｇに関して例１１固定トリプシンを有するラテックスの凍結乾燥トリプシンと反応させたラテックス（例８）１ｇを、凍
結乾燥させ、その後６ケ月−２０℃で貯蔵する。再分散
は例１０に記載したように０．０５Ｍ燐酸塩緩衝剤で行
なわれる。

【００９４】カゼインに対する活性（４％カゼイン溶液
２０ｍｌ中の再分散性ラテックスの固体１ｇ、３７℃、
ｐＨ８．０）例１２トリプシンの固定例８におけると同様に行なうが、トリプシンの固定のた
めに例３による分散液１５ｍｌ（遠心分離３０分、５０
００ｒ.ｐ.ｍ）を使用する。

【００９５】基質としてカゼインに対する活性（ｐＨ
８．０、３７℃）１．使用５．５Ｕ／ｇ担持材料２．使用４．２Ｕ／ｇ担持材料３．使用４．０Ｕ／ｇ担持材料例１３蛍光標識化ラテックスの合成例１による重合容器中に母分散液１ａ４０ｇを予め装
入し、これに燐酸塩緩衝液ｐＨ７（テイトリゾール、メ
ルク）５ｍｌ、４，４′−アゾビス−（シアノ吉草酸）
のナトリウム塩０．２ｇ及び蒸留水１８０ｇを加える。
この混合物を８０℃に加熱した後、同様に８０℃で３時
間かけて、メチルメタクリレート１２７ｇイソブチルメタクリレート１５ｇエチレングリコールビスメタクリレート７．５ｇフロール−グリーン−ゴールド（Ｆｌｕｒｏｌ−Ｇｒｕｅｎ−Ｇｏｌｄ）０．６ｇ４，４′−アゾビス−（シアノ−吉草酸）のナトリウム塩１．０ｇナトリウムラウリルスルフェート０．５ｇ蒸留水４５０ｇからなるエマルジョンを加える。

【００９６】この供給の終了後（＝ラテックス核）、８
０℃で１時間かけて同時に次の両方の混合物を添加す
る：混合物Ａ：メチルメタクリレート２４ｇエチレングリコールビスメタクリレート２ｇグリシジルメタクリレート２１ｇ混合物Ｂメタクリルアミド３ｇ４，４′−アゾビス−（シアノ吉草酸）のナトリウム塩０．３ｇ蒸留水１５５ｇ供給の終了後、更に６０分間８０℃で保持し、その後冷
却する。良好な濾過性の凝集物を有さない固体含量１９
％の分散液、ｐＨ７．７、粘度：１０ｍＰａ．ｓｅｃが
生じる。粒径：２μｍ。ＵＶ−励起において蛍光は肉眼
でも蛍光顕微鏡によってもあきらかに可視である。

【００９７】例１４抗アルブミンの固定例５による分散液１０ｍｌを０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７．５で１００ｍｌに希釈する。（燐酸塩緩衝液に有
利に０．０５％ナトリウムアジドを加える）。ポリマー
固体約２％の分散液が生じる。

【００９８】抗血清（カタログＮｏ．６１−０１５６３
８９＜ヤギ＞）を緩衝液と一緒に次の濃度に希釈する。

【００９９】ａ）１０００μｇＡＫ／ｍｌｂ）２００μｇ〃／ｍｌｃ）４０μｇ〃／ｍｌｄ）８μｇ〃／ｍｌｅ）０μｇ〃／ｍｌラテックス粒子への抗アルブミンの結合はそれぞれ２％
分散液１ｍｌと希釈列ａ）〜ｅ）１ｍｌとを反応させる
ことにより行なわれる。室温で５日間撹拌し、例６に記
載したようにラテックス粒子を遠心分離により精製す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゲルハルトマルケルトドイツ連邦共和国オーバー−ラムシユタツトライプツイガーシユトラーセ 25 (72)発明者ノルベルトジユターリンドイツ連邦共和国オーバー−ラムシユタツトアムホレト 23 (72)発明者コルネリアフアイルドイツ連邦共和国エルツハウゼンラインシユトラーセ 36

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的に作用を有する物質を固定する
ための核−外皮構造を有するポリマーラテックスに１種
以上の酵素を固定する方法において、このポリマーラテ
ックスが再分散性であり、この際外皮のポリマー材料がＩ）ラジカル重合性架橋剤０．１〜２０重量％ＩＩ）一般式Ｚ′−（Ｒ）ｎ−Ｘ［式中、Ｚ′はラジカル重合性単位を表わし、Ｒはスペ
ーサーを表わし、Ｘは反応性の親核的に攻撃性の基を表
わし、かつｎは０又は１を表わす］のラジカル重合性官
能性モノマー、及び置換されていてよい一般式Ｉ［式中、Ｒ _１は水素又はメチル基を表し、Ｒ _３及びＲ _４
は相互に独立して水素又は炭素原子数１〜４のアルキル
基を表わす］のメタクリルアミド及びアクリルアミドの
群並びに一般式ＩＩ［式中、Ｒ′ _１は水素又はメチル基を表わし、Ｒ′ _２は
水素又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表わし、Ｑは
酸素又は−ＮＲ″ _２基（ここでＲ″２は水素又は炭素原
子数１〜４のアルキル基を表わす）を表わし、ｐは１〜
３の整数であり、ｍは１〜２５の整数であり、但し、Ｑ
が酸素の場合ｐは１ではない］の化合物の群からなるラ
ジカル重合性親水性モノマーＢ４．９〜
９９．９重量％ただし官能性モノマーの外皮の全ポリマ
ーに関する量は少なくとも０．１重量％である及びＩＩＩ）メタクリル酸エステル及びアクリル酸エステル
の群並びにカルボン酸のビニルエステルの群からなる水
不溶性であるか又は限られて水溶性のラジカル重合性モノマーＡ０〜９５重量％からなり、この際外皮のモノマー組成はＩＶ）外皮のＴλｍａｘ値が無水状態で２０〜２５０℃
であるように選択されており、かつポリマー粒子の核の
ポリマー材料はラジカル重合性モノマーの乳化重合によ
り形成されている核一外皮構造を有するポリマーラテッ
クスであり、かつこのポリマーラテックスからなる担体
と酵素とを共有結合の形成下に反応させることを特徴と
する酵素の固定法。
【請求項２】生物学的に作用を有する物質を固定する
ための核−外皮構造を有するポリマーラテックスに１種
以上の酵素を固定する方法において、このポリマーラテ
ックスが再分散性であり、この際外皮のポリマー材料がＩ）ラジカル重合性架橋剤０．１〜２０重量％ＩＩ）一般式Ｚ′−（Ｒ）ｎ−Ｘ［式中、Ｚ′はラジカル重合性単位を表わし、Ｒはスペ
ーサーを表わし、Ｘは反応性の親核的に攻撃性の基を表
わし、かつｎは０又は１を表わす］のラジカル重合性官
能性モノマー、及び置換されていてよい一般式Ｉ［式中、Ｒ _１は水素又はメチル基を表わし、Ｒ _３及びＲ
_４は相互に独立して水素又は炭素原子数１〜４のアルキ
ル基を表わす］のメタクリルアミド及びアクリルアミド
の群並びに一般式ＩＩ［式中、Ｒ′１は水素又はメチル基を表わし、Ｒ′ _２は
水素又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表し、Ｑは酸
素又は−ＮＲ″ _２基（ここでＲ″ _２は水素または炭素原
子数１〜４のアルキル基を表わす）を表わし、ｐは１〜
３の整数であり、ｍは１〜２５の整数であり、但し、Ｑ
が酸素の場合ｐは１ではない］の化合物の群からなるラ
ジカル重合性親水性モノマ−Ｂ４．９〜
９９．９重量％ただし官能性モノマーの外皮の全ポリマ
ーに関する量は少なくとも０．１重量％である及びＩＩＩ）メタクリル酸エステル及びアクリル酸エステル
の群並びにカルボン酸のビニルエステルの群からなる水
不溶性であるか又は限られて水溶性のラジカル重合性モノマーＡ０〜９５重量％からなり、この際外皮のモノマー組成はＩＶ）外皮のＴλｍａｘ値が無水状態で２０〜２５０℃
であるように選択されており、かつポリマー粒子の核の
ポリマー材料はラジカル重合性モノマーの乳化重合によ
り形成されており、かつ核が１種以上の色素を含有して
いる、核−外皮構造を有するポリマーラテックスであ
り、かつこのポリマーラテックスからなる担体と酵素と
を共有結合の形成下に反応させることを特徴とする酵素
の固定法。