DE3209098C2

DE3209098C2 -

Info

Publication number: DE3209098C2
Application number: DE3209098A
Authority: DE
Inventors: Allan P. Newburyport Mass. Us Jarvis; Franklin Richmond Va. Us Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1987-08-13
Also published as: SE452335B; IT8220138A0; SE8201555L; FR2501715A1; BE892478A; JPS57202289A; NO161446C; DE3209098A1; IT1150680B; JPS6038111B2; CA1172586A; NO161446B; FR2501715B1; NO820796L; GB2094832B; DK112482A; CH662363A5; GB2094832A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kulti vierung verankerungsabhängiger Zellen, d. h. vonZel len, die normalerweise in Form von einer oder mehre ren Schichten auf einem Substrat kultiviert werden müssen und in Suspension nicht wachsen.

Aufgrund der Fortschritte in der Zellbiologie wurde nachgewiesen, daß verankerungsabhängige Zel len verschiedener höherer Organismen zur Erzeugung kleiner Mengen von Substanzen in der Lage sind, de ren signifikante Brauchbarkeit zur Behandlung von Er krankungen zu unterstellen bzw. nachgewiesen ist, bei spielsweise Interferone. Derartige Zellen eignen sich ferner auch für Forschungszwecke.

Bei derartigen Zellkulturen besteht die grund sätzliche Gefahr einer bakteriellen oder anderweiti gen Kontamination. In den meisten Fällen sind ferner die Mengen der von den Zellkulturen erzeugten ange strebten Substanzen nur sehr klein. Da zudem ver ankerungsabhängige Zellen im Gegensatz zu Suspensions kulturen nicht unter Auffüllung eines Volumens kulti viert werden können, gibt es gegenwärtig kein prak tisch geeignetes Verfahren zur Kultivierung einer großen Anzahl von Zellen, wie sie zur Herstellung nennenswerter Mengen von durch die Zellen erzeugten angestrebten Substanzen erforderlich sind.

Gegenwärtig müssen verankerungsabhängige Zellen, wie etwa normale Fibroblasten und bestimmte Viren und Epithelzellen, auf einem Substrat kultiviert wer den. Kunststoffolien und -platten sind als substrate für derartige Zwecke im Handel erhältlich. Einige Arten von verankerungsabhängigen Zellen vermehren sich, bis die Platte mit einer Monoschicht von Zel len bedeckt ist, und stellen dann die Vermehrung ein. Andere Zellen vermehren sich wiederum weiter unter Bildung von einer oder mehreren zusätzlichen Schichten auf der ersten Zellschicht.

Erfindungsgemäß (vgl. auch den Anspruch 1) wird eine Impfkultur von ver ankerungsabhängigen Zellen in einer Vielzahl von Mikrokapseln mit semipermeablen Membranen einge kapselt. Die Herstellung der Membranen wird dabei so kontrolliert, daß sie eine gewählte Obergrenze der Permeabilität besitzen, d. h. Mikroporen mit Di mensionen vorgeben, die ausreichend sind, um den Durchtritt von Molekülen mit einer Molmasse bis zu beispielsweise 2 × 10⁵ zuzulassen, jedoch den Durchtritt von Materialien mit höherer Molmasse ausschließen. Die Kapselmembranen geben so eine Mikroumgebung vor, innerhalb derer die Zellen zusammen mit hoch molekularen Serumbestandteilen eingeschlossen sind, die Zellen jedoch für niedermolekulare Nährstoffe, wie Aminosäuren, frei zugänglich sind, und Zellstoff wechselprodukte mit niederer Molmasse aus den Kapseln heraus in das umgebende Medium gelangen können.

Die Zellen enthaltenden Mikrokapseln werden an schließend in einem üblichen Kulturmedium disper giert. Die Innenoberflächen der Kapselmembranen und/oder bestimmte in Wasser dispergierbare Ma terialien mit hoher Molmasse, die in den Mikrokapseln eingeschlossen sind, wirken als Substra te, an die sich die Zellen anheften. Da das Ver hältnis der Kapseloberfläche zum Volumen des extrakapsulären Mediums sehr groß sein kann, sind die einzelnen Zellen für die erforderlichen Nähr stoffe günstig zugänglich, wobei die Fläche, auf der die Zellen wachsen können, im Vergleich zu herkömmlichen Monolayer-Kulturen vergrößert ist. Der mittlere Durchmesser der Mikrokapseln kann all gemein zwischen einigen µm und 1 mm oder darüber liegen. Die bevorzugte mittlere Größe liegt grö ßenordnungsmäßig bei einem Durchmesser von 100 bis 500 µm.

Wenn ein Verankerungssubstrat, wie etwa Colla gen oder dgl., in den Kapseln eingeschlossen ist, wach sen Fibroblasten auch innerhalb der Kapselmembra nen und zeigen normale Fibroblastenmorphologie.

Der Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Kultivierung verankerungsabhängiger Zellen anzugeben,bei dem die Ausbeute an veranke rungsabhängigen Zellen oder kontaktinhibiertenZel len, die in vitro kultiviert wurden, erhöht ist; über das Volumen des zur Kultivierung verwendeten Mediums soll dabei eine große Oberfläche zur Ver fügung stehen, die sich als Substrat für veranke rungsabhängige Zellen eignet. Das Verfahren soll ferner die Produktion von Interferon zulassen.

Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kulti vierung verankerungsabhängiger Zellen in Suspension erlaubt die Kultivierung größerer Zellzahlen pro Volumeneinheit des Kulturmediums im Vergleich mit Mono layer-Kulturen.

Die Mikrophotographie am Ende der Beschreibung zeigt bei 200facher Ver größerung verankerungsabhängige Zellen, die innerhalb einer Mikrokapsel nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren kultiviert wurden und herkömmliche Fibroblastenmorphologie aufweisen.

Das zugrundeliegende breite Erfindungskonzept beruht darauf, um die einzelnen Zellen oder Grup pen von Zellen eine Vielzahl von semipermeablen Membranen vorzusehen, die als Substrat mit hoher Oberfläche wirken, an dem sich die Zellen verankern können, und/oder die ein Material mit hoher Molmasse innerhalb der Mikrokapseln einschlie ßen, das seinerseits als Verankerungssubstrat wirkt. Zellen, die in Suspension wachsen, können ebenfalls nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt und kultiviert werden. Die Mikrokapseln dienen als Mikroumgebung für die Zellen zusammen mit zumindest den hochmolekularen Komponenten des Kulturmediums und trennen die Zellen vom extrakapsulären wäßrigen Medium, wobei Bakterien und andere relativ große Verunreinigungen die Membranen nicht durchdringen können.

Verankerungsabhängige Zellen von Säugetieren und Menschen, wie etwa Fibroblasten, Epithelzellen und Nierenzellen, erfordern zur Erhaltung ihrer Le bensfähigkeit die Anwesenheit von Serumbestandtei len, von denen ein Teil eine oberhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen liegende Molmasse besitzen kann. Derartige Komponenten können zusammen mit den eingekapselten Zellen eingeschlos sen sein und müssen sich nicht im extrakapsulären Medium befinden.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, jedoch nicht zwingend erforderlich, innerhalb der Mikrokapseln ein Material mit hoher Molmasse einzuschlie ßen, das als Verankerungssubstrat dient. Zu diesem Zweck wurde Collagen, d. h. ein natürliches Protein, das einen Hauptbestandteil der Bindegewebe dar stellt, erfolgreich verwendet. Andere verträgliche, in Wasser dispergierbare Proteine mit hoher Molmasse können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise Polylysin. Wenn die Proteine freie Aminogruppen besitzen, können sie durch Umsetzung mit einem wasserlöslichen Gummi während der Membran erzeugung wasserunlöslich gemacht werden, wie im folgenden erläutert ist. Es wird angenommen, daß derartige Materialien zur Entstehung einer Matrix innerhalb des intrakapsulären Volumens führen. Durch Einschließen solcher Materialien kann die Zelldichte innerhalb der Kapseln erhöht werden, da die Zellen innerhalb des intrakapsulären Volu mens anstelle des Wachstums an der Innenfläche der Kapselmembran oder zusätzlich dazu wachsen.

Die eingekapselte Impfkultur wird dann in einem geeigneten Kulturmedium der Art suspendirt, wie es zur Kultivierung bei herkömmlichen Kultur verfahren verwendet wird. Serumproteine, die von den Zellen nicht aufgenommen werden, können aus dem extrakapsulären Medium weggelassen werden. Der pH- Wert, die Temperatur, die Ionenkonzentration und dgl., sollten allerdings gleich sein wie bei herkömmli chen Medien. Ferner kann der Sauerstoff- und CO₂- Transport in gleicher Weise wie bei herkömmlichen Kulturen gefördert werden, da diese gelösten Gase frei durch die Membranen hindurchtreten können.

Die Inkubation der eingekapselten Zellkultur führt zur Zellteilung. Auf diese Weise kultivier te Fibroblastenzellen zeigen klassische Fibrobla stenmorphologie und bilden Anordnungen von Zellen an der Innenseite der Membran oder auf dem in den Kapseln enthaltenen Verankerungssubstrat. Frisches Kulturmedium kann erforderlichenfalls kontinuier lich oder absatzweise durch Austausch des extra kapsulären Mediums geliefert werden. Wenn bei der Kultivierung angestrebte Zellstoffwechselpro dukte erzeugt werden sollen, kann der entsprechende Metabolit je nach seiner Molmasse und der vorliegenden Obergrenze der Permeabilität der Membranen aus dem intrakapsulären Volumen oder dem extrakapsu lären Medium gewonnen werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des er findungsgemäßen Verfahrens werden solche Membranen hergestellt, die sich ohne Zellschädigung selektiv aufbrechen lassen. Hierdurch können die Zellen er forderlichenfalls aus den Kapseln freigesetzt wer den.

Ein Grund für die Freisetzung der Zellen nach der Kultivierungsphase besteht darin, die Produktion interessierender Substanzen durch die Zellen zu stimulieren. Ein Beispiel hierfür ist die Produktion von Interferon aus menschlichen Fibroblasten, Leuko cyten oder Lymphoblastoidzellen, bei denen die Aus scheidung von Interferon durch Behandlung mit be stimmten Viren oder hochmolekularen Nucleinsäuren induziert wird. Wenn in solchen Fällen die Ober grenze der Permeabilität der Membranen kleiner ist als die Molmasse des induzierenden Faktors, muß die Induzierung der Interferonproduktion vor der Einkapselung vorgenommen werden, oder die Kapselmembranen müssen nach der Kultivierung der Zellen selektiv aufgebrochen werden, um einen Kontakt dieser hochmolekularen Materialien mit den Zellen zu ermöglichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hängt davon ab, daß sich um die Zellen semipermeable Membranen er zeugen lassen, ohne daß ihre Lebensfähigkeit zu gleich negativ beeinflußt wird. Ein geeignetes Einkapselungsverfahren ist im folgenden näher erläutert.

Einkapselung der Zellen

Das einzukapselnde Gewebe oder die einzukapseln den Zellen werden in einem wäßrigen Medium suspen diert, das sich vorzugsweise zur Kultivierung des betreffenden Zelltyps eignet. Hierfür geeignete Medien sind im Handel erhältlich. Der mittlere Durchmesser des einzukapselnden Materials kann in einem weiten Bereich zwischen einigen µm bis zu einigen mm variieren. Die bestenErgebnisse werden allerdings mit Kapseln erzielt, deren Größe im Bereich von 300 bis 1000 µm liegt. Einzelne ver ankerungsabhängige Zellen wie etwa Fibroblasten aus menschlichen oder tierischen Geweben, Nierenzellen sowie Epithelzellen, können nach Wunsch eingekapselt werden. Ferner ist die Einkapselung von Leukocyten, Lymphoblastoidzellen, Pancreas-β -Zellen, -α-Zellen, -w-Zellen, verschiedenen Teilen davon oder von anderen Gewebeeinheiten möglich.

Die Erhaltung der Lebensfähigkeit solcher leben der Materialien hängt u. a. von der Verfügbarkeit der erforderlichen Nährstoffe, dem Sauerstofftransport, der Abwesenheit toxischer Substanzen im Medium so wie dem pH-Wert des Mediums ab. Es was entsprechend bisher nicht möglich, solche lebende Materialien unter gleichzeitiger Einkapselung in einer physio logisch verträglichen Umgebung zu halten. Das Pro blem bestand darin, daß die bisher zur Membraner zeugung erforderlichen Bedingungen für Gewebe töd lich oder schädlich waren, und bisher vor der DE-OS 30 12 233 kein Verfahren zur Membranerzeugung verfügbar war, bei dem Gewebe gesund überleben konnten.

Der Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß bestimmte wasserlösliche Substanzen, die mit le benden Geweben physiologisch verträglich sind und unter Bildung einer formbeständigen, zusammenhängen den Masse wasserunlöslich gemacht werden können, zur Erzeugung ′temporärer Kapseln′ bzw. von Schutz schichten um einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen herum herangezogen werden können, und daß auf diese temporären Kapseln durch entsprechende Behandlung eine dauerhaftere semipermeable Membran um die Zellen herum ohne Schädigung der Zellen aufgebracht werden kann. Derartige Substanzen werden dem Gewebe kulturmedium typischerweise in einer Konzentration von größenordnungsmäßig unter 1,0 Masse-% zugesetzt, das ferner die Zellen der Impfkultur, erforderlichen falls Serumkomponenten und wahlweise auch Zellsubstra te, wie Collagen oder andere hochmolekulare, in Wasser dispergierbare Materialien, enthält, die als Veranke rungssubstrat dienen. Die Konzentration des als Substrat angewandten Materials sollte im Bereich von etwa 10 µg/ml bis etwa 1 mg/ml und vorzugsweise im Bereich von größen ordnungsmäßig 100 bis 500 µg/ml liegen.

Die Lösung wird dann in Tröpfchen umgewandelt, die das Gewebe zusammen mit dem Medium enthalten und dann unmittelbar wasserunlöslich gemacht und in Gel form übergeführt werden, zumindest in einer Oberflä chenschicht. Danach werden die formbeständigen tempo rären Kapseln mit einer dauerhafteren Membran ver sehen, die erfindungsgemäß anschließend erforderli chenfalls unter Freisetzung des Gewebes ohne Schädi gung selektiv aufgebrochen werden kann. Nach der Er zeugung der permanenten Membran kann der Kapselin halt, wenn das zur Erzeugung der temporären Kapseln verwendete Material dies zuläßt, wieder verflüssigt werden. Dies geschieht durch Wiederherstellung der Bedingungen im Medium, unter denen das Material lös lich ist.

Das zur Erzeugung der temporären Kapseln verwen dete Material kann ein beliebiges nicht toxisches, wasserlösliches Material sein, das durch Änderung der ionischen Umgebung bzw. der Ionenkonzentration in eine formbeständige Masse umgewandelt werden kann. Das Material sollte ferner zahlreiche leicht ionisierbare anionische Gruppen, beispielsweise Carboxylgruppen, aufweisen, die durch Ausbildung von Salzbindungen mit Polymeren reagieren können, die eine Vielzahl von kationischen Gruppen aufweisen. Wie im folgenden näher erläutert ist, erlauben der artige Materialien die Abscheidung einer permanenten Membran mit einer wählbaren Obergrenze der Permeabi lität (allgemein nicht über 100 000 bis 150 000, bezogen auf die Molmasse) ohne Schwierigkeiten auf den Oberflächenschichten der temporären Kapseln.

Zu den bevorzugten Materialien zur Erzeugung der temporären Kapseln gehören saure, wasserlösli che natürliche oder synthetische Polysaccharidgummi. Derartige Materialien sind handelsüblich. Sie werden typischerweise aus Pflanzenmaterialien extrahiert und in vielen Fällen als Lebensmittelzusätze ver wendet. Als bevorzugter wasserlöslicher Gummi wird Natriumginat verwendet. Alginate im Molmassen bereich 150 000 sind verwendbar; aufgrund ihrer molekularen Abmessungen und ihrer Viskosität können sie jedoch üblicherweise die abschließend er zeugten Kapselmembranen nicht durchdringen. Daher sind Alginate mit niedrigerer Molmasse, beispielsweise mit Molmassen von 50 000 bis 80 000, leichter durch Diffusion durch eine Membran geeigneter Porosität aus dem intrakapsulä ren Volumen zu entfernen und daher bevorzugt. An dere verwendbare Gummi sind etwa saure Fraktionen von Guargummi, Carageenan, Pectin, Traganthgummi und Xanthangummi.

Diese Materialien enthalten glycosidisch vernetzte Saccharidketten. Ihre freien Säuregruppen liegen oft in Form von Alkalimetallsalzen, beispielsweise in der Natriumform, vor. Wenn ein mehrwertiges Ion, wie von Calcium oder Aluminium, gegen die Alkalimetall ionen ausgetauscht wird, werden die wasserlös lichen Polysaccharidmoleküle unter Bildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels ′vernetzt′, das durch Abtrennung der Ionen durch Ionenaustausch oder mit einem Trennmittel bzw. Maskierungsmittel wieder löslich gemacht werden kann. Obgleich im we sentlichen beliebige mehrwertige Ionen, die zur Salz bildung mit dem sauren Gummi in der Lage sind, ver wendet werden können, werden vorzugsweise physiolo gisch verträgliche Ionen, beispielsweise Calcium, angewandt, wodurch sich Gewebe in lebendem Zustand halten lassen. Auch andere mehrwertige Kationen sind jedoch verwendbar. Magnesiumionen sind anderer seits zur Gelbildung mit Natriumalginat unwirksam.

Eine typische Lösung ist so zusammengesetzt, daß sie gleiche Volumina einer Zellkultur im ent sprechenden Medium (mit oder ohne Verankerungs substrat) sowie einer 1- bis 2%igen Lösung des Gummis in physiologischer Salzlösung enthält. Bei Verwendung von Natriumalginat hat sich eine 1,0- bis 1,5%ige Lösung als günstig erwiesen.

Collagen oder ein anderes natürliches oder synthetisches, in Wasser dispergierbares Protein oder Polypeptid können dabei in der Zellkultur vorliegen und werden dann im intrakapsulären Volumen der am Ende gebildeten Kapseln eingeschlossen. Wenn ein Polymer mit zahlreichen kationischen Gruppen, beispielsweise Polylysin, hierfür verwendet wird, reagieren die kationischen Gruppen mit den anioni schen Stellen am wasserlöslichen Gummi unter Bil dung einer im wesentlichen wasserunlöslichen Matrix, die mit dem Gummi verknüpft ist. Die bevorzugten Konzentrationen für solche Materialien liegen im Bereich von größenordnungsmäßig 100 bis 500 µg/ml der Suspension einschließlich der Gummilösung.

Im nächsten Verfahrensschritt der Einkapselung wird die Gummilösung, die das Gewebe enthält, in Tröpfchen einer erwünschten Größe umgewandelt, worauf die Tröpfchen unmittelbar unter Erzeugung formbeständiger kugelförmiger oder sphäroidaler Massen geliert werden. Die Tröpfchenbildung kann wie folgt durchgeführt werden:

Ein Rohr, das eine wäßrige Lösung mit mehrwertigen Kationen, beispielsweise eine 1,5%ige CaCl₂-Lösung, enthält, wird mit einem Stopfen versehen, der eine Tropfenerzeugungseinrichtung trägt. Die Tropfener zeugungseinrichtung weist ein Gehäuse mit einer oberen Lufteinlaßdüse und einem länglichen Hohl körper auf, der in Gleitpassung im Stopfen vor gesehen ist. Oben am Gehäuse wird eine 10-ml- Spritze mit einer Schrittpumpe montiert, die beispielsweise eine mit PTFE beschichtete Nadel von 0,25 mm Innendurchmesser auf weist, die längs durch das Gehäuse hindurchgeht. Das Innere des Gehäuses ist so konstruiert, daß am Ende der Nadel ein konstanter laminarer Luftstrom einwirkt, der austretende Tröpfchen abreißt. Im praktischen Einsatz wird die Spritze mit der das einzukapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt und die Schritt pumpe betätigt, die absatzweise Lösungströpfchen aus der Nadelspitze herausdrückt. Die Tröpfchen werden durch den Luftstrom abgerissen und fallen etwa 2,5 cm tief in die CaCl₂-Lösung, wo sie durch Absorption von Calciumionen sofort geliert werden. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der CaCl₂-Lösung ist hierbei groß genug, daß die Natriumalginat-Zell suspension die physikalisch günstigste Form, nämlich die Kugelform, annehmen kann, bei der maximales Volu men bei zugleich minimaler Oberfläche vorliegt. Die Luft innerhalb des Rohrs strömt durch eine Öffnung im Stopfen aus. Durch diese Verfahrensweise wird das Gel ′vernetzt′, und es bilden sich hochviskose, formbeständige temporäre Schutzkapseln, die das suspendierte Gewebe und sein Medium enthalten. Die Kapseln sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und können durch Absaugen abgetrennt wer den.

In der nächsten Verfahrensstufe wird eine semi permeable Membran auf der Oberfläche der temporären Kapseln durch ′Vernetzung′ der Oberflächenschichten aufgebracht. Dies kann dadurch geschehen, daß die gelierten temporären Kapseln einer wäßrigen Lösung eines kationische Gruppen enthaltenden Polymers ausgesetzt werden, die mit den anionischen funtio nellen Gruppen in den Gelmolekülen reagieren können. Polymere, die gegenüber sauren Gruppen reaktive Gruppen, wie etwa freie Imino- oder Amonigruppen, enthalten, sind bevorzugt. In diesem Stadium wird der Polysaccharidgummi durch Wechselwirkung (Entstehung von Salzverbindungen) zwischen den Carboxylgruppen und den Amino- oder Iminogruppen vernetzt. Die Permeabi lität kann vorteilhaft innerhalb bestimmter Grenzen durch Auswahl der Molmasse des eingesetzten ver netzenden Polymers und durch Einstellung der Konzentra tion der Polymerlösung sowie der Dauer und der Tempe ratur der Einwirkung eingestellt werden. Lösungen eines Polymers mit niederer Molmasse dringen in einer gegebenen Zeitdauer weiter in die temporären Kapseln ein, als dies bei Polymeren mit höherer Molmasse der Fall ist. Der Penetrationsgrad des Vernetzungsmittels läßt sich mit der resultie renden Permeabilität korrelieren. Allgemein gilt, daß die Porengröße umso höher ist, je höher die Molmasse und je niedriger die Penetration sind. All gemein können Polymere mit einer Molmasse im Bereich von 3000 bis 100 000 oder darüber je nach der Reaktionsdauer, der Konzentration der Polymer lösung und dem angestrebten Permeabilitätsgrad einge setzt werden.

Günstige Reaktionsbedingungen liegen z. B. vor, wenn Polylysin mit einer mittleren Molmasse von etwa 35 000 verwendet, die Reaktion unter Rühren 2 min lang durchgeführt und eine physiologische Salz lösung eingesetzt wird, die 0,0167% Polylysin ent hält. Hierdurch können Membranen mit einer Ober grenze der Permeabilität von etwa 100 000 erzielt werden. Optimale Reaktionsbedingungen, die sich zur Einstellung der Permeabilität in einem gegebenen System eignen, können aufgrund der oben angegebenen Richtlinien leicht empirisch ermittelt werden. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Obergrenze der Permeabilität der Membranen, ausgedrückt als Molmasse, auf einen gewählten Wert unter etwa 150 000 einzustellen.

Beispiele für geeignete vernetzende Polymere sind etwa Proteine und Polypeptide natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit freien Amino- oder Iminogruppen, Polyethylenamine, Polyethylen imine und Polyvinylamine. Polylysin wurde eben falls sowohl in der D- als auch in L-Form erfolg reich verwendet. Proteine, wie Polyarginin, Poly citrullin und Polyornithin, sind ebenfalls ver wendbar. Polymere mit höherer positiver Ladungsdichte, beispielsweise Poly venylamine, haften stark an den anionischen Grup pen der Gelmoleküle und bilden stabile Membranen, die jedoch etwas schwierig aufzubrechen sind.

Durch Behandlung mit einer verdünnten Lösung eines Gummis oder eines zwitterionischen Puffers werden die freien Aminogruppen auf den Oberflächen der Kapseln gebunden, die sonst zu einer Verklumpungs tendenz der Kapseln führen würden.

In diesem Stadium der Einkapselung können Kapseln gewonnen werden, die eine semipermeable Membran aufweisen, die eine gelierte Gummilösung, ein mit dem entsprechenden Zelltyp kompatibles Kulturmedium und die Zellen sowie ggf. eine interne Matrix aus Collagen oder einem anderen Verankerungs substrat umgibt. Da der Stofftransport innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch gefördert wer den sollte, ist es bevorzugt, das Gel wieder zu sei ner wasserlöslichen Form zu verflüssigen. Dies kann durch Wiederherstellung der Bedingungen erfolgen, unter denen der Gummi flüssig ist, beispielsweise durch Abtrennung des Calciums oder anderer mehr wertiger Kationen aus dem inneren Gel. Das Medium in der Kapsel kann in einfacher Weise durch Ein tauchen der Kapseln in phosphatgepufferte Salzlö sung, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält, resolubilisiert werden. Einwertige Ionen werden beim Eintauchen der Kapseln in die Lösung unter Rühren gegen Calcium oder andere mehrwertige Ionen innerhalb des Gummis ausgetauscht. Zum glei chen Zweck können auch Natriumcitratlösungen ver wendet werden, wodurch die zweiwertigen Ionen abgetrennt bzw. maskiert werden können.

Die wie oben eingekapselten Zellkulturen können in Kulturmedien suspendiert werden, die alle mit den jeweiligen Zellen verbundenen Forderungen spezifisch erfüllen und in denen die Zellen ihren normalen In-vitro-Stoffwechsel sowie ihre Zell teilung fortsetzen. Wenn die Kultur eine Umgebung von hochmolekularen Komponenten, wie etwa Serum bestandteilen, erfordert, können diese aus dem extrakapsulären Medium weggelassen werden. Die normalerweise von den Zellen aufgenommenen Kompo nenten besitzen typischerweise eine relativ niedere Molmasse und diffundieren leicht durch die Kapselmembranen in die Mikroumgebung der Zellen, wo sie die Zellmembran durchdringen. Die Stoff wechselprodukte der Zellen, die in das intra kapsuläre Medium hinein abgeschieden werden, diffundieren, wenn sie eine Molmasse un terhalb der Obergrenze der Permeabilität der Kapselmembran besitzen, ebenfalls hindurch und sammeln sich im extrakapsulären Medium an.

Die eingekapselten Zellen können unter Be dingungen beispielsweise der Temperatur, des pH- Werts oder der ionischen Umgebung kultiviert wer den, die gleich sind wie bei herkömmlichen Kulturen. Auch die von den Zellen produzierten Produkte können aus dem extrakapsulären Medium oder aus dem intra kapsulären Volumen nach bekannten Verfahren ge wonnen werden. Das erfindungsgemäße Kulturver fahren bietet allerdings demgegenüber folgende Vorteile:

1. Die Zellen der Kultur sind vor der Kontamination durch Verbindungen und Materialien geschützt, deren Abmessungen oberhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen liegen. Dies bedeutet, daß die Anforderungen an die Sterili tät gegenüber bisherigen Kulturverfahren nicht so strikt sind, da Mikroorganismen die eingekapselten Zellen nicht erreichen können.

2. Die Kapseln immobilisieren ihrerseits die Zellen innerhalb einer Umgebung, in der eingeschlossene Materialien mit hoher Molmasse abgegrenzt sind, wobei zugleich Nährstoffe mit niederer Molmasse sowie die Produkte leicht entfernt bzw. eingeführt werden können. Hierdurch kann die Nähr lösung absatzweise oder kontinuierlich gesammelt und erforderlichenfalls ergänzt werden, ohne daß dabei Störungen bei den Zellen auftreten.

3. Die von den Zellen produzierten angestrebten Substanzen lassen sich leichter gewinnen. Aus geschiedene Zellprodukte mit molekularen Ab messungen, die klein genug sind, um die Kapsel membranen durchdringen zu können, sammeln sich zusammen mit den Nährstoffen im extrakapsulären Medium an. Serumkomponenten mit hoher Molmasse und dgl. werden allerdings nicht in das extra kapsuläre Medium abgegeben, wodurch die Gewinnung der interessierenden Zellprodukte erheblich ver einfacht wird. Ausgeschiedene Zellprodukte, deren molekulare Dimensionen oberhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen liegen, sammeln sich innerhalb der Kapseln an. Diese Produkte kön nen in relativ konzentrierter Form durch Isolierung der Kapseln und anschließendes selektives Aufbre chen der Kapselmembranen, beispielsweise durch das nachstehend beschriebene Verfahren, gewonnen werden.

4. Das intrakapsuläre Volumen stellt eine Umgebung dar, die sich gut zur Zellteilung eignet. Bei Suspensionskulturen wurde festgestellt, daß sie innerhalb der Kapseln Mitose zeigen. Von einer Verankerung abhängige Zellen, die in normalen Kulturen in einer zweidimensionalen Monoschicht wachsen, vermehren sich unter Aggregatbildung inner halb der Kapseln. Solche Zellen benutzen dabei die Innenoberflächen der Membranen als Substrat und/oder setzen sich an den oben erläuterten hochmolekularen Materialien fest, die sich innerhalb der Kapseln befinden. Dies führt zu einer signifikanten Erhöhung der Zelldichte im Vergleich mit herkömmlichen Kul turen. Die Erhaltung der Lebensfähigkeit solcher Zellcluster wird dadurch unterstützt, daß das Ver hältnis von Oberfläche zu Volumen bei den Kapseln sehr groß sein kann, so daß sämtliche Zellen Zugang zu den erforderlichen Nährstoffen, Sauerstoff und dgl. besitzen.

In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, die Kapselmembranen zur Freisetzung der Zellen ohne Beschädigung selektiv zu zerstören. Ein diesbezüg lich bemerkenswertes Beispiel ist die Herstellung von Interferon. Zur Interferonproduktion befähigte Zellen müssen zur Erzielung der Interferonproduk tionsstufe der Einwirkung bestimmter Viren oder Nucleinsäuren ausgesetzt werden. Bei einigen Ver fahren zur Induktion der Interferonproduktion wer den ferner der Kultur Reagentien zur Inhibierung der Proteinsynthese zugegeben. Die Wachstumsstufe des Kultivierungsverfahrens muß daher unter Be dingungen durchgeführt werden, die sich erheblich von den Bedingungen bei der Induktion der Inter feronproduktion unterscheiden. Wenn die zur Induk tion der Interferonproduktion angewandten Substanzen eine Molmasse besitzen, die oberhalb der Ober grenze der Permeabilität der Kapselmembranen liegt, wie dies bei Induktionen durch Viren der Fall ist, kann die Induktion der Interferonproduktion nicht in der eingekapselten Zellkultur vorgenommen wer den. Interferon produzierende Zellen müssen daher, wenn sie innerhalb von Kapseln kultiviert wurden, durch Aufbrechen der Membranen freigesetzt wer den, um die Interferonproduktion induzieren zu können.

Aufbrechen der Membranen

In Membranen der oben angegebenen Art einge schlossene Zellen können nach einem Verfahren freigesetzt werden, bei dem im Handel erhältliche Reagentien mit Eigenschaften angewandt werden, die die eingekapselten Zellen nicht in nennenswerter Weise nachteilig beeinflussen. Die Kapseln werden zuerst aus dem suspendierenden Medium abgetrennt, zur Entfernung auf der Außenseite der Mikrokapseln vor liegender kontaminierender Materialien gründlich ge waschen und anschließend unter Rühren in einer Misch lösung mit einatomigen, mehrwertigen Kationen, wie etwa Calciumionen, und einem Trennpolymer mit zahlreichen anionischen Gruppen, wie etwa einem Salz einer Polysulfonsäure oder Poly phosphorsäure, dispergiert. In dieser Stufe ist die Verwendung von Heparin, d. h. einem natürlichen sulfonierten Polysaccharid, bevorzugt. Die anioni sche Ladungsdichte des eingesetzten Trennpolymers sollte gleich oder vorzugsweise größer sein als die Ladungsdichte des ursprünglich zur Membranerzeugung angewandten sauren Gummis. Die Molmasse des Polymers sollte mit der Molmasse des bei der Membranerzeugung eingesetzten Polymers mit zahlrei chen kationischen Gruppen mindestens vergleichbar und vorzugsweise größer sein.

Innerhalb der Suspension vonKapseln in der Misch lösung konkurrieren die Calciumionen mit den zur Membran erzeugung verwendeten polykationischen Polymerketten um die anionischen Gruppen auf dem wasserlöslichen Gummi. Gleichzeitig konkurrieren das Heparin oder andere Polymere mit zahlreichen anionischen Grup pen, die in der Lösung gelöst sind, mit dem anioni schen Gummi in der Membran um die kationischen Stel len der Polymerkette. Dies führt zu einem in Wasser dispergierbaren oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex, beispielsweise aus Polylysin und Heparin, sowie zur Assoziation der einatomigen Kationen mit den Molekülen des Gels.

Durch diesen Verfahrensschritt werden die Membra nen bei anschließendem Inkontaktbringen mit einem Trennmittel bzw. Maskierungsmittel löslich, das das Aufbrechen der Membranen durch Aufnahme einatomiger Ionen aus dem Gel vervollständigt. Im Medium ver bleibende Reste von Kapselmembranen können ggf. leicht von den Zellen getrennt werden.

Eine üblicherweise bevorzugte Lösung für die erste Stufe des selektiven Aufbrechens der Membra nen enthält 1,1% (M/V) Calciumchlorid und 500 bis 1500 Einheiten Heparin/ml Lösung. Diese Lö sung wird mit einem solchen Volumen an Mikrokapseln versetzt, daß sie etwa 20 bis 30% des Gesamtvolu mens der Suspension einnehmen. Calciumchlorid und Heparin sind bevorzugt, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind und hierdurch die Möglichkeit von Zellschädigungen auf ein Minimum zurückgedrängt wird. Gemische mit Strontiumsalzen oder anderen Salzen mit mehrwertigen Kationen, jedoch nicht Mg⁺⁺-Ionen, können ebenfalls zusammen mit den Polysulfonsäure- oder Polyphosphorsäure salzen der oben angegebenen Art eingesetzt werden.

Die Konzentration der einatomigen Ionen sowie die des in dieser Verfahrens stufe eingesetzten anionischen Polymers können in einem weiten Bereich variieren. Optimale Konzentrationen können leicht empirisch ermittelt werden und hängen von der Expositionszeit sowie dem zur Erzeugung der Membranen verwendeten jeweiligen speziellen Poly mer ab.

Als Trennmittel zum selekti ven Aufbrechen der Membranen wird üblicherweise be vorzugt Natriumcitrat verwendet, jedoch können auch andere Alkalimetallcitrate und EDTA-Alkalisalze Verwendung finden. Bei Anwendung von Natrium citrat beträgt die optimale Konzentration grö ßenordnungsmäßig 50 bis 60 mM. Zur Minimierung von Zellschädigungen ist es bevorzugt, das Citrat oder andere Trenn- bzw. Maskierungsmittel in iso tonischer Salzlösung zu lösen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Aus führungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel: Kultivierung menschlicher Fibroblasten

Durch 5 min Behandlung einer herkömmlichen Mono layerkultur mit Trypsin und EDTA bei 37°C in bekann ter Weise hergestellte Humanfibroblasten werden in einem vollständigen Kulturmedium (CMLR-1969) suspendiert, das mit 40 Volum-% gereinig tem Kälberfetalserum, 0,8% Natriumalginat und 200 µg/ml gereinigtem Kälberhautcollagen ergänzt ist. Die Zelldichte der Suspension beträgt etwa 1,5 × 10⁷ Zellen/ml.

Anschließend wird eine 1,5%ige Calciumchlorid lösung zur Gelbildung von Tröpfchen verwendet, die unter Verwendung der oben erläuterten Tröpfchener zeugungseinrichtung hergestellt werden. Aus der Na delspitze treten Tröpfchen von größenordnungsmäßig 50 bis 500 µm Durchmesser aus, die nach Eintreten in die Calciumchloridlösung sofort gelieren.

Nach 5 min wird die überstehende Lösung abge saugt. Die gelierten Kapseln werden dann in ein Becherglas übertragen, das 15 ml einer Lösung ent hält, die aus 1 Teil einer 2%igen 2-Cyclohexyl- aminoethansulfonsäure-Pufferlösung in 0,6%iger NaCl-Lösung (isotonisch, pH 8,2) und 20 Teilen 1%iger CaCl₂-Lösung besteht. Nach 3 min Eintauchen werden die Kapseln zweimal in 1%iger CaCl₂-Lösung gewaschen.

Die Kapseln werden anschließend in 32 ml einer Lösung übertragen, die 0,005% (M/V) Polylysin (mittlere Molmasse 43 000) in physiologi scher Salzlösung enthält. Nach 3 min wird die Polylysinlösung abdekantiert. Die resultierenden Kapseln, die ′permanente′ semipermable Membra nen aufweisen, werden dann zweimal mit 1%iger CaCl₂-Lösung und zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und mit 10 ml einer 0,03%igen Alginsäurelösung gemischt.

Die Kapseln klumpen nicht zusammen und zeigen sämtlich eingeschlossene Fibroblasten. Das Gel im Kapselinneren wird durch 5 min Eintauchen der Kapseln in ein Gemisch aus Salzlösung und Citrat puffer (pH 7,4) wieder verflüssigt. Die obigen Verfahrensschritte werden sämtlich bei 22 bis 37°C durchgeführt.

Bei mikroskopischer Untersuchung ergibt sich, daß die Kapseln eine sehr dünne Membran aufweisen, die die Zellen umgibt. Die Membranen sind für Mole küle mit einer Molmasse bis zu etwa 100 000 durchlässig.

Die resultierendenKapseln werden in CMLR-1969- Medium suspendiert, das mit 10% Kälberfetalserum er gänzt ist. Nach 4 bis 5 Tagen Inkubation bei 37°C er gibt sich bei mikroskopischer Untersuchung, daß die Kapseln Fibroblasten enthalten, die der Mito se unterlagen und innerhalb der Mikrokapseln die klassische Fibroblastenmorphologie aufweisen.

Die Kapselmembranen können ohne Schädigung der Zellen wie folgt aufgebrochen werden:

Eine Menge von 10 ml der Mikrokapselsuspension, die etwa 500 bis 1000 Kapseln/ml enthält, wird zu nächst absitzen gelassen. Nach Absaugen des Mediums werden die Kapseln zweimal mit Salzlösung gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden dann mit 3,0 ml einer Lösung gewaschen, die 1000 Einheiten Heparin/ml und 1,1% (M/V) CaCl₂ ent hält. Die Suspension wird 3 min bei 37°C gerührt; nach Absitzenlassen der Kapseln wird der Überstand abgesaugt, worauf die Kapseln zweimal mit 3,0 ml 0,15 M NaCl-Lösung gewaschen werden. Nach Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit 2,0 ml einer Mischlösung vermischt, die gleiche Volumina einer 110 mM Natriumcitratlösung und 0,15 M NaCl-Lösung (pH 7,4) enthält. Das Ge misch wird zum Ingangbringen der Auflösung der Membranen 1 min von Hand verwirbelt, worauf die Zellen zweimal mit Medium gewaschen werden.

Die Induktion der Produktion von Interferon-β (INF-β) wird nach dem Vilcek-Verfahren nach der Superinduktionstechnik vorgenommen. Die Zellsus pension wird unter einer CO ₂-haltigen Atmosphäre (5% CO₂, 95% Luft) 1 h bei 37°C in Gegenwart von 100 µg/ml Poly I-Poly C (doppelsträngige RNS, bekannter INF-β-Inducer und 50 µg/ml Cycloheximid (Inhibitor der Proteinsynthese) inkubiert. Nach 1 h werden die suspendierten Zellen in CMLR-1969-Medium ge waschen, das 50 µg/ml Cycloheximid enthält, und da nach in der gleichen Lösung 3 h bei 37°C unter der gleichen CO₂-haltigen Atmosphäre resuspendiert. Nach Ablauf der Inkubationsdauer wird der Waschschritt wiederholt, worauf die Zellen in einem Medium resuspendiert werden. das 50 µg/ml Cycloheximid und 5 µg/ml Actinomycin D (RNS-Synthese inhibitor) enthält, und danach 2 h bei 37°C unter der gleichen CO₂-haltigen Atmosphäre in kubiert. Die Zellen werden anschließend zweimal mit Medium gewaschen und 18 bis 24 h bei 37°C in serumfreiem Medium suspendiert; während die ser Zeit scheiden die Fibroblasten INF-β aus, das eine Molmasse von größenordnungsmäßig 21 000 aufweist und aus dem extrakapsulären Medium gewonnen werden kann.

Bei einem Poly I - Poly C mit einer Sedimentationszahl von 5 S (Poly I und Poly C zu einer doppelsträngigen RNS vereinigt) durch geführten Versuch wurden 2500 Einheiten INF-β pro 10⁵ Zellen in der Kultur erzeugt. Die gleiche Ausbeute wurde in einem zweiten Lauf erzielt, bei dem Poly I - Poly C mit einer Sedimentationszahl von 12 S (doppelsträngig, Handelsprodukt) verwendet wurde.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung verankerungsabhängiger Zellen, gekennzeichnet durch

(A) Suspendieren der Zellen in einem Medium, das ein Verankerungssubstrat sowie alle zur Erhaltung der Lebensfähigkeit und zur Unterstützung der Mitose der Zellen erforderlichen hochmolekularen Kompo nenten (I) mit einer Molmasse oberhalb einer ge wählten Grenze enthält,
(B) Einkapseln der Zellen zusammen mit dem Medium in semipermeablen Membranen mit einer Obergrenze der Permeabilität, die den Durchtritt des Ver ankerungssubstrats und der Komponenten (I) ausschließt, jedoch denDurchtritt von Molekülen mit einer Molmasse unterhalb der gewählten Grenze erlaubt,
(C) Suspendieren des Produkts von Schritt (B) in einem Kulturmedium, das alle zur Erhaltung der Lebensfähigkeit und zur Unterstützung der Mitose der Zellen erforderlichen Komponenten (II) mit einer Molmasse unterhalb der gewählten Grenze enthält, und
(D) Stattfindenlassen der Mitose innerhalb der Membranen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als Verankerungssubstrat ein Pro tein eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein Collagen eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Collagen Kälberhautcollagen in einer Konzen tration von 10 µg/ml bis 1,0 mg/ml Medium eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als Zellen Fibroblasten eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als hochmolekulare Komponenten (I) Serumbestandteile eingesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als Zellen Humanfibroblasten eingesetzt werden, die zur Interferonausscheidung befähigt sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Einkapselung sphäroidale Membranen mit einem mittleren Durchmesser von 100 bis 500 µm hergestellt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (A) als Verankerungssubstrat ein Protein mit zahlreichen freien kationischen Gruppen verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Obergrenze der Permeabilität der Mem branen unterhalb 2,0 × 10⁵, ausgedrückt als Mol masse, gewählt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Obergrenze der Permeabilität der Membranen unterhalb 1 × 10⁵, ausgedrückt als Molmasse, ge wählt wird.