DE4026992A1 - Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialien - Google Patents
Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialienInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Trägersystemen für biologisch aktive Materialien mit
kovalenter Bindung an die polymer-beschichtete Oberfläche der
Trägermaterialien.
Die europäische Patentschrift Nr. 00 71 704 stellt
"Oberflächenreiche Systeme zur Fixierung von nucleophile
Gruppen enthaltenden Substraten" vor. Die reaktiven Einheiten
zur Bindung der die nucleophilen Systeme enthaltenden
Substrate sind dabei Bestandteil eines durch
Emulsionspolymerisation hergestellten Polymerlatex, der aus
0,03 bis 6 µm großen Latexteilchen aufgebaut ist und wobei der
Polymerlatex selbst zu einem oberflächenreichen System
aggregiert und/oder an einem oberflächenreichen Trägermaterial
fixiert ist.
Sofern die Verbindung der einzelnen Latexteilchen
untereinander nicht durch Filmbildung erfolgt, kann bei der
EP-C die Verknüpfung untereinander bzw. zum Träger durch
kovalente Bindungen geschehen. Gegebenenfalls kann die
kovalente Verknüpfung der Latexteilchen auch durch den Einsatz
von multifunktionellen Nucleophilen verstärkt werden. Auch der
Zusatz untergeordneter Mengen einer weichen, filmbildenden
Substanz, z. B. Latexteilchen mit niedrigerer Glastemperatur
wird erwähnt. Als besonders bevorzugt hat die Ausfällung
mittels der zu fixierenden, biologisch wirksamen Einheiten
selbst zu gelten. In der genannten EP werden die funktionellen
Gruppen X als Bestandteile von Monomeren Z′-(Rn)-X genau
definiert, wobei die Gruppen X im physiologisch sinnvollen pH-
Bereich (etwa pH 5,0-9,0), bei Temperaturen unterhalb 40
Grad C und in wäßrigem Milieu mit den nucleophilen Gruppen,
insbesondere den Amino-, Hydroxy- und Thiolgruppen der zu
fixierenden biologisch aktiven Materialien kovalent
zu reagieren vermögen.
Die DE-A 20 16 729 sieht ein Verfahren zur Herstellung
unlöslicher Enzyme in aktiver Form vor, bei dem ein
Mischpolymerisat mit einer Enzymlösung behandelt und eine
Quervernetzung des Enzym-Polymerkomplexes und/oder eine
Neutralisation der restlichen reaktionsfähigen chemischen
Gruppen durchgeführt wird. Die Lehre dieser
Offenlegungsschrift umfaßt die Auflösung jeglicher
Partikelstruktur - soweit von der Herstellung her vorhanden -
durch Auflösung der Mischpolymerisate in Lösungsmitteln.
Damit entfällt die Voraussetzung für das Vorhandensein einer
Partikelstruktur bei der Verfilmung. Soweit unlösliche
Niederschläge oder Präcipitate den Gegenstand der Lehre
bilden, sind sie nicht das unmittelbare Ergebnis des
Polymerisationsverfahrens, sondern Folgeprodukte einer
(externen) Vernetzung des gebildeten polymeren Materials,
welche die Zugänglichkeit eher herabsetzt.
Der Stand der Technik die Immobilisierung von biologisch
aktiven Materialien an polymeren Trägern betreffend, ist in
nicht wenigen Übersichtsartikeln behandelt worden (vgl.
Encyclopädia of Polymer Science and Engineering, Vol. 2, pg. 55
-59, John Wiley, 1985; Characterization of Immobilized
Biocatalysts, Ed. K. Buchholz, Dechema-Monographien, No. 1724-
1731, Vol. 84, Verlag Chemie, 1984; Methods in Enzymology, Ed.
W. B. Jokoby, Vol. 104, pg. 3-369, Academic Press, 1984;
Biotechnology, Ed. H. J. Rehm & G. Reed, Vol. 7a, pg. 347-464,
Verlag Chemie, 1987).
In der letztgenannten Literaturstelle wird darauf hingewiesen,
daß ungeachtet des großen Angebots an Immobilisationstechniken
keine spezifische Technik für sich in Anspruch nehmen kann,
mit idealem Ergebnis universell anwendbar zu sein. Führt die
Immobilisation zum Eingebundensein (Entrapment) der biologisch
aktiven Einheiten innerhalb der Trägermatrix, dann muß mit
erschwerter Zugänglichkeit infolge des Diffusionswiderstandes
für die Substrate gerechnet werden; ein Effekt, der neben
anderen die (scheinbare) Michaeliskonstante deutlich
beeinflußt. Das klassische "Entrapping" ist daher
wirkungsgemäß begrenzt auf niedermolekulare Substrate und
Produkte, bei denen sich der Widerstand gegen den
Massentransport in Grenzen hält. Interne Diffusionseffekte
spielen verständlicherweise eine maßgebliche Rolle, wenn es
sich um im Innern eines porenhaltigen Trägersystems fixierte
Enzyme handelt.
In "Biotechnology" (loc. cit. pg. 353) werden die Vorteile und
Nachteile poröser und nicht-poröser Träger einander
gegenübergestellt. Bei nicht porösen Trägern wird der Vorteil
der geringen diffusionsbedingten Beschränkungen durch den
Nachteil der geringen aktiven Oberfläche und in der Folge
geringen Enzymbeladung, dem Zwang zur Benutzung kleiner
Trägerpartikeln und den Schwierigkeiten bei der Handhabung
insbesondere im kontinuierlichen Betrieb aufgewogen.
Bei porösen Trägern schlägt zwar die große innere Oberfläche
und hohe Enzymbeladung und der relative Schutz vor externer
Wirkungsbeeinträchtigung zu Buche, dagegenzuhalten sind aber
die mit der großen inneren Oberfläche verbundenen
Diffusionsprobleme, die hohen Kosten, die u. a. mit der
unabdingbaren Kontrolle der Hohlraumdimensionen zu tun haben
und gegebenenfalls Flüssigkeits-Druckprobleme, die mit der
Tendenz zur Gelbildung zusammenhängen.
Idealerweise sollten die biologisch aktiven Strukturen an
einem Träger mit möglichst großer Oberfläche so fixiert sein,
daß möglichst wenige der biologisch aktiven Strukturen von der
Wechselwirkung mit den Substraten ausgeschlossen bleiben bzw.
daß optimale Zutrittsmöglichkeiten für die Substratmoleküle
bestehen.
Die Lösung des obengenannten europäischen Patents stellt eine
Annäherung an dieses Ideal dar, insofern Träger mit großer
Oberfläche zur Verfügung gestellt werden, welche die
Bindungsfunktionen für die Fixierung des biologisch aktiven
Materials, insbesondere von Enzymen, Antikörpern usw. in
Oberflächennähe aufweisen. Eine ebenfalls interessante Lösung
stellt die US-A 47 10 525 dar, die redispergierbare
Polymerlatices mit Kern-Schale-Aufbau beschreibt, die in der
Schale die funktionellen Gruppen zur kovalenten Fixierung der
biologisch aktiven Materialien besitzen.
Es bestand dessen ungeachtet die Aufgabe, noch
leistungsfähigere polymere Trägersysteme zur kovalenten
Fixierung von biologisch aktiven Materialien zur Verfügung zu
stellen, die eine möglichst optimale Nutzung der in der Regel
teuren biologisch aktiven Materialien gewährleisten.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur
Herstellung von Trägersystemen zur kovalenten Bindung von
biologisch aktivem Material mit polymer-beschichteter
Oberfläche, wobei das Polymer die zur kovalenten Bindung
geeigneten funktionalen Gruppen enthält, und wobei ein an sich
bekanntes Supportmaterial mit einer Mischung einer
filmbildenden Polymerdispersion FD und einer nicht-
filmbildenden Polymerdispersion NFD beschichtet wird.
Als Supportmaterialien eignen sich die gemäß dem Stand der
Technik entwickelten Träger (vgl. Biotechnology, Vol. 7A,
loc. cit. pg. 351-367; 411-412; Dechema-Monographien, Vol.
84, loc. cit. pg. 49-72). Dabei kommen sowohl anorganische als
organische Supportmaterialien in Frage. Als Träger
anorganischer Provenienz seien beispielsweise genannt:
Aluminiumoxid, Zirkondioxid, Magnesia, Siliciumdioxid, Glas,
Mineralien in verschiedenen Modifikationen, z. B. Tone wie
Attapulgit, Bentonit, sowie Kieselgur, Bimsstein u. ä.,
keramische Materialien, Sand, Titandioxid, Metalle, wie z. B.
ferromagnetisches Material, und zwar in gepfropftem wie im
ungepfropftem Zustand. Weiter sind organische Träger-
Materialien natürlichen Ursprungs von Bedeutung, wie z. B.
Polysaccharide (Cellulose, Dextrane, Stärke, Agar, Agarose,
Alginate, Carragenate, Chitin, Chitosan) sowie Proteine wie
Collagen, Gelatine, Albumin, Seide u. ä., ferner verschiedene
Modifikationen der Kohle.
Als synthetische polymere Träger seien
Polystyrol, Polyacrylate und -amide, Maleinsäureanhydrid-
Polymere, Vinyl- und Allyl-Polymere und Polyamide genannt.
Für Geometrie der Träger haben sich in der Technik gewisse
Präferenzen herausgebildet. Erwähnt sei z. B. die gut zu
handhabende Kugelform, etwa mit Durchmesser 1-10 mm,
insbesondere um 6 mm.
In diesem Zusammenhang sind Polystyrolkugeln besonders
bevorzugt.
Als beschichtbare Oberflächen im Sinne der vorliegenden
Erfindung müssen aber auch diejenigen von Körpern nicht
kugelförmiger oder strikt regelmäßiger Gestalt betrachtet
werden, z. B. von Granulen, Sticks, sowie im Hinblick auf einen
hohen Oberflächenanteil z. B. als Katalysatorträger entwickelte
Massen, z. B. mit Wabenstruktur, ebenfalls Gefäßoberflächen, wie
z. B. Glasoberflächen. Ferner Flächengebilde, auf Cellulose
oder auch textiler (z. B. Seide)basis, z. B. beschichtete
Papiere.
Im allgemeinen genügen die etablierten Supportmaterialien der
Voraussetzung unter den Bedingungen der Fixierung chemisch
inert (bzw. in eindeutigem Sinne aktivierbar) zu sein.
Bei Anwendung für diagnostische Zwecke empfiehlt sich auch für
die vorliegende Erfindung Perlen bzw. Kugeln mit ca. 0,01 bis
10 mm Durchmesser, vorzugsweise der Perlbereich 0,1 bis 0,6 mm,
sowie die diagnostisch bereits verwendeten Größen 0,01-10
mm, insbesondere im Bereich 6-7 mm, einzusetzen.
Auf die Fläche berechnet sollten Flächen des Trägers von 1 mm²
bis 100 cm², vorzugsweise 10 mm² bis 10 cm², zur Verfügung
stehen. Bei Anwendung planer Träger kann von quadratischen
oder rechteckigen Formen ausgegangen werden, es können aber
auch Rundformen zur Anwendung kommen, z. B. die an sich
bekannten Filterplättchen. Auch irreguläre Formen sind
möglich.
Als Anforderungen, welche die erfindungsgemäß zu verwendenden
Trägermaterialien mit denen des Standes der Technik gemeinsam
hat; sei erwähnt: Mechanische Stabilität, insbesondere unter
Scherbeanspruchung. Die Materialien sollen bei den üblichen
Manipulationen wie Filtrieren, Rühren, Schütteln, sowie beim
Transport und bei der Lagerung ausreichende Stabilität
besitzen und keinen störenden Abrieb entwickeln.
Zur Erleichterung der Handhabung ist eine Fixierung in Haltern
möglich.
Die Polymerdispersionen und zwar die nichtfilmbildende
Dispersion NFD wie die filmbildende Dispersion FD können in an
sich bekannter Weise nach den Regeln der Emulsionspolymerisation
gewonnen werden. (Vgl. H. Rauch-Puntigam, Th.
Völker, "Acryl- und Methacrylverbindungen" pg. 217-230,
Springer-Verlag, 1967, Houben-Weyl, Methoden der Organischen
Chemie, 4. Auflage, Bd. 14/1, pg. 133-390, Georg Thieme-Verlag
1961). Die praktische Durchführung kann z. B. in Anlehnung
an DE-OS 18 04 159, DE-OS 19 10 488 und DE-OS 19 10 532
erfolgen. Die gewünschte Größe der Latex-Teilchen wird
praktisch durch die Emulgatorkonzentration zu Beginn der
Polymerisation eingstellt. Im allgemeinen liegt die
Emulgatorkonzentration zu Beginn der Emulsionspolymerisation
zwischen 0,005 und 0,5 Gew.-%, bezogen auf den gesamten
Polymerisationsansatz. Es ist auch möglich, die gewünschte
Teilchengröße durch Zusatz einer definierten Menge eines
feinteiligen Saatlatex einzustellen. Die Größe der Latex-Teilchen
soll zwischen 0,03 und 6 µm liegen, vorzugsweise
zwischen 0,03 und 1 µm. Als Emulgatoren können die bekannten
anionischen und nichtionischen Emulgatoren verwendet werden,
beispielsweise Fettalkoholsulfate und -sulfonate, -phosphate
und -phosphate, Alkalisalze langkettiger Fettsäuren,
langkettige Sarkoside sowie oxathylierte Fettalkohole,
substituierte Phenole, die zum Teil sulfiert sein können,
sowie andere in der Emulsionspolymerisation verwendete
Emulgatoren (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Bd.
XIV/I, loc. cit).
Die Verwendung kationischer Tenside empfiehlt sich nur
insoweit als sich diese von tertiären oder quartären
Ammoniumsalzen ableiten. Des weiteren können auch
einpolymerisierbare Emulgatoren verwendet werden.
Als Initiatoren können ebenfalls die allgemein bei
Emulsionspolymerisation üblichen verwendet werden (vgl. J.
Brandrup. E. H. Immergut, "Polymer Handbook" second Edition, J.
Wiley & Sons; H. Rauch-Puntigam, Th. Völker, "Acryl- und
Methacrylverbindungen", Springer-Verlag 1967). Genannt seien
Peroxide, Hydroperoxide, Persäuren und Azoverbindungen, z. B.
Kaliumperoxidisulfat, Wasserstoffperoxid u. a. m.
Die Konzentration der Initiatoren liegt in der Regel im
üblichen Bereich, beispielsweise bei 0,01 bis 1,0 Gew.-%,
bezogen auf die Monomeren. Der Feststoffgehalt der Dispersion
kann je nach Teilchengröße zwischen 10 und 60 Gew.-% liegen.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Polymer-Dispersionen können
im Prinzip aus den bekannten, der Emulsionspolymerisation
zugänglichen Monomeren aufgebaut sein. Genannt seien z. B.
Polymerisate auf Basis von
- - Acrylaten bzw. Methacrylaten
- - Styrol und Styrolderivaten
- - Vinylfettsäureestern wie Vinylacetat, Vinylpropionat,
- - Vinylhalogenverbindungen wie z. B. Vinylchlorid, Tetrafluorethylen
- - Vinylidenverbindungen
sowie Misch-Copolymerisate wie z. B. Copolymerisate des Styrols
mit Butadien, Polyvinyliden-Copolymerisate mit Vinylacetat
u. a. Im allgemeinen ist die Polymerisation radikalisch
initiiert.
Das Molekulargewicht der Polymerisate (Bestimmung durch
Gelpermeations-Chromatographie; vgl. Encyclopedia of Polymer
Science & Engineering, Bikales, Overberger and Menges, 2nd Ed.
Vol. 10, pg. 1-19; J. Wiley 1987) hat sich als nicht
eigentlich kritisch erwiesen.
Unter praktischen Gesichtspunkten liegen die Molekulargewichte
der Polymerisate im Bereich 10 000 bis 2×10⁶, vorzugsweise
oberhalb 50 000.
Ein unabdingbarer Bestandteil mindestens eines der verwendeten
Polymertypen ist ein Minimum an funktionalen Gruppen X, die
zur kovalenten Bindung mit den biologisch aktiven Materialien
geeignet sind. Vorzugsweise sind die funktionalen Einheiten X
Bestandteil der nichtfilmbildenden Dispersionen NFD. Dabei
kann es sich um eine aktivierbare Gruppe (Gruppe X′) handeln,
die eines zusätzlichen aktivierenden Reagenzes Q bedarf,
vorzugsweise ist die funktionale Gruppe X aber unmittelbar zur
Reaktion mit nucleophilen Gruppen des biologisch aktiven
Materials geeignet, zweckmäßigerweise unter Bedingungen,
welche biologisch akzeptabel sind, d. h. welche die
biologische Aktivität im Endeffekt nicht beeinträchtigen. Als
derartige Bedingungen sind z. B. ein physiologisch sinnvoller
pH-Bereich des wäßrigen Mediums, z. B. der pH-Bereich 5,0-9,0,
insbesondere Pufferlösungen, ferner die Abwesenheit von
Agenzien, welche die biologische Aktivität beeinträchtigen und
ein geeigneter Temperaturbereich, der die Inaktivierung der
Proteine vermeidet, z. B. unterhalb 60 Grad C, insbesondere
unterhalb 40 Grad C zu betrachten.
Am Träger T befindliche Carboxylgruppen können beispielsweise
analog den Methoden der Peptidsynthese mit den Aminogruppen
der biologisch aktiven Materialien kovalent verknüpft werden,
beispielsweise mit der Carbodiimidmethode. Amidfunktionen
lassen sich mittels Glutardialdehyd aktivieren oder durch
Hydrazinolyse und Diazotierung, letzteres gilt auch für Ester.
Auch aromatische Aminogruppen am Träger lassen sich durch
Diazotierung aktivieren. Aliphatische Aminogruppen können z. B.
mittels Glutaraldehyd, mit D-Cyclopenta-dialdo-1,4-furanose
oder mittels Thiophosgen kovalent mit den Aminogruppen des
biologisch aktiven Materials verknüpft werden.
Für Hydroxygruppen eignet sich die Umsetzung mit halogenierten
Triazinen oder mit 1,1′-Carbonyldiimidazol zur Aktivierung und
bei Glykol-Konfiguration die Reaktion mit Bromcyan zum
Imidocarbonat (vgl. Biotechnology, Ed. H. J. Rehm & Reed, Vol.
7a, loc. cit.).
Bevorzugt stellt, wie bereits erwähnt, die Gruppe X eine
aktivierte, unmittelbar zur Reaktion mit den nucleophilen
Gruppen der biologisch aktiven Materialien geeignete Funktion
dar.
X hat somit vorzugsweise die Bedeutung einer
Sulfonsäurehalogenid-, einer Thioisocyanatgruppe, eines
aktivierten Esters, einer Thiocarbonyldioxy-, Carbonylimidoyldioxy-,
Haloethoxy-, Haloacetoxy-, Oxiran-, Aziridin-,
Formyl-, Keto-, Acryloyl- oder Anhydridgruppe.
Als Sulfonsäurehalogenide kommen die Chloride und Bromide, als
Haloacetoxy die Fluoro-, Chloro- und Bromoverbindungen, als
Esterkomponente der aktivierten Ester solche von
Hydroxylaminverbindungen, wie des N-Hydroxysuccinimids oder
des N-Hydroxyphthalimids, von (mittels elektronenanziehenden
Gruppen) aktivierten Phenolen, wie von Halogenphenolen, wie
Trichlorphenol oder von Nitrophenolen, von heterocyclischen
Lactamen, wie Pyridon in Frage.
Besonders bevorzugt sind Oxiran-, Keto-, Formyl-,
Sulfonsäurechlorid-, Thioisocyanatgruppen sowie aktivierte
Carbonsäureester sowie Carbonsäureanhydride.
Die funktionalen Gruppen tragenden Monomeren entsprechen
vorzugsweise der Formel
Z-(R)n-X
worin
X die oben angegebene Bedeutung besitzt,
R für einen chemischen inerten Abstandshalter (Spacer) zwischen der funktionalen Einheit und der polymerisierbaren Einheit,
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht.
X die oben angegebene Bedeutung besitzt,
R für einen chemischen inerten Abstandshalter (Spacer) zwischen der funktionalen Einheit und der polymerisierbaren Einheit,
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht.
Größe und Typ des Abstandshalters R sind vergleichsweise
unkritisch. Typische Vertreter von derartigen Abstandshaltern
sind beispielsweise Alkylengruppen von C₁ bis C₂₀,
vorzugsweise C₂ bis C₁₂, wobei gegebenenfalls Kohlenstoffatome
durch Ätherbrücken ersetzt sein oder auch Alkylverzweigungen
und/oder Substitution z. B. mit einer Hydroxyfunktion vorliegen
können. Vorzugsweise ist jedoch R linear. Darüber hinaus
andere ursprünglich (d. h. vor dem Einbau) bifunktionelle
Gruppen enthaltende Einheiten, wobei sowohl am
polymerständigen als am funktionalen Ende eine Verknüpfung
über Amid-, Ester-, Äther-, Thioäther-, Harnstoff-, Urethan-,
Sulfonamid- und ähnliche Gruppen erfolgen kann. Im allgemeinen
bringt der Abstandhalter eine Distanz der funktionellen
Gruppen X von der Polymerhauptkette im Bereich von 0,5-4 nm.
In einer Reihe von Beispielen kann die Gruppe R ganz fehlen,
d. h. n kann auch den Wert 0 besitzen.
Radikalisch polymerisationsfähige Einheiten I sind z. B.
Vinylgruppen, wobei Z beispielsweise die Bedeutung
besitzt, worin R₁ für Wasserstoff oder Methyl bzw. für
CH₂-COOR₂, CH₂-CONHR₂ oder CH₂-CON(R₂)₂ steht, wobei R₂
einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Des weiteren kann Z sich von der Maleinsäure ableiten:
Als reaktionsfähige und zugleich polymerisierbare Einheiten
sind ferner Maleinsäureanhydrid und Itaconsäureanhydrid
geeignet.
Zur Verdeutlichung des Formelschemas Z-R-X seien die folgenden
Beispiele aufgeführt:
(Polymerisierbarer aktivierter Ester mit Spacer)
CH₂=C(-CH₃)-CO-O-C₆H₂Cl₃
(2,4,5-Trichlorphenylmethacrylat) R=O
CH₂=C(CH₃)-COO-CH₂-CH₂-Br
(2-Bromäthylmethacrylat)
CH₂=CH-COO-CH₂-CH₂-O-CSNH-(CH₂)₆-N=C=S
(Anlagerungsprodukt von Acrylsäure-2-Hydroxyethylester an 1,6-
Hexandiisothiocyanat)
CH₂=CH-O-CO-CH₂-Cl
(Chloressigsäurevinylester)
CH₂=C(CH₃)-COO-C₆H₄-SO₂-CH₃
(4-Methylsulfinylphenyl)-methacrylat)
CH₂-CH-COO-CH₂-C=C-H
(Propargylacrylat)
Die Polymer-Dispersionen vom Acrylattyp sind in der Regel
aufgebaut aus (Meth)acrylat-Monomeren der Formel
worin R₁ die oben bezeichneten Bedingungen besitzt und worin
R₃ für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 1-18
Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 1-8 C-Atomen oder einem
Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Ringgliedern steht, speziell einen
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, vor allem einen n-Butyl-
oder einen 2-Ethylhexylrest steht (vgl. H. Rauch-Puntigam,
Acryl- und Methacrylverbindungen, Springer Verlag, 1967, pg.
217-230).
Als im wesentlichen hydrophobe Comonomere kommen u. a. Diene
wie Butadien, Chlorpropen, Isopren in Frage. Ferner können
aktivierte Vinylverbindungen wie Vinylester von Fettsäuren wie
Vinylacetat und Vinylpropionat, Vinylether, Allylether und
Allylester, Acrolein, Vinylmethylketon, vinylgruppenhaltige
Heterocyclen wie Vinylimidazol, Vinylpyrroliden, Vinylpyridin,
Vinylcarbazol und Styrol und seine Derivate, insbesondere
alkylierte Derivate wie α-Methylstyrol, Vinyltoluol u. ä.
copolymerisiert werden, wobei jedoch darauf zu achten ist, daß
die Copolymerisate in (unerwünschte) gruppenbedingte
Wechselwirkungen mit den zu fixierenden, biologisch aktiven
Materialien treten können. Unter dem Gesichtspunkt einer
möglichen Haptenwirkung kann es z. B. in bestimmten Fällen
zweckmäßig sein, von der Verwendung aromatenhaltiger Monomeren
ganz abzusehen.
Im allgemeinen überwiegt der Anteil der obengenannten
(Meth)acrylatmonomeren an den die Dispersion FD bzw. NFD vom
Acrylattyp bildenden Polymeren. In der Regel beträgt deren
Anteil über 50 Gew.-% und - sofern sie nicht-funktionalisierte
Polymerkomponenten darstellen - bis zu 99,9 Gew.-%,
vorzugsweise bis zu 99 Gew.-%.
Wenigstens eine der beiden Dispersionen FD und NFD enthält die
bereits vorstehend beschriebenen Monomeren mit funktionalen
Gruppen X oder mit aktivierbaren Gruppen X′. Der Anteil an
Monomeren mit funktionalen Gruppen X an den Polymeren der
Dispersionen FD bzw. NFD kann 0,1 bis 80 Gew.-% betragen. Im
allgemeinen beträgt der Anteil der (Meth)acrylat-Monomeren der
obigen Formel 1 bis 40 Gew.-%.
Außer den funktionalisierten Monomeren können die Polymerisate
noch andere Comonomere enthalten, z. B. deutlich hydrophile
Monomere, insbesondere der Formel
worin R₁ die
oben bezeichneten Bedeutungen besitzt und Q für die Reste -CH,
COOR₄, worin R₄ Wasserstoff-, Natrium-, Kalium- oder Ammoniumionen
bedeutet oder
worin R₅ und R₆ für
Wasserstoff oder für einen R₃ entsprechenden Alkylrest stehen
oder unter Einbeziehung des Stickstoffatoms einen,
gegebenenfalls noch weiteren Stickstoff oder Sauerstoff
enthaltenden, 5- oder 6gliedrigen Heterocyclus bilden oder
für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 2 bis 8
Kohlenstoffatomen steht, der mindestens eine, vorzugsweise
endständige -OH- oder -NR₅R₆-Gruppe mit den oben bezeichneten
Bedeutungen aufweist.
Der Anteil der hydrophilen Monomeren an den Polymerisaten, die
gegebenenfalls verbesserte Haftfestigkeit und verbesserte
Eignung bei spezialisierten Anwendungen mit sich bringen
können, liegt, sofern überhaupt vorhanden, bei 0,5 bis
30 Gew.-%, vorzugsweise bei 1 bis 20 Gew.-% (bezogen auf die
eingesetzten Monomeren).
Neben den oben beschriebenen Monomerkomponenten können die
Polymerisate noch vernetzende Monomere enthalten.
Unter "vernetzende Monomeren" werden wie üblich z. B. solche
Monomere verstanden, die zwei oder mehrere reaktive
Doppelbindungen im Molekül enthalten, wie z. B. mit der
Acrylsäure oder vorzugsweise der Methacrylsäure veresterte Di-
oder Polyole sowie Allylverbindungen, wie z. B.
Allylmethacrylat, Triallylcyanurat u. a.
Genannt seien z. B. Ethylenglykoldimethacrylat, 1,4-
Butandioldimethacrylat, Triglykoldimethacrylat,
Trimethylolpropantrimethacrylat.
Der Anteil an Vernetzer liegt in der Regel zwischen 0 und
50 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20, insbesondere 5-20 Gew.-%,
bezogen auf die Gesamtheit der Monomeren.
Der Gehalt der Dispersionen FD bzw. NFD an Polymerisat liegt
in der Regel bei 10 bis 60 Gew.-%.
Die Herstellung von Styroldispersionen ist in Houben-Weyl,
Methoden der organischen Chemie, 4. Auflage, Bd. XIV/1, Georg
Thieme Verlag, 1961, S. 834-839, ausführlich beschrieben. Als
Emulgatoren eignen sich insbesondere die Fettseifen, wie z. B.
Natriumoleat, ferner Harzseifen sowie Alkylsulfonate und
kationenaktive Emulgatoren, normalerweise in Mengen von 2 bis
6 Gew.-% bezogen auf die Wassermenge.
Als Initiatoren kommen auch hier vor allem wasserlösliche z. B.
vom Typ der Peroxydisulfatsalze in Frage, ferner Redoxsysteme,
gewöhnlich in Mengen von 0,01 bis 0,2 Gew.-%, bezogen auf die
Monomeren. Als Regler können die üblicherweise verwendeten,
z. B. Schwefelregler angewendet werden, normalerweise in Mengen
von 0,05 bis 2 Gew.-% bezogen auf die Monomeren.
Vorteilhaft wählt man für die Startreaktion mit
Peroxydisulfaten ein schwach saures Milieu (pH 3-6).
Vorteilhafterweise bemüht man sich bei der Polymerisation um
den Ausschluß von Luftsauerstoff, z. B. durch Arbeiten unter
einem Schutzgas wie Stickstoff.
Als Comonomeren für Styrol bzw. die an sich bekannten
radikalisch polymerisationsfähigen Styrolderivaten können die
unter "Dispersionen vom Acrylattyp" genannten Monomeren zur
Anwendung kommen, wobei sinngemäß die Rolle der
(Meth)acrylatmonomeren durch Styrol und/oder seine Derivate
übernommen wird und umgekehrt.
So wird im allgemeinen der Anteil an Styrol bzw.
Styrolderivaten an den Polymeren mehr als 50 Gew.-% und bis zu
100 Gew.-% betragen. Von Interesse sind insbesondere auch
Copolymerisate vom Styrol-Butadientyp. Beim Styrol-Butadientyp
kann in bekannter Weise ausgehend von einem 1 : 1-Gew.-
Verhältnis durch Variation der Anteile das
Eigenschaftsspektrum in Richtung "härter" (höherer
Styrolanteil) oder "weicher" verschoben werden (vgl. zum Beispiel
Houben-Weyl, 4. Auflage, loc. cit. Bd. XIV/1, pg. 147, 327).
Als Monomere dieses Typs kommen solche der Formel
in Frage, worin R₇ für einen Alkylrest mit 1 bis 6
Kohlenstoffatomen, insbesondere 1 bis 2 Kohlenstoffatomen
steht, d. h. Vinylacetat und -propionat.
Als Comonomere kommen beispielsweise gegebenenfalls
halogenierte Olefine wie Ethylen, Vinylchlorid, andere
Vinylester wie Vinylphosphonsäurediester, (Meth)acrylate der
bereits genannten Art (s. Dispersionen vom Polyacrylattyp)
(Meth)acrylnitril u. ä. (vgl. Houben-Weyl, loc. cit. 4. Auflage,
Bd. 14/2, pg. 704, Bd. 14/1, pg. 911-918). Die Polymerisation
lehnt sich im allgemeinen an die bereits genannten Verfahren
an, beispielsweise in bezug auf die Emulgatoren, Initiatoren
und Regler. Vorteilhaft ist die Polymerisation im pH-Bereich 4
-5.
Von besonderem Interesse sind Polyvinyliden-Copolymerisate.
Als Monomere dieses Typs kommen vor allem Vinylchlorid und
insbesondere Vinylidenchlorid in Frage (Houben-Weyl, loc. cit.
pg. 887, 891-905). Als Acrylat-Komponenten seien der
Acrylsäuremethylester, -ethylester, -butylester, -octylester,
-nonylester, -2-ethylhexylester, -3,5,5-trimethylhexylester
sowie der Methacrylsäuremethylester und das Methacrylsäureamid
genannt. Im allgemeinen beträgt der Anteil an Comonomeren vom
Acrylattyp und/oder an (Meth)acrylnitril, Vinylester (oder
Vinylchlorid) bei den Vinyliden-Copolymeren 10-20 Gew.-%,
wobei die Erweichungstemperatur i. a. auf einen erwünschten Wert
sinkt.
Auch die Polymerisation der halogenierten Vinylverbindungen
schließt an die bereits erwähnten Verfahrensweisen an. Als
Emulgatoren eignen sich insbesondere Alkalisalze von
Fettsäuren bzw. Alkyl- oder Acrylsulfonaten sowie
nichtionogene Polyethylenoxid-Emulgatoren. Als Initiatoren
eignen sich übliche Perverbindungen, insbesondere
Redoxinitiatoren.
Die filmbildende Dispersion FD zeichnet sich dadurch aus, daß
im Zuge der Trocknung, d. h. während des Verdampfens des
flüssigen Mediums, in der Regel eines wäßrigen Mediums, die
Glastemperatur Tg überschritten wird.
Die Glastemperatur Tg ist in erster Näherung mit der
Glastemperatur des getrockneten Polymerisats gleichzusetzen,
solange das Polymerisat kein hydroplastisches Verhalten zeigt,
d. h. aufgrund seiner Zusammensetzung durch Wasser weichgemacht
wird.
(Die Glastemperatur Tg eines Copolymerisats läßt sich aus den
Beiträgen der Monomeren ableiten [vgl. R. Vieweg, F. Esser,
Kunststoff-Handbuch, Bd. IX, Polymethacrylate, pg. 333-342,
Carl Hanser Verlag, 1975; H. F. Mark et al., Ed. Encyclopedia of
Polymer Science & Technology, Vol. 7, pp. 531, 544, John Wiley,
1987; T. G. Fox, Bull. Am. Phys. Soc., 1, 123, 1956]).
Im allgemeinen genügt jedoch die Kenntnis der minimalen
Filmbildungstemperatur MFT zur Auswahl geeigneter
Polymerdispersionen bzw. der darin enthaltenen Monomeren.
Im Einklang mit dem Wissen des Fachmanns (demzufolge die MFT
die maßgebliche Kenngröße für die Filmbildungseignung einer
Polymerdispersion darstellt, deren Wert [in Grad C] bei der
Trocknung überschritten werden muß), ist die MFT der
filmbildenden Dispersion FD zweckmäßig unter 60 Grad C,
vorzugsweise <40 Grad C, insbesondere <30 Grad C
anzusetzen.
Die Bestimmung der MFT wird nach DIN 35 787 vorgenommen.
Besonders bevorzugt sind filmbildende Dispersionen FD auf
Basis von (Meth)acrylat-Dispersionen, die den oben erläuterten
Bedingungen genügen (vgl. Houben-Weyl, 4. Auflage, Bd. XIV/1,
loc. cit. pg. 1048).
Die filmbildende Dispersion FD kann aus den vorstehend
erläuterten Polymerklassen ausgewählt werden, vorausgesetzt,
das Polymer genügt den vorstehend dargelegten Regeln. In der
Praxis wird die Glastemperatur Tg der Polymeren den Wert
30 Grad C nicht überschreiten, d. h., es handelt sich um relativ
"weiche" Polymerisate. (Werte für die Glastemperaturen Tg von
Homopolymerisaten finden sich z. B. in Brandrup-Immergut,
Polymer Handbook, 2nd, Ed. J. Wiley). Durch Copolymerisation
entsprechender Monomerer läßt sich ein weites Spektrum von
Latices mit kontinuierlich abgestuften Filmhärten herstellen.
Besonders genannt seien Dispersionen FD mit folgender
Polymerzusammensetzung: Methacrylsäureester von C₁-C₄-
Alkoholen, insbesondere Methylmethacrylat in Anteilen von 20
bis 80 Gew.-%, speziell 20-60 Gew.-%, sowie Acrylsäureester
von C₁-C₄-Alkoholen in Anteilen von 80 bis 20 Gew.-% bezogen
auf die Gesamtheit des Polymeren.
Die wäßrige nicht-filmbildende Dispersion hat die grundlegende
Eigenschaft, daß die Einfriertemperatur der Polymerisate
über der Filmbildungstemperatur liegt. Nach üblichem
Sprachgebrauch kann man das Polymerisat der nicht-
filmbildenden Dispersion als "hart" bezeichnen. Voraussetzung
dafür ist das Überwiegen sogenannter "harter" Monomerer,
ablesbar an den Erweichungspunkten der Homopolymerisate (vgl.
Houben-Weyl, 4. Auflage, loc. cit. Bd. XIV/1, pg. 1034).
Polymethacrylsäureester sind bekanntlich "härter" als
Polyacrylsäureester. Die "Härte" nimmt mit steigender Größe
der Alkoholreste zunächst ab und steigt dann nach dem n-
Dodecyl in der Methacrylesterreihe und dem n-Octylester in der
Acrylesterreihe wieder an. Als "harte" Monomere haben z. B. das
Methylmethacrylat und das Styrol und seine Derivate zu
gelten.
Alternativ zu der Anwendung "harter" Monomerer, etwa vom Typ
des Methylmethacrylats oder des Styrols und seiner Derivate
kann die nicht-filmbildende Dispersion auch so aufgebaut sein,
daß an sich "weiche" Monomere mit höheren Gehalten an
vernetzenden Monomeren, beispielsweise mit mindestens 5 Gew.-%
und bis zu 50 Gew.-% kombiniert werden. Solche Polymerisate
bilden keine geschlossenen Filme aus.
Vorzugsweise stellen die nicht-filmbildenden Dispersionen NFD
Polymere mit <60 Gew.-% "harter" Monomerer wie
Methylmethacrylat bzw. Styrol und seiner Derivate dar.
Der Gehalt der Dispersionen an Polymerisat liegt in der Regel
im Bereich 10 bis 60 Gew.-%.
Die nichtfilmbildende Dispersion NFD weist im allgemeinen
Teilchengrößen im Bereich von 0,03 bis 5 µ, vorzugsweise 0,1
bis 2 µ, auf.
Die filmbildende Dispersion FD hat im allgemeinen
Teilchengrößen im Bereich von 0,02 bis 5 µ, vorzugsweise 0,04
bis 0,5 µ. Die Bestimmung der Teilchengröße wird mit Hilfe der
Photonenkorrelationsspektroskopie mit dem Nano-Sizer TDM der
Firma Coulter Electronics, Ltd., Luton Beds., vorgenommen.
Als eine praktische Bemessungsregel kann gelten, daß die
Teilchen der nicht-filmbildenden Dispersion jeweils im
Durchschnitt um einen Faktor 1,2 bis 20 größer sein sollen als
die der filmbildenden Dispersion, vorzugsweise 1,5- bis 10mal,
speziell 2- bis 5mal so groß.
Das quantitative Verhältnis der beiden Dispersionstypen bei
der erfindungsgemäßen Anwendung liegt vorteilhafterweise bei
50 : 50 Gew.-Teile bis 99 Gew.-Teile nicht-filmbildende
Dispersion NFD zu 1 Gew.-Teil filmbildende Dispersion FD,
insbesondere 60 Gew.-Teile NFD zu 40 Gew.-Teile FD bis
95 Gew.-Teile NFD zu 5 Gew.-Teile FD, speziell 65 Gew.-Teile
NFD zu 35 Gew.-Teile FD bis 90 Gew.-Teile NFD zu 10 Gew.-
Teilen FD bezogen auf das trockene Polymerisat.
Daraus läßt sich der folgende überraschende Befund ableiten:
Der aus theoetischen Betrachtungen abgeleitete Wert für eine
sinnvolle Obergrenze der filmbildenden Polymerkomponente (FE-
Polymer) im Gemisch liegt bei ca. 26 Vol.-%. (In erster
Näherung können für die hier vorliegende Betrachtung Vol.-%
und Gew.-% gleichgesetzt werden.)
Mit wachsendem Unterschied in der Teilchengröße ist zu
erwarten, daß sich das real existierende System der Idealform
der dichtesten Kugelpackung der NFD-Teilchen annähert, wobei
die FD-Teilchen in den Zwickeln sitzen. Daher wäre zu folgern,
daß mit steigendem Faktor im Verhältnis der Teilchengröße der
Anteil der filmbildenden Komponente unter die theoretisch
anzunehmende Grenze von 26 Vol.-% zu senken ist im Interesse
der Bildung eines porösen Materials bzw. um das völlige
Ausgefülltwerden der geometrisch möglichen Hohlräume zu
vermeiden. Faktisch hat es sich aber gezeigt, daß der obengenannte
Wert von ca. 26 Vol.-% an FD-Polymer drastisch
überschritten werden kann, ohne daß der Ausschluß-Effekt
eintritt, vermutlich weil das real existierende System von der
Idealform der dichtesten Kugelpackung signifikant abweicht.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Trägersysteme zur
kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material geschieht
durch Beschichtung des Supportmaterials mit einer Mischung der
filmbildenden Polymerdispersion FD und der nicht-filmbildenden
Polymerdispersion NFD, vorzugsweise in den oben angegebenen
Verhältnissen. Die Beschichtung kann in an sich bekannter
Weise, z. B. durch Sprühen oder Tauchen, vorgenommen werden,
vorzugsweise im Gemisch, aber auch der Einzelauftrag ist
möglich (sequentielles Sprühen).
Besonders bewährt hat sich beispielsweise das Aufbringen des
Dispersionsgemisches mittels einer Sprüheinrichtung. Eine
besonders günstige Ausführungsform sieht das Versprühen der
Dispersionsgemische auf perl- oder kugelförmiges
Supportmaterial (s. dort), vorteilhafterweise in einer
Dragiertrommel unter gleichzeitiger Zuführung von Luft, vor.
Die Beschichtung kleinerer Teilchen erfordert eine besonders
intensive Trocknung, so daß ein Verkleben der Teilchen
vermieden wird. Dafür eignen sich spezielle Geräte mit hohem
Luftdurchsatz, z. B. Wirbelschichtgeräte oder Coatingapparaturen
mit durchlöcherten Trommeln.
Für den Überzugsprozeß sind die Verfahrensparameter, z. B.
Sprühgeschwindigkeit, Zuluftmenge, Zuluftparameter, den
jeweiligen Eigenschaften von Kernmaterial und
Dispersionsmischung anzupassen.
Ausgehend von einer Definition "Schicht" gleich "Dicke eines
Monolayer" haben sich folgende Bemessungsgrenzen bewährt: ca.
eine Schicht bis 1000 Schichten, bevorzugt eine Schicht bis
100 Schichten.
Als Daumenregel kann man auch das Verhältnis der Massen von
Supportkörper und Beschichtung anwenden, demzufolge ein
Massenverhältnis Supportmaterial zu Beschichtung (in
getrocknetem Zustand) von 1 : 50 bis 10 000 : 1 zu
brauchbaren Resultaten führt.
Die biologisch aktiven Materialien, deren Fixierung an festen
Trägern unter vielerlei Gesichtspunkten in Wissenschaft und
Technik betrieben wird, fallen in viele verschiedene Klassen.
So ist beispielsweise eine Einteilung nach chemischen
Gesichtspunkten möglich, z. B. nach funktionalen Gruppen, wie
in Aminosäuren, Peptiden und Proteinen, in Nucleoside,
Nucleotide und Polynucleotide (Saccharide), wobei - wie
ersichtlich wiederum - nieder- und hochmolekulare
Verbindungstypen zu unterscheiden wären.
Besonderes Interesse können polymere Verbindungen
beanspruchen, an erster Stelle Proteine, Lipoproteine,
Polysaccharide (Mucopolysaccharide), Nucleinsäuren wie DNA und
RNA, Lipoide.
In vielen Fällen wird durch die Art der funktionalen Gruppen
auch die Auswahl der zur Verfügung stehenden
Fixierungsmechanismen wie z. B. kovalent, polar (ionisch),
komplexchemisch, hydrophob oder durch Occlusion bestimmt.
Des weiteren ist eine Einteilung nach der biologischen
Wirksamkeit sinnvoll: Danach lassen sich z. B. Biokatalysatoren
wie Enzymkomplexe, Blutfaktoren, Hormone (Messenger-
Substanzen), immunologisch aktive Materialien wie Antigene und
Antikörper (z. B. Monoclonale Antikörper) unterscheiden.
Weiter sind der Fixierung auch morphologisch (und meist auch
funktionell) definierbare Einheiten zugänglich wie Organellen,
z. B. Mitochondrien, Viren, ganze Zellen und Zellbestandteile,
Zellhybride, z. B. Bakterienzellen, eukariotische Zellen u. ä.
Schließlich bietet sich auch eine Klassifizierung der
immobilisierten Materialien nach der vorgesehenen technischen
Verwendung an. So ist z. B. außer der Anwendung von
Biokatalysatoren der Einsatz in der Diagnostik und in der
(Affinitäts)chromatographie von Interesse.
Die immobilisierten Biokatalysatoren können z. B. zur
Produktion bzw. der Umwandlung sehr verschiedenartiger
Substrate wie Aminosäuren, Peptide und Enzyme von Zuckern
organischen Säuren, Antibiotika, Steroiden, Nucleosiden und
Nucleotiden, Lipiden, Terpenoiden und organischen
Grundchemikalien dienen (vgl. Ullmann, 5. Auflage, Bd. 9A,
loc. cit. S. 389-390).
Als immunologisch aktive Materialien seien z. B.:
Mikroorganismen, wie gram-positive und gram-negative Bakterien, Spirochäten, Mycoplasma, Mycobacterien, Vibrionen, Actinomyceten, Protozoen, wie intestinale Protozoen, Amöben, Flagellaten, Sporozoen, intestinale Nematoden und Gewebenematoden (Würmer), Trematoden (Schistosomen, Egel), Cestoden, Toxoplasma, sowie Pilze, wie Sporotrichum, Cyptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Candida, Viren und Rickettsien, wie Hunde-Hepatitis, Shope-Pappillome, Influenza A+B, Hühnerpest, Herpes-Simplex, HIV, Adenoviren, Polyane, Rous-Sarkom, Impfpocken, Pliovirus, Masern, Hundestaupe, Leukämie, Mumps, Newcastle-Krankheit, Sendai, ECHO, Maul- und Klauenseuche, Psittacosis, Rabies, Extromelia, Baumviren, weiter Gewebe-Antigene, Enzyme, wie Pancreas- Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, Glucose-Oxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Aminosäure-Oxidase, Urease, Asparaginase, Proteasen, Blutzellen-Antigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene, wie Blutplättchen, Leucozyten, Plasma-Proteine, Milch-Proteine, Speichel-Proteine, Urin-Proteine, Antikörper einschließlich Auto-Antikörper genannt. Erwähnt seien insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen Antigene beispielsweise der folgenden Art gerichtet sind.
Mikroorganismen, wie gram-positive und gram-negative Bakterien, Spirochäten, Mycoplasma, Mycobacterien, Vibrionen, Actinomyceten, Protozoen, wie intestinale Protozoen, Amöben, Flagellaten, Sporozoen, intestinale Nematoden und Gewebenematoden (Würmer), Trematoden (Schistosomen, Egel), Cestoden, Toxoplasma, sowie Pilze, wie Sporotrichum, Cyptocoecus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Candida, Viren und Rickettsien, wie Hunde-Hepatitis, Shope-Pappillome, Influenza A+B, Hühnerpest, Herpes-Simplex, HIV, Adenoviren, Polyane, Rous-Sarkom, Impfpocken, Pliovirus, Masern, Hundestaupe, Leukämie, Mumps, Newcastle-Krankheit, Sendai, ECHO, Maul- und Klauenseuche, Psittacosis, Rabies, Extromelia, Baumviren, weiter Gewebe-Antigene, Enzyme, wie Pancreas- Chymotrypsinogen, Procarboxypeptidase, Glucose-Oxidase, Lactatdehydrogenase, Uricase, Aminosäure-Oxidase, Urease, Asparaginase, Proteasen, Blutzellen-Antigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene, wie Blutplättchen, Leucozyten, Plasma-Proteine, Milch-Proteine, Speichel-Proteine, Urin-Proteine, Antikörper einschließlich Auto-Antikörper genannt. Erwähnt seien insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen Antigene beispielsweise der folgenden Art gerichtet sind.
Antigen-Klassen | |
antigen | |
Bakteriell | |
Tetanus-Toxoid, H. influoenza Typ b Polysaccharid, Diphterie-Toxin, Chlamydia trachomatis, M. leprae, Lipopolysaccharid/Endotoxin, Pneumokokken, LPS von P. aeruginosa, Exotoxin von P. aeruginosa, Streptokokken Gruppe A Kohlehydrat | |
Viral | X31 Influenza-Virus-Nukleoprotein, Masern-Virus, HSV Glykoprotein D, Masern-Virus, Nukleocapsid, Zytomegalie-Virus, Influenza-A-Viren, Röteln-Virus-Antigene, HTLV I, Varizella-Zoster, HBsAg |
Autoimmun | doppelsträngige DNA, Inselzellen (Diabetes mellitus), Myasthenia gravis, Antiidiotypen, Thyreotropin-Rezeptor, Rheuma-Faktor, Acetylcholin-Rezeptor, Schilddrüse, Sperma |
Tumor | Mamma-Ca, Prostata-Ca, Lungen-Ca, Magen-Ca, Melanom, BD2 (humanes Melanom), Gliom, Rectum-Ca, Leukämie, Cervix-Ca |
Gewebe/Blut | Rhesus D, Blutgruppenantigen A, HLA-A, B, C, DR, Intermediäre Filamente |
Andere | Malaria, Forssman-Antigen, Schaferythrozyten, Nitrophenol, Dinitrophenol, Trinitrophenol, Keyhole limpet hemocyanin (KLH), Rheumafaktor, Insulin |
Besonders genannt seien die Immunoglobuline aller Klassen,
speziell die oligomeren Typen, insbesondere IgM, IgE und IgA.
Die kovalente Fixierung der biologisch aktiven Materialien
setzt das Intaktsein der reaktiven Gruppen X in den
Polymerisaten der Dispersionen FD und NFD und somit eine
entsprechend schonende Herstellung und Handhabung voraus. Eine
solche schonende Herstellung wird z. B. in der EP-A 00 71 704
beschrieben.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der
Erfindung.
In ein 2-l-Polymerisationsgefäß, ausgestattet mit
Rückflußkühler, Rührer und Thermometer, gibt man
2,90 g Methylmethacrylat
2,90 g Isobutylmethacrylat
0,30 g Glykoldimethacrylat
3,60 g Ammoniumperoxydisulfat
0,72 g Natriumlaurylsulfat
2,90 g Isobutylmethacrylat
0,30 g Glykoldimethacrylat
3,60 g Ammoniumperoxydisulfat
0,72 g Natriumlaurylsulfat
in 1482 g doppeldestilliertem Wasser und erwärmt auf
80 Grad C. Zu diesem Gemisch gibt man eine Mischung aus
171,00 g Methylmethacrylat
171,00 g Isobutylmethacrylat
18,00 g Glykoldimethacrylat
171,00 g Isobutylmethacrylat
18,00 g Glykoldimethacrylat
bei 80 Grad C während 2 Stunden tropfenweise unter Rühren zu.
Das Rühren bei 80 Grad C wird noch zusätzlich 2 Stunden lang
fortgesetzt. Dann wird das Gemisch auf Raumtemperatur
abgekühlt und filtriert. Man erhält eine Dispersion, die im
wesentlichen frei von Koagulat ist mit einem Feststoffgehalt
von ca. 20 Gew.-%, einer Viskosität (bestimmt nach DIN 53 018)
von 4 mPa · s und einem durchschnittlichen Partikalradius von
120 nm (bestimmt mit "Coulter Nanosizer").
In einem Witt'schen Topf wurde die Vorlage unter Rühren auf
80 Grad C erhitzt, der Initiator (Ammoniumperoxodisulfat oder
das Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure))
zugegeben und anschließend der Zulauf als Emulsion oder
Monomerengemisch innerhalb einer bestimmten Zeit zudosiert.
15 min nach Zulaufende wurde die Dispersion auf Raumtemperatur
abgekühlt und filtriert.
Vorlage:
1478,0 g Wasser
2,9 g Isobutylmethacrylat
2,9 g Methylmethacrylat
0,3 g Glykoldimethacrylat
3,6 g Ammoniumperoxodisulfat
1478,0 g Wasser
2,9 g Isobutylmethacrylat
2,9 g Methylmethacrylat
0,3 g Glykoldimethacrylat
3,6 g Ammoniumperoxodisulfat
Zulauf
(über 20 min):
168,1 g Isobutylmethacrylat
168,1 g Methylmethacrylat
17,7 g Glykoldimethacrylat
168,1 g Isobutylmethacrylat
168,1 g Methylmethacrylat
17,7 g Glykoldimethacrylat
Feststoffgehalt: 21,1 Gew.-%; pH = 2,4; Viskosität: 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 480 nm.
Es wurde verfahren wie in Beispiel 1b), nur:
Vorlage:
1485,0 g Wasser
0,72 g Natriumlaurylsulfat
3,6 g Ammoniumperoxodisulfat
1485,0 g Wasser
0,72 g Natriumlaurylsulfat
3,6 g Ammoniumperoxodisulfat
Feststoffgehalt: 21,4 Gew.-%; pH 2,3; Viskosität 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 270 nm.
Vorlage:
427,0 g Wasser
540,0 g Saatlatex B
9,0 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
0,35 g 4,4′-Azobis-(4-canovaleriansäure), Na-Salz
427,0 g Wasser
540,0 g Saatlatex B
9,0 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
0,35 g 4,4′-Azobis-(4-canovaleriansäure), Na-Salz
Zulauf:
585,0 g Wasser
0,88 g Natriumlaurylsulfat
2,12 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
119,7 g Isobutylmethacrylat
119,7 g Methylmethacrylat
12,6 g Glykoldimethacrylat
585,0 g Wasser
0,88 g Natriumlaurylsulfat
2,12 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
119,7 g Isobutylmethacrylat
119,7 g Methylmethacrylat
12,6 g Glykoldimethacrylat
Feststoffgehalt: 21,2 Gew.-%, pH = 62,2, Viskosität: 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 730 nm.
Zu einem 2-l-Polymerisationsgefäß mit Rückflußkühler, Rührer
und Thermometer wird eine Lösung, bestehend aus
7,50 g Phosphatpuffer, pH = 7,0
0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
0,48 g Natriumlaurylsulfat
150,00 g eines Saatlatex gemäß Beispiel 1 (= Saatlatex A)
275,00 g destilliertes Wasser
0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
0,48 g Natriumlaurylsulfat
150,00 g eines Saatlatex gemäß Beispiel 1 (= Saatlatex A)
275,00 g destilliertes Wasser
hergestellt und auf 80 Grad C erwärmt.
Zu dieser Lösung gibt man tropfenweise und unter Rühren eine
Emulsion bestehend aus
210,00 g Ethylacrylat
75,00 g Methylmethacrylat
15,00 g Glycidylmethacrylat
1,76 g Natriumsalze der 4,4′-Azobis-(4-Cyano)valeriansäure
0,73 g Natriumlaurylsulfat und
933,00 g destilliertes Wasser bei 80 Grad C innerhalb 4 St.
75,00 g Methylmethacrylat
15,00 g Glycidylmethacrylat
1,76 g Natriumsalze der 4,4′-Azobis-(4-Cyano)valeriansäure
0,73 g Natriumlaurylsulfat und
933,00 g destilliertes Wasser bei 80 Grad C innerhalb 4 St.
Die Dispersion rührt man weitere 15 Minuten, läßt auf
Raumtemperatur abkühlen und filtriert. Man erhält eine völlig
koagulatfreie Dispersion mit einem Feststoffgehalt von ca. 20 Gew.-%,
einem pH-Wert von 7,0, einer Viskosität von 6 mPa · s
und einem durchschnittlichen Partikelradius von ca. 240 nm.
In ein Polymerisationsgefäß, wie in Beispiel 1 beschrieben, gibt
man ein Gemisch aus
7,50 g Phosphatpuffer pH = 7,0
0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
30,00 g Saatlatex A gemäß Beispiel 1
0,29 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
30,00 g Saatlatex A gemäß Beispiel 1
und 340 g doppelt destilliertes Wasser und erwärmt auf
80 Grad C. Zu dieser Mischung gibt man während 4 Stunden bei
80 Grad C eine Emulsion, hergestellt aus
180,00 g Methylmethacrylat
105,00 g Ethylacrylat
15,00 g Glycidylmethacrylat
1,76 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
0,73 g Natriumlaurylsulfat
865,00 g doppelt destilliertes Wasser
105,00 g Ethylacrylat
15,00 g Glycidylmethacrylat
1,76 g Natriumsalz der 4,4′-Azobis-(4-cyano)-Valeriansäure
0,73 g Natriumlaurylsulfat
865,00 g doppelt destilliertes Wasser
Die Dispersion wird weitere 15 Minuten bei 80 Grad C gerührt,
wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Man
erhält eine koagulatfreie Dispersion mit einem Feststoffgehalt
von ca. 20 Gew.-% und einen pH-Wert von 7,0, einer Viskosität
von 6 mPa · s und einen Partikelradius von ungefähr 400 nm.
Vorlage:
272,0 g Wasser
0,48 g Natriumlaurylsulfat
7,5 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
150,0 g Saatlatex C
0,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
272,0 g Wasser
0,48 g Natriumlaurylsulfat
7,5 g Titrisollösung pH 7 (Merck)
150,0 g Saatlatex C
0,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Zulauf
(über 240 min):
932,0 g Wasser
0,73 g Natriumlaurylsulfat
1,76 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
210,0 g Ethylacrylat
75,0 g Methylmethacrylat
15,0 g Glycidylmethacrylat
932,0 g Wasser
0,73 g Natriumlaurylsulfat
1,76 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
210,0 g Ethylacrylat
75,0 g Methylmethacrylat
15,0 g Glycidylmethacrylat
Feststoffgehalt: 20,2 Gew.-%, pH = 7,3; Viskosität 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser 560 nm, MFT: 5 Grad C.
Der Zulauf besteht aus Emulsion 1 und Emulsion 2 im Verhältnis
70 : 30, die nacheinander zugetropft werden.
Vorlage:
407,0 g Wasser
9,0 g Tritrisollösung, pH 7 (Merck)
36,0 g Saatlatex C
0,35 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
407,0 g Wasser
9,0 g Tritrisollösung, pH 7 (Merck)
36,0 g Saatlatex C
0,35 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Emulsion 1
(über 168 min):
726,0 g Wasser
0,61 g Natriumlaurylsulfat
1,48 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
163,8 g Methylmethacrylat
75,6 g Ethylacrylat
12,6 g Allylmethacrylat
726,0 g Wasser
0,61 g Natriumlaurylsulfat
1,48 g 4,4-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
163,8 g Methylmethacrylat
75,6 g Ethylacrylat
12,6 g Allylmethacrylat
Emulsion 2
(über 72 min):
311,0 g Wasser
0,27 g Laurylsulfat
0,64 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
64,8 g Ethylacrylat
43,2 g Glycidylmethacrylat
311,0 g Wasser
0,27 g Laurylsulfat
0,64 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
64,8 g Ethylacrylat
43,2 g Glycidylmethacrylat
Feststoffgehalt: 20,8 Gew.-%, pH: 7,3; Viskosität: 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 760 nm, MFT < 50 Grad C.
Vorlage:
560,0 g Wasser
1,12 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4′-cyanovaleriansäure), Na-Salz
560,0 g Wasser
1,12 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4′-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Zulauf
(über 240 min):
860,0 g Wasser
4,2 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), 420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat
860,0 g Wasser
4,2 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), 420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat
Feststoffgehalt: 27,7 Gew.-%, pH = 7,6; Viskosität: 6 mPa · s,
Teilchendurchmesser: 82 nm, MFT: 8 Grad C.
Vorlage:
1411,0 g Wasser
37,5 g Titrisollösung, pH 7 (Merck)
1200,0 g Saatlatex D
1,18 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
1411,0 g Wasser
37,5 g Titrisollösung, pH 7 (Merck)
1200,0 g Saatlatex D
1,18 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Nach Zugabe des Initiators wird zuerst innerhalb von 120 min
eine Emulsion, bestehend aus
1830,0 g Wasser
2,92 g Natriumlaurylsulfat
2,92 g Natriumlaurylsulfat
Zulauf 1:
5,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
313,5 g Isobutylmethacrylat
313,5 g Methylmethacrylat
33,0 g Glykoldimethacrylat
5,29 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
313,5 g Isobutylmethacrylat
313,5 g Methylmethacrylat
33,0 g Glykoldimethacrylat
zugetropft und dann innerhalb von 60 min gleichzeitig a) ein
Monomergemisch aus
126,0 g Glycidylmethacrylat
102,0 g Methylmethacrylat
12,0 g Glykoldimethacrylat
102,0 g Methylmethacrylat
12,0 g Glykoldimethacrylat
und b) eine Lösung aus
Zulauf 2:
601,0 g Wasser
60,0 g Methacrylamid
1,77 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
601,0 g Wasser
60,0 g Methacrylamid
1,77 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Feststoffgehalt: 20,8 Gew.-%, pH = 7,7, Viskosität: 5 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 1120 nm; MFT < 60 Grad C.
Der Zulauf besteht aus Emulsion 1 und Emulsion 2 im Verhältnis
4 : 1, die nacheinander zugetropft werden.
Vorlage:
559,0 g Wasser
0,42 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
559,0 g Wasser
0,42 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Emulsion 1
(über 192 min):
679,0 g Wasser
3,36 g Natriumlaurylsulfat
0,78 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
456,0 g Methylmethacrylat
24,0 g Allylmethacrylat
679,0 g Wasser
3,36 g Natriumlaurylsulfat
0,78 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
456,0 g Methylmethacrylat
24,0 g Allylmethacrylat
Emulsion 2
(über 48 min):
177,0 g Wasser
0,84 g Natriumlaurylsulfat
0,2 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
84,0 g Ethylacrylat
36,0 g Methylmethacrylat
177,0 g Wasser
0,84 g Natriumlaurylsulfat
0,2 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
84,0 g Ethylacrylat
36,0 g Methylmethacrylat
Feststoffgehalt: 29,6 Gew.-%, pH: 6,7; Viskosität 5 mpa · s;
Teilchendurchmesser: 204 nm, MFT < 50 Grad C.
Vorlage:
560,0 g Wasser
1,12 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
560,0 g Wasser
1,12 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
Zulauf
(über 240 min):
860,0 g Wasser
4,2 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat
860,0 g Wasser
4,2 g Natriumlaurylsulfat
0,98 g 4,4′-Azobis-(4-cyanovaleriansäure), Na-Salz
420,0 g Ethylacrylat
180,0 g Methylmethacrylat
Feststoffgehalt: 28,7 Gew.-%, pH: 6,7, Viskosität: 6 mPa · s;
Teilchendurchmesser: 82 nm, MFT: 8 Grad C.
In einem Witt'schen Topf werden
920 g Wasser
29 g eines ethoxylierten Isononylphenols (Ethoxylierungsgrad 100)
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
6 g Methacrylsäure
29 g eines ethoxylierten Isononylphenols (Ethoxylierungsgrad 100)
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
6 g Methacrylsäure
vorgelegt und durch die Apparatur mit N₂ gespült. Die Polymerisation
wurde durch Zugabe von 0,5 g Ammoniumperoxidisulfat, 0,7 g
Natriumpyrosulfit und 0,01 g Eisen-(II)-Sulfat ausgelöst. Nach
Überschreiten der Temperaturspitze wurde auf 40 Grad C
abgekühlt und
100 g des oben genannten Emulgators
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
6 g Methacrylsäure
346 g Ethylacrylat
146 g Methylmethacrylat und
6 g Methacrylsäure
zugefügt und die Polymerisation durch Zusatz von 0,7 g
Natriumpyrosulfit und 0,5 g Ammoniumperoxodisulfat erneut
ausgelöst. Nach Überschreiten des Temperaturmaximums wurde auf
Raumtemperatur abgekühlt und mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt
und mit Wasser auf 30% F.G. verdünnt.
Feststoffgehalt: 30%, Teilchendurchmesser: 160 nm,
Viskosität: 20 mPa · s, MFT: 7 Grad C.
Anwendungsfähige Mischungen erhält man durch Mischen der
Polymerdispersionen aus den Beispielen 2 und 3 in
Verhältnissen (angegeben in Gew.-%), die aus den folgenden
Tabellen 1-7 zu entnehmen sind.
34 ml der Dispersionsmischungen werden mit entionisiertem
Wasser auf ein Endvolumen von 200 ml verdünnt.
- a) Das Sprühaggregat wird mit 6-8 ml der anwendungsfähigen Mischungen aus Beispiel 11 gefüllt.
- b) Ein Dragierkessel (Durchmesser 145 mm, zwei Verteilerplatten) wird mit 150 Polystyrolkugeln (Spherotech-Kugeln, bezogen von Spherotech-Vertriebs GmbH, Fulda, Bundesrepublik Deutschland) mit einem Durchmesser von 6,35 mm beschickt. Die Rotation des Kessels lief mit 50-70 rpm an, wobei 5-7 ml der anwendungsfähigen Mischung auf die Kugeln aufgesprüht werden, während sie innerhalb des Dragierkessels in Bewegung waren. Der Sprühprozeß wurde bei Raumtemperaturen während ca. 30 Minuten durchgeführt, währenddessen wird ein nichtgeheizter Luftstrahl (elektr. Föhn) in den Dragierkessel geblasen, um die Feuchtigkeit zu verdampfen.
- c) Nach Abschluß des Beschichtungsschritts werden die beschichteten Perlen in einer geschlossenen Polystyrolflasche bei -15 Grad C aufbewahrt bis zu ihrer Anwendung z. B. zur Immobilisierung von Antikörpern.
- a) 1000 µg eines monoklonalen Antikörpers aus der Maus (gerichtet gegen ein menschliches Polypeptidhormon vom Molekulargewicht ca. 30 000) wurden in 20 ml einer 0,3molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH=8,0) gelöst.
- b) Diese Antikörper-Präparation wird auf 100 in einem Becherglas befindliche beschichtete Perlen gemäß Beispiel 12 aufgebracht.
- c) Man läßt dieses Gemisch bei 23 Grad C über Nacht stehen ohne Bewegung.
- d) Der wäßrige Anteil dieses Gemischs wird durch Vakuumabsaugen entfernt, und die zurückbleibenden Perlen werden dreimal mit je 80 ml PBS (Standardpuffer, mit Kochsalzzusatz pH=7,2) gewaschen. Der Waschvorgang besteht in fünfminütigem schwachem Schütteln, gefolgt vom Absaugen der wäßrigen Phase, wobei die Perlen in dem verwendeten Gefäß zurückbleiben.
- e) Nach dem dritten Waschgang gibt man 20 ml einer Pufferlösung, die 1 Gew.-% an Serumalbumin in PBS (pH=7,2) enthält, auf die Perlen auf. Diese Mischung läßt man über Nacht bei 23 Grad C ohne zu schütteln stehen.
- f) Das Waschen erfolgt wie unter b) beschrieben.
- g) Die beladenen Perlen bewahrt man im Kühlschrank bei +5 Grad C auf bis zum Gebrauch.
- a) Die Polystyrolkugeln, die gemäß Beispiel 13 gewonnen worden waren, werden in Teströhrchen mit Kalottenboden (9,6 mm Durchmesser) abgefüllt, und zwar eine Perle pro Reagenzglas.
- b) Dazu gibt man 100 µl eines radioaktiven Tracers (verschiedener monoklonaler Antikörper, der gegen das oben genannte Antigen gerichtet ist und mit ¹²⁵J markiert wurde in der Größenordnung von ca. 50 000 Counts per Minute).
- c) Unmittelbar nach der Zugabe des Tracers gibt man 100 µl des Antigens zu in den untenstehend (s. Tabelle) angegebenen Konzentrationen.
- d) Die Mischung wird bei Raumtemperatur (21 Grad C) mittels einer Orbital-Schüttelmaschine bei 300 Umdrehungen pro Minute 3 Stunden lang geschüttelt.
- e) Der wäßrige Anteil des Inkubationsansatzes wird durch Vakuumabsaugen beseitigt.
- f) Jedes Reagenzglas mit seiner Perle wird dreimal mit je 1 ml Pufferlösung gewaschen (2 Gew.-% Rinderserumalbumin in 0,2molarem Trispuffer vom pH 8,5 und 1,2 Gew.-% an R-Tween-20-Emulgator).
- g) Die Teströhrchen werden in einem Gamma-Szintillationszähler ausgezählt (Typ Multi Crystal Gamma Counter LB 2103).
Die so erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 1-7 (s.
unten) wiedergegeben.
Wie die Werte in den Tabellen 1-7 zeigen, ergibt das
erfindungsgemäße Überziehen der Polystyrolkugeln bzw. -perlen
mit dem Gemisch der Dispersionen FD und NFD eine erhebliche
Verbesserung, nämlich einen Abfall des Variationskoeffizienten
parallel zu einem gewissen Anstieg (9585 cpm : 16 636 cpm) im
Bereich der Testergebnisse bei den höchsten angewendeten
Konzentrationen.
Bei den niedrigen Konzentrationen des Analyten schlägt sich
hingegen der Unterschied zwischen der Beschichtung mit
ausschließlich der filmbildenden Dispersion FD gegenüber dem
Gemisch aus filmbildender und nichtfilmbildender Dispersion NFD
nicht in einem deutlichen Anstieg der Testempfindlichkeit
nieder.
Die besten Ergebnisse ergeben Perlen, die erfindungsgemäß mit
dem Latex aus einem Dispersionsgemisch, das 10-20 Gew.-% der
filmbildenden Dispersion FD enthält, beschichtet sind.
Verglichen mit nichtbeschichteten Polystyrolperlen (die als
Stand der Technik zu gelten haben) weisen mit dem Gemisch der
filmbildenden Dispersion FD und nichtfilmbildenden Dispersion
NFD beschichtete Polystyrolperlen einen mindestens vierfachen
Anstieg der gemessenen Counts-per-minute (cpm)-Werte im
unteren und mittleren Konzentrationsbereich des Analyten auf,
der sogar noch bis in die zweithöchste Konzentration
hineinreicht. Selbst bei der höchsten Konzentration ergibt
sich ein Anstieg der gemessenen cpm-Werte um den Faktor ca.
2,5. Der erfindungsgemäß erzielte Fortschritt in der Technik
des Festkörper-Immunoassays kann somit als eindeutig
nachgewiesen gelten.
700 g PMMA-Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße
von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt)
mit folgender Dispersionsmischung überzogen:
Nichtfilmbildende Dispersion gemäß Beispiel 7|1225 g | |
filmbildende Dispersion gemäß Beispiel 10 (auf 20% Trockensubstanz verdünnt) | 525 g |
1750 g |
Verhältnis Kern/Schale = 2 : 1
Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40 Grad C
Ablufttemperatur 23-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40 Grad C
Ablufttemperatur 23-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min
Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es
ist freifließend, nach einer Teilchengrößenanalyse mittels
Rüttelsieb liegen 81,4% (Gew.) der Ausbeute im Bereich von
0,3-0,6 mm.
Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 0,7 U/g
Casein: 0,3 U/g
BAEE: 0,7 U/g
Casein: 0,3 U/g
900 g PMMA-Perlpolymerisat mit einer mittleren Teilchengröße
von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt)
mit folgender Dispersionsmischung überzogen.
Nichtfilmbildende Dispersion gemäß Beispiel 7|3150 g | |
filmbildende Dispersion gemäß Beispiel 4 | 1350 g |
4500 g |
Verhältnis Kern/Schale = 1 : 1
Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-50 Grad C
Ablufttemperatur 19-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 11,84 g/min
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-50 Grad C
Ablufttemperatur 19-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 11,84 g/min
Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es
ist freifließend, 85,8% (Gew.) der Ausbeute liegen im
Korngrößenbereich von 0,3 bis 0,6 mm.
Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 3,9 U/g
Casein: 1,04 U/g
BAEE: 3,9 U/g
Casein: 1,04 U/g
500 mg Trypsin (vom Ring, Art. No. 24 579, 40 v/mg; E. Merck,
D-6100 Darmstadt) werden in 10 ml 1 M Kalium-Phosphatpuffer
(pH 7,5) gelöst und zu 5 g PT 9376-43 gegeben.
Die Mischung wird 10 sec. lang leicht geschüttelt und bei
+23 Grad C 72 Stunden lang stehen gelassen.
Danach wäscht man siebenmal mit jeweils 10 Volumen
deionisiertes Wasser und dreimal mit jeweils 10 Volumen 0,1 M
Phosphatpuffer (enthält 500 ppm p-Hydroxybenzoesäure zur
Konservierung und 2% 2-Propanol).
Gewaschen (auf Fritte über Vakuum) erhält man eine
Feuchtausbeute: 5,6 g.
Aktivität gegenüber
BAEE: 3,2 U/g
Casein: 0,36 U/g
BAEE: 3,2 U/g
Casein: 0,36 U/g
Aktivität im Vergleich zum Stand der Technik:
(siehe Tabelle unten) ergibt keinen Aktivitätsverlust durch Dragierung (Essenz der Erfindung).
(siehe Tabelle unten) ergibt keinen Aktivitätsverlust durch Dragierung (Essenz der Erfindung).
Auf 20 g Casein nach Hammarstein (Art. No. 2242, E. Merck, D-6100
Darmstadt) gibt man 350 ml deionisiertes Wasser und 32 mol
0,5 M NaOH und rührt so lange bei 60 Grad C, bis das Casein
gelöst ist. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird der pH-Wert
durch Zugabe von 0,1 M HCl auf pH 8,0 eingestellt. Dann wird
das Volumen mit deionisiertem Wasser auf 500 ml aufgefüllt.
(Es sollte beachtet werden, daß auf Grund der Aggregation von
Casein die Lösung immer etwas trübe ist.)
20 ml Substratlösung und 2 g Produkt nach Beispiel 17
werden bei 37 Grad C, pH 8,0, in einem thermostatisierten
Reaktionsgefäß mit pH-Stat.-Einheit gerührt. Gleichzeitig wird
die Menge an hydrolysiertem Substrat über den Verbrauch an
0,01 N NaOH gegen die Zeit aufgezeichnet.
Nach 10 min der Inkubation wird das Produkt in einer
Glasfritte (Porosität No 2) aufgefangen, und dasselbe Produkt
wird für weitere 10 min inkubiert.
Für die Deklaration der Aktivität wird der 4. Cyclus
herangezogen.
1% BAEE-Lösung (Art. No. 1672; E. Merck, D-6100 Darmstadt)
wird in 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst.
20 ml Substratlösung und 2 g Produkt nach Beispiel 17
(Feuchteinwaage) werden bei 37 Grad C und pH 7,5 mit 0,1 M
NaOH titriert.
Inkubationszeit: 10 min.
Für die Deklaration der Aktivität wird der 4. Cyclus herangezogen.
Inkubationszeit: 10 min.
Für die Deklaration der Aktivität wird der 4. Cyclus herangezogen.
900 g PMMA-Perlpolymerisat mit einem mittleren
Teilchendurchmesser von 310 µm wird im Wirbelschichtgerät
(Uniglatt, Fa. Glatt) mit 1575 g der Dispersion aus Beispiel
5 überzogen.
Verhältnis Kern/Schale: 3 : 1
Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 20-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min
Sprühdruck 1,8 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 20-23 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 8,75 g/min
Das erhaltene Produkt wird 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Es
ist freifließend, 62,2% (Gew.) der Ausbeute liegt im
Korngrößenbereich von 0,3-0,6 mm.
Aktivität nach Bindung von Trypsin:
BAEE: 0,3 U/g
Casein: 0,9 U/g
BAEE: 0,3 U/g
Casein: 0,9 U/g
775 g PMMA-Perlpolymerisat (PLEXIDON® M 449) mit einem
mittleren Teilchendurchmesser von 100 µm wird im
Wirbelschichtgerät (Uniglatt, Fa. Glatt) mit folgender
Dispersionsmischung überzogen:
Dispersion aus Beispiel 6|1803,33 g | |
Dispersion aus Beispiel 8 | 775,00 g |
2583,33 g |
Verhältnis Kern/Schale: 1 : 1
Verfahrensbedingungen:
Sprühdruck 2 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 22-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 10,5 g/min
Trocknung 24 Stunden im Vakuum
Sprühdruck 2 bar
Zulufttemperatur 40-45 Grad C
Ablufttemperatur 22-25 Grad C
Sprühgeschwindigkeit 10,5 g/min
Trocknung 24 Stunden im Vakuum
Das erhaltene Produkt ist freifließend und weiß.
Der mittlere Teilchendurchmesser liegt bei 189 µm.
Claims (21)
1. Verfahren zur Herstellung von Trägersystemen zur
kovalenten Bindung von biologisch aktivem Material,
bestehend aus einem an sich bekannten festen
Supportmaterial mit polymerbeschichteter Oberfläche, wobei
das Polymer die zur kovalenten Bindung geeigneten
funktionalen Gruppen enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Supportmaterial mit einer Mischung einer
filmbildenden Polymerdispersion FD und einer nichtfilmbildenden
Dispersion NFD beschichtet wird, wobei
mindestens eine der beiden Polymerdispersionen die zur
kovalenten Bindung geeigneten funktionalen Gruppen
besitzt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
ein anorganisches Supportmaterial verwendet wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
ein organisches Supportmaterial verwendet wird.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-3, dadurch
gekennzeichnet, daß kugelförmige Partikel verwendet
werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
Kugeln mit einem Durchmesser im Bereich 0,01 bis 10 mm
verwendet werden.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß Flächengebilde auf Cellulose- oder
textiler Basis bzw. Glasfaser verwendet werden.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Polymerdispersionen ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus Polyacrylaten, Polystyrol und Polymerisaten
aus Alkylstyrol, Polyvinylester,
Polyvinylhalogenverbindungen sowie Mischpolymerisaten.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polymerdispersionen einen Gehalt
an funktionale Gruppen tragenden Monomeren der Formel
Z-(R)n-Xworin
X für eine Sulfonsäurehalogenid-, Thioisocyanat-, Thiocarbonyldioxy-, Carbonyl-imidoyldioxy-, Haloethoxy-, Aziridin-, Epoxy-, Formyl-, Keto-, Acryloyl-, Anhydrid- oder aktivierte Estergruppe als funktionale Gruppen
R für einen chemisch inerten Abstandhalter (Spacer),
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht,
besitzen.
X für eine Sulfonsäurehalogenid-, Thioisocyanat-, Thiocarbonyldioxy-, Carbonyl-imidoyldioxy-, Haloethoxy-, Aziridin-, Epoxy-, Formyl-, Keto-, Acryloyl-, Anhydrid- oder aktivierte Estergruppe als funktionale Gruppen
R für einen chemisch inerten Abstandhalter (Spacer),
n für 0 oder 1 und
Z für eine polymerisationsfähige Einheit steht,
besitzen.
9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die zur kovalenten Bindung geeigneten
funktionalen Gruppen Bestandteil der nichtfilmbildenden
Dispersion NFD sind.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-9, dadurch
gekennzeichnet, daß der Gehalt an funktionalen Monomeren
im Polymerisat 0,1 bis 80 Gew.-%, bezogen auf die
Gesamtheit der Monomeren, beträgt.
11. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Polymerdispersionen Polyacrylate
bestehend zu mindestens 50 Gew.-%, bezogen auf die
Gesamtheit der Monomeren, aus Monomeren der Formel
worin
R₁ für Wasserstoff oder Methyl oder eine Gruppe CH₂-COOR₂ steht, worin R₂ einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₃ für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einem Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Ringgliedern steht
darstellen.
R₁ für Wasserstoff oder Methyl oder eine Gruppe CH₂-COOR₂ steht, worin R₂ einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet und
R₃ für einen gegebenenfalls verzweigten Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen oder einem Cycloalkylrest mit 3 bis 12 Ringgliedern steht
darstellen.
12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die filmbildende Dispersion FD eine
minimale Filmbildungstemperatur (nach DIN 53 787) von
unter 60 Grad C, vorzugsweise unter 40 Grad C besitzt.
13. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Einfriertemperatur des die
nichtfilmbildende Dispersion NFD bildenden Polymerisats
über der Filmbildungstemperatur liegt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Einfriertemperatur der nichtfilmbildenden Dispersion
NFD bei mindestens 30 Grad C liegt.
15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 7 und 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Partikel der filmbildenden
Dispersion FD eine durchschnittliche Teilchengröße im
Bereich 0,02 bis 5 µ besitzen.
16. Verfahren gemäß den Ansprüchen 7 und 13, dadurch
gekennzeichnet, daß die Partikel der nichtfilmbildenden
Dispersion NFD eine durchschnittliche Teilchengröße im
Bereich 0,04 bis 5 µm besitzen.
17. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 15 und 16, dadurch
gekennzeichnet, daß die Partikel der nichtfilmbildenden
Dispersion NFD durchschnittlich um einen Faktor 1,2 bis 20
größer sind als die der filmbildenden Dispersion FD.
18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 7-17, dadurch
gekennzeichnet, daß bei der Applikation die nichtfilmbildende
Dispersion NFD zur filmbildenden Dispersion
FD im Verhältnis 50 Gew.-Teile : 50 Gew.-Teile bis
99 Gew.-Teile zu 1 Gew.-Teil steht.
19. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-18, dadurch
gekennzeichnet, daß das Supportmaterial durch Tauchen oder
Sprühen mit der filmbildenden Polymerdispersion FD und der
nichtfilmbildenden Polymerdispersion beschichtet wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß
beim Tauchen oder Sprühen das Gemisch der
Polymerdispersionen verwendet wird.
21. Verwendung der gemäß den Verfahrensansprüchen 1-20
hergestellten Trägersystemen zur kovalenten Bindung von
biologisch aktivem Material.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4026992A DE4026992A1 (de) | 1990-08-25 | 1990-08-25 | Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialien |
CH2436/91A CH682373A5 (de) | 1990-08-25 | 1991-08-19 | Verfahren zur Herstellung von Trägersystemen für biologisch aktive Materialien. |
FR9110480A FR2666033B1 (fr) | 1990-08-25 | 1991-08-21 | Procede de preparation de systemes porteurs pour des matieres biologiquement actives et utilisation de ces systemes. |
GB9118256A GB2248196B (en) | 1990-08-25 | 1991-08-23 | Process for preparing a carrier for binding biologically active substances |
US07/979,425 US5342646A (en) | 1990-08-25 | 1992-11-19 | Method for making carrier systems for biologically active materials |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4026992A DE4026992A1 (de) | 1990-08-25 | 1990-08-25 | Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialien |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4026992A1 true DE4026992A1 (de) | 1992-02-27 |
Family
ID=6412968
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE4026992A Withdrawn DE4026992A1 (de) | 1990-08-25 | 1990-08-25 | Verfahren zur herstellung von traegersystemen fuer biologisch aktive materialien |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5342646A (de) |
CH (1) | CH682373A5 (de) |
DE (1) | DE4026992A1 (de) |
FR (1) | FR2666033B1 (de) |
GB (1) | GB2248196B (de) |
Cited By (1)
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