JPS6379587A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、細胞培養用基材に関する。

〔従来の技術および問題点〕

動物等の細胞培養（ｍ織培養を含む）は、Ｍ胞・組織等
の生化学的研究や医療的研究における重要な技術でおる
。

各種臓器の中で肝臓は惚めて多槙多様な特異機能を有す
る臓器であシ、生体の恒常性維持に重要な役割を担りて
いる。これらの機能はいずれも肝臓を構成する６種類の
細胞のうち約７０％を占める肝実細胞によりて行われて
いる。このことから計時異機能の生化学的研究や、増殖
再生、薬物の代謝、毒性試験等の応用面への研究が盛ん
に行われてきている。しかし全動物レベルでは系が複雑
すぎて解析が困難であるため、肝機能を有する肝細胞レ
ベルの生体外（ｉｎマ１ｔｒｏ）ｖｒ究法が待望されて
いる。

一方、近年高機能性を得るため細胞を組み込んだハイブ
リッド型人工臓器が注目を集めている。

現在実用化されている人工腎臓や人工心肺とは異な夛、
肝臓においては、その代謝機能が多種多様であるため、
肝細胞そのものを利用したハイブリッド屋人工肝臓に対
する期待は大きい。

いずれの場合においても、その最大のポイントは、肝細
胞をその機能を保持させたままいかに長期間培養させる
かにある。

肝機能を有する培養肝細胞体の樹立をめざす努力はかな
υ古くから行われているが、いずれの肝細胞株も生体内
（ｉｎマｉｖｏ　）の機能を維持しておらイ〜 ず、現在ではこれにズわる方法として、初代培養肝細胞
が広く用いられている。しかし、現在のところ肝細胞の
培誉法は生存性、増殖性の向上などまだ多くの問題を残
している。これらの問題を改咎する肝細胞の培養条件と
して、血？＃、ホルモン。

成長因子等の培養液成分や酸素の供給状態も重要である
が、肝細胞のような組鎗細胞はなんらかの基材に接着す
ることが生存性の決めてとなっていることから、肝細胞
が接着する基質材料も極めて重要な因子となっている。

このような基材として従来最も良く知られているものは
コラーゲンでめる力机コラーゲン自体が生体成分である
ため高価であシ、また製品の均一性、劣化、ゲルの製造
法等によシ基材としては多くの問題点を有している。ま
た、現在市販されている細胞培養用シャーレ（ポリスチ
レンシャーレの表面を親水化処理したもの）は、上記の
ような欠点は克服したものの、肝実質細胞の生存率は悪
く、５〜７日で５０％以上の細胞が死んでしまう。

また、これら従来の基材を用いて細胞を培養する際、仔
牛血清を添加しないと細胞の生存率は極度に低下してし
まう、このような基材では慢性毒性試験はもちろんのこ
と、ハイブリッド型人工肝臓の開発に関しては全く不適
切な基材と考えられ。

さらに肝実質細胞の長期培養に適した基材のぬ現が待た
れている由縁である。

細胞の接着機構はまだ殆ど解明されていないが。

大別すると細胞表面に存在するレセプター等による特異
的な相互作用が介在する場合と、一般的な化学吸着や物
理吸着による非特異的な相互作用が、介在する場合があ
る。この後者においては、細胞と基材表面との間には種
々の２次的な相互作用力（例えば、静電相互作用力、水
素結合力、疎水性相互作用力％ファン・デア・ワールス
カ等）が働いておシ、基材の設計にはこのような相互作
用力を期制する考え方が必要である。このような観点か
ら基材表面が必要とする条件を挙げると、親水性と疎水
性の適度なバランス、表面荷電の正負とその分布状態、
化学的、物理的な表面微Ｍｉ構造等である。

この発明は上記背景に基づいてなされたものであ）、比
較的容易に基材表面の構造を制御し、肝細胞等の細胞と
の非ｔｈ異的相互作用力の規制によシ、肝実質細胞等の
細胞の長期初代培養用基材を提供することを目的とする
。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明の細胞培養用基材は、カチオンポリマーと７ニ
オンボリマーとを該カチオンポリマー中のカチオン席と
該アニオンポリマー中の７ニオン席とのｔ１度比（〔カ
チオン席）／〔アニオン席〕）が０．５〜１．５となる
ように配合してなシ、該カナオンポリマーとアーオンボ
リ／δ間の高分子錯体を含むことを特徴とするものであ
る。

上記基材の表面状態は、成分ポリマーであるカチオンポ
リマーやアニオンポリマーの構造の選択。

１合条件の選択（例えば、混合比等）によ少容易に制御
することができる。

カチオンポリマーとしては、第４級窒素を主鎖または側
鎖に有するポリマーが生体でるり１例えば下記一般式（
１）で示されるカチオンポリマーなどのいわゆる累積型
カチオンポリマーおよび例えば下記一般式（２）で示さ
れるカチオンポリマーなどの側鎖型カチオンポリマーが
るる。

（１）累核型カナオンボリマ一二 （式中、Ｒ，、Ｒ４は炭素数１０以下のアルキレン基、
アラルキレン基、アリレン基、ピペラジン環（Ｒ１ある
い―Ｒ４が隣接した２個の窒素原子および各々の窒素原
子に結合したＲ、、Ｒ，、Ｒ，あるいはＲ・と−緒にな
って、ピペラジン環を形成したもの）、エーテル結合、
エステル結合らるいはアミド結合を含む直鎖アルキレン
基、および脂環基の群から選ばれる基ｓ　Ｒ１ｔ　ＲＨ
ｔ　Ｒ１＊　ＲＨは炭素数３以下のアルキル基、アルキ
ルアルコール基。

およびベンジルアルキル基の群から選ばれる基であシ、
Ｘは対イオン、ｎは厘合夏（例えば５０以上）を示す）
。

（２）側鎖型力チオンポリマｍ： ＲＩ （Ｒ１は水素、メチル基、エチル基の群から選ばれる基
、亀はピリジンＭ（Ｒｓ−Ｒａと一緒になってピリジン
環を形成したもの）、ベンジル基、エステル結合、エー
テル結合あるいはアミド結合を含む直鎖アルキレン基、
および脂環基の群から選ばれる基ｋＲ１１Ｒ４およびＲ
，は炭素数３以下のアルキル基、アルキルアルコール基
、およびベンジルアルキル基の群から選ばれる基でめシ
、Ｘ　は対イオン、ｎは重合度（例えは５０以上）を示
す）。

カチオンポリマーの具体例を挙けると、４級化ポリエチ
レンイミン、ポリ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチ
ル−アルキレン−ｐ−キシリレンジアンモニウムジクロ
ライド）、ポリ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチ
ル−アルキレン−ジアンモニウムジクロ２イド）、ポリ
（Ｎ、Ｎ−ジメチルーヒドロキシグロビルアンモニウム
クロライド）、ポリ（ビニルペンジルトリメチルアンモ
ウニラムクロライド）。

ポリ（２−ヒドロキシ−３−メタクロイルオキシプロピ
ルトリメチルアンモニウムクロライド）。

ポリ（２−メタクロイルオ中ジエチルトリメチルアンモ
ニウムクロライド）、ポリ（グリシジルトリメチルアン
モニウムクロライド）、ポリビニルピリジウムクロライ
ド、ポリビニルイミダゾリニウムクロライド、ポリ　〔
（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）メ
チレン−１，４−フェニレンメチレンジクロライド〕、
ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムプロマイト
）。

ポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロライド）等で
ある。

アニオンポリマーとしては、カルボ／酸系ポリマーおよ
びスルホン酸系ポリマーを含む。その例を挙げると、ポ
リアクリル酸、ポリメタクリール酸。

ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、これらポリマーを構
成する単量体のいずれか２捌以上の共重合体、またはそ
れら単量体と該単量体のカルボキシル基にエステル結合
もしくはアミド結合によりて結合した炭素数１８以下の
アルキル基もしくはアルキレン基を有するカルボン酸誘
導体（カルボン酸アル中ルもしくはアルキレンエステル
、またはカルボン酸アルキルもしくはアルキレンアミド
）との共重合体、カルボキシメチルセルロース、カルボ
キシメチルスターチ、ポリグルタミン酸、ポリアスパラ
ギン酸、アルギン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチ
レンスルホンｒＲ，多糖類のスルホン酸化物例えばヘパ
リン、リグニンスルホン酸。

、Ｉ−’　ＩＪビニルアルコールスルホン［等ｆ６る。

上記カチオンポリマーとアニオンポリマーとをカチオン
ポリマー中のカチオン席とアニオンポリマー中のアニオ
ン席との譲度比（〔カチオン席〕／〔アニオン席〕）が
０．５〜１．５の範囲（この範囲を逸脱すると、高分子
錯体を形成しにくくな凱細胞接着率が低下する）内、よ
り好ましくは０．７５〜１．２５　　の範囲内で水沼液
中で反応させ（溶液のＰＨｓイオン強反、温度等は、こ
れらの反応が比較的活性であるので特に制限はしない）
ｈ高分子電解質錯体ゲル（細胞培養用基材）を得る。

これをシャーレに塗布して細胞培養用基材を提供するこ
とができる。

なお、この発明の基材を用いて細胞を培養する際の培地
としてはウィリアムのＥ培地の他ＭＥＭ培地を用いるこ
とができる。

なお、実験として肝実質細胞を雄ラットの肝臓よシセグ
レン（Ｓｅｇｌｅｎ　）　　の方法に準じ分離精製した
（開腹後、無カルシウムの前潅流用緩２＠液で肝臓内血
液を脱血しながら肝臓を摘出し、脱血後。

コラゲナーゼ酵素液（トリズシンインヒピターを含む）
にて潅流をおこない、ろ過、遠心によシ得た）。このよ
うにして得た肝実質細胞をウィリアム（ｗ１１１五ａｍ
）のＥ培地（５Ｘ１０　Ｍ胞／ｍ）ｔＰＨ＝す、４．抗
生物質、ホルモンを含む）に懸濁させ。

前述した培養用基材として高分子を解質錯体ゲルを塗布
したシャーレに深さ約２〜５鵡になるように注入し、さ
らに必要であれば分生血清を１０％添加した。この細胞
を注入したシャーレを、３８υ、混合ガス（５％Ｃｏ、
、　４５％ｏ、、　ｓｏ％Ｎ、）下にて数日間培養した
。肝細胞の生存性は細胞の接着率よシ評価した。すなわ
ち、従来肝細胞の様な組繊細胞は細胞が死ぬと浮遊して
くる。換言すれば接層している細胞がそく主存している
細胞と考えてよいとされている。具体的には、最初にシ
ャーレ中に注入した細胞の内、生存している細胞の割合
をトリバンブルー染色法により確認し、？：、れを１０
０チとする。所定時間培養後、培養液を更新すると共に
、古い培養液中に浮遊している細胞数をカウントシ、接
着率を計算した。

これらの実験の結果、ブランク実験として同条件下で行
った市販の細胞培養用シャーレ、コラーゲン・コーティ
ング基材等が培養２日後において接Ｍ率が７０〜８０チ
であったのに対し１本特許請求の囲で示される高分子電
解質錯体ゲルは全てこれ以上の接Ｎ率を示した。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を詳細に説明する。

実施例　１ ポリカチオンであるポリ〔（ジメチルイミニオ）エチレ
ン（ジメチルイミニオ）メチレン−１゜４−フェニレン
メチレンジクロライド〕トホ“リアニオンであるアクリ
ル飯含盆約６０モル％のアクリル酸／２−エチルへキシ
ルアクリレートのランダム共重合体を脱水と滅菌をかね
、１００℃で減圧下−昼夜乾燥した。とれらのポリマー
濃度がそれぞれカチオン席、アニオン席として０．　Ｉ
　Ｍとなるように滅菌水に俗解しく具体的にはポリカチ
オンｏ、ｘ５ｇ６るいはポリアニオン０，２１　ｇ　ｅ
それぞれ１０　ｃｏ　　の滅菌水に溶解せしめる）、こ
れらの溶液をシャーレ中にて等容−挙に混合し、尚分子
電屏質錯体ゲルを形成させ６．この上泣み液ケ捨て、ｐ
Ｈ７，４の生理的食埴水で３回洗浄、畝１水で１回洗浄
を行い、さらに８０゛Ｃにて６時間アニーリングしてゲ
ルを安定化させ、コーティングを完了した。雄２ツ）（
１５０ｇａ度）の肝臓よシセグレンの方法に準じ分離鞘
裂した（開腹後。

無カルシウムの前潅流用緩衝液で肝臓内血液を脱血しな
がら肝臓を摘出し、脱血後、コラゲナーゼ酵素液（トリ
プシンインヒビターを含む）にて潅流を行い、ろ過、遠
心によシ得た）肝実質細胞をウィリアムのＥ培地（５Ｘ
１０　　＃Ｉ胞／ｍ）、ｐＨ＝７．４、抗生物質、ホル
モンを含む）に懸濁させ、前述した培養用基材として高
分子電解質錯体ゲルを塗布したシャーレに深さ約２鵬に
なるように注入し。

さらに修生血清を１０％添加した。？−（２）細胞を注
入したシャーレを、３８℃、混合ガス（５％ＣＯ！。

４５％Ｏ，，５０％Ｎり　　下にて４日間まで培養した
。

なお、比較として、アテロコラーゲンおよび市販の培養
用シャーレを用いて同様に培養をおこなっ九、これらの
結果を第１図に示す０図中、線Ａは本実施例のもの％線
Ｂはアテロコラーゲンのもの。

および線Ｃは市販の培養用シャーレのものである。

実施例　２ 上記実施例１と同様のポリカチオンとポリアニオンを用
い、混合時、ポリカチオン溶液１容に対してポリアニオ
ン溶液１．２５容で上記実施例１と同様な方法にて高分
子電解質錯体ゲルをコーティングした（この場合は、ゲ
ル中にポリアニオンが過剰となっておシ、全体として負
荷電の状態になっている）、この高分子電解３ｉ［錯体
ゲル上で上記実施例１と同様な方法で肝夾Ｘ細胞を２日
間培養した結果、肝実質細胞の接着率は９０％でめった
。

実施例　３ 上記実施例１と同様のポリカチオンを用い。

ポリアニオンとしてアクリル酸含量７０％のアクリル酸
／ラウリルアクリレートのランダム共重合体を用い、こ
れらの等容を上記実施例１と同様の方法によシ混合する
ことによって得られた高分子電解質錯体ゲルを基材とし
、上記実施例１と同様な方法で肝実質細胞を２日間培養
した。その結果、肝実質細胞の接着率は９５％でおった
。

実施例　４〜９ 下記表１に示すポリアニオンとポリカチオンを用い１表
２に示す条件で上記実施例１と同様の方法に従って反応
を行い、その結果１表２に示すような肝実質細胞の接着
率が得られた。

表　　　１ 実施例　　　　　ポリ７ニオン　　　　　　ポリカチオ
ン７　　　同上　　　　　同上 表　　　２ ４　　　　　１．０　　　　　　　　　　有　　　３　
　　８２５　　　　　　１０　　　　　　　　　　　有
　　　２　　　７５６　　　　　０．５　　　　　　　
　　　有　　　４　　　６７７　　　　　　１．２５　
　　　　　　　　　　無　　　２　　８０９　　　　　
１．０　　　　　　　　　　　　有　　　４　　　６３
実施例　１０ 修生血清を添加しなかった以外は実施例１の操作を繰り
返した。比較として市販の培養剤シャは市販の培養用シ
ャーレのものを示す。この結果゛から、修生血清を添加
しないと市販の培養剤シャーレにあっては接着率が大幅
に低下するがこの発明のものでは接着率に大きな変化は
ないことがわかる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によれば比較的長時間の培
養をおこない、また修生血清を添加しなくても細胞の接
着率（生存率）が低下しない細胞培養用基材が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれこの発明の細胞培養用
基材を用いて細胞を培養したときの細胞接着率の経時変
化を比＆ガとともに示すグラフ図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 カチオンポリマーとアニオンポリマーとを該カチオンポ
   リマー中のカチオン席と該アニオンポリマー中のアニオ
   ン席との濃度比（〔カチオン席〕／〔アニオン席〕）が
   ０．５〜１．５となるように配合してなり、該カチオン
   ポリマーとアニオンポリマー間の高分子錯体を含むこと
   を特徴とする細胞培養用基材。