DK163668B

DK163668B - Polymerpartikler med kerne-skal-opbygning, der er redispergerbare i en vaeske til dannelse af en latex til brug ved immobilisering af biologisk aktive stoffer

Info

Publication number: DK163668B
Application number: DK144382A
Authority: DK
Inventors: Dieter Kraemer; Werner Siol; Gerhard Markert; Norbert Suetterlin; Cornelia Feil
Original assignee: Roehm Gmbh
Priority date: 1981-04-29
Filing date: 1982-03-30
Publication date: 1992-03-23
Also published as: DE3116995C2; EP0065069B1; EP0065069A2; US4829101A; JP2536995B2; JPH03210476A; JPS585302A; JPH05346430A; JPH0723893B2; MX160019A; ATE19524T1; DK163668C; EP0065069A3; DK144382A; JPH0613611B2; US4710525A; DE3116995A1

Description

i

DK 163668 B

Opfindelsen angår polymerpartikler med kerne-skal-opbygning, der er red ispergerbare i en væske til dannelse af en latex til brug ved immobilisering af biologisk aktive stoffer.

5 Problemet vedrørende bærerfiksering af biologisk virksomme stoffer foreligger i mangfoldige aspekter inden for det tekniske område, eksempelvis inden for biokemi og bioteknologi, og medicinen, især bl.a. den medicinske diagnostik. I reglen er der med de til fiksering bestemte "biologisk virksomme stoffer" tale om forbindelser eller funktionsenheder, der er egnede til vekselvirkning med biologiske systemer, eller om selve disse biologiske systemer. Den særlige interesse inden for teknikken gælder bl.a. fiksering af katalysatorer, specielt af enzymer, eller substratfikseringen, der eksempelvis er 15 af betydning for affinitetskromatografien. Til forklaring af de foreliggende tekniske problemer gås der i det følgende nærmere ind på immobiliseringen af sådanne "biologisk virksomme stoffer", som lader sig udnytte diagnostisk.

20 I tilfælde af sådanne diagnostisk udnyttelige reaktioner er der tale om konstatering af vekselvirkningen af i organismen tilstedeværende eller af organismen producerede stoffer, som er symptomatiske for den tilstand, der skal konstateres diagnostisk, med sådanne stoffer, der så vidt muligt reagerer 25 specifikt på disse "symptomatiske" stoffer. Immunreaktionerne har en overordentligt høj specificitetsgrad. Immunreaktioner forløber som bekendt mellem antigener og antistoffer. Den ene af de to reaktionspartnere skal være kendt, for at den anden kan bestemmes kvalitativt eller kvantitativt i en legemsvæske

Q

eller lokaliseres i celler og væv.

Der findes forskellige analytiske metoder til påvisning af antigen-antistofreaktioner (Ag-AK-reaktion), f.eks. radioimmu- noprøven, enzymimmunoprøven, immunofluorescens, immunodiffu-35 2

DK 163668 B

sion, men især immunoagglutination.

Immunoagglutinationen muliggør påvisning af selv lave koncentrationer af immunologisk aktive materialer, idet man benytter partikelformede bærere som indikatorer, hvis sammen-5 klumpning gør en foreliggende immunreaktion visuelt eller fotometrisk konstaterbar. Alt efter arten af den benyttede bærer skelner man mellem bakterie-, urin-, leukocyt-, bento-nit- og latexagglutination.

Latexagglutinationen er blevet viet forholdsvis stor opmærk-10 somhed.

De foreslåede latexer kan tilhøre forskellige polymerisat-typer. Der gøres hyppigt brug af latexer på basis af styren eller styrenholdige copolymere (carboxyleret polystyren, carboxylerede polystyren-butadien-copolymere, styren-divinyl= 15 benzen, styren-acrylamid, acrylonitril-butadien-styren, styren-methacrylat) eller på basis af anioniske phenolharpikser, diazoteret aminocellulose i form af fine partikler etc.

Også latexer på (meth)acrylatbasis er blevet foreslået. Ifølge U.S.A.patentskrift nr. 4.138.383 fremstilles polymerisater 20 af acrylatmonomere, der indeholder ΟΗ-,-Νί^- eller C00H- grupper, i nærværelse af tværbindere i form af suspensioner af runde mikrosfæroider med en ensartet diameter, der er mindre eller lig med 2.000 Å. Til disse latexmikrosfæroider bindes immunoglobuliner G (IgG) covalent under anvendelse af 25 carbodiimid eller glutaraldehyd som kondensationsmiddel. Også forsøg på modifikation af latexopbygningen er blevet foretaget. Således foreslås i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.840.768 latexer som bærere, hvortil en vandopløselig polyhydroxyforbindelse er bundet covalent. Det sidstnævnte 30 trykskrift tager sigte på en partikelstørrelse i området fra 0,01 til ca. 0,9 ym og en specifik vægt i nærheden af vands.

3

DK 163668 B

Latexmaterialet skal med henblik på immunologisk-diagnosti-ske prøver være indifferent og have aktive grupper, der muliggør en covalent binding med en polyhydroxyforbindelse. Såfremt disse anførte betingelser er opfyldt, skulle vilkår-5 lige latexpolymere være egnede.

I belgisk patentskrift nr. 874.588 anbefales latexpartikler med en diameter på 0,15 - 1,5 μ med keme-ska 1 -opbygning. Kernen skal være dannet ved hjælp af polymerisation eller copolymerisation af "hårde" monomere, og den ydre omhylning skal 10 være dannet ved hjælp af copolymerisation af en eller flere "hårde" monomere med en ethylenisk umættet forbindelse, der har frie epoxygrupper. Eksempelvis beskrives den radikali-ske polymerisation af styren og glycidylmethacrylat i nærværelse af en polystyrenlatex. Den således dannede latex kan 15 f.eks. fyldes med human-chloriongonadotropin. Den tekniske realisation af latex-konceptet inden for immundiagnosen er imidlertid hidtil ikke kommet ud over et vist trin. Til de begrænsende faktorer hører f.eks. binding af de biologisk virksomme stoffer (f.eks. af antistofferne).

20 Hidtil er de biologisk virksomme stoffer overvejende blevet bundet adsorptivt til latexen. Derved opstår næsten automatisk problemer som følge af diffusionen af de kun løst bundne biomakromolekyler. 1 nogle tilfælde bliver der - som allerede nævnt - gjort brug 25 af en covalent binding af de biologisk virksomme stoffer. I almindelighed er der herved tale om bindingsfunktioner, hvis indføring skal foretages i flere fremgangsmådetrin, for det meste om den polymeranaloge indføring af -COOH- eller -NH2“ grupper samt den påfølgende kobling med proteinet ved hjælp 30 af (opløselige) carbodiimider eller glutardialdehyd. Som eksempel skal nævnes den covalente immobilisering i flere trin ifølge tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.812.845. Fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.833.510 kendes partikler med 4

DK 163668 B

kerne-skal-opbygning, hvori kernen udgøres af et vinyl-og/eller dienpolymerisat med carboxylsyre- og/eller sulfon= syregrupper/ og skallen udgøres af et vinylpolymerisat med endestillede, aminsubstituerede thiophenolethergrupper. Ak-5 tiveringen af latexen kan eksempelvis ske ved hjælp af diazo-tering.

I stedet for den ccvalente fiksering via en flertrinsproces har man også forsøgt at stille latexer med permanent reaktionsdygtige grupper, eksempelvis oxirangrupper, til rådig-10 hed. Disse har imidlertid kun en ringe lagringsstabilitet.

Som måske den mest graverende ulempe ved de til fiksering af biologisk virksomme systemer benyttede latexer skal de påfølgende lige så krævende som uundværlige rensningsoperationer betragtes. I tilfælde af den covalente fiksering af 15 proteiner til en latex skal f.eks. alle hjælpestoffer (i tilfælde af en carbodiimidkobling de dannede urinstoffer) og først og fremmest ikke-bundet protein fjernes i tidsrøvende rensningstrin, eksempelvis ved hjælp af ultrafiltrering. Disse tidsrøvende og besværlige operationer udelukker næsten 20 en fornuftig anvendelse af meget værdifulde, men biologisk ikke særligt stabile materialer.

Der forelå derfor den opgave at stille latexer til rådighed, ved hvis anvendelse de ovenfor omtalte ulemper ikke eller kun i ringe omfang optræder. For latexteknologien er der ganske 25 vist sat bestemte grænser hidrørende fra de fysiske forhold. Latexpartikler er som bekendt i sig selv metastabile systemer, der kun i nærværelse af tensider og kun inden for et begrænset tidsrum kan holdes stabile. Især viser latexpartikler sig at være ustabile over for forøget elektrolytkoncentra-30 tion. Da imidlertid fysiologisk relevante processer forløber i elektrolytholdige opløsninger (f.eks. i 0,9% kogsaltopløsning) , er håndteringen af de sædvanlige latexpartikler meget vanskelig, frem for alt når der er tale om de til diagnostiske arbejder karakteristiske små stofmængder. Aggluti- 5

DK 163668 B

nationer kan let se ud til at forekomme, så snart f.eks. tørringer optræder, eller også blot koncentrering fører til udfældning af latexpartiklerne. En stabilisering ved hjælp af høj emulgatorkoncentration er som følge af dens 5 denaturerende virkning på biologiske systemer ikke tilråde lig. Ved hjælp af indbygning af stærkt ioniske grupper kan en stabiliserende virkning på latexpartiklerne ganske vist fremkaldes, men man påvirker dermed samtidig vedvarende de for den specifikke vekselvirkning bestemmende egenskaber hos 10 latexerne.

Dermed stilles en række krav til de latexer, der er bestemt til immobilisering af biologisk virksomme stoffer.

Latexpartiklerne skal have reaktive grupper, der muliggør en covalent binding af de biologisk relevante molekyler under fysiologi-15 ske betingelser.

Latexpartiklerne skal også kunne lagres som vandfri faste stoffer med henblik på at sikre et konstant indhold af reaktive grupper over et længere tidrum.

Latexpartiklerne skal være fuldstændigt redispergerbare. Dermed bli-20 ver indtørringer ved håndteringen ukritiske.

Latexpartiklerne skal være centrifugerbare.. Denne betingelse er først opfyldt, når deres massefylde er tilstrækkeligt forskellig fra massefylden af bæremediet eller af den kontinuerlige fase. Hvis massefylden af partiklerne er højere end 25 massefylden af det omgivende medium, kan separeringen af partiklerne foretages ved hjælp af sedimentation, og hvis den er mindre, kan separeringen foretages ved hjælp af flotation.

Det har nu vist sig, at polymerpartikler med kerne-skal-opbyg-30 ning er særligt egnede til covalent immobilisering af bio- 6

DK 163668 B

logisk virksomme stoffer eller strukturer, især med henblik på en diagnostisk anvendelse.

Polymerpartiklerne ifølge opfindelse er kendetegnet ved, at 5 skallens polymermateriale I) er så hydrofilt, at det uden forankring til kernematerialet og/eller uden tværbinding i det mindste ville være delvis vandopløseligt, II) indeholder funktionelle grupper, der er egnede til covalent fiksering af de biologisk virksomme stoffer, III) i vandfri tilstand ifølge 10 sin monomersammensætning har en Txmax> på 20 - 20°C, og IV) er opbygget af 4,9 - 99,9 vægt% af en monomer, der bærer de funktionelle grupper, sammen med en hydrofil monomer B, 0 - 95 vægt% af den i det væsentlige ikke-hydrofi le monomer A og 0,1 - 20 vægt% tværbindende monomer, alle vægtprocenter regnet i 15 forhold til den samlede vægt af skallens polymermateriale, med det forbehold, at mængden af monomer bærende de funktionelle grupper udgør mindst 0,1 vægt%, hvorhos monomeren bærende de funktionelle grupper har formlen 20 Z' - (R)n-X, hvor Z' betegner en polymerisationsdygtig enhed, R er en afstandsholdende enhed og X en i vandig opløsning i pH-området 6,0 - 9,0 med de biologisk virksomme stoffers nucleofile grup-25 per fortrinsvis reagerende funktionel gruppe, og n betyder 0 eller 1, at kernens polymermateriale er afstemt efter latex-partiklernes formstabilitet og deres redispergerbarhed og har en T\max. på mindst 0°C, og at polymerpartiklernes gennemsnitlige partikeldiameter ligger mellem 0,05 og 5 pm, idet vægten 30 af kernens polymermateriale står i forholdet 1:3 - 10:1.

Ifølge opfindelsen består skallen af kerne-skal-latexpartik-lerne (K-S-latex) af et med vand kvældbart materiale. Skal-35 materialet skal ud fra sammensætningen være hydrofilt i så høj grad, at det uden forankringen til kernematerialet og/eller uden tværbinding i det mindste ville være delvis opløseligt i vand. Derved kan skallen også som sådan være tværbundet. Opløsningen af latex-skallen i omgivende vand forhindres altså ved hjælp af bindingen til latex-kernen, f.eks.

DK 163668 B

7 som følge af podning og/eller tværbinding. Skallen har derudover de funktionelle grupper, der er nødvendige til covalent fiksering af biologisk virksomme stoffer eller strukturer. Fortrinsvis anvendes sådanne i og for sig kendte funk-5 tionelle grupper, som i vandig opløsning reagerer med kraf tigere nucleofile stoffer end vand, og i det fysiologisk hensigtsmæssige pH-område, d.v.s. især i området fra 6,0 til 9,0, især fra 6,5 til 8,0, ikke eller kun i underordnet omfang angribes af vand.

10

Udvælgelsen af de funktionelle grupper tager hensyn til den kendsgerning, at materialet, der skal fikseres, især materialet af biologisk oprindelse, som nucleofile grupper, i almindelighed indeholder de (frie) aminogrupper foruden 15 eventuelt yderligere phenoliske grupper, hydroxygrupper el ler thiolgrupper.

Opbygningen af skaldelen af partiklerne ifølge opfindelsen i sin reaktive form kan derfor i stærkt skematiseret form an-2o gives som følger:

X-(R) d(R) —X

. n ,B B 'i n I / \ / \l -Z — A A .A Z — ΑΧ/

Y

25 A — Β - hvori X står for de funktionelle grupper til covalent fiksering, fortrinsvis sådanne, der opfylder de ovenfor nævnte betingelser. R repræsenterer en afstandsholder (spacer) mel-30 lem funktionelle og polymeriserbare grupper, idet størrelse og type af afstandsholderne er forholdsvis ukritiske. I en række eksempler kan gruppen R helt mangle, d.v.s. at n kan have værdien 0 eller 1.

3 5 o X betyder i reglen en af de på tale kommende nucleofile angribelige grupper, d.v.s. en aktiveret gruppe, fortrinsvis betydningen en sulfonsyrehalogenidgruppe, en thio= isocyanatgruppe, en aktiveret ester eller en thiocarbonyl= 8

DK 163668 B

dioxy-, carbonylimidoyloxy-, halogenethoxy-, halogenacetoxy-, oxiran-, aziridin-, formyl-, keto-, acryloyl- eller anhydrid-gruppe- Som sulfonsyrehalogenider kommer chloriderne og bro= miderne på tale, som halogenacetoxyforbindelser fluor-, chlor-5 og bromforbindelser, som esterkomponenter de aktiverede estere, sådanne hydroxylaminforbindelser, som N-hydroxysuccinimid eller N-hydroxyphthalimid, sådanne (ved hjælp af elektrontiltrækkende grupper) aktiverede phenoler, såsom halogenphenoler, som trichlorphenol, eller nitrophenoler, heterocykliske lac= 10 tamer, såsom pyridon.

Særligt foretrukne er oxiran-, keto-, formyl-, sulfonsyrechlo= rid- og thioisocyanatgrupper samt aktiverede carboxylsyreeste-re og carboxylsyreanhydrider. I tilfælde af de monomere af typen Z'-(R) -X repræsenterer Z' følgelig en (radikalisk) polymerisationsdygtig enhed, og n er 0 eller 1.

Sådanne radikaliske polymerisationsdygtige enheder er f.eks. vinylgrupper, hvorved Z' eksempelvis har betydningen 20

O

CH = C - C -

^ I

E1 25 hvori R^ står for hydrogen eller methyl eller for CH2~ COOR2,CH2-CONHR2 eller CHACON (R2)2, hvori R2 står for en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer. Endvidere kan Z' være afledt af maleinsyre.

O

II

30 η a/\ N-

II

CH\C/

II

o 35 Som reaktionsdygtige og desuden polymeriserbare enheder be tragtes endvidere maleinsyreanhydrid og itaconsyreanhydrid samt acrolein, methacrolein, methylvinylketon og aktiverede vinylestere. Særligt foretrukne er derivater af (meth)acryl= syre og af maleinimid samt maleinsyre- og itaconsyreanhydrid.

9

DK 163668 B

Til tydeliggørelse af formeludtrykket Z'-R-X skal anføres følgende eksempler: 0 ch3 0 - ch2

CH0 = C - CO - NH - (CH0)C - O - N I

2 2 5 \ I

5 C - CH„ il 2

O

Z' R X

(polymeriserbar aktiveret ester med spacer).

CH_ = CH - CO - O - CH~ - CH - CH0 (Glycidylacrylat).

0

Z' R X

CH2 = CCH3 - CO - O - CH2 - CH2 - o - C - CH2 - Cl 15 O

Z' R X

(2-(chloracetoxy)-ethylmethacrylat).

^ ch2 = cch3 - co - o - c6h2ci3

Z' X

(2,4,5-trichlorphenylmethacrylat). R = 0 25 ch2 «= c(ch3) - coo - ch2 - ch2 - Br (2-bromethylmethacrylat) .

CH2 = C(CH3)COO - CH2 - CHOH - CHj - O - (CH^ - 30 O - CH~ - CH - CH0 2 \ / 2 0 (Tillejringsprodukt af methacrylsyre til 1,4-butandioldi= glycidylether).

35

CH2 = CH - COO - CH2 - CH2 - O - CSNH - (CH^ - N = C = S

(TiIlejringsprodukt af acrylsyre-2-hydroxyethylester til 1,6-hexandiisothiocyanat).

10

DK 163668 B

CH2 = CH - O - CO - CH2 - Cl (Chloreddikesyrevinylester) CH - CCk ^0 U N - (CH ) - C^ b CH - COx * * \0 - Cg - Cl5 (4 '-maleimido- smørsyre-pentachlorphenylester).

CH2 = C(CH3) - C00 - C6H4 - S02 - CH3 ((4-methylsulfinylphenyl)-methacrylat).

CH2 = CH - C00 - CH2 - C = C - H

(Propargylacrylat).

15

Med hensyn til de øvrige i skallens opbygning deltagende enheder (A og B i den skematiske afbildning) er der definitionsmæssigt tale om sådanne, som bibringer skallen de krævede egenskaber, nemlig hydrofili og hårdhed. Som holde- 2 0 punkt for den ønskede hårdhed i vandfri tilstand kan gælde TXmaks :2° “ 250°c' især 50 ~ 200°C (ifølge DIN 53.445).

På den anden side bør de i skallens opbygning deltagende mono= mere selv hensigtsmæssigt ikke indeholde nogen stærkt nucle- ofile grupper (såsom eksempelvis -NH_, -SH). Endvidere bør 2 5 ^ skallen fortrinsvis ikke indeholde nogen aromatiske grupper.

Endvidere skal skallens bestanddele i sig selv være tværbundet på en eller anden måde. Y står som symbol på denne tværbinding eller på sammenknytningen med kernen.

3 0 I betydningen af den skematiske afbildning skal endvidere de i første række for skaldelens hydrofili ansvarlige bestanddele betegnes som B, idet yderligere bestanddele, hvis udvælgelse i første række skal afstemmes med den resulterende hårdhed af det samlede polymerisat, betegnes som A. De for 35 skalopbygningen af den til anvendelse ifølge opfindelsen be stemte latex nævnte betingelser opfyldes f.eks. af copolymeri-sater af methacrylat- og/eller acryltypen, idet den kvalitative og den kvantitative del skal dimensioneres således, at de ovenfor anførte kriterier for polymerlatexens skal er op-

DK 163668B

11

I betragtning som hydrofile bestanddele B kommer f.eks. eventuelt substituerede methacrylamider og acrylamider med den almene formel I

5 CH2 = C - CONR3E4 (i) R1 hvori R.^ betyder hydrogen eller methyl, og R^ og R^ uafhængigt af hinanden betyder hydrogen eller en alkylgruppe med jq 1-4 carbonatomer, altså usubstituerede amider samt de med primære og sekundære aminer dannede amider. Nævnes skal især (meth)acrylsyreamid/ N-methyl- (henholdsvis isopropyl-eller -butyl)-(meth)-acrylsyreamid, Ν,Ν-dimethyl-(meth)-acrylsyreamid, samt endvidere (meth)acrylsyremorpholid 15 (særtilfælde, hvor nitrogenet via R^ og R^ er del af en ring) og N-vinylpyrrolidon-2.

Dertil kommer hydroxygruppeholdige monomere af acrylat- eller methacrylattypen, især hydroxygruppeholdige estere eller 2o amider af acryl- og methacrylsyre samt alkoxyalkylester-

og/eller amider af acryl- og methacrylsyre til de hydrofile monomere af typen B, f.eks. repræsentanter med den almene formel II

25 CH2 = C - CO - [Q - (CH2)p]m - OR*2 (I1) ' R1 hvori R*^ betyder hydrogen eller methyl, R* ^ betyder hydrogen eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, Q betyder oxygen 30 eller en gruppe -NR'^r hvori R" står for hydrogen eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, p er et helt tal fra 1 til 3, fortrinsvis 2, og m er et helt tal fra 1 til 25, med det forbehold, at når Q står for oxygen, skal p ikke være lig med 1. Nævnes skal især hydroxyethylacrylat, hydroxyethyl= 35 methacrylat, 2-hydroxyethyl(meth)acrylamid, 2-hydroXypropyl- (meth) acrylamid og (meth) acrylsyremonoestere af glycerol og andre polyoler.

Til monomertypen B hører endvidere sulfoethylacrylater og i- ti 7 ί Ί τμλ 4-Τ-» a nvtr Ί J- «V- e* i"· H — Μ ««r ri ·>» 4 An*» 12

DK 163668 B

ethylmethacrylamider. Som hydrofile grupper i latexens skal kan endvidere indbygges polymeriserbare syrer, såsom (meth)- acrylsyre, itaconsyre eller maleinsyre eller polymeriserbare tertiære aminer, såsom 2-N,N-dimethylaminoethyl-(meth) acryl= amid eller -(meth)acrylsyreester eller 3-N,N-dimethylamino= 5 propyl-(meth)acrylamid eller -ester. Til undgåelse af en ensidig opladning af latexpartiklerne bør disse sure eller basiske grupper altid samtidig være til stede i en partikel (f.eks. methacrylsyre og 2-N,N-dimethylaminoethyl-(methacry= lat)).

10

Som monomere af typen A kommer ikke eller højst i begrænset grad vandopløselige monomere på tale, idet den kvalitative og den kvantitative andel må afpasses således, at det ovenfor anførte kriterium for hårdheden af det resulterende po= 15 lymensat opfyldes.

a) Estere af acryl- og/eller methacrylsyre med c;j/"C2o“ alkoholer, især methyl-, ethyl- samt propyl- og butyl= esteren af methacrylsyre, samt methyl-, ethyl-, propyl- 20 og buty lesteren og 2-ethylhexy lesteren af acrylsyre.

b) Copolymeriserbare monomere af vinylacetattypen, især vinylacetat, vinylpropionat, vinylbutyrat og vinyliso= butyrat.

25

Det vil forstås, at de såkaldt "bløde" monomere af typen A kun kan være til stede i underordnet mængde, i almindelighed i en mindre mængde end 50 vægt%, regnet i forhold til skallens polymer.

30 Hårdheden eller de andre relevante egenskaber af polymerisat-filmene af de individuelle monomere er kendt tilligemed deres bidrag til egenskaberne af copolymerisater [se U.S.A.patentskrift nr. 2.795.564, H.Rauch-Puntigam, T.Volker, i 35 "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer-Verlag, Berlin 1967, side 303-304, og T.G.Fox, Bull.Am.Phys.Soc. 1, 123 (1956)] .

13

DK 163668 B

Mængden af tværbinderen Y må afpasses således, at en bortsvømning af latex-skallen ikke længere er mulig, og i reglen kræves mindst 0,1 vægt% dertil. Større mængder tværbinder virker på ingen måde generende, så at der i reglen 5 anvendes mængder fra 0,1 til 20%, især indtil 10 vægt%.

Fra kemiske synspunkter kan Y være ethvert multifunktionelt acrylat eller methacrylat, f.eks. glycoldimethacrylat, butan= dioldiacrylat, triethylenglycoldimethacrylat, tetraethylen= glycoldiacrylat, pentaerythrittetraacrylat etc. Derved skal 10 ikke alle funktionelle OH-grupper i den til grund for tværbindingsmidlet liggende polyol være forestret med polymeriser-bare syrer (f.eks. pentaerythritdimethacrylat 2 frie OH-grupper) , så at disse tværbindingsmidler også kan have helt igennem hydrofil karakter. Et andet eksempel på et hydrofilt 15 tværbindingsmiddel Y er N,N-methylenbis(methacrylamid). Endvidere kan der selvsagt som tværbinder også anvendes sådanne monomere, som foruden en let polymeriserbar gruppe indeholder enheder, der er lette at pode, f.eks. allylmethacrylat.

Kernen i kerne-skal-partiklerne ifølge opfindelsen er ikke 20 egentligt kritisk, såfremt den betingelse er opfyldt, at de resulterende latexpartikler er formstabile, d.v.s. i sig selv har tilstrækkelig stivhed. Med henblik på teknikkens krav skal redispergerbarheden af kerne-skal-latexsysternet være sikret. Kernens polymermateriale kan eksempelvis dels op-25 fylde disse krav ved, at der er tale om et i og for sig blødt, men kraftigt tværbundet polymerisat, og dels ved, at der er tale om et i og for sig hårdt (tværbundet eller ikke-tvær-bundet) polymerisat. Det ligger i naturen af kerne-skal-opbygningen, at generende vekselvirkninger, som kan udgå fra 30 kernematerialet, er mindre at befrygte, så at der også i denne henseende foreligger en relativ valgfrihed. Kernen kan derfor være bærer af den til en fysisk separation eller identifikation egnede egenskab, f.eks. bærer af en ad fysisk vej 14

DK 163668 B

konstaterbar markering. Dermed kan der eksempelvis være tale om farvestoffer, fluorescensfarvestoffer og lignende. Endvidere kan kernen som følge af sin fra det omgivende medium afvigende vægt muliggøre den fysiske separering.

5 Mulig er følgelig en opbygning af kernematerialet af sådanne monomere eller comonomere, som er forligelig med kravet om latexens redispergerbarhed, f.eks. alle copolymerisatsammensætninger af derivater af methacrylsyre og acrylsyre samt forskellige vinylestere, som bibringer copolymerisatet 10 en (ifølge DIN 53.445) på mindst 0°C, f.eks. co= polymerisater af methylmethacrylat, butylmethacrylat,' methyl= acrylat og forskellige andre. Medens der på skal-materialeområdet til stadighed må tages hensyn til den manglende tilstedeværelse af aromatiske grupperinger (potentielle hapten-15 egenskaber), kan der i latexens kerne selvsagt også anvendes monomere af styrentypen, f.eks. styren, vinyltoluen og di= vinylbenzen, og dermed også copolymerisater af styren og maleinsyre- eller fumarsyreestere.

Hvis kernepolymerisatets glastemperatur ligger tydeligt under 20 0°C, anbefales medanvendelsen af mindst 1% tværbinder, f.eks.

glycoldimethacrylat, divinylbenzen etc. I forbindelse med kravet om en fra bærermediets massefylde eller fra den kontinuerlige fases massefylde afvigende massefylde af det samlede system har først og fremmest sådanne monomere særlig be-25 tydning, som giver latexen en forøget massefylde. Til rådighed står især "tunge" monomere, altså specielt sådanne med et eller flere halogenatomer, især chlorerede eller bromerede monomere. Nævnes skal eksempelvis vinylforbindelser, såsom vinylchlorid, styrenderivater, såsom chlor- eller bromstyren, 30 samt derivater af (meth)acrylsyren, som bærer disse tunge grupper på sidekæden, f.eks. 2,4,6-tribromphenoxyethylmethacrylat. Alternativt kan man også opbygge kernen af monomere, hvis massefylde som polymere adskiller sig mindre stærkt fra massefylden af bæremediet eller af den kontinuerlige fase. I et

DK 163668B

15 sådant tilfælde skal kernens størrelse forøges så meget, at der alligevel sikres en god separerbarhed.

Fremstillingen af kerne-skal-partiklerne af den ifølge opfindelsen anvendelige art kan ske i analogi med de i og for sig 5 kendte metoder, jfr. tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.722.752. Til foretrukne udførelsesformer skal eksempelvis i det følgende anføres fremgangsmåderne til fremstilling af et kerne-skal-latexmateriale med grov partikelstørrelse og et findelt kerne-skal-latexmateriale. Om en latex skal have grov parti-10 kelstørrelse eller være findelt, fastlægges hensigtsmæssigt ved hjælp af kernematerialet. Fremstillingen af en polyme-risatkerne med grov partikelstørrelse kan eksempelvis ske ved hjælp af en fuldstændig emulgatorfri polymerisation.

En fordelagtig udførelsesform består i, at monomeren eller 15 monomerblandingen i løbet af 0,5 - 4 timer tildryppes til et til ca. 50 - 100°C opvarmet vandforlag, som indeholder en tilstrækkelig mængde af en vandopløselig initiator, såsom eksempelvis kalium- eller ammoniumperoxiddisulfat, hydrogenperoxid eller salte af 4,4'-azobis(cyanovalerianesyre). I stedet 20 for en termisk polymerisation i området fra 50 til 100°C kan reaktionen imidlertid ved hjælp af et redox-initiator-system også initieres ved lavere temperatur. Også olieopløselige startere, såsom eksempelvis dibenzoylperoxid eller azoisosmørsyredinitril, er egnede som polymerisationsinitia-25 torer. I disse tilfælde er medanvendelsen af i det mindste ringe mængder emulgator fordelagtig eller også nødvendig. En anden vej til opnåelse af store latexpartikler fører via en flertrinsmetode ved hjælp af kernelatex. I dette tilfælde påpolymeriserer man i et andet eller i yderligere nogle ef-30 terfølgende trin den ønskede monomer eller monomerblanding på en forinden vilkårligt fremstillet kernelatex. Som frem- 16

DK 163668 B

gangsmåde kommer såvel batch-, flerdobbeltbatch- eller, endnu bedre, monomer- eller emulsionstilførsel på tale. Væsentligt for denne udførelsesform er det, at den samlede emulgatorkoncentration i de efter kernelatexen følgende 5 trin holdes så lav, at al monomer påpolymeriserer på disse kernelatex-partikler, og ingen nydannelse af partikler finder sted. Særligt store polymerisatkerner opnås da, når man som kernelatex anvender de først beskevne uden emulgator fremstillede grovpartiklede latexer (jfr. 10 europæisk offentliggørelsesskrift nr. 79.101.398.0 og tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.833.601).

Grovpartiklede systemer opnår man også, når man i et første trin fremstiller en kernelatex, der indeholder et po= lymerisat med meget lav molekylvægt. Disse latexpartikler 15 kan kvældes med monomer eller monomerblandinger og polyme-riseres til store latexpartikler. Medanvendelsen af underordnede mængder af et fuldstændig vanduopløseligt materiale sammen med monomeren eller monomerblandingen kan have lignende virkning som den lavmolekylære polymer (se tysk of-20 fentliggørelsesskrift nr. 2.751.867, og europæisk patent u nr. 0.003.905). Kerner med grov partikelstørrelse (f.eks. med en diameter fra ca. 0,5 til mere end 2 μια, er fordelagtige, når kernepolymerisatets massefylde ikke afviger kraftigt fra massefylden af bærermediet eller af den kontinu-25 erlige fase.

Fremstillingen af en findelt polymerisatkerne repræsenterer i princippet syntesen af en latex i overensstemmelse med de kendte kriterier for emulsionspolymerisation, hvorved den ønskede størrelse af kerne-latex-partiklerne indstilles 30 ved hjælp af emulgatorkoncentrationen ved begyndelsen af po= lymerisationen. Som følge af den kendsgerning, at kernematerialets sammensætning er relativt ukritisk, er det i princippet også her muligt at anvende enhver latex som 17

DK 163668 B

kernemateriale, såfremt det opfylder de nævnte krav, såsom eksempelvis formstabilitet og høj massefylde. Til fremstillingen af det findelte kernemateriale egner sig som fremgangsmåde éttrins- eller flertrinsbatch-, monomer-5 eller emulsionstilførsel eller kontinuerlige arbejdsmåder.

Som initiatorer kan de i ovenstående afsnit til fremstillingen af den storpartiklede kerne-latex nævnte vandopløselige eller olieopløselige starter anvendes. Polymerisationen kan, som angivet deri, foregå rent termisk eller ved hjælp af 10 et redoxsystem. Som emulgatorer egner sig i princippet alle anioniske, kationiske, ikke-ioniske eller amfotere tensider, enkeltvis eller i kombination, idet anioniske og/eller ikke-ioniske emulgatorer foretrækkes. En særlig fordelagtig udførelsesform til en fremstilling af findelte kerne-latexer 15 består i, at man opvarmer en hensigtsmæssig puffer- (ca.

pH 7) og emulgatorholdig opløsning til den ønskede polymerisationstemperatur, tilsætter en vandopløselig initiator i visse mængder og derpå i løbet af 0,5 - 6 timer tildrypper en monomer emulsion (inklusive tværbinder). Findelte kerner, 20 f.eks. med en diameter fra ca. 0,1 til 0,5 pm, kan da benyttes, når massefylden af kernepolyraerisatet adskiller sig tilstrækkelig meget fra massefylden af bæremediet eller af den kontinuerlige fase.

Polymerisationen af skallen på latex-kemen kan foregå umid-25 delbart i tilknytning til polymerisationen af kernematerialet. Fremgangsmåden er i princippet lig med de metoder, som ovenfor er blevet beskrevet for kerne-latexen. Monomerblandingen i skalsammensætningen, i hvilken monomerene af SRX-typen hensigtsmæssigt befinder sig,bliver som sådan eller som emul-30 sion i vand eller pufferopløsning sat til kerne-latexen i 18

DK 163668 B

løbet af 0,5 - 4 timer, idet der atter må sørges for, at den samlede emulgatorkoncentration forbliver så lav, at nydannelse af partikler undgås. Eventuelt kan det være nødvendigt samtidig at dosere to forskellige monomertil-5 førsler, hvoraf den ene eventuelt indeholder vand. Dette er altid nødvendigt, når monomerene ikke er indbyrdes opløselige, eller når kun en del af monomerene er opløselig i vand, men den anden del ikke er opløselig i vand.

Skalmonomeren påpolymeriserer under disse forudsætninger 10 på den tilstedeværende polymerisatkerne. Det kan vise sig hensigtsmæssigt før tilførslen af skalmonomerene at efter-tilføre en initiator eller pufferopløsning, især når polymerisationen af latex-kernen ikke er foretaget i pufferopløsning, og når skalmonomerene tilsættes som monomertilførsel.

15 Tilsætningen af en puffer er først og fremmest overordentligt vigtig, når der med de funktionelle monomere Z'(R)n-X er tale om højreaktive forbindelser. Således vil man naturligt afstemme pufferblandingerne på en sådan måde, at en ødelæggelse af disse reaktive grupper (f.eks. som følge af hydrolyse) 20 under forløbet af syntesen af latexpartiklerne holdes så ringe som muligt. Polymerisationsbetingelserne er ud over en begrænset emulgatorkoncentration svarende til dem, der er beskrevet til fremstilling af kernen. Enkelt- eller flerdobbelt-batch er mulige som fremgangsmåder, men en monomer-, eller 25 emulsionstilførsel foretrækkes. Polymerisationen kan foregå termisk i området fra ca. 50 til 100°C, eller den kan ved hjælp af et redox-initiatorsystem også foregå ved lavere temperatur. Som polymerisationsihitiatorer kommer fortrinsvis de ved emulsionspolymerisation sædvanlige vandopløselige 30 startere på tale. Der kan imidlertid principielt også anvendes olieopløselige initiatorer, når blot disses nedbrydningstemperatur ligger i det anførte temperaturområde.

Et hensigtsmæssigt forhold mellem skaltykkelsen og kernestørrelsen forligger eksempelvis, når vægten af kernematerialet 19

DK 163668 B

forholder sig til vægten af skalmaterialet som 1:3 til 5:1, men også mere ekstreme kerne-skal-forhold er principielt mulige (10:1). Det vil forstås, at skal-andelen i almindelighed skal vælges desto større, jo mindre latex-kernen er.

5 Latexerne fremkommer i form af relativt lavviskose vandige dispersioner. Polymerindholdet kan - som rettesnor - eksempelvis ligge i området fra 15 til 30 vægt%. Principielt er imidlertid faststofindhold fra mindre vægtprocenter indtil ca. 70 vægt% mulige.

10 Anvendelse af kerne-skal-Jatexpartiklerne til fremstilling af diagnostiske reagenser.

De diagnostiske reagenser kan ifølge opfindelsen fremstilles ved omsætning af de omhandlede kerne-skal-latexpartikler med de biologisk virksomme stoffer eller strukturer. De biolo-15 gisk virksomme stoffer eller strukturer kan eksempelvis være "immunologisk aktivt" materiale. Som "immunologisk aktivt" materiale kan eksempelvis komponenter i fysiologisk væsker, celle- og vævsekstrakter komme på tale, forudsat at et immunologisk modreagens står til rådighed, eller dette lader 20 sig fremstille.

Som repræsentative eksempler på immunologisk aktive materialer skal nævnes eksempelvis aminosyrer, peptider, proteiner, enzymer, lipoproteiner, glycoproteiner, lipoider, nuclein-syrer, polysaccharider, primære aminer, alkaloider, hormoner, 25 vitamin, steroler og steroider. Som immunologisk aktive strukturer skal eksempelvis nævnes mikroorganismer, såsom grampositive og gramnegative bakterier, spirokæter, mycoplas= ma, mycobakterier, vibrioner, aktionomyceter, protozoer, såsom intestinale protozoer, amøber, flagellater, sporozoer, 30 intestinale nematoder og vævsnematoder (orm), trematoder (schistosomer, igler), cestoder, toksoplasma, samt svampe, såsom Sporotrichum, Cryptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, 20

DK 163668 B

Coccidioides, Candicta, vira og ricketsier, såsom hunde-hepatitis/ Shope's Papillom, influenza A + B, hønsepest/ Herpes-simplex,, Adeno-vira, polyaner, Rous-Sarkom, vaccinationskopper, Polio-virus, mæslinger, hundesyge, leukæmi, 5 fåresyge, Newcastle-syge (Newcastle-disease, pseudohønsepest),

Sendai, ECHO, mund- og klovsyge, Psittacosis, Rabies, Ex-tromelia, træ-vira samt endvidere vævsantigener, hormoner, såsom hypofysehormon, insulin, glucagon, thyroid-hormon, choriongonadotropin, choriont væksthormon-prolactin, human-10 placenta-lactogen, enzymer, såsom pancreas-chymotrypsinogen, procarboxypeptidase, glucoseoxidase, lactatdehydrogenase, uricase, aminosyre-oxidase, urease, asparaginase, proteaser, blodcelleantigener, blodgruppestoffer og andre isoantigener, såsom blodplader, leucozyter, plasmaproteiner, mælkeproteiner, 15 spytproteiner, urinproteiner og antistoffer inklusive auto antistoffer.

Anvendelse af kerne-skal-latexpartiklerne til immobilisering af enzymer.

Til omsætning .af partiklerne ifølge opfindelsen med enzymer kan 20 man på enkel måde inkubere enzymet i vandigt miljø, fortrinsvis ved tilnærmelsesvis fysiologiske betingelser, eksempelvis i en egnet efter enzymtypen afstemt puffer, med en passende mængde af latexen, fortrinsvis ikke væsentligt over stuetemperatur og under moderat omrøring, og når epoxygruppen an-25 vendes som funktionel gruppe, kan der f.eks. arbejdes uden begrænsning inden for pH-området 7 - 9. Generelt skal der til omsætningen regnes med et tidsrum på indtil flere dage, eksempelvis 3 dage. Det ikke-covalent bundne enzym kan fraskilles ved hjælp af flere ganges centrifugering (ca. ved 30 5.000 omdr./min.) og redispergering i pufferopløsning. Be stemmelsen af aktiviteten kan ske i analogi med de kendte enzymspecifikke bestemmelsesmetoder. En særlig fordel ved den foreliggende opfindelse består i, at også de fyldte la= taxer kan redispergeres og - eksempelvis i form af et fryse- 21

DK 163668 B

tørret pulver - eventuelt kan opbevares i et længere tidsrum. Den begrænsende faktor er i alle tilfælde stabiliteten af det fikserede biologiske materiale.

Latexpartiklerne ifølge opfindelsen kan også anvendes som bærere 5 af andre - f.eks. industrielt anvendelige - enzymer i passende form. Nævnes skal eksempelvis acylaser, penicillinaserne, glucose-isomerase, peroxidaser etc.

I forskellige aspekter, f.eks. til at følge immunagglutina-tionen, kan det - som allerede nævnt - være fordelagtigt at 10 forsyne latexerne med en markering, eksempelvis et fluorescens- farvestof.

Polymer partiklerne ifølge den foreliggende opfindelse egner sig til immobilisering af mikroorganismer generelt, idet omsætningsbetingelserne svarer til betingelserne ved immobili-15 sering af proteiner. I forhold til teknikkens standpunkt frembyder den foreliggende fremgangsmåde en bedre tilgængelighed af den immobiliserede mikroorganisme i forhold til substratmolekyler. Fremhæves skal den ringe cytotoksicitet, der er særegen for den foreliggende immobiliseringsmetode.

20 De ovenstående synspunkter gælder også for immobiliseringen af vira og af eucariotiske celler. Den polyfunktionelle natur af polymerlatexerne muliggør også generelt deres anvendelse til tværbinding af biologisk virksomme materialer.

Under dette aspekt får især latexpartiklerne med lille dia-25 meter (rettesnor ca. 500 Å) særlig betydning. Også inden for den præparative organiske syntese kan polymerlatexerne ifølge opfindelsen med fordel anvendes, hvorved man ikke nødvendigvis behøver at arbejde i vandigt miljø, men også kan (med)anvende organiske reaktionsmedier. Der kan eksempelvis 30 på denne måde indføres beskyttelsesgrupper. Et særligt interessant aspekt ligger i anvendelsen i forbindelse med en peptidsyntese ifølge Merrifield (se Merrifield, Adv.En-zymol.32 (1969) 221 - 296).

22

DK 163668 B

1. Fremstilling af latex 1 (eksempel på en latex med grov partikelstørrelse).

a) Syntese af stamdispersionen.

I en polymerisationsbeholder udstyret med tilbagesvaler, 5 omrører og termometer anbringes 1.600 g vand, og der op varmes til 80°C. Efter tilsætning af en monomerblanding bestående af 3 g isobutylmethacrylat, 3 g methylmetha= crylat og 0,3 g ethylenglycoldimethacrylat tilsættes 4 g ammoniumpersulfat opløst i 36 g vand.

10 Derpå tildrypper man, ligeledes ved 80°C,en blanding af 200 g isobutylmethacrylat, 200 g methylmethacrylat og 20 g ethylenglycoldimethacrylat i løbet af 2 timer. Efter afslutning af monomertiIsætningen lader man henstå i yderligere 1 time ved 80°C. Man opnår en koagulatfri, 15 let filtrerbar lavviskos ca. 20%-ig dispersion.

b) Syntese af den oxirangruppeholdige dispersion.

I en polymerisationsbeholder udstyret med tilbagesvaler, omrører og termometer anbringes 350 ml vand. Dertil sættes 10 ml af en phosphatpufferopløsning, pH 7 (Titrisol, 20 Merck), og 80 g af stamdispersionen. Efter opvarmning til 80°C tilsætter man 0,4 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(4-cyanovalerianesyre) i 4 ml vand.

Derpå tilsætter man en emulsion bestående af 1.000 g vand, 1 g natriumlaurylsulfat, 2 g natriumsalt af 4,4'-azobis-25 (cyanovalerianesyre), 150 g methylmethacrylat, 150 g iso= butylmethacrylat, 15 g ethylenglycoldimethacrylat i løbet af 3 timer ved 80°C. 1 tilslutning dertil tilsættes i løbet af 60 minutter samtidig en opløsning af 20 g methacrylsyreamid og 0,6 g 23

DK 163668 B

natriumsalt af 4,4'-azobis(4-cyanovalerianesyre) i 300 g vand samt en monomerblanding bestående af 35 g methylmethacrylate 40 g glycidylmethacrylat samt 4 g ethylenglycoldimethacrylat. Derpå omrøres yderligere i 5 60 minutter ved 80°C. Man opnår en koagulatfri, lav viskos dispersion med et faststofindhold på ca. 20%. Partikelstørrelsen er ca. 2 um.

2. Fremstilling af latex 2 (eksempel på en latex med grov partikelstørrelse).

10 a) Syntese af stamdispersionen.

I en polymerisationsbeholder ifølge det foregående eksempel anbringes 1.600 g vand/ og der opvarmes til 80°C. Efter tilsætning af en monomerblanding bestående af 6/24 g styren og 0,06 g allylmethacrylat tilsætter man 15 4 g ammoniumpersulfat opløst i 36 g vand. Man tildrypper, ligeledes ved 80°C/en blanding af 415 g styren og 5 g allylmethacrylat i løbet af 2 timer. Efter afsluttet monomertilsætning lader man henstå i yderligere 2 timer ved 80°C. Man opnår en koagulatfri, groft filtrerbar og 20 viskos ca. 20%-ig dispersion.

b) Syntese af den oxirangruppeholdige dispersion.

Man går frem som i eksempel 1, men opvarmer til 85°C og tilsætter 1,0 g natriumsalt af 4,4'-azobis(4-cyanovale= rianesyre) i 10 ml vand. Dertil sætter man i løbet af 25 3 timer ved 85°C en emulsion af: 1.000 g vand, 1 g na= triumlaurylsulfat, 4 g natriumsalt af 4,4'-azobis(cyano= valerianesyre), 312 g styren og 4 g allylmethacrylat.

X tilslutning dertil tilsættes samtidig en opløsning af 20 g methacrylsyreamid og 0,6 g natriumsalt af 4,4'- 30 azobis(4-cyanovalerianesyre) i 300 g vand samt en monomer- 24

DK 163668 B

blanding bestående af 35 g methylmethacrylat, 40 g gly= cidylmethacrylat samt 4 g ethylenglycoldimethacrylat.

Derpå omrøres i yderligere 60 minutter ved 80°C. Man opnår en koagulatfri, let filtrerbar lavviskos dispersion med et faststof indhold på 20%. Partikelstørrelsen er ca. 2 μιη.

5 3. Fremstilling af latex 3 (eksempel på findelt latex).

I en polymerisationsbeholder med den ovenfor beskrevne udrustning opløses 5 ml phosphatpufferopløsning (pH 7, Titrisol, Merck), 0,03 g natriumlaurylsulfat og 0,2 g 10 natriumsalt af 4,4'-azobis-(4-cyanovalerianesyre) i 100 ml vand. Man opvarmer til 80°C og tildrypper i løbet af 3 timer en emulsion bestående af 0,1 g natriumlauryl= sulfat, 0,5 g natriumsalt af 4,4'-azobis(4-cyanovaleriane= syre), 80 g methylmethacrylat, 15 g (2-ethyl-[2,4,6-tri= 15 bromphenoxy]-ethyl)-methacrylat, 5 g ethylenglycoldimeth= acrylat og 200 g vand. Derpå sætter man i løbet af 90 minutter samtidig til reaktionsblandingen en opløsning af 5 g methacrylsyreamid i 75 g vand og en monomerblanding bestående af 10 g glycidylmethacrylat, 1 g ethylenglycol= 20 dimethacrylat, og 9 g methylmethacrylat.

Derpå opretholder man i yderligere ca. 60 minutter en temperatur på 80°C. Der opnås en ca. 25%-ig lavviskos dispersion med partikelstørrelsen 0,3 ym. Indholdet af oxirangrupper andrager 31% af det benyttede glycidylmeth= acrylat (titrering med natriumthiosulfat).

25 4. Fremstilling af latex 4.

4a. Fremstilling af kerne-dispersionen.

I en polymerisationsbeholder med den i eksempel 1 beskrev- 25

DK 163668 B

ne udrustning anbringes 0,3 g natriumtetradecylsulfonat, 0,6 g ammoniumpersulfat og 500 g destilleret vand, og der opvarmes til 80°C. Til dette forlag drypper man ved 80°C i løbet af 6 timer en emulsion bestående af 500 g 5 p-bromstyren, 300 g fumarsyrediethylester, 4 g natrium= tetradecylsulfonat, 4 g ammoniumpersulfat og 710 g destilleret vand.

Efter afsluttet tilsætning omrøres i yderligere 2 timer ved 80°C, hvorefter der køles til stuetemperatur og fil-10 treres. Dispersionen er lavviskos og har et faststof indhold på ca. 40%.

4b. Fremstilling af kerne-skal-dispersionen.

500 g af den 40%-ige dispersion 4a indstilles på pH 7,0 med phosphatpuffer og fortyndes med en opløsning bestå-15 ende af 1 g af natriumsaltet af 4,4'-azobis-(cyanovaleri= anesyre) og 0,5 g natriumtetradecylsulfonat i 1.000 ml destilleret vand indtil et volumen på ialt 1.000 ml (= 20%-ig dispersion 4a med pH 7,0). Man opvarmer denne blanding til 80°C i en polymerisationsbeholder, opret-20 holder denne temperatur i 15 minutter og tildrypper der på samtidig ved 80°C følgende 2 opløsninger:

Opløsning A: 20 g 2-brommethylmethacrylat 2,5 g glycoldimethacrylat 17,5 g N-t.butylmethacrylamid 25 10 g methylmethacrylat.

Opløsning B: 1 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(cyano= valerianesyre) i 50 g destilleret vand.

TiIdrypningstiden er ca. 2 timer. Doseringshastigheden 30 skal for de to tilsætningers vedkommende så vidt muligt 26

DK 163668 B

være lige store. Efter afsluttet tilsætning lader man henstå i yderligere 1 time ved 80°C. Derpå afkøles og filtreres. Der opnås en findelt, lavviskos dispersion med et faststofindhold på ca. 23%.

5 4c. Fremstilling af kerne-skal-dispersionen.

Man går frem som i eksempel 4b (fortynding af dispersionen 4a, neutralisation etc.), men doserer følgende opløsninger:

Opløsning A: 10 g vinylacetat 10 30 g chloreddikesyrevinylester 2.5 g methylenbisacrylamid 7.5 g acrylamid.

Opløsning B: 2 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(cyano= valerianesyre) i 50 g destilleret 15 vand.

Tildrypningstiden er ca. 3 timer, og efter afsluttet tilsætning lader man henstå i yderligere 2 timer ved 80°C. Efter afkøling og filtrering opnås en findelt, lavviskos dispersion.

20 5. Syntese af latex 5.

Trin I.

I en polymerisationsbeholder ifølge eksempel 1 placeres følgende komponenter: 1.550 g destilleret vand 25 0,8 g natriumlaurylsulfat 3.2 g methylmethacrylat 3.2 g isobutylmethacrylat.

27

DK 163668 B

og der opvarmes til 80°C under omrøring. I tilslutning dertil tilsættes en opløsning af 4 g ammoniumpersulfat i 40 ml vand. Derpå tilsætter man ved 80°C en monomerblanding bestående af 190 g methylmethacrylat/ 190 g 5 isobutylmethacrylat og 20 g glycolbismethacrylat.

Varigheden af monomertiIsætningen er 2 timer. Efter afsluttet tilsætning lader man henstå i yderligere 2 timer ved 80°C. Efter afkøling opnås en let filtrerbar koagulat-fri dispersion med et faststofindhold på 19%, pH 2,2.

10 Viskositeten er 4 mPa.sek.

Trin II.

I en polymerisationsbeholder ifølge eksempel 1 placeres 160 g af dispersionen fra trin I, hvortil man sætter 10 g phosphatpuffer, pH 7 (Titrisol, Merck)/ 0f4 g natri= 15 umsalt af 4,4'-azobis-(cyanovalerianesyre) og 310 g de stilleret vand. Man opvarmer denne blanding til 80°C og tilsætter i løbet af 3 timer følgende emulsion: 143 g methylmethacrylat 143 g isobutylmethacrylat 20 15 g ethylenglycolbismethacrylat 1 g natriumlaurylsulfat 1/8 g natriumlaurylsulfat 970 g destilleret vand.

I umiddelbar tilslutning dertil tilsætter man samtidig de 25 to følgende blandinger (varighed 1 time):

Blanding A: 44 g methylmethacrylat 4 g ethylenglycolbismethacrylat 42 g glycidylmethacrylat.

28

DK 163668 B

Blanding B: 0,6 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(cyano= valerianesyre) 10 g methacrylamid 320 g destilleret vand.

5 Efter afsluttet tilsætning lader man henstå i yderligere 1 time ved 80°C. Efter afkøling opnås en koagulatfri dispersion med et faststofindhold på ca. 19%. Partikelstørrelsen er ca. 0,4 ym.

6. Rensning af latexen ifølge eksempel 1 10 (fjernelse af syntebetingede hjælpestoffer, emulgatorer, initiatorer etc.).

10 ml af dispersionen 1 centrifugeres i 15 minutter ved 5.000 omdr./min. Det overstående serum hældes fra, hvor på partiklerne redispergeres i IN NaCl (1 g polymerisat-15 faststof i ca. 50 ml IN NaCl). Derpå centrifugeres i 10 minutter ved 5.000 omdr./min. og dekanteres. Redis-pergeringen i IN NaCl og centrifugeringen gentages yderligere to gange. 1 tilslutning dertil redispergeres partiklerne i 0,05M 20 phosphatpuffer, pH 7,5 (1 g polymerisat-faststof i 50 ml 0,05M phosphatpuffer, pH 7,5) . Der centrifugeres i 10 minutter ved 5.000 omdr./min., og den overstående væske frahældes. Denne proces gentages en gang. Lagringen af den således opnåede latex sker i køleskab ved +5°C.

25 7. Rensning af latexen ifølge eksempel 3.

Man går frem som i eksempel 6, men forøger centrifugerings-tiden til 30 minutter (5.000 omdr./min.).

8. Omsætning til immobilisering af trypsin.

15 ml af dispersionen ifølge eksempel 1 (ca. = 3 g polyme= 29

DK 163668 B

risat-faststof) tilsættes 300 mg trypsin (opløst i 6 ml 1M phosphatpuffer, pH 7,5), hvorpå der omrøres i 72 timer ved 23°C.

Ikke-covalent bundet enzym fjernes derefter ved hjælp 5 af tre ganges centrifugering og redispergering i 0,05M

phosphatpuffer (gennemførelse ifølge eksempel 6) .

9. Måling af aktiviteten af det immobiliserede enzym« a) Hydrolyse af N-benzoyl-arginin-ethylester (BAEE) ved 37°C og pH 7,5 (pH-stat) .

10 1 g af tørstoffet fra den ved hjælp af centrifugering rensede latex ifølge eksempel 8 (benyttet som ca. 2 g fugtigt materiale med ca. 1 g vand) dispergeres i 20 ml af en 2%-ig BAEE-opløsning.

γ)

Anvendelse Aktivitet [U/g] 15 1. anvendelse 14,2 2. anvendelse 12,1 3. anvendelse 11,8 4. anvendelse 11,8 x)

Aktiviteter regnet i forhold til 1 g bærermateriale; 20 en U svarer til 1 ymol/min., målt ved hjælp af begyn delseshastigheden .

b) Hydrolyse af casein (37°C, pH 8,0).

1 g af tørstoffet fra den ved hjælp af centrifugering rensede latex ifølge eksempel 8 (benyttet som ca. 2 g 25 fugtigt materiale med ca. 1 g vand) dispergeres i 20 ml af en 4%-ig caseinopløsning.

DK 163668B

30

Anvendelse Aktivitet [U/g bærermateriale] 1. anvendeIse 3,2 2. anvendelse 2,6 3. anvendelse 2,6 4. anvendelse 2,6 5 10. Frysetørring af en reaktiv latex.

15 ml af dispersionen ifølge eksempel 1 renses som beskrevet i eksempel 6. Derved opnås et polymerisat med ca. 50% restfugtighed. Denne centrifugerede latex frysetørres og lagres derpå ved -20°C i 6 måneder.

10 Redispergering af den frysetørrede latex.

Rédispergeringen foretages med 0,05 molær phosphatpuffer, pH 7,5. Derved skal der omrøres kraftigt i ca. 5 minutter. Alternativt kan den i pufferen suspenderede prøve også kortvarigt behandles med ultralyd.

15 Derefter følger omsætningen med enzymet som beskrevet i eksempel 8 (10% trypsin, regnet i forhold til den benyttede latex).

Aktivitet af den frysetørrede, i 6 måneder ved -20°C lagrede, redispergerede og med 10% trypsin omsatte latex:

Aktivitet [U/g]x^ Aktivitet [U/g]x^ 20 Anvendelse (substrat: BAEE) (substrat: Casein) 1. anvendelse 13,3 2,9 2. anvendelse 10,6 2,2 3. anvendelse 10,6 2,2 regnet pr. g bærematerxale.

x) 31

DK 163668 B

11. Frysetørring af en latex med immobiliseret trypsin.

1 g af den med trypsin omsatte latex (eksempel 8) frysetørres og lagres derpå i 6 måneder ved -20°C. Redisper-geringen foretages - som beskrevet i eksempel 10 - med 0. 05M phosphatpuffer.

5 Aktivitet i forhold til casein (1 g faststof fra den re- dispergerede latex i 20 ml 4%-ig caseinopløsning), 37°C, pH 8,0:

Anvendelse Aktivitet [U/g bæremateriale] 1. anvendelse 3,6 10 2. anvendelse 2,4 3. anvendelse 2,4 12. Immobilisering af trypsin.

Man går frem som i eksempel 8, men anvender til immobiliseringen af trypsinet 15 ml af dispersionen ifølge ek-15 sempel 3 (centrifugering i 30 minutter ved 5.000 omdr./min.).

Aktiviteter i forhold til casein som substrat (pH 8,0,37°C):

Anvendelse Aktivitet [ϋ/g bssremateriale] 1. anvendelse 5,5 2. anvendelse 4,2 3. anvendelse 4,0 20 13. Syntese af en fluorescensmarkeret latex.

I en polymerisationsbeholder ifølge eksempel 1 placeres 40 g af stamdispersionen la, hvortil man sætter 5 ml phosphatpuffer, pH 7 (Titrisol, Merck), 0,2 g natriumsalt 32

DK 163668 B

af 4,41-bis-(cyanovalerianesyre) og 180 g destilleret vand. Efter opvarmning af blandingen til 80°C tilsætter man - ligeledes ved 80°C - i løbet af 3 timer en emulsion bestående af: 127 g methylmethacrylat, 15 g isobutyl= 5 methacrylat, 7/5 g ethylenglycolbismethacrylat, 0,6 g

Flurol-grøn-guld/ 1/0 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(cyano= valerianesyre), 0,5 g natriumlaurylsulfat,og 450 g destilleret vand.

Efter afslutning af denne tilsætning (= latex-kerne) tiΙ-ΙΟ sætter man ved 80°C i løbet af 1 time samtidig de to føl gende blandinger:

Blanding A: 24 g methylmethacrylat 2 g ethylenglycolbismethacrylat 21 g glycidylmethacrylat.

15 Blanding B: 3 g methacrylamid 0/3 g natriumsalt af 4,4'-azobis-(cyano= valerianesyre) 155 g destilleret vand.

Efter afsluttet tilsætning lader man yderligere henstå i 20 60 minutter ved 80OC, hvorpå der afkøles. Der opnås en let filtrerbar, koagulatfri dispersion med et faststofindhold på 10%, pH 7,7 og viskositet 10 mPa.sek. Partikelstørrelsen er 2 jim. Fluorescensen ved UV-aktivering er tydeligt synlig, såvel makroskopisk som i fluorescens-25 mikroskop.

14ί: Immobilisering af antialbumin.

10 ml af dispersionen ifølge eksempel 5 fortyndes med 0/05M phosphatpuffer, pH 7,5, til 100 ml. (Phosphatpufferen tilsættes hensigtsmæssigt 0,05% natriumazid). Der

Claims

1. Polymerpartikler med kerne-skal-opbygning, der er redi sper-gerbare i en væske til dannelse af en latex til brug ved immobilisering af biologisk aktive stoffer, kendetegnet ved, at skallens polymermateriale I) er så hydrof i 11, at det 25 uden forankring til kernematerialet og/eller uden tværbinding i det mindste ville være delvis vandopløseligt, II) indeholder funktionelle grupper, der er egnede til covalent fiksering af de biologisk virksomme stoffer, III) i vandfri tilstand ifølge sin monomersammensætning har en Txmax> på 20 - 20°C, og IV) er 30 opbygget af 4,9 - 99,9 vægt% af en monomer, der bærer de funktionelle grupper, sammen med en hydrofil monomer B, 0 - 95 vægt% af den i det væsentlige ikke-hydrofi 1e monomer A og 0,1 - 20 vægt% tværbindende monomer, alle vægtprocenter regnet i forhold til den samlede vægt af skallens polymermateriale, med 35 det forbehold, at mængden af monomer bærende de funktionelle grupper udgør mindst 0,1 vægt%, hvorhos monomeren bærende de funktionelle grupper har formlen DK 163668 B Z' - (R)n-X> hvor Z* betegner en polymerisationsdygtig enhed, R er en afstandsholdende enhed og X en i vandig opløsning i pH-området 5 6,0 - 9,0 med de biologisk virksomme stoffers nucleofile grup per fortrinsvis reagerende funktionel gruppe, og n betyder 0 eller 1, at kernens polymermateriale er afstemt efter latex-partiklernes formstabilitet og deres redispergerbarhed og har en T\max. P& mindst 0°C, og at polymerpartiklernes gennemsnit-10 lige partikeldiameter ligger mellem 0,05 og 5 pm, idet vægten af kernens polymermateriale står i forholdet 1:3 - 10:1.

2. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at skallens poly- 15 mermateriale ikke indeholder aromatiske strukturenheder.

3. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at skallens polymermateriale er elektroneutralt. 20

4. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at monomererne af typen A og B for mindst 50 vægt%'s vedkommende, regnet i forhold til den samlede vægt af monomeren A eller B, 25 består af derivater af acryl- og/eller methacrylsyre.

5. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge ethvert af kravene 1 - 4, kendetegnet ved, at kernen er opbygget af et i sig selv blødt, men kraftigt 30 tværbundet polymermateriale.

6. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at kernen er opbygget af et i sig selv hårdt polymermateriale. 35

7. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølget ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at kernen bærer af en ad fysisk vej konstaterbar markering. DK 163668 B

8. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølget ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at kernen indeholder et eller flere farvestoffer.

9. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at kernen indeholder et eller flere fluorescensfarvestoffer.

10. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning 10 ifølge ethvert af kravene 1 - 9, kendetegnet ved, at kernen har en sådan massefylde, at den samlede polymerlatex bibringes en fra det til anvendelse bestemte vandige medium afvigende massefylde.

11. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge krav 10, kendetegnet ved, at kernene helt eller delvis er opbygget af sådanne monomerer, som giver den samlede polymerlatex en højere massefylde end det vandige mediums massefylde. 20

12. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge ethvert af kravene 1 - 11, kendetegnet ved, at den gennemsnitlige partikeldiameter andrager 0,5 til >2 pm.

13. Redispergerbare polymerpartikler med kerne-skal-opbygning ifølge ethvert af kravene 1 - 12, kendetegnet ved, at skallens vægtandel vælges desto større, jo mindre latexker-nen er.

14. Vandige 1atexer af de redispergerbare polymerpartikler ifølge kravene 1 - 13. 1 Vandige latexer af de redispergerbare polymerpartikler ifølge krav 14, kendetegnet ved, at de har et poly-35 merindhold på 15 - 30 vægt%, regnet i forhold til den samlede latex. DK 163668 B

16. Anvendelse af de vandige polymerlatexer ifølge kravene 14 - 15 til fremstilling af diagnostiske reagenser.

17. Anvendelse af de vandige polymerlatexer ifølge krav 14 - 5 15 til fremsti lling af diagnostika til påvisning af antigen- anti stofreakt i oner.

18. Anvendelse af redispergerbare polymerpartikler ifølge krav 1 til immobilisering af antistoffer. 10

19. Anvendelse af de vandige pol ymer 1atexer ifølge krav 14 -15 til immobilisering af mikroorganismer.

20. Anvendelse af de vandige polymerlatexer ifølge krav 14 - 15 15 til immobilisering af vira.

21. Anvendelse af de vandige polymerlatexer ifølge krav 14 -15 til immobilisering af et eller flere enzymer.

22. Anvendelse af de vandige polymerlatexer ifølge krav 14 - 15 til tværbinding af bio(makro)molekyler. 25 1 35