DE3209045C2

DE3209045C2 - Verfahren zum selektiven Aufbrechen permeabler Membranen

Info

Publication number: DE3209045C2
Application number: DE3209045A
Authority: DE
Inventors: Franklin Richmond Va. Lim
Original assignee: Damon Biotech Inc Needham Heights Mass; Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1981-03-13
Filing date: 1982-03-12
Publication date: 1986-06-19
Also published as: IT8220139A0; NO158284B; IT1150681B; NO820795L; GB2094750B; JPS6152737B2; CH651579A5; NO158284C; FR2501528B1; FR2501528A1; DE3209045A1; SE8201557L; DK112382A; CA1184518A; SE454181B; GB2094750A; BE892477A; JPS57197031A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mikroverkapselung von Kernmaterialien und anschließenden Freisetzung des Kernmaterials durch selektives Aufbrechen der Mikrokapselmembranen. Bei der Einkapselung werden beispielsweise um ein Tröpfchen herum semipermeable Membranen durch Ausbildung zahlreicher ionischer Salzbrücken zwischen einem polyionischen Polymer im Tröpfchen und einem vernetzenden polyionischen Polymer mit zahlreichen ionischen Gruppen entgegengesetzter Ladung erzeugt. Diese Membranen können dadurch selektiv aufgebrochen werden, daß sie zunächst mit einer Lösung konkurrierender vernetzender mehrwertiger und vorzugsweise zwei- oder dreiwertiger Ionen und anschließend einer Lösung eines konkurrierenden polyionischen Polymers der gleichen Ladung wie beim Polymer im ursprünglichen Tröpfchen zusammengebracht werden. Alternativ kann auch eine Mischlösung aus den beiden Lösungen mit den konkurrierenden Substanzen zusammen eingesetzt werden. Membranen, die aus einem anionischen Alginat bestehen, das an ein kationisches Protein gebunden ist, können beispielsweise dadurch selektiv aufgebrochen werden, daß sie einer Mischlösung einatomiger, mehrwertiger Kationen, z.B. Ca ↑ ↑-Ionen und eines wasserlöslichen Polymers mit zahlreichen anionischen Gruppen, z.B. Heparin, ausgesetzt und anschließend die einatomigen Kationen abgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich vorteilhaft zur Einkapselung und anschließenden Freisetzung von Zellkulturen ohne Schädigung der .

Description

(A) die Mikrokapseln einer Lösung von mehrwertigen Kationen sowie eines polyanionischen Trennpolymers, das eine zum Aufbrechen der Salzbrücken ausreichende Ladung aufweist, ausgesetzt werden,

(B) die Kationen mit dem polykationischen Polymer um die anionischen Gruppen am polyanionischen Polymer und das polyanionische Trennpolymer mit dem polyanionischen Polymer um die kationischen Gruppen am polykationischen Polymer konkurrieren gelassen werden, und

(C) die mit dem polyanionischen Polymer nach Schritt (B) assoziierten Kationen abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (C) durch Einwirkung einer einen Chelatbildner enthaltenden Lösung auf die Membranen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner Citrationen und/oder EDTA-Ionen verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines Polymers mit zahlreichen Aminogruppen als polykationisches Polymer eingesetzt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines sauren, wasserlöslichen Gummi* als polyanionisches Polymer eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines Alginats als polyanionisches Polymer eingesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Trennpolymer Heparin verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kationen Ca⁺ +-Ionen eingesetzt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln eingesetzt werden, deren polykationisches Polymer ausgewählt ist unter

(a) Proteinen mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen;

(b) Proteinen mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen;

(c) Polypeptiden mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen;

(d) Polypeptiden mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen;

(e) Polyvinylaminen;
(0 Polyethyleniminen;

(g) Polyethylenaminen und
(h) deren Gemischen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein unter Polysulfonsäuren, Polyphosphorsäuren, ihren Salzen sowie deren Gemischen ausgewähltes Trennpolymer eingesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Trennpolymer ein Polymer mit Polysulfonsäure-Salzgruppen verwendet wird.

ίο 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,

dadurch gekennzeichnet, daß ein polyanionisches Trennpolymer verwendet wird, das eine höhere Ladungsdichte als das polyanionische Polymer der Mikrokapseln aufweist

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln eingesetzt werden, die lebende Zellen enthalten.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines Proteins als polykationisches Polymer, Natriumalginat als wasserlöslicher Gummi und Calciumionen als Kationen eingesetzt und Heparin als Trennpolymer verwendet werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (C) als Trennmittel ein Citrat verwendet wird, das in einer mit den Zellen physiologisch verträglichen Lösung gelöst ist

Die Erfindung betrifft die reversible Einkapselung, d. h. ein Verfahren, mit dem Flüssigkeiten oder Feststoffe zunächst verkapselt und danach unter Freisetzung des Materials durch selektives Aufbrechen der Kapselmembranen wieder freigesetzt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Mikroverkapse-Iung lebender Zellen, die anschließend ohne Beschädigung aus den erzeugten Kapselmembranen wieder freigesetzt werden können.

In der GB-A 20 46 209 ist ein Mikroverkapselungsverfahren angegeben, das sich zur Einkapselung praktisch beliebiger Feststoffe oder Flüssigkeiten in Mikrokapseln mit semipermeablen oder im wesentlichen im- permeablen Kapselmembranen eignet. Ein herausragender Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß bei der Erzeugung der Kapselmembranen keine toxischen oder denaturierenden Reagentien verwendet oder extreme Temperaturen oder andere Bedingungen, unter denen lebende Zellen geschädigt werden, angewandt werden. Diese Verfahrensweise eignet sich entsprechend besonders zur Mikroverkapselung lebender Materialien, die lebensfähig und im gesunden Zustand bleiben. Da bei diesem Verfahren der Permeabilitätsgrad der Membranen einstellbar ist, können Zellkulturen von Procaryonten, Eukaryonten oder anderer Herkunft so mikroverkapselt werden, daß die Zellen der Kultur oder kontaminierenden Bakterien, hochmolekularen Immunglobulinen und anderen möglicherweise schädlichen Faktoren geschützt sind und innerhalb einer Mikroumgebung abgegrenzt bleiben, die sich zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit sowie der Stoffwechselfunktionen günstig eignet. Wenn die Mikrokapseln in einem üblichen Kulturmedium suspendiert werden, das das Wachstum der betreffenden lebenden Zellen erlaubt, können die mikroverkapselten Zellen die für den Metabolismus erforderlichen Nahrungssubstanzen, die durch die Membran hindurchdiffundieren, aufnehmen und ihre

Stoffwechselprodukte durch die Kapselmembran hindurch in das umgebende Medium abgeben.

Ein Verfahren, mit dem derartige Mikrokapseln ohne Schädigung ihres Inhalts aufgebrochen werden können, ist der GB-A 20 46 209 allerdings nicht zu entnehmen.

Der Erfindung Hegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum selektiven Aufbrechen der Membranen von Mikrokapseln des oben definierten Typs anzugeben, mit dem der Inhalt der Mikrokapseln, d. h. fein verteilte Materialien sowie Flüssigkeiten und Lösungen, ohne Schädigung freigesetzt werden kann, das sich auch bei Mikrokapseln mit eingekapselten lebenden Zellen oder lebendem Gewebe anwenden läßt

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteranspräche.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven Aufbrechen der Membranen von Mikrokapseln, die nach dem oben erläuterten Mikroverkapselungsverfahren hergestellt wurden, ohne das eingekapselte Material in irgendeiner nachweisbaren Form zu schädigen. Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich im einzelnen auf das selektive Aufbrechen von Mikrokapseln mit Membranen auf der Basis einer wasserunlöslichen Matrix, die aus mindestens zwei wasserlöslichen Komponenten erzeugt wurde, nämlich einem polykationioschen Polymer mit zahlreichen kationischen Gruppen, z. B. einem Polyethylenamin, und einem polyanionischen Polymer mit zahlreichen anionischen Gruppen, z. B. Natriumalginatgummi. Die beiden Komponenten sind durch Salzbrücken zwischen den anionischen und den kationischen Gruppen unter Matrixbildung miteinander verbunden.

Die Membranen solcher Mikrokapseln besitzen üblicherweise sphäroidale Form, die einen abgeschlossenen Innenraum vorgibt, der die eingekapselte Substanz enthält. Das Verfahren kann jedoch auch an Mikrokapseln dieses Typs durchgeführt werden, die abweichende Form besitzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Schritte:

Zunächst werden die Mikrokapseln mit Membranen des oben erläuterten Typs einer Lösung von mehrwertigen Kationen, die einatomig sind oder eine sehr niedere Molekülmasse besitzen, sowie einer Lösung eines polyanionischen Trennpolymers (Stripping-Polymers) mit zahlreichen anionischen Gruppen ausgesetzt. Diese Lösungen werden vorzugsweise zusammengemischt. Die anionische Ladung des Polymers muß ausreichen, um die Salzbrücken aufzubrechen, und sollte vorzugsweise gleich oder größer als die Ladungsdichte des polyanionischen Polymers der Membran sein. Die Lösung wird mit den Kapseln in Kontakt gebracht, damit die Kationen, beispielsweise Calcium- oder Aluminiumionen, mit dem polykationischen Polymer in der Kapselmembran um die anionischen Stellen auf dem polyanionischen Polymer konkurrieren können. Gleichzeitig konkurriert das Trennpolymer, das zahlreiche anionische Gruppen aufweist, mit dem polyanionischen Polymer um die kationischen Stellen an den Polymerketten. Dies führt zu einem »Aufweichen« bzw. beginnendem Aufbrechen der Kapselmembranen. Zur Vervollständigung des Aufbrechens werden die Mikrokapseln gewaschen und dann zur Abtrennung der am polyanionischen Polymer assoziierten Kationen einem Trennmittel ausgesetzt. Bevorzugte Trennmittel sind Chelatbildner wie Citrationen oder EDTA-Ionen. Wenn die Kapseln lebensfähige Zellen enthalten, was einer wichtigen erfindungsgemäßen Ausführungsform entspricht, wird das Trennmittel vorzugsweise mit einer isotonischen Salzlösung gemischt

Als Kation wird üblicherweise Calcium bevorzugt Beispiele für das polyanionische Trennpolymer mit anionischen Gruppen, das in der Mischlösung verwendet wird, sind Polysulfonsäuren bzw. vorzugsweise deren Salze, die natürlich oder synthetisch sein können. Besonders günstige Ergebnisse sind mit Heparin erzielbar, d. h. einem natürlichen Polymer, das zahlreiche Sulfonatgruppen enthält Polymere, die Polyphosphorsäure- oder Polyacrylsäuresalzgruppen enthalten, sind ebenfalls verwendbar.

Als Trennmittel wird üblicherweise bevorzugt Natriumcitrat verwendet

Erfindungsgemäß können entsprechend Kulturen lebender Zellen beliebigen Ursprungs, die in einer sterilen, stabilisierenden Umgebung in Mikrokapseln des oben angegebenen Typs eingeschlossen sind, in denen die normalen Stoffwechselvorgänge und sogar die Mitose ablaufen können, ohne Schädigung freigesetzt werden.

Obgleich im wesentlichen beliebige Materialien, die mit wäßrigen Medien verträglich sind und in flüssiger oder fester Form nach dem oben genannten Verfahren eingekapselt sind, gemäß der Erfindung wieder ohne Schädigung.freigesetzt werden können, liegt die derzeit bemerkenswerteste Anwendbarkeit bei der Freisetzung eingekapselter lebender Systeme wie etwa von Zellkulturen. Die Erläuterung der Erfindung bezieht sich daher im folgenden primär auf die Einkapselung und erfindungsgemäße Freisetzung von Zellen, wobei das erfindungsgemäße Verfahren vom Fachmann ohne weiteres auch bei weniger empfindlichen eingekapselten Materialien durchgeführt werden kann.

Die einzukapselnden Gewebe oder Zellen werden in einem wäßrigen Medium suspendiert, das sich zur Aufrechterhaltung und Unterstützung der Stoffwechselvorgänge der betreffenden Zellen eignet. Hierfür geeignete Medien sind dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig und in zahlreichen Fällen handelsüblich. Der mittlere Durchmesser der einzukapselnden Zellmassen oder anderer Materialien kann in weitem Bereich zwischen einige μηι bis zu einigen mm und darüber variieren. Die Langerhans'schen Inseln von Säugetieren und Menschen besitzen z. B. typischerweise einen Durchmesser von 50 bis 200 μπι. Gewebefragmente und einzelne Zellen wie etwa Fibroblasten, Leukocyten, Lymphoblastoidzellen, Pancreas-/?, -χ- oder J-Zellen, Langerhans'sche Inseln, Hepatocyten sowie Zellen anderer Gewebe können gewünschtenfalls eingekapselt werden. Ferner ist eine Einkapselung von Mikroorganismen einschließlich solcher Mikroorganismen möglich, die durch DNA-Rekombination oder andere Verfahren kinetisch modifiziert wurden.

Die Erhaltung der Lebensfähigkeit solcher lebender Materialien hängt u. a. von der Verfügbarkeit der erforderlichen Nährstoffe, dem Sauerstofftransport, der Abwesenheit toxischer Substanzen im Medium so wie dem pH-Wert des Mediums ab. Solche lebenden Materialien werden bei und nach der Einkapselung in einer physiologisch verträglichen Umgebung gehalten.

Bei dem gattungsgemäß zugrundeliegenden Einkapselungsverfahren werden bestimmte wasserlösliche Substanzen, die z. B. mit lebenden Geweben physiologisch verträglich sind und unter Bildung einer formbeständigen, zusammenhängenden Masse wasserunlöslich gemacht werden können, zur Erzeugung »temporärer

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Kapseln«, & h. von Schutzschichten z. B. um einzelne bige mehrwertige Ionen, die zur Salzbildung mit dem Zellen, Gruppen von Zellen oder Gewebe herum, her- sauren Gummi in der Lage sind, verwendet werden könangezogen. Diese Substanzen werden dem Gewebekul- nen, werden vorzugsweise physiologisch verträgliche turmedium typischerweise in einer Konzentration von Ionen, beispielsweise Calciumionen, angewandt wogrößenordnungsmäßig 1 bis 2 Masse-% zugesetzt Die 5 durch sich Gewebe in lebendem Zustand halten lassen. Lösung wird anschließend in Tröpfchen umgewandelt Für weniger empfindliche Materialien können auch andie das Gewebe zusammen mit dem Aufbewahrungs- dere mehrwertige Kationen eingesetzt werden. Magne- bzw. Kulturmedium enthalten, und dann unmittelbar siumionen sind zur Gelbildung mit Natriumalginat unwasserunlöslich gemacht und in Gelform übergeführt wirksam.

zumindest in einer Oberflächenschicht Anschließend io Eine typische Lösung ist so zusammengesetzt daß sie

werden die formbeständigen temporären Kapseln mit gleiche Volumina einer Zellsuspension im entsprechen-

einer dauerhafteren Membran versehen, die erfindungs- den Medium sowie einer 1- bis 2°/oigen Lösung des

gemäß anschließend unter Freisetzung des eingekapsel- Gummis in physiologischer Salzlösung enthält Bei Ver-

ten Inhalts ohne Schädigung selektiv aufgebrochen wer- Wendung von Natriumalginat hat sich eine 1,2- bis

den kann. Nach der Erzeugung der permanenten Mem- is l,6°/oige Lösung als günstig erwiesen,

bran kann der Kapselinhalt wenn das zur Erzeugung im nächsten Verfahrensschritt der Einkapselung wird

der temporären Kapseln verwendete Material dies zu- die Gummilösung, die das Gewebe enthält in Tröpfchen

l?|ßt, wieder verflüssigt werden. Dies geschieht durch einer erwünschten Größe umgewandelt die ausrei-

Wiederherstellung der Bedingungen im Medium, unter chend ist um die einzukapselnden Zellen einzuhüllen,

denen das betreffende Material löslich ist 20 Danach werden die Tröpfchen unmittelbar unter Erzeu-

Das zur Erzeugung der temporären Kapseln verwen- gung formbeständiger kugelförmiger oder sphäroidaler

dete Maferial kann ein beliebiges nichttoxisches, was- Massen geliert Die Tropfenbildung kann in herköromli-

serlösliches Material sein, das durch Änderung der ioni- eher Weise erfolgen.

sehen Umgebung bzw. der Ionenkonzentration in eine Ein Rohr, das eine wäßrige Lösung mehrwertiger formbeständige Masse umgewandelt werden kann. Das 25 Kationen, beispielsweise l,5%ige CaCh-Lösung, ent-Material enthält ferner zahlreiche leicht ionisierbare an- hält wird mit einem Stopfen versehen, der eine Tropfenionische Gruppen, beispielsweise Carboxylgruppen, die erzeugungseinrichtung trägt Die Tropfenerzeugungsdurch Ausbildung von Salzbindungen mit Polymeren einrichtung weist ein Gehäuse mit einer oberen Lufteinreagieren können, die eine Vielzahl von kationischen laßdüse und einem länglichen Hohlkörper auf, der in Gruppen aufweisen. Wie im folgenden näher erläutert 30 Gleitpassung im Stopfen vorgesehen ist Oben am Geist erlauben derartige Materialien die Abscheidung ei- häuse wird eine 10-ml-Spritze mit einer Schrittpumpe ner permanenten Membran wählbarer Permeabilität im montiert die beispielsweise eine mit PTFE beschichtete Bereich von im wesentlichen nichtporösen Eigenschaf- Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm auften bis zu einer Durchlässigkeit entsprechend einer Mo- weist die längs durch das Gehäuse hindurchgeht Das lekülmasse von einigen Hunderttausend. 35 Innere des Gehäuses ist so konstruiert daß am Ende der

Zu den bevorzugten polyanionischen Polymeren zur Nadel ein konstanter laminarer Luftstrom einwirkt Im Erzeugung der temporären Kapseln gehören saure, praktischen Einsatz wird die Spritze mit der das einzuwasserlösliche natürliche oder synthetische Polysaccha- kapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt und die ridgummi. Zahlreiche derartige Materialien sind han- Schrittpumpe betätigt, die absatzweise Lösungströpfdelsüblich. Sie werden typischerweise aus Pflanzenma- 40 chen aus der Nadelspitze herausdrückt. Jedes Tröpfterialien extrahiert und in vielen Fällen als Lebensmit- chen wird durch den Luftstrom abgerissen und fällt ettelzusätze verwendet Als polyanionisches Polymer wird wa 2,5 cm tief in die CaCb-Lösung, wo es durch Absorpvorzugsweise Natriumalginat verwendet. Alginate im tion von Calciumionen sofort geliert wird. Der Abstand Molekülmassenbereich von 150 000+ sind verwend- zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der bar; aufgrund ihrer molekularen Abmessungen können 45 CaCl₂-Lösung ist hierbei groß genug, damit die Natrisie jedoch üblicherweise die abschließend erzeugten umalginat-Zellsuspension die physikalisch günstigste Kapselmembranen nicht durchdringen. Form, nämlich die Kugelform, annehmen kann, bei der

Zur Herstellung von Mikrokapseln ohne oingeschlos- maximales Volumen bei zugleich minimaler Oberfläche

senes flüssiges Alginat können Alginate mit niedrigerer vorliegt. Die Luft innerhalb des Rohrs strömt durch eine

Molekülmasse, beispielsweise mit Molekülmassen von 50 öffnung im Stopfen aus. Durch diese Verfahrensweise

40 000 bis 80 000, verwendet werden. Aus den am Ende wird das Gel »vernetzt«, und es bilden sich hochviskose,

erhaltenen Kapseln kann das Alginat dann leichter aus formbeständige temporäre Kapseln, die das suspendier-

dem intrakapsulären Volumen durch Diffusion durch te Gewebe und sein Medium enthalten. Die Kapseln

eine Membran ausreichender Porosität entfernt wer- sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und

den. Andere verwendbare polyanionische Gummi sind 55 werden durch Absaugen abgetrennt,

saure Fraktionen von Guargummi, Carageenan, Pectin, In der nächsten Verfahrensstufe wird eine Membran

Tragantgummi und Xanthangummi. auf der Oberfläche der temporären Kapseln durch Ver-

Diese Materialien enthalten glycosidisch gebundene netzung der Oberflächenschichten aufgebracht. Dies

Polysaccharidketten. Ihre freien Säuregruppen liegen in geschieht dadurch, daß die temporären Kapseln, die Po-

vielen Fällen in Form von Alkalimetallsalzen, beispiels- 60 lyanionen, enthalten, einer wäßrigen Lösung eines poly-

weise in der Natriumform, vor. Beim Austausch von kationischen Polymers mit kationischen Gruppen aus-

Alkalimetallionen gegen mehrwertige Ionen wie Calci- gesetzt werden, die mit den anionischen funktionellen

um, Strontium oder Aluminium, werden die Flüssigkeit Gruppen im polyanionischen Polymer reagieren kön-

und die wasserlöslischen Polysaccharidmoleküle unter nen. Polymere, die reaktive kationische Gruppen wie

Bildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels 65 etwa freie Aminogruppen oder Aminogruppen in Kom-

»vernetzt«, das durch Abtrennung der Ionen durch Io- bination mit Iminogruppen aufweisen, sind bevorzugt,

nenaustausch oder mit einen» Trennmittel wieder löslich In diesem Stadium wird der Polysaccharidgummi durch

gemacht werden kann. Obgleich im wesentlichen belie- Wechselwirkung (Entstehung von Salzbindungen) zwi-

sehen den Carboxylgruppen und den Amino- oder Iminogruppen des polykationischen Polymers vernetzt. Die Permeabilität kann vorteilhaft innerhalb bestimmter Grenzen durch Auswahl der Molekülmasse des eingesetzten vernetzenden Polymers sowie durch Variation der Einwirkungsdauer und der Konzentration des Polymers in der Lösung eingestellt werden. Lösungen eines Polymers mit niederer Molekülmasse dringen während einer gegebenen Zeitdauer weiter in die temporären Kapseln ein als Lösungen von Polymeren mit höherer MolekUlmasse. Der Penetrationsgrad des Vernetzungsmittels läßt sich mit der resultierenden Permeabilität korrelieren. Allgemein gilt, daß die Porengröße umso höher ist je höher die Molekülmasse und je geringer die Penetration sind. Längere Einwirkungsdauer und höher konzentrierte Polymerlösungen führen zu einer Verringerung der resultierenden Obergrenze der Membranpermeabilität. Die mittlere Molekülmasse des Polymers stellt jedoch die wichtigste Einflußgröße dar.

Allgemein können Polymere mit einer Molekülmasse im Bereich von 10 000 bis 100 000 oder darüber, je nach der Reaktionsdauer, der Konzentration der Polymerlösung und dem angestrebten Permeabilitätsgrad, eingesetzt werden.

Günstige Reaktionsbedingungen liegen z. B. vor, wenn Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von etwa 35 000 verwendet, die Reaktion unter Rühren 3 min lang durchgeführt und eine physiologische Salzlösung eingesetzt wird, die 0,0167% Polylysin enthält. Unter diesen Bedingungen werden Membranen mit einer Obergrenze der Permeabilität für Molekülmassen von etwa 100 000 erhalten. Allgemein entstehen aus Materialien mit höherer Molekülmasse Membranen, die anschließend im Vergleich zur Verwendung von Materialien mit niedrigerer Molekülmasse schwieriger aufzubrechen sind. Die Ladungsdichte des vernetzenden polykationischen Polymers beeinflußt ebenfalls die Porengröße und die Leichtigkeit des Aufbrechens entsprechender Membranen. Allgemein gilt, daß Materialien mit höherer Ladungsdichte weniger poröse Membranen ergeben, die schwieriger aufzubrechen sind.

Optimale Reaktionsbedingungen, die sich zur Einstellung der Permeabilität in einem gegebenen System eignen, können aufgrund der oben angegebenen Richtlinien leicht empirisch ermittelt werden.

Beispiele für geeignete vernetzende Polymere sind etwa Proteine und Polypeptide natürlichen sowie synthetischen Ursprungs mit freien Aminogruppen oder Amino- und Iminogruppen in Kombination, Polyethylenamine, Polyethylenimine und Polyvinylamine. Polylysin wurde ebenfalls erfolgreich verwendet, und zwar in der D- und L-Form. Proteine wie Polyarginin, Polycitrullin und Polyornithin sind ebenfalls verwendbar. Polymere mit höherer positiver Ladungsdichte, beispielsweise Polyvinylamine, haften stark an den anionischen Gruppen der polyanionischen Moleküle und sind daher schwieriger aufzubrechen.

In diesem Stadium der Einkapselung können Kapseln gewonnen werden, die eine »permanente« semipermeable Membran aufweisen, die eine gelierte Gummilösung, ein mit dem entsprechenden Zelltyp kompatibles Kulturmedium sowie die Zellen umgibt Wenn lediglich eine einfache Aufbewahrung der Zellen in einer Schutzumgebung angestrebt ist müssen keine weiteren Schritte durchgeführt werden. Wenn andererseits der Stofftransport innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch gefördert werden soll, ist es bevorzugt, das Gel wieder zur wasserlöslichen Form zu verflüssigen. Dies kann durch Wiederherstellung der Bedingungen erfolgen, unter denen der Gummi flüssig ist, beispielsweise durch Abtrennung des Calciums oder anderer mehrwertiger Kationen aus dem Gel. Das Medium in der Kapsel kann in einfacher Weise durch Eintauchen der Kapseln in phosphatgepufferte Salzlösung, die Alkalimetallionen und Wasserstoffionen enthält, resolubilisiert werden. Einwertige Ionen werden beim Eintauchen der Kapseln in die Lösung unter Rühren gegen

ίο Calcium oder andere mehrwertige Ionen innerhalb des Gummis ausgetauscht. Zum gleichen Zweck können auch Natriumcitratlösungen verwendet werden, die die zweiwertigen Ionen abtrennen bzw. maskieren. Die Gummimoleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb der Obergrenze der Permeabilität der Membranen können anschließend durch Diffusion aus dem intrakapsulären Volumen abgetrennt werden.

Es kann schließlich auch erwünscht sein, die Kapseln so zu behandeln, daß freie Aminogruppen, die sonst zu einer Verklumpungstendenz der Kapseln führen würden, zu binden. Dies kann beispielsweise durch Eintauchen der Kapseln in eine verdünnte Lösung von Natriumalginat geschehen.
Aus der obigen Erläuterung geht hervor, daß bei der Membranherstellung weder scharfe Reagentien noch extreme Temperaturen oder andere für Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen schädliche Bedingungen angewandt werden müssen. Daher können auch sehr empfindliche Zellen wie Hepatocyten, Leukocyten, Fibroblasten und Lymphoblasten sowie Zellen verschiedener endocriner Gewebe von Säugetieren und Menschen ohne Schwierigkeiten eingekapselt werden. Zellen mikrobiologischen Ursprungs, wie etwa Hefen, Schimmelpilze und Bakterien, die in ungünstiger Umgebung besser überleben können, sowie inerte Reagentien, Feststoffe oder biologisch aktive Materialien können nach diesem Verfahren natürlich ebenfalls ohne Schädigung eingekapselt werden.
Die eingekapselten Zellen der oben erläuterten Art können in Medien zur Aufbewahrung oder in Kulturmedien suspendiert werden und bleiben frei von bakterieller Infektion. Beim Suspendieren in einem Kulturmedium unterliegen Zellen, bei denen In-vitro-Mitose auftritt der Mitose auch in den Kapseln. Der normale, in vitro stattfindende Metabolismus wird auch in diesem Fall fortgesetzt wenn die für die Stoffwechselprozesse erforderlichen Faktoren ausreichend niedere Molekülmasse besitzen, daß sie die Kapselmembran durchdringen können, oder diese Substanzen zusammen mit den

so Zellen eingekapselt wurden. Die Stoffwechselprodukte der Zellen durchdringen die Membran, wenn ihre Molekülmasse unterhalb der Obergrenze der Permeabilität liegt und sammeln sich im Medium an. Die eingekapselten Zellen können nach Wunsch gelagert, versandt oder

kultiviert werden und lassen sich nach der im folgenden erläuterten erfindungsgemäßen Verfahrensweise ohne Schädigung durch selektives Aufbrechen der Membranen wieder aus ihrer Schutzumhüllung freisetzen.
Das eingekapselte Material kann erfindungsgemäß in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung handelsüblicher Reagentien mit Eigenschaften, die die eingekapselten Zellen nicht nachteilig beeinflussen, freigesetzt werden.
Die Kapseln werden zunächst von dem Medium, in dem sie suspendiert sind, abgetrennt zur Entfernung von Verunreinigungen gründlich gewaschen und anschließend unter Rühren in einer separaten oder vorzugsweise gemischten Lösung vom mehrwertigen Kat-

ionen wie Calciumionen oder anderen einatomigen Ionen, auch mit niederer Molekülmasse, und einem polyanionischen Trennpolymer (Stripping-Polymer) mit zahlreichen anionischen Gruppen wie etwa Polysulfonsäuregruppen dispergiert. Polymere mit Polyphosphorsäure- oder Polyacrylsäure-Gruppen sind ebenfalls verwendbar. Zum Aufbrechen von Membranen, die Zellen enthalten, ist Heparin, das ein natürliches sulfoniertes Polysaccharid darstellt, bevorzugt.

Die anionische Ladung des eingesetzten Trennpolymers muß ausreichend sein, um die Salzbrücken aufzubrechen. Die anionische Ladungsdichte kann daher gleich oder vorzugsweise größer sein als die Ladungsdichte des inneren polyanionischen Polymers (beispielsweise des Gummis), das ursprünglich zur Membranerzeugung verwendet wurde.

Die Molekülmasse des Trennpolymers sollte mindestens mit dem des zur Membranerzeugung verwendeten inneren polykationischen Polymers vergleichbar und vorzugsweise größer sein. Innerhalb der Suspension konkurrieren die Calciumionen mit dem inneren polykationischen Polymer als Membranbestandteil um die anionischen Stellen am polyanionischen Polymer. Gleichzeitig konkurriert das in der Lösung gelöste Trennpolymer mit dem polyanionischen Gummi in der Membran um die kationischen Stellen am polykationischen Polymer. Dies führt zu einem in Wasser dispergierbaren oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex beispielsweise von Polylysin mit dem polyanionischen Polymer sowie zur Assoziation der Kationen mit den Gelmolekülen.

Durch diesen Verfahrensschritt wird die Membran für die anschließende Umsetzung mit einem Trennmittel zugänglich, die das Aufbrechen der Membranen durch Aufnahme zwei- oder dreiwertiger Ionen aus dem Gel vervollständigt. Typischerweise können Kapselmembranreste, die im Medium verbleiben, soweit sie überhaupt vorhanden sind, leicht von den Zellen abgetrennt werden.

Eine üblicherweise bevorzugte Lösung für den ersten Schritt des selektiven Aufbrechens der Membranen enthält 1,1% (M/V) Calciumchlorid und 500 bis 1500 Einheiten Heparin/ml Lösung. Diese Lösung wird mit einem solchen Volumen an Mikrokapseln versetzt, daß sie etwa 20 bis 30% des Gesamtvolumens der Suspension einnehmen. Calciumchlorid und Heparin sind bevorzugt, wenn Membranen von Zellen enthaltenden Kapseln aufgebrochen werden sollen, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind und hierdurch die Möglichkeit von Zellschädigungen auf ein Minimum zurückgedrängt wird. Gemische von Aluminiumsalzen oder anderen mehrwertigen Kationen (jedoch nicht Mg⁺ +-Ionen) können ebenfalls zusammen mit dem Polysulfonsäuresalz oder einem anderen Salz der oben angegebenen Art eingesetzt werden.

Die Konzentration der Ionen und des anionischen Polymers in der in dieser Verfahrensstufe eingesetzten Lösung kann allgemein in einem weiten Bereich variieren. Optimale Konzentrationen können leicht empirisch ermittelt werden. Für den jeweiligen Ansatz der eingekapselten Zellen ist dabei die niedrigste noch geeignete Konzentration bevorzugt

Als Trennmittel zur Durchführung des selektiven Aufbrechens der Membranen wird üblicherweise bevorzugt Natriumcitrat verwendet, jedoch können auch andere Alkalimetallcitrate und EDTA-Alkalisalze Verwendung finden. Bei Anwendung von Natriumcitrat beträgt die optimale Konzentration größenordnungsmäßig 55 mM. Wenn die aufzubrechenden Kapselmembranen lebensfähige Gewebe enthalten, wird das Citrat vorzugsweise in isotonischer Salzlösung gelöst, um die Zellschädigung möglichst weitgehend zurückzudrängen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Kapselerzeugung

Beispiel 1
Einkapselung von Pancreasgewebe

Aus Rattenpancreas gewonnene Langerhans'sche Inseln werden zu einer vollständigen Gewebekultur (CMRL-1969, Connaught Laboratories, Toronto, Canada) in einer Konzentration von etwa 10³ Stück/m! zugegeben. Die Gewebekultur enthält sämtliche zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Langerhans'schen Inseln erforderlichen Nährstoffe sowie die von den Zellen zur Hormonerzeugung verwendeten Aminosäuren. 0,4 ml einer Suspension von Langerhans'schen Inseln einer Konzentration von etwa 10⁵ Stück/ml wird anschließend zu 0,5 ml einer l,2%igen Lösung von Natriumalginat in physiologischer Salzlösung zugegeben.

Anschließend wird eine l,5%ige Calciumchloridlösung angewandt, um die Tröpfchen von größenordnungsmäßig 300—400 μιτι Durchmesser zu gelieren. Nach Abtrennen der überstehenden Lösung durch Absaugen werden die gelierten Tröpfchen in ein Becherglas übertragen, das 15 ml einer Lösung enthält, die aus 1 Teil einer 2%igen Pufferlösung von 2-(Cydohexylamino)-ethansulfonsäure in 0,6%iger NaCl-Lösung (isotonisch, pH = 8,2) und 20 Teilen l%iger Calciumchloridlösung besteht. Nach 3 min Eintauchen werden die Kapseln zweimal in 1 %iger CaCl₂-Lösung gewaschen.

Die Kapseln werden danach in 32 ml einer Lösung eingetragen, die Vso einer l%igen Polylysinlösung (M 35 000) in physiologischer Salzlösung enthält. Nach 3 min wird die Polylysinlösung dekantiert Die Kapseln werden mit 1% CaCb-Lösung gewaschen und wahlweise 3 min in einer Lösung von Polyethylenimin (M 40 000—60 000) resuspendiert, die durch Verdünnung einer 3,3%igen Stammlösung von Polyethylenimin in Morpholinopropansulfonsäure-Puffer (0,2 M, pH = 6) mit einer ausreichenden Menge 1 %iger CaCl₂-Lösung zur Erzielung einer resultierenden Polymerkonzentration von 0,12% hergestellt wurde. Die resultierenden Kapseln mit »permanenten« semipermeablen Membranen werden anschließend zweimal mit l%iger CaCl₂-Lösung und zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann mit 10 ml einer 0,12%igen Alginsäurelösung gemischt

Die Kapseln klumpen nicht zusammen; bei vielen Kapseln ist sichtbar, daß sie Langerhans'sche Inseln enthalten. Das Gel im Inneren der Kapseln wird durch 5 min Eintauchen der Kapseln in ein Gemisch aus Salzlösung und Citratpuffer (pH = 7,4) wieder verflüssigt Schließlich werden die Kapseln in CMLR- 1969-Medium suspendiert

Bei der mikroskopischen Untersuchung ergibt sich, daß diese Kapseln eine dünne Membran besitzen, die eine Insel umgibt innerhalb deren einzelne Zellen sichtbar sind. Moleküle mit einer Molekülmasse bis zu etwa 100 000 können die Membranen durchdringen. Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe und Plasmakomponen-

ten, die im Kulturmedium eingesetzt werden, beispielsweise Fetalkälberserum-Komponenten mit niederer Molekülmasse, können daher zu den Langerhans'schen Inseln gelangen, wobei zugleich eine Ausscheidung des Insulins möglich ist.

Beispiel 2
Einkapselung von Hepatocyten

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle der 0,4 ml Suspension von Langerhans'schen Inseln nunmehr eine Leberzellensuspension mit 10⁵ Zellen/ml verwendet wird, deren Lebensfähigkeit nach dem Farbstoff-Ausschlußverfahren (Trypanblau-Ausschluß) sowie ihre festgestellte Fähigkeit zur kontinuierlichen Harnstoffproduktion nachgewiesen war.

Es ist bekannt, daß Lebergewebe in vitro Toxine aus der Umgebung aufzunehmen vermag. Toxine, die eine ausreichend niedere Molekülmasse besitzen, um durch die semipermeablen Membranen hindurchgehen zu können, werden entsprechend durch die Zellen entgiftet.

Beispiel 3
Einkapselung von Aktivkohle

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle der 0,4 ml der Gewebesuspension gekörnte Aktivkohle direkt in der Natriumalginatlösung suspendiert und als Vernetzungsmittel Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von 35 000 verwendet wird. Wenn die Aktivkohlepartikel kleiner sind als der kleinste Innendurchmesser der zur Tröpfchenerzeugung verwendeten Kapillare, resultiert Aktivkohle mit großer Oberfläche, die von semipermeablen Membranen umgeben ist. Hierdurch wird in wirksamer Weise das Auftreten von Aktivkohle-Bruchstücken, Abrieb oder Staub vermieden, wobei das Produkt zur Absorption von Materialien eines beliebigen, vorgewählten Molekülmassenbereichs aus der durch die Kapseln hindurchgetretenen Flüssigkeit herangezogen werden kann.

Beispiel 4
Einkapselung von Human-Fibroblasten

Menschliche Fibroblasten, die durch 5 min Behandlung von Vorhautgewebe mit Trypsin und EDTA bei 37° C in bekannter Weise erhalten sind, werden in einem vollständigen Kulturmedium (CMLR-1969) unter Zusatz von 40 Volum-gereinigtem Fetal-Kälberserum 0,8% Natriumalginat und 200 mg/ml gereinigtem Collagen aus Kälberhaut suspendiert Die Konzentration der Zellsuspension beträgt etwa 1,5 · 10⁷ Zellen/mL Die temporären Alginatkapseln werden wie oben hergestellt Auf den Oberflächenschichten der Kapseln werden dann durch 3 min langes Suspendieren der Kapsem in einer 0,005%igen (G/V) wäßrigen Lösung von PoIy-L-lysin (M 43 000) semipermeable Membranen abgeschieden.

Die resultierenden Kapseln werden im Kulturmedium (CMLR-1969) mit einem Zusatz von 10% Fetal-Kälberserum suspendiert Die obigen Schritte werden sämtlich bei 37° C durchgeführt Nach Inkubation bei der gleichen Temperatur ergibt sich bei mikroskopischer Untersuchung, daß die Kapseln Fibroblasten enthalten, die der Mitose unterlagen und innerhalb der Mikrokapseln ihre dreidimensionale Fibroblastenmorphologie aufweisen.

Selektives Aufbrechen von Membranen gemäß
der Erfindung

to Beispiel 5

Die Mikrokapseln der Beispiele 1 bis 4 können zum selektiven Aufbrechen der Kapselmembranen ohne Schädigung des eingekapselten Kernmaterials wie folgt behandelt werden.

10 ml-Portionen der etwa 500 bis 5000 Kapseln/ml enthaltenden Mikrokapselsuspensionen werden absitzen gelassen; anschließend wird das Suspensionsmedium abgesaugt Die Kapseln werden zweimal mit Salzlösung gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden anschließend mit einer aliquoten Menge von 3,0 ml Salzlösung gewaschen, die Heparin in verschiedenen Konzentrationen, die im folgenden angegeben sind, sowie 1,1% (G/V) CaCk enthält Die Kapseln mit dem darin eingeschlossenen Alginat besitzen nach Abschluß dieses Verfahrensschritts einen gelförmigen, formbeständigen Innenkern. Die Suspension wird 10 min bei 37° C gerührt; nach Absitzenlassen der Kapseln wird der Überstand abgesaugt, worauf die Kapseln zweimal mit 3,0 ml 0,15 M NaCl-Lösung gewaschen werden. Nach Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit 2,0 ml einer Mischlösung gemischt, die gleiche Volumina einer HOmM Natriumcitratlösung und einer 0,15 M NaCl-Lösung enthält (pH = 7,4).

Die Kapselmembranen, die mit 1000 Einheiten/ml Heparin behandelt und 1 min in der NaCl-Natriumcitrat-Lösung verwirbelt worden waren, waren vollständig desintegriert Das gleiche Ergebnis wird mit Kapseln erzielt die 2 min mit 2000 Einheiten/ml Heparin behandelt und anschließend 15—30 s von Hand verwirbelt werden. Niedrigere Konzentrationen an Heparin sind bevorzugt, da hierdurch die Möglichkeit von Zellschädigungen verringert wird.
Nach Auflösung der Membranen können etwa vorliegende Membranreste durch Absaugen und Waschen abgetrennt werden. Nach Resuspendieren im Kulturmedium können die freigesetzten Zellen durch Tryptanblau-Ausschluß getestet werden. Hierbei ergibt sich, daß sie in gesundem, lebensfähigem Zustand sind und relativ wenige Zellen Farbstoff aufnehmen.

Beispiel 6

Nach Beispiel 3 hergestellte Kapseln werden nach dem Waschen 6 min unter Rühren mit 3,0 ml einer Lösung behandelt die 1000 Einheiten/ml Heparin und 1,0% AlCl₃ enthält Nach Absaugen des Überstands wird das Kemmaterial durch 30 bis 90 s Verwirbeln der Kapseln in einer 0,1 M Natriumcitratlösung freigesetzt

Beispiel 7

Es wird wie in Beispiel 6 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle von Natriumeitrat 0,10 M EDTA-Na bei pH 7,0 verwendet wird. Hierdurch wird ein rasches Aufbrechen der Kapselmembranen erzielt

1 I	IiY g:	32 09 045 13	14
Ί	r	Beispiel 8
ι t ν t	U	Nach Beispiel 3 hergestellte Kapseln werden nach dem Waschen mit 3,0 ml einer wäßrigen Lösung behan delt, die 10 mg/ml Polyvinylsulfat (M etwa 50 000) und 5 1% CaCl₂ enthält. Die Nachbehandlung mit 0,10 M Na- triumcitratlösung führt zu einer im wesentlichen voll ständigen Auflösung der Kapseln.
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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum selektiven Aufbrechen von Mikrokapseln mit permeablen Membranen auf der Basis einer Matrix aus einem polykationischen Polymer und einem polyanionischen Polymer, die über Salzbrücken zwischen den anionischen und kationischen Gruppen aneinander gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß