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Die
folgende Erfindung betrifft die Verwendung von Trägern mit
Azlactonfunktion zur Bereitstellung einer Zellselektion.
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Das
sich rasch vergrößernde Wissen
in den Bereichen Molekularbiologie und Zellbiologie, Immunologie
und Genetik führte
zur Identifizierung und Charakterisierung verschiedener hochspezialisierter
Subpopulationen von Zellen in vielen Arten von Geweben. So führte beispielsweise
die Identifizierung seltener „Stammzellen" in solch kritischen
Geweben wie dem Gehirn, den Langerhans'schen Zellen der Bauchspeicheldrüse sowie
der Leber zu Vermutungen, daß eines
Tages viele kranke Gewebe durch Regeneration von gesunden Geweben
nach Zelltransplantation behandelt werden könnten (Beardsley, Scientific
American, Juni 1998, S. 11–12).
Tatsächlich
sind solche Therapien auf Gebieten, wie z.B. der Krebsbehandlung,
bereits gelungen. Durch die zur Zerstörung von Krebsgewebe notwendigen
Chemotherapie- oder Strahlungsdosen wird häufig auch das Knochenmark des
Patienten und praktisch sein gesamtes Immunsystem zerstört. Eine
Transplantation zuvor aus entweder dem Mark oder peripherem Blut
isolierten hämatopoetischen
Stammzellen kann durch Rekonstituierung des Knochenmarks und der
Zellen des Immunsystems den Patienten retten (Donahue, et al., Blood,
1996, 87, S. 1644–1653).
Ebenso wird angenommen, daß gereinigte
Stammzellen oder andere spezifische Zellpopulationen für die Entwicklung
verschiedener Immuntherapien (z.B. AIDS-Therapien) und der Gentherapie
wichtig sind.
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Um
die Forschung und besonders klinische Anwendungen auf diesen und
verwandten Gebieten zu fördern,
werden immer wirksamere Verfahren zur Trennung und Reinigung verschiedener
Zellpopulationen benötigt. Über die
Jahre wurden verschiedene Verfahren zur Trennung/Reinigung von Zellen
benutzt. Dabei waren diese Trenntechniken von verschiedenen biologischen
und biochemischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften
der zu trennenden Zellpopulation abhängig (Esser, in „Cell Separation
Methods and Applications",
D. Recktenwald und A. Radbruch, Hersg., Marcel Dekker, NY, NY, 1997,
S. 1–14).
Dabei waren auf Immunaffinität
beruhende Trennungen vielversprechend hinsichtlich der Bereitstellung
relativ reiner Präparationen
spezifischer Zellen. Im US-Patent Nr. 5,035,994 (Civin) wird die
Verwendung eines mit einer Festphase verknüpften monoklonalen Antikörpers, der
spezifisch an ein Antigen auf menschlichen pluripotenten lymphohämatopoetischen
Stammzellen bindet, zur Trennung der Stammzellen von einer Suspension
aus Mark- oder Blutzellen beschrieben. Von Pope et al., (Bioconjugate
Chem., 1993, 4, S. 166–171)
wird die Verwendung bifunktioneller Silanreagenzien zur Aktivierung
fester Träger
aus Glas und Zellulose beschrieben. Dabei werden dann Ziege-Antimaus-Antikörper kovalent
mit den aktivierten Trägern
verknüpft
und die derivatisierten Träger
zur selektiven Abreicherung mononukleärer CD34+- oder CD4+-Zellen aus peripheren Blutproben
verwendet. Im US-Patent Nr. 5,215,927 (Berenson, et al.) wird die
Immunselektion von Zellen mit einem Avidin-Biotin-Erkennungssystem
beschrieben. Während
diese und andere im Stand der Technik beschriebene Verfahren die
Selektion und Reinigung ausgewählter
Zellpopulationen berücksichtigen,
besteht weiterhin ein Bedarf an neuen Verfahren und Materialien,
durch die diese Zellpopulationen mit verbesserter Reinheit und Ausbeute
bereitgestellt werden können.
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Träger mit
Azlactonfunktion sind als ziemlich gut zur Immobilisierung biologisch
aktiver Materialien geeignet beschrieben worden. So wird beispielsweise
im US-Patent Nr. 5,403,902 (Heilmann, et al.) die Herstellung von
Materialien aus Partikulärstoffen
oder Kügelchen
beschrieben, an die Biomakromoleküle, wie z.B. Proteine, Antikörper, Enzyme
usw., gekoppelt werden können.
Diese Materialien eignen sich beispielsweise zur Reinigung von Proteinen
mittels Affinitätschromatographie.
In den US-Patenten Nr. 5,262,484, 5,292,514, 5,451,453, 5,486,358
und 5,510,421 werden jeweils weitere Träger mit Azlactonfunktion sowie
Materialien und ihre Verwendungen beschrieben. Doch wurde in keiner
dieser Literaturangaben beschrieben oder vorgeschlagen, daß sich Träger mit
Azlactonfunktion zur Reinigung oder Selektion ganzer Zellen eignen
könnten.
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In
der PCT-Patentveröffentlichung
WO 93/04576 (Kim et al.) wird die Fähigkeit von Trägern mit
Azlactonfunktion zur Trennung proteinhaltiger Materialien von nichtproteinhaltigen
Materialien beschrieben. Dies kann bei der Trennung und Reinigung
von biologischen Materialien sinnvoll sein. Wird der Träger mit
Azlactonfunktion mit einem Gemisch aus proteinhaltigen und nichtproteinhaltigen
Materialien in Kontakt gebracht, so reagieren die proteinhaltigen
Materialien mit dem Träger
und werden daran gekoppelt, wobei die nichtproteinhaltigen Materialien
(z.B. Nukleinsäuren)
nicht mit dem Träger
reagieren, sondern in Lösung
verbleiben. Zwar wird in dieser Veröffentlichung die Fähigkeit
zur Trennung ganzer Zellen aus natürlich vorkommenden biologischen
Flüssigkeiten
nicht beschrieben, doch wird offenbart, daß das nichtproteinhaltige Material
biologische Aktivität
zur weiteren Bearbeitung nach der Trennung von dem Träger mit
Azlactonfunktion, an den proteinhaltiges Material gekoppelt ist,
zurückbehält.
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In
der PCT-Patentveröffentlichung
Wo 94/22918 (Velander et al.) wird ein Verfahren zur Derivatisierung
eines porösen
Trägers,
und zwar so, daß der
Ligand verteilt wird, beschrieben. In den in der Veröffentlichung
offenbarten Beispielen wird die kovalente Kopplung monoklonaler
Antikörper
und Proteine für
weitere biologische Trennverfahren bestimmt.
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Im
US-Patent Nr. 5,200,471 (Coleman et al.) wird ein Verfahren zur
kovalenten Kopplung von Liganden an Träger mit Azlactonfunktion beschrieben,
und zwar insbesondere mit einem Verfahren zur Erhöhung der Qualität der kovalent
gekoppelten Liganden, um eine hochspezifische gebundene biologische
Aktivität
zu erhalten.
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Im
US-Patent Nr. 5,561,097 (Gleason et al.) wird ein Verfahren zur
kovalenten Kopplung kleiner Ligandenmoluküle an Träger mit Azlactonfunktion, und
zwar so, daß dabei
die Dichte und Verteilung der Liganden kontrolliert werden kann,
beschrieben. Dieses Verfahren eignet sich zur Herstellung von Chromatographieträgern.
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Es
besteht ein Bedarf an neuen Materialien und Verfahren zur Selektion
oder Reinigung ganzer Zellen. Es wurde nun gefunden, daß Trägermaterialien
mit Azlactonfunktion, von denen bereits bekannt war, daß sie sich
zur Herstellung von Chromatographieträgern zur Proteinreinigung und
zur Präparation
kovalent gekoppelter Liganden, wie z.B. Proteinen, Enzymen u.ä., eignen,
auch als Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Trägern zur
Selektion und Reinigung ganzer Zellen dienen können.
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Kurz
gesagt wird in einem erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur
Zellselektion, umfassend die Schritte (a) Prä-Screening von Basispolymerträgern mit
einem Gemisch aus ganzen Zellen zur Identifizierung eines oder mehrerer
Basispolymerträger,
die eine minimale nichtspezifische Bindung ganzer Zellen aus dem Gemisch
zeigen; (b) Einbringen einer Azlactoneinheit in den in Schritt (a)
identifizierten Basispolymerträger,
so daß ein
Träger
mit Azlactonfunktion bereitgestellt wird; (c) Derivatisierung des
Trägers
mit Azlactonfunktion mit einer Substanz, die gegenüber einem
gewünschten
Typ von ganzen Zellen biologisch aktiv ist, wobei die Substanz kovalent
an den Träger
mit Azlactonfunktion gekoppelt wird; (d) Inkontaktbringen des Produkts
aus Schritt (c) mit einem die ganzen Zellen enthaltenden Gemisch;
(e) Ermöglichen
der Wechselwirkung der ganzen Zellen mit und deren Bindung an die
gekoppelte biologisch aktive Substanz; (f) Entfernen eines Restes des
Gemischs von dem Träger;
und (g) gegebenenfalls Eluieren der gebundenen Zellen von der gekoppelten biologisch
aktiven Substanz zur Herstellung einer gereinigten Sammlung ganzer
Zellen.
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Unter „Träger" wird ein beliebiger
Gegenstand verstanden, der eine Azlactonfunktion aufweist oder mit einer
Azlactonfunktion versehen werden kann. Dabei können zur Verwendung in der
folgenden Erfindung akzeptierbare Träger im Rahmen der Erfindung
stark variieren. Je nach der bevorzugten Endverwendung kann ein
Träger
porös oder
nichtporös
sein. Je nach der letztendlich gewünschten Nutzung kann ein Träger durchgegehend
oder nichtdurchgehend sein. Ein Träger kann aus verschiedenen
Materialien hergestellt sein, wobei dies Träger aus keramischen, Glas-,
metallischen oder polymeren Materialien oder Materialkombinationen
einschließt.
Je nach der letztendlichen gewünschten
Nutzung kann ein Träger
biegsam oder nichtbiegsam sein.
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Unter „mit Azlactonfunktion" versteht man, daß ein Träger Azlactonfunktionsgruppen
auf inneren und/oder äußeren Oberflächen eines
solchen Trägers
aufweist. Somit weisen solche reaktiven Träger eine Azlactonfunktionsgruppe
der Formel:
auf, wobei:
R
1 und R
2 unabhängig für eine Alkylgruppe
mit 1 bis 14 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis
14 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 5 bis 12 Ringatomen, eine
Arenylgruppe mit 6 bis 26 Kohlenstoffatomen sowie 0 bis 3 S-, N-
und nichtperoxidischen O-Heteroatomen stehen oder R
1 und
R
2 zusammen mit dem Kohlenstoff, an den
sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring mit 4 bis 12 Ringatomen
bilden können und
n für eine
ganze Zahl 0 oder 1 steht.
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„Kovalent
gekoppelt" bedeutet
mittels einer kovalenten Bindung chemisch gebunden.
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Unter
einer „biologisch
aktiven Substanz" versteht
man Substanzen, die, sobald sie kovalent mit dem Träger mit
Azlactonfunktion gekoppelt und daran immobilisiert sind, zur Bereitstellung
einer selektiven oder spezifischen Wechselwirkung mit bestimmten
Zielpopulationen ganzer Zellen geeignet sind.
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Unter
einer „ganzen
Zelle" versteht
man eine biologisch aktive Pflanzen- oder Tierzelle, deren Struktur während der
Trennung von anderen biologischen Materialien erhalten bleibt und
die dazu in der Lage ist, nach Verwendung des Trägers mit Azlactonfunktion,
an den eine biologisch aktive Substanz kovalent gekoppelt ist, zur
Trennung einer solchen Pflanzen- oder Tierzelle von anderen biologischen
Materialien biologisch aktiv zu bleiben. Zu den für die Herstellung
von Zellselektionsträgern
geeigneten Trägern
mit Azlactonfunktion gehören Träger aus
Kügelchen
oder Partikulärstoffen,
wie z.B. diejenigen, die im US-Patent
Nr. 5,403,902 offenbart sind, poröse Träger, wie z.B. diejenigen, die
im US-Patent Nr. 5,344,701 sowie in der PCT-Patentveröffentlichung
WO 93/06925 offenbart sind, Membranträger, wie z.B. diejenigen, die
im US-Patent Nr.
5,510,421 offenbart sind, daraus hergestellte Mischformen und Gegenstände, wie
z.B. diejenigen, die im US-Patent Nr. 5,408,002 veröffentlicht
sind, Substrate, wie z.B. diejenigen, die im US-Patent Nr. 5,292,514 offenbart sind,
sowie Pfropfcopolymere und daraus hergestellte Gegenstände, wie
z.B. diejenigen, die in den US-Patenten Nr. 5,013, 795 und 5,262,484
offenbart sind.
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Die
zur Derivatisierung des Trägers
mit Azlactonfunktion über
kovalente Kopplung verwendete biologisch aktive Substanz kann direkt
mit der spezifischen Population ganzer Zellen, die ausgewählt werden
soll, wechselwirken. Zu solchen Substanzen gehören beispielsweise, ohne darauf
beschränkt
zu sein, ein gegen ein auf der Oberfläche der auszuwählenden
ganzen Zelle exprimiertes spezifisches Zelloberflächen-Markermolekül (oder
-Antigen, AG) gerichteter Antikörper
(AB). Andererseits kann die biologisch aktive Substanz mit der ausgewählten Population
ganzer Zellen über
eine zweite, intermediäre
biologisch aktive Substanz wechselwirken.
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Ein
Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Leichtigkeit der Herstellung
von für
die Selektion ganzer Zellen geeigneten Trägern.
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Ein
weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Vielseitigkeit
und Vielfältigkeit
von für die
Herstellung von Trägern
mit Azlactonfunktion, die sich zur Eignung für die Selektion ganzer Zellen
modifizieren lassen, zur Verfügung
stehenden Verfahren.
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Ein
weiteres Merkmal der folgenden Erfindung besteht darin, daß sich die
Oberflächeneigenschaften der
Träger
für die
Selektion ganzer Zellen leicht kontrollieren lassen, um nichtspezifische
Wechselwirkungen mit ganzen Zellen, die keine Zielzellen sind, zu
minimieren oder zu verhindern.
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Ein
Vorteil der Erfindung besteht darin, daß Zielpopulationen ganzer Zellen
isoliert werden können,
die höhere
Reinheiten als solche, die mit herkömmlichen Trägern, wie z.B. denjenigen,
die oben bei der Erörterung des
Standes der Technik identifiziert wurden und bei denen von der Azlactonchemie
verschiedene chemische Reaktionen verwendet werden, isoliert wurden,
aufweisen.
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Ein
weiterer Vorteil der folgenden Erfindung besteht darin, daß Zielpopulationen
ganzer Zellen in höheren
Ausbeuten als solche, die mit herkömmlichen Trägern isoliert wurden, und auf
eine Weise, bei der die biologische Aktivität erhalten bleibt, isoliert
werden können.
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Weitere
Merkmale und Vorteile werden in den folgenden erfindungsgemäßen Ausführungsformen
offenbart.
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Träger mit
Azlactonfunktion
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Bei
den Trägern
mit Azlactonfunktion kann es sich um beliebige Verbindungen oder
Materialien handeln, die wenigstens eine Azlactongruppierung enthalten
oder umfassen, die sich durch kovalente Umsetzung mit einer biologisch
aktiven Substanz derivatisieren läßt. Solche Träger mit
Azlactonfunktion sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Bei dem Träger mit
Azlactonfunktion handelt es sich vorzugsweise um ein unlösliches Feststoffmaterial,
wobei unter dem Ausdruck „unlöslich" verstanden wird,
daß keine
Lösung
in dem Medium, von dem die Selektion ganzer Zellen erfolgen soll,
stattfindet, wobei das Material auf seiner Oberfläche Azlactongruppierungen
umfaßt,
die für
eine Umsetzung mit der für
die Selektion ganzer Zellen geeigneten biologisch aktiven Substanz
unmittelbar zur Verfügung
stehen.
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Zu
den Trägern
mit Azlactonfunktion gehören
beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Kügelchen,
partikuläre
Stoffe, Membranen, Gewebebahnen und Vliesbahnen sowie feste Kunststoffgegenstände mit einer
Azlactoneinheiten umfassenden Oberfläche. Derartige Träger mit
Azlactonfunktion sind verschiedentlich in der oben angegebenen Sammlung
von US-Patenten, die sämtlich
von der Minnesota Mining and Manufacturing Company (3M) aus St.
Paul, Minnesota, USA gehalten werden, offenbart.
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Träger mit
Azlactonfunktion aus Kügelchen
und partikulären
Stoffen sind insbesondere ausführlich
im US-Patent Nr. 5,403,902 (Heilmann, et al.) beschrieben. Die genannten
Träger
werden dabei mit Umkehrphasen-Suspensionspolymerisationsverfahren
und Dispersionspolymerisationsverfahren aus 2-Alkenylazlactonmonomeren
und gegebenenfalls Comonomeren und Vernetzern hergestellt.
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Poröse Träger mit
Azlactonfunktion, wie z.B. Membranen und Vliesmaterialien, sind
im US-Patent Nr. 5,344,701 (Gagnon, et al.) beschrieben. Diese Träger werden
durch Pfropfpolymerisation von Azlactonmonomeren und gegebenenfalls
Comonomeren auf die Oberflächen
bereits existierender Träger
unter Verwendung hochenergetischer Strahlung hergestellt. Als Alternative
werden die Oberflächen
der bereits existierenden Träger
mit Azlacton-Monomeren, Vernetzern und gegebenenfalls Comonomeren
beschichtet, und anschließend durch
Polymerisation die Träger
mit Azlactonfunktion gebildet.
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Weitere
poröse
Träger
mit Azlactonfunktion sind in der PCT-Patentveröffentlichung WO 93/06925 (Rasmussen,
et al.) beschrieben, wobei Partikel mit Azlactonfunktion in eine
durchgehende poröse
Matrix, wie z.B. eine fibrillierte Polytetrafluorethylenmembran
oder eine Vliesbahn, eingebaut sind.
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Mit
Lösungsmittelphaseninversionstechniken
hergestellte Membrane mit Azlactonfunktion sind im US-Patent Nr.
5,510,421 (Dennison, et al.) beschrieben.
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Thermoplastische
Pfropfcopolymere sowie Copolymergemische sind in den US-Patent Nr.
5,013,795; 5,262,484 und 5,408,002 (jeweils Coleman, et al.) beschrieben.
Diese Zusammensetzungen eignen sich zur Herstellung von Kunststofformteilen
mit Azlactonfunktion, wie z.B. Mikrotitrationsvertiefungen und -platten,
Petrischalen, Schläuchen,
Körperimplantaten,
Teströhrchen,
Zentrifugenröhrchen,
Bechergläsern,
Küvetten usw.,
die sich ebenso als Substrate für
die Herstellung von Trägern
für die
Selektion ganzer Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung eignen.
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Weitere
in der vorliegenden Erfindung geeignete Substrate mit Azlactonfunktion
sind in US-Patent Nr. 5,292,514 (Capecchi, et al.) offenbart.
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Biologisch
aktive Substanzen
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Für die vorliegende
Erfindung geeignete biologisch aktive Substanzen können mit
den ganzen Zielzellen entweder direkt oder indirekt, d.h. über den
Intermediärschritt
mit einer oder mehreren sekundären
biologisch aktiven Substanzen, wechselwirken.
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Zu
biologisch aktiven Substanzen, die zu einer direkten Wechselwirkung
mit ganzen Zielzellen in der Lage sind, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,
Antikörper
gegen Oberflächenantigene
ganzer Zellen, Lectine sowie weitere Proteine, von denen bekannt
ist, daß sie
mit den Oberflächen
ganzer Zellen wechselwirken. Eine große Vielfalt spezifischer Oberflächenantigene
ganzer Zellen wurde bereits identifiziert und werden allgemein als
CD-Antigene bezeichnet („Cell
Separation Methods and Applications", D. Recktenwald und A. Radbruch, Hrsg.,
Marcel Dekker, NY, NY, 1997, S. 297–319). Die Herstellung von Antikörpern gegen
diese Antigene liegt sicherlich im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmanns.
In der Tat sind viele dieser Antikörper zur Zeit aus kommerziellen
Quellen, wie z.B. R&D
Systems, Minneapolis, MN und Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis,
IN, erhältlich.
Durch die kovalente Kopplung dieser Antikörper an Träger mit Azlactonfunktion erhält man Träger, die
zur direkten Wechselwirkung und Selektion ganzer Zielzellen über Antikörper-Antigen-Bindungswechselwirkungen
fähig sind.
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Weitere
auf Träger
mit Azlactonfunktion immobilisierte biologisch aktive Substanzen
können
indirekt mit ganzen Zielzellen wechselwirken. So wird beispielsweise
im Rahmen der Erfindung eine intermediäre biologisch aktive Substanz
verwendet, die minimal „bifunktionell" ist, d.h. die eine
Funktionalität
aufweist, die eine spezifische Erkennung oder Wechselwirkung mit
der Zielpopulation ganzer Zellen zeigt, doch ebenso eine zweite
Funktionalität
aufweist, die mit der an den Träger
mit Azlactonfunktion gekoppelten biologisch aktiven Substanz wechselwirkt
und daran bindet. Eine solche intermediäre Substanz wäre beispielsweise
ein Antikörper
gegen ein Oberflächenantigen
ganzer Zellen, das mit einem Antigen, welches spezifisch mit einem
zweiten, auf dem Träger
immobilisierten Antikörper
wechselwirkt, konjugiert ist. Ein weiteres Beispiel, bei dem es sich
um eine bevorzugte intermediäre
Verbindung zur Verwendung in der folgenden Erfindung handelt, ist
ein mit Biotin konjugierter Anti-CD34+-Antikörper. Die Selektion ganzer
Zellen wird dabei über
eine Wechselwirkung des Antikörperteils
mit der ganzen Zielzelle und des Biotins mit auf den Träger immobilisiertem
Avidin erzielt.
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Verfahren
zur Derivatisierung von Trägern
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Verfahren
zur Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen auf Trägern mit
Azlactonfunktion sind im Fachgebiet allgemein bekannt und ausführlich in
den oben erwähnten
Patentliteraturangaben beschrieben. Verbesserte Immobilisierungsbedingungen
für Proteine
und Antikörper
werden insbesondere im US-Patent Nr. 5,200,471 (Coleman, et al.)
sowie in der PCT-Patentveröffentlichung
WO 94/22918 (Velander, et al.) gelehrt. Zusätzlich werden im US-Patent
Nr. 5,561,097 (Gleason, et al.) Techniken zur Kontrolle der Dichte
von an Trägern
mit Azlactonfunktion gekoppelten Liganden beschrieben.
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Die
Vielseitigkeit und Einfachheit der Immobilisierungsbedingungen erlauben
zusammen mit den für die
Herstellung von Trägern
mit Azlactonfunktion zur Verfügung
stehenden vielfältigen
Techniken die Herstellung und Optimierung von Trägern zur Selektion ganzer Zellen
in einem bislang nicht bekannten Ausmaß. So läßt sich beispielsweise, sobald
ein Gemisch ganzer Zellen identifiziert wurde, aus dem eine Zielpopulation ganzer
Zellen ausgewählt
werden soll (z.B. Knochenmark oder peripheres Blut), ein Grundpolymerträger identifizieren,
der eine minimale unspezifische Bindung ganzer Zellen aus dem genannten
Gemisch zeigt. Dadurch wird ein hoher Reinheitsgrad in der ausgewählten Population
ganzer Zellen gewährleistet.
Als nächstes
läßt sich
eine Azlactongruppierung mittels verschiedener Techniken, die in
den obigen Patentliteraturangaben offenbart sind, in den Grundpolymerträger einbauen,
um so die zur kovalenten Kopplung der biologisch aktiven Substanz
an den Träger
benötigte
aktive Chemie bereitzustellen. Schließlich kann eine geeignete biologisch aktive
Substanz an den Träger
immobilisiert werden, wodurch der Träger zur Selektion ganzer Zellen
bereitgestellt wird. Je nach der Identität der biologisch aktiven Substanz
sowie der spezifischen Eigenschaften der ganzen Zielzellen läßt sich
die Menge an Azlactonfunktionalität sowie die Menge an eingebauter
biologisch aktiver Substanz leicht vom Fachmann in Routineexperimenten
optimieren, um so die beste Selektion ganzer Zellen zu erhalten.
Darüberhinaus
können
aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Azlactonkopplungschemie
die Oberflächeneigenschaften
des fertigen Trägers
zur Selektion ganzer Zellen während
des Immobilisierungsvorgangs manipuliert werden, um so die Eigenschaften
des Trägers
hinsichtlich der Selektion ganzer Zellen weiter zu verbessern. In
vielen Fällen
lassen sich Träger
zur Selektion ganzer Zellen herstellen, durch die ausgewählte Populationen
ganzer Zellen mit verbesserter Reinheit und Trennungsausbeuten verglichen mit
denjenigen, die mit herkömmlichen
Trägern
unter Verwendung von Polyacrylamid- oder Polystyrolpolymeren oder
mit herkömmlichen
chemischen Bindungsreaktionen, wie z.B. die Kopplung mit Cyanogenbromid oder
auf Basis mit Carbodiimid, erhalten werden, bereitgestellt werden.
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Weitere
Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht, wobei jedoch die jeweiligen Materialien und deren
Mengen, die in diesen Beispielen angegeben werden, ebenso wie alle
weiteren Bedingungen und Einzelheiten nicht so verstanden werden
sollten, als daß sie
eine unangemessene Beschränkung
der vorliegenden Erfindung darstellen.
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Beispiele
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Testverfahren
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Selektion/Reinigung
ganzer Zellen: die Auswertung der Wechselwirkung ganzer Zellen mit
partikulären
Trägern
wurde in den folgenden Beispielen mit dem CeprateTM LC
Avidin Column Kit (CellPro, Inc., Bothell, WA) gemäß den Angaben
des Herstellers vorgenommen. Die Selektion auf ganze CD34+-Zellen
wurde mit einem Anti-Mensch-CD34-biotinylierten
monoklonalen Antikörper
(Maus)(CellPro, Inc) erreicht.
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Avidin-Kopplungsdichten:
Die Dichte des an Azlactonträger
gekoppelten Avidins wurde unter Verwendung eines Biotin-p-Nitrophenylesterreagenz
sowie der von Hermanson, et al., American Biotechnology Laboratory,
September 1994, S. 86–88
beschriebenen Vorschrift beurteilt.
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Beispiel 1. Beurteilung
der unspezifischen Bindung mit Ficoll-behandelter Leukozytenmanschette
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Die
vernetzten Träger
wurden gemäß den Lehren
der
US 5,403,902 mittels
Umkehrphasen-Suspensionspolymerisation unter Verwendung des Polymerstabilisators
aus Beispiel 24E dieser Literaturstelle hergestellt. Dabei wurde
als Vernetzer Methylenbisacrylamid (MBA) und als Comonomere Dimethylacrylamid (DMAm),
Acrylamid (Am), Vinyldimathylazlacton (VDM) oder N-Acryloyl-2-methylalanin (Natriumsalz)
(AMA) verwendet. Diese Partikulärträger wurden
zur Abtrennung kleiner Partikel elutriiert und danach für die Analyse in
die Ceprate LC-Säule
gepackt. Jede Säule
wurde einem Challenge mit einem Minimum von 50 × 10
6 ganzen Zellen
aus Ficollbehandelter Leukozytenmanschette, die aus frischen Vollblut
gewonnen wurde, unterzogen; dabei wurden die Fraktionen des Durchlaufs
gesammelt. Die ganzen Zellen, sowohl Lymphozyten als auch Monozyten,
wurden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (Flourescence-Activated Cell Sorting,
FACS) gezählt
und mit denen der Ausgangsprobe verglichen. In Tabelle 1 sind die
beurteilten Träger,
die gewonnenen Zellmengen sowie die unspezifischen Bindungseigenschaften
des mit dem kommerziellen Kit gelieferten avidinierten Polyacrylamidträgers aufgeführt.
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Diskussion:
Dieses Beispiel deutet an, daß mehrere
Monomerkombinationen niedrige unspezifische Bindungseigenschaften
gegenüber
Lymphozyten zeigen, was eine wichtige Eigenschaft für einen
zur Selektion/Reinigung ganzer Stammzellen vorgesehenen Träger darstellen
würde.
Die schlechtere Gewinnung bei den Monozyten ist kein Grund zur Besorgnis
und kann sogar einen Vorteil gegenüber dem kommerziellen Träger darstellen,
da Monozytenpopulationen T-Zellen enthalten, durch die eine antikörpervermittelte
Immunität bereitgestellt
wird, die man gerne bei der Herstellung zellvermittelter Immunzellen,
wie z.B. pluripotenter Stammzellen, minimieren würde. Eine weitere Anmerkung
zu den Proben 1e/1f und 1g/1h ist notwendig. VDM (hydrolysiert)
und AMA weisen die gleiche chemische Formel auf, wurden jedoch mit
unterschiedlichen Verfahren in die erhaltenen Polymerpaare eingebaut.
Bei 1e wurde beispielsweise das Polymer mit dem Verfahren II des
oben zitierten US-Patents 5,403,902 hergestellt, wobei das VDM-Monomer
copolymerisiert und danach der erhaltene Träger unter Erhalt der Testprobe
hydrolysiert wurde. Dagegen wurde die Probe 1f durch Copolymerisation
von AMA, dem Synthesevorläufermolekül von VDM,
hergestellt. Somit kann das Herstellungsverfahren für ein Polymer
dessen Wechselwirkung mit biologischen Spezies beeinflussen, selbst
wenn dieses vermutlich dieselbe chemische Formulierung aufweist.
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Beispiel 2. Beurteilung
der unspezifischen Bindung aus mobilisiertem peripherem Blut.
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Die
leistungsstärksten
Träger
aus Beispiel 1 wurden ebenso wie der Träger 1f wie in Beispiel 1 beurteilt,
außer
daß es
sich bei dem Challenge um mobilisiertes peripheres Blut handelte,
zu dem der Anti-CD34+-Antikörper vor
Auftragen auf die Säule
gegeben worden war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
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Dieses
Beispiel veranschaulicht ebenfalls, daß Polymerrückgrate gefunden werden können, die
im Vergleich mit dem Stand der Technik eine gleichwertige oder niedrigere
unspezifische Bindung zeigen.
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Beispiel 3. Azlacton/Dimethylacrylamid-Träger
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Partikuläre Träger wurden
aus MBA, VDM und DMAm mittels Umkehrphasen-Suspensionspolymerisationen
nach Verfahren II des US-Patents 5,403,902 hergestellt. Das Gesamtgewicht
der Monomere in diesen Experimenten betrug 20 g. Die MBA- und DMAm-Monomere
wurden in einem Gemisch aus Methanol (30 ml) und Wasser (70 ml)
gelöst.
Nach dem Lösen
wurde Natriumpersulfat (0,5 g) zugegeben und lösen gelassen. Diese Lösung wurde
dann zu einer auf 35°C
vorequilibrierten Lösung
aus VDM, Toluol (132 ml), Heptan (243 ml) und Stabilisator (0,33
g) unter Rühren
und Stickstoff gegeben. Die Stickstoffspülung wurde noch 5 Minuten fortgesetzt,
und danach wurde mit Tetramethylethylendiamin (TMEDA, 0,5 ml) versetzt,
um die Polymerisation zu starten. Es wurde noch 2 Stunden polymerisiert
und das Produkt danach durch Filtration gesammelt, mit Azeton gewaschen,
zur Abtrennung von Partikeln mit einem Durchmesser von weniger als
100 Mikron mit Methanol als Flüssigphase
elutriiert und unter Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Avidin Kopplung: Avidin wurde an die Träger unter Verwendung einer
Lösung
von Avidin (1 mg/ml) in 0,1 M Natriumcarbonat/1,4 M Natriumsulfat-Puffer,
pH 9,5, gekoppelt. Nach der Kopplung wurde die überschüssige Azlactonfunktionalität mit 0,2
M Glycin, pH 9,0, gequencht. Jeder Träger wurde in Doppelbestimmung
hinsichtlich der Selektion ganzer CD34+-Zellen beurteilt. Jede Ceprate
LC-Säule
aus Träger
(2,0 ml) erhielt insgesamt 2,0 × 108 ganze Zellen aus einer frischen Knochenmarkprobe.
In Tabelle 3 sind die Trägerzusammensetzung,
die Anzahl sowie die Ausbeute in % der ausgewählten ganzen Zielzellen (Durchschnittswerte
der Doppelbestimmungen) aufgeführt.
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Beispiel 4. Azlacton/Acrylamid-Träger
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Die
Träger
wurden wie in Beispiel 3 hergestellt, wobei Dimethylacrylamid durch
Acrylamid ersetzt wurde, und wie in Beispiel 3 beurteilt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Die angegebenen % Ausbeuten beziehen sich auf die der Kontrolle
für ganze
CD34+-Zellen.
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Diskussion:
Die Beispiele 3 und 4 zeigen, daß sich mit Trägern auf
Azlactonbasis eine ausgezeichnete Selektion ganzer Zellen erzielen
läßt.
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Beispiel 5. Untersuchung
der Avidindichte
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Es
wurde ein ähnlicher
Träger
wie in Beispiel 3b aus MBA/VDM/DMAm (20:20:60) hergestellt. Trägerproben
wurden einem Challenge mit verschiedenen Avidinkonzentrationen unterzogen,
sodaß eine
Reihe von Avidinkopplungsdichten bereitgestellt werden konnte. Die
Träger
wurden wie in Beispiel 3 beurteilt; die Ergebnisse sind in Tabelle
5 gezeigt, wobei sich die angegebenen % Ausbeute auf die kommerzielle
Kontrolle beziehen.
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Diese
Daten deuten zusammen mit denen aus Beispiel 4 an, daß die Leistung
der aus Partikeln mit Azlactonfunktion hergestellten Träger mit
denen herkömmlicher
Träger
vergleichbar ist, jedoch bei wesentlich niedrigeren Avidindichteniveaus
erfolgen kann.
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Beispiel 6.
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Ein
Träger
wurde aus MBA/VDM/DMAm (20:20:60) dem Zwei-Schritte-Prozeß des Verfahrens I aus dem
US-Patent 5,403,902 hergestellt. Nach dem Trocknen wurde dieser
Träger
mit einem Sonic Sifter (ATM Corporation, Milwaukee, WI) klassiert,
so daß zwei
Größenfraktionen,
8a (106–150
Mikron) und 8b (75–106 Mikron)
erhalten wurden. Nach der Hydratisierung wies die Probe 8a einen
mittleren Durchmesser von 204 Mikron auf, während 8b 155 Mikron maß. Avidin
wurde unter Verwendung von 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,5, und unter
verschiedenen Bedingungen gekoppelt, und die Träger wurden anschließend unter
Verwendung von Proben aus Mark und mobilisiertem peripherem Blut
hinsichtlich CD34+-Selektion
beurteilt. Kopplungsbedingungen: (a) 1 mg/ml Avidin, 1,4 M Sulfat;
(b) 1 mg/ml Avidin, kein Sulfat; (c) 4mg/ml Avidin, 1,4 M Sulfat;
(d) 3 mg/ml Avidin, kein Sulfat. Die Ergebnisse sind in Tabelle
6 aufgeführt,
wobei die %-Werte für
Reinheit und Ausbeute auf die Werte des Kontrollträgers normiert
wurden.
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Dieses
Beispiel führte
zu einer Reihe von überraschenden
Ergebnissen: (1) Es stellte sich heraus, daß die Dichte des gekoppelten
Avidins wesentlich höher
bei der Abwesenheit als beim Vorhandensein von Sulfat war, ein Ergebnis,
das auch mit den oben nach Verfahren II hergestellten Trägern bestätigt wurde.
Dies steht in scharfem Kontrast zum Stand der Technik, wo sich eine
erhöhte
Effizienz von Proteinkopplungen an Träger mit Azlactonfunktion in
Gegenwart von Sulfat zeigte (US-Patent
Nr. 5,200,471 (Coleman et al.)). (2) Träger nach Verfahren I zeigten
trotz der gleichen chemischen Zusammensetzung eine verbesserte Leistung
hinsichtlich % Ausbeute, verglichen mit den Kügelchen nach Verfahren II (siehe
Beispiel 4c). (3) Kügelchen
nach Verfahren I zeigten im Vergleich mit dem Kontrollträger ebenso
außerordentlich
gute Reinheiten. (4) Die optimale Leistung für Träger mit Azlactonfunktion findet
bei einer wesentlich kleineren Partikelgröße als beim Kontrollträger, einem
250 Mikro großen
Kügelchen,
statt.
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Beispiel 7
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Die
in Beispiel 6 beschriebene Trägersynthese
wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Polymerisation mit Natriumpersulfat
als einzigem Initiator ausgeführt
wurde und die Reaktionstemperatur 55°C betrug. Die klassierte Probe
zeigte eine hydratisierte mittlere Größe von 214 Mikron. Avidin wurde
mit einer Dichte von 307 μg/ml
gekoppelt und wie zuvor analysiert, wobei sich vergleichbare Ausbeuten
und verbesserte Reinheiten im Vergleich mit dem Kontrollträger ergaben.
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Beispiel 8
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Ein
Träger
wurde wie in Beispiel 7 hergestellt und bei einer Dichte von 70μg/ml an NeutraAvidinTM (Pierce Chemical, Rockford, IL) gekoppelt.
Bei der Beurteilung auf CD34+-Selektion aus Mark zeigte dieser Träger eine
Reinheit von 108% und eine Ausbeute von 129% bei Vergleich mit dem
Kontrollträger.
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Beispiel 9
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Aus
(a) dem nach Beispiel 28 des US-Patents 5,408,002 hergestellten
Polymethylmethacrylat/poly VDM-Gemisch und (b) dem nach Beispiel
44 des US-Patents 5,262,484 hergestellten VDM-Pfropfpolypropylen werden
Mikrotitrationsplatten geformt, die auf den Innenflächen der
Vertiefungen Azlactongruppen aufweisen. Unter Verwendung der Vorschrift
für das „Panning" [„Abfahren"] ganzer Zellen bei
Esser, in „Cell
Separation Methods and Applications", D. Recktenwald und A. Radbruch, Hrsg.,
Marcel Dekker, NY, NY, 1997, S. 8, wird eine ausgezeichnete Selektion
ganzer Zellen im Vergleich mit derjenigen bei Verwendung von Kontrollplatten ohne
Azlactonfunktion erzielt.
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Beispiel 10
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Ein
Vliesbelag mit Azlactonfunktion wurde gemäß Beispiel 20 des US-Patents
5,344,701 hergestellt. Die Derivatisierung mit einem Anti-CD4-Antikörper, wie
in Pope, et al., Bioconjugate Chem., 1993, 4, S. 166–171 beschrieben,
gestattet eine einfache Abreicherung mononucleärer ganzer CD4+-Zellen aus
einer peripheren Blutprobe in einem einfachen Durchflußfiltrationsmodus.
Die Porosität
des Vlieses gestattet den nichtgebundenen ganzen Zellen, leicht
durch die Apparatur zu fließen, während der
immobilisierte Antikörper
die ganzen CD4+-Zellen
einfängt.
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Alternativ
lassen sich Membrane mit Azlactonfunktion gemäß US-Patent Nr. 5,510,421 herstellen,
mit einem geeigneten Antikörper
derivatisieren und für
die Selektion ganzer Zellen in einem Querstromfiltrationsmodus verwenden.
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Beispiel 11. Verwendung
von Kügelchen
mit Azlactonfunktion zur Typisierung menschlicher Blutzellen
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Kommerziell
erhältliches
für die
Blutgruppen A und B selektives Antiserum wird mit Protein-A-derivatisierten
Azlactonkügelchen
(hergestellt nach Beispiel 4 des US-Patents 5,200,471) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phosphat-Buffered
Saline, PBS) in einem Verhältnis
von etwa 5 mg Serum-IgG auf 1 ml gepackte Kügelchen inkubiert, indem bei
Umgebungstemperatur etwa 15 Minuten geschüttelt wird. Nichtgebundenes
Protein wird durch mehrere Spülschritte
mit PBS und Zentrifugation abgetrennt. Eine Probe von menschlichem
Blut wird zehnfach mit PBS verdünnt.
Proben des verdünnten
Bluts von jeweils 200 μl
werden mit jeweils etwa 50 μl
der obigen Antiserum-Protein-A-Azlactonkügelchen-Präparation
bei Umgebungstemperatur unter vorsichtigem Mischen etwa 15 Min.
inkubiert. Man läßt die Kügelchen
zum Absetzen mehrere Minuten stehen und vergleicht danach die Trübung der überstehenden
Flüssigkeit
mit derjenigen von Kontrollen, bei denen die Protein-A-Kügelchen
mit Präimmunserum
inkubiert wurden. Die Kontrollproben sind trübe, da sich keine Blutzellen
mit den Kügelchen
auf dem Boden des Röhrchens
absetzen. Die Zellen der gleichen Blutgruppe, wie das Antiserum
enthaltenden Röhrchen
sind klar bzw. ihre Trübung
ist im Vergleich mit den Kontrollen stark reduziert.
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Beispiel 12. Typisierung
von menschlichem Blut durch direkte Immobilisierung eines spezifischen
Antikörpers
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Antikörper gegen
menschliche Blutgruppenantigene oder beliebige andere Zelloberflächenmarker können direkt
auf Trägern
mit Azlactonfunktion immobilisiert und zur Bluttypisierung (wie
in Beispiel 11 beschrieben) oder zur Reinigung einer bestimmten
Fraktion ganzer Zellen verwendet werden. Zur Entfernung der spezifisch
gebundenen ganzen Zellen, das spezifische Antigen mit der Kügelchen-Antikörper-ganze
Zelle-Suspension inkubieren, nachdem die nichtgebundenen ganzen
Zellen durch mehrmaliges Spülen
mit isotonischem Puffer weggewaschen worden sind. Zur Freisetzung
ausgewählter
ganzer Zellen der Blutgruppe A, z.B., die Suspension auf ungefähr 0,1 ml
Kügelchen
pro ml Suspension mit einer Konzentration des benötigten Antigens
von 1 mg/ml oder höher
verdünnen.
So können
beispielsweise Blutgruppe-A-positive ganze Zellen unter Verwendung
eines kurzen, in Alpha-N-Ac-Galactosamin endenden Polysaccharids
eluiert werden. Andere Antigene müßten spezifisch gegenüber den
auf der Oberfläche
der eingefangenen ganzen Zellen exprimierten Markern sein.
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Beispiel 13. Direkte Immobilisierung
ganzer Zellen zur Selektion spezifischer, an diese bindende Zellen.
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Aktivierte,
den Zelloberflächenmarker
CD-28 präsentierende
T-Zellymphozyten lassen sich aus einer Population von Lymphozyten
(z.B. einer Leukozytenmanschettenfraktion aus einer Vollblutprobe) über ihre
Fähigkeit,
an Antigen präsentierende
Zellen oder Makrophagen zu binden, reinigen. Gereinigte antigenpräsentierende
Zellen können
direkt auf Trägern
mit Azlactonfunktion immobilisiert werden, indem etwa 1 Millionen ganze
Zellen mit 1–2
ml Kügelchen
in einem isotonischen Puffer, der weitgehend frei von primärem Amin
ist, (unter vorsichtigem Schütteln
etwa 15 Minuten) inkubiert. Nichtgekoppelte ganze Zellen werden durch
Absetzen der Suspension, Entfernen der überstehenden Lösung und
mehrerer Spülschritte
abgetrennt. 1 ml der Präparation
von immobilisierten antigenpräsentierenden
Zellen wird mit etwa 10 ml einer Leukozytenmanschettenpräparation,
die mit PBS auf etwa 0,5 Millionen ganze Zellen/ml verdünnt wurde,
30 Min. unter vorsichtigem Hin- und Herbewegen inkubiert. Man läßt den Träger absetzen,
entfernt die überstehende
Lösung
und führt danach
zwei Waschschritte mit jeweils fünf
Volumen PBS durch. Gereinigte ganze T-Zellen können abgetrennt werden, indem
die Kügelchenaufschlämmung beim
Durchleiten von PBS durch die Aufschlämmung (z.B. unter Verwendung
der Ceprate-Vorrichtung)
vorsichtig gerührt
wird.
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Die
Erfindung wird durch die oben beschriebenen Ausführungsformen nicht beschränkt.
