DE69626979T2

DE69626979T2 - Versorgungsmatrix auf kollagen-basis

Info

Publication number: DE69626979T2
Application number: DE69626979T
Authority: DE
Inventors: Shu-Tung Li
Original assignee: Regen Biologics Inc
Current assignee: Regen Biologics Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: CA2223427A1; EP0831867A1; JPH11506727A; EP0831867A4; AU5799296A; CA2223427C; WO1996039159A1; US5677284A; DE69626979D1; AU712098B2; EP0831867B1

Description

Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verabreichung therapeutischer Mittel.
Im Allgemeinen kann ein wasserlöslicher Wirkstoff leicht in eine wasserlösliche/quellbare Kollagen-Transportsystem- oder -depot-Matrix eingearbeitet werden. Dies kann erreicht werden, indem man den wasserlöslichen Wirkstoff mit einer Kollagenzubereitung mischt, wobei der Wirkstoff mit Kollagen co-präzipitiert wird, so dass der Wirkstoff mit Kollagenfasern eingeschlossen wird. Wegen der Vielseitigkeit von Kollagen als ein Transportsystern- oder -depot-Vehikel, besonders von faserbildenden Kollagenen, wie etwa Kollagen vom Typ 1, können viele biologisch aktive Stoffe, einschließlich lebender Zellen, auf eine kontrollierbare Art und Weise in die Kollagenmatrix eingearbeitet werden.
Die folgenden Dokumente offenbaren Kollagen, das vernetzt oder anderweitig chemisch modifiziert wurde: Singh et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Baccate. Mater., 20 (1993), 107–408; Singh et al., J. Control. Red., 35 (1995) 165–179; U.S. Patent Nr. 4, 164, 559 an Miyata et al.; U.S. Patent Nr. 4, 925, 677 an Feijen et al.; U.S. Patent Nr. 5, 041, 292 an Feijen et al.; U.S. Patent Nr: 5, 332, 802 an Kelman et al; und EP 671, 165.
Trotz der nützlichen Eigenschaften von Kollagen für Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Anwendungen sind Verfahren, um Wirkstoffe unter Verwendung unlöslicher Kollagenteilchen-Matrizes effektiver und effizienter zu transportieren oder zu verabreichen, noch zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis, umfassend Kollagenteilchen, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis, umfassend Kollagenteilchen, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist.
Die Matrix schließt Kollagenteilchen (z. B. hergestellt aus Kollagen vom Typ 1) ein, wobei jedes einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. pH 6,5 – 7,8) eine negative Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen (bevorzugt –100 mol/mol Kollagen bis –300 mol/mol Kollagen) oder eine positive Nettoladungsdichte zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen (bevorzugt + 50 mol/mol Kollagen bis +200 mol/mol Kollagen; und besonders bevorzugt +100 mol/mol Kollagen bis +160 mol/mol Kollagen) aufweist. Der Durchmesser eines in dieser Offenbarung genannten Kollagenteilchen bezieht sich auf die größte Abmessung des Teilchens, nachdem es luftgetrocknet, gefriergetrocknet oder unter Vakuum getrocknet wurde (d. h. unter den in Beispiel 1, Herstellung von Kollagenteilchen, E. und F., unten dargestellten oder dazu äquivalenten Bedingungen). Es ist zu beachten, dass der hier genannte Wert der Ladungsdichte eines Kollagenteilchens eine Durchschnittszahl darstellt, die auf Basis einer in Beispiel 1, Änderung der Nettoladungsdichte auf –40 – –70 mol/mol, unten dargestellten Formel berechnet wurde.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenteilchen für eine Kollagen-Transportsystem- oder -depot-Matrix. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenteilchen für eine Kollagen-Transportsystem- oder -depot-Matrix, bei dem man eine Kollagenzubereitung unter Bildung von Teilchen fragmentiert; und die Teilchen chemisch so modifiziert, dass jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist. Das Verfahren umfasst die Schritte, dass man zunächst eine Kollagenzubereitung (z. B. reines oder im wesentlichen reines, Kollagen, z. B. ⩾ 90 Gewichts % Kollagen des Trockengewichts von gereinigtem Material, wie durch eine Analyse des Hydroxyprolingehalts des gereinigten Kollagenmaterials aufgezeigt) unter Bildung von Kollagenteilchen fragmentiert (z. B. durch Mahlen oder Schneiden); und dann die Teilchen chemisch so modifiziert (z. B. Desaminierung, Acetylierung, Succinylierung, Desguanidinierung, Methylierung oder eine Kombination. davon), dass jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. pH 6,5 – 7,8) eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist. Es ist wünschenswert, dass entweder vor oder nach dem Modifizierungsschritt nur Teilchen mit Durchmessern zwischen 40 μm und 450 μm ausgewählt werden, z. B. durch Sieben.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung eines pastenartigen Materials, das Kollagenteilchen umfasst, von denen jedes einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in wässriger Lösung bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. pH 6,5 – 7,8) eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist. Von diesem Aspekt aus betrachtet stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Kollagenteilchen umfassenden pastenartigen Materials bereit, bei dem man die Kollagenteilchen, einen Wirkstoff und eine wässrige Lösung unter Bildung des pastenartigen Materials mischt, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mol Kollagen und 250 mol/mol Kollagen aufweist. Von noch einem weiteren Aspekt aus betrachtet stellt die Erfindung ein durch dieses Verfahren erhältliches pastenartiges Material zur Verwendung als Arzneimittel bereit. Das Ver fahren umfasst den Schritt, dass man 3 Komponenten, d. h. einen Wirkstoff, eine wässrige Lösung und die vorgenannten Kollagenteilchen, unter Bildung eines pastenartigen Materials mischt. Zwar weist die Lösung bevorzugt einen pH von etwa 7,0 auf, ein höherer oder tieferer pH kann jedoch unter bestimmten Umständen verwendet werden. Im Allgemeinen können zuerst zwei beliebige der drei Komponenten gemischt werden, bevor die dritte Komponente hinzugefügt wird. Alternativ können alle drei Komponenten zur gleichen Zeit vermischt werden. Sofern erforderlich, kann das pastenartige Material weiter verarbeitet werden (z. B. Erzeugung einer passenden Matrixform), bevor es in oder auf ein mit dem Wirkstoff zu, behandelndes Lebewesen (d. h. ein Säugetier, wie etwa ein menschlicher Patient) verabreicht wird. Die Verabreichung kann entweder mit einer Spritze, einer Kanüle oder einem Katheter oder durch chirurgische Implantation ausgeführt werden.
Die Wirkstoffe, die einem Lebewesen unter Verwendung der oben beschriebenen Transportsystem- oder -depot-Matrix verabreicht werden können, umfassen, ohne darauf -begrenzt zu sein, Wachstumsfaktoren (wie etwa Transformierender Wachstumsfaktor β, Epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin-artiger Wachstumsfaktor, Plättchen-entstammender Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Knochenmorphogenese-Protein), Prostaglandin, Thrombin, Makromoleküle (z. B. zell adhäsive Proteine wie etwa Laminin, Fibronectin und Chondronectin, Polysaccharide wie etwa Glucosaminoglykan, Glycoprotein und Kollagene, wie etwa Kollagen vom Typ 1 bis Kollagen vom Typ XIV), lebende Zellen, allogene Knochenspane, autogene Knochenspane, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Calciumcarbonat und Bioglas ein.
Die Kollagenteilchen-Matrix der vorliegenden Erfindung weist eine hohe Kapazität, eine wirkstoffenthaltende wässrige Lösung zu absorbieren, auf, wie durch ein in Beispiel 1, letzter Absatz, unten beschriebenes Verfahren gemessen.
Andere Merkmale oder Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der, folgenden detaillierten Beschreibung mehrerer Ausführungen sowie aus den beigefügten Ansprüchen ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Kollagenteilchen-Transportsystem- oder -depot-Matrix der vorliegenden Erfindung umfasst hochgradig hydrophile, unlösliche Kollagenteilchen mit Durchmessern zwischen 40 μm und 450 μm und einer Nettoladungsdichte im Bereich von –40 mol/mol Kollagen bis –400 mol/mol Kollagen oder von +40 mol/mol Kollagen bis +250 mol/mol Kollagen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH-Wert von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,8).
Die Wirkstofftransportsystem-oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis der vorliegenden Erfindung kann z. B. aus dem Kollagen des nativen Typs 1 hergestellt werden. Das Kollagenmolekül des Typs 1 weist etwa 250 positiv geladene Gruppen (ε-Aminogruppen von Lysinen und Hydroxylysinen, von denen jede einen pH von größer als pH 9 besitzt, und Guanidinogruppen oder Arginine, die einen pH von grö- ßer als pH 12 besitzen) und etwa 250 negativ geladene Gruppen (β-Carboxylgruppen von Asparaginsäuren und γ-Carboxylgruppen von Glutaminsäuren, von denen jede einen pH von weniger als pH 5 besitzt) auf. Bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,8) ist das Kollagenmolekül folglich elektrisch neutral und seine Teilchen bilden daher keine effektive kohäsive Matrix aus.
Um eine Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis mit Kollagenteilchen, von denen jedes eine gewünschte negative Nettoladungsdichte bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,8) aufweist, zu erhalten, können die ε-Aminogruppen von Lysinen und Hydroxylysinen der Kollagenteilchen chemischen Modifikationsreaktionen unterworfen werden, wie etwa Acetylierung mit Acetanhydrid, so dass die positiv geladenen ε-Aminogruppen in neutrale Acetylgruppen überführt werden. Da etwa 100 e-Aminogruppen pro Kollagenmolekül des Typs 1 vorhanden sind, beträgt die Nettoladungsdichte eines vollständig acetylierten Kollagens –100 mol/mol Kollagen bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,8), und als Folge der abstoßenden elektrostatischen Wechselwirkungen der negativ geladenen Carboxylgruppen wird das Kollagen hydrophiler und absorbiert mehr Wasser (quillt). Um den Grad der Hydrophilie (Quellfähigkeit) weiter zu erhöhen, können die ε-Aminoruppen von Lysinen und Hydroxylsinen durch Succinylierung unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid in Carboxylgruppen (Ladungsumkehrung) überführt werden. Die Nettoladungsdichte eines vollständig succinylierten Kollagens beträgt daher etwa –200 mol/mol Kollagen. Ein noch höherer Grad an Hydrophilie (oder Nettoladungsdichte) des Kollagens kann durch aufeinanderfolgende chemische Modifikationen erhalten werden, z. B. indem man zunächst alle Guanidinogruppen von Argininen in Kollagen durch eine Desguanidinierungsreaktion in Gegenwart von Hypobromit unter alkalischen Bedingungen in Aminogruppen überführt, (Überführung von Arginin in Ornithin) und anschließend eine Succinylierung unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid durchführt. Die aus diesen aufeinanderfolgenden Modifikationen resultierende Nettoladungsdichte beträgt etwa –500 mol/mol Kollagen bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,8).
Auch Kollagenteilchen mit einer positiven Nettoladungsdichte können hergestellt werden, indem man die Carboxylgruppen modifiziert, wie etwa durch eine Ve- resterungsreaktion mit Methylalkohol, so dass die Carboxylgruppen in Methylestergruppen überführt werden. Ein vollständig methyliertes Kollagen weist eine Nettoladungsdichte von etwa +250 mol/mol Kollagen auf. Wie das negativ geladene Kollagen weist das positivgeladene Kollagen einen höheren Grad an Hydrophilie auf und quillt aufgrund abstoßender Ladungswechselwirkungen zwischen den Amino- und Guanidinogruppen von Lysinen, Hydroxylysinen und Argininen bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7 8).
Sofern notwendig, kann ein polyanionisches Polymer, wie etwa Alginsäure oder Polyglutaminsäure, unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie etwa Carbodiimid, kovalent an die Kollagenteilchen gebunden werden, wobei Amidbindungen zwischen den Carboxylgruppen des polyanionischen Polymers und den Aminogruppen des Kollagens gebildet werden. Als Folge des Anstiegs der durchschnittlichen Anzahl von Carboxylgruppen pro Kollagenmolekül erhöht man auf diese Weise die Nettoladungsdichte der Kollagenteilchen. Es ist zu betonen, dass die Einarbeitung von polyanionischem Polymer in die Kollagenmatrix vom Durchmesser des Polymers und damit von der Diffusionsgeschwindigkeit des Polymers in die Kollagenmatrix abhängt, um eine effektive Verknüpfung zwischen dem Polymer und dem Kollagen zu bewirken. Eine ineffektive Verknüpfung führt zu einer Oberflächen-Verknüpfung, die keine signifikante Quellung der Matrix hervorruft. Eine effektivere Einarbeitung kann erreicht werden, indem man die Verknüpfungsreaktion unter Matrix-quellenden Be dingungen ausführt, um die Diffusion des Polymers in den inneren Raum der Kollagenmatrix zu erleichtern, wie etwa bei einem pH von weniger als 4 oder über 11.
Darüber hinaus kann ein polykationisches Polymer, wie etwa Polylysin, Chitosan und dergleichen, unter Verwendung von Carbodiimid als ein Vernetzungsmittel kovalent so mit der Kollagenmatrix verknüpft werden, dass die Aminogruppen der Polykationen mit den Carboxylgruppen im Kollagen verbunden sind. Mit dem Anstieg der durchschnittlichen Anzahl von Aminogruppen pro Kollagenmolekül erhöht man auf diese Weise die Nettoladungsdichte der Kollagenteilchen.
Zur Verabreichung eines Peptids oder Proteins mit einer positiven Nettoladung ist die Kollagen-Transportsystem-oder -depot-Matrix mit einer negativen Nettoladung wünschenswerter. Die Wirkstofftransportsystem-, oder -depot-Matrix dient dazu, den Peptid- oder Protein-Wirkstoff durch elektrostatische Wechselwirkungen zu binden, zusätzlich zu den mechanischen Wechselwirkungen, wie etwa Verhakung und Einschluss. Zur Verabreichung eines Peptids oder Proteins mit einer negativen Nettoladung ist andererseits die Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix mit einer positiven Nettoladung wünschenswerter. In Abhängigkeit vom Durchmesser des abzugebenden Wirkstoffes kann des Weiteren das Ausmaß der abstoßenden Wechselwirkungen (Quellung)-der Kollagenmoleküle innerhalb der Matrix so kontrolliert werden, dass die optimale Verabreichungsbedingung der Matrixerhalten wird, um die Wirksamkeit des bestimmten interessierenden Wirkstoffes zu maximieren. Es ist oft wünschenswert, den Wirkstoff zunächst durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in einer Form von Liposomen, Mikrokapseln oder imprägniert in synthetische Polymere zu verkapseln, was ein zusätzliches Mittel darstellt, die Freisetzungsgeschwindigkeit bestimmter Wirkstoffe zu kontrollieren. Im speziell vorliegenden Fall können die Wirkstoff-enthaltenden Liposomen, Mikrokapseln oder synthetischen Polymere zunächst in einer wässrigen Lösung dispergiert werden, die dann unter Bildung einer pastenartigen Matrix zur Verabreichung mit der Kollagen-Transportsystem- oder -depot-Matrix gemischt wird.
Wenn der zu verabreichende Wirkstoff ein unlösliches-Material, wie etwa Knochenspane oder -teilchen, Bioglas oder Hydroxyapatitteilen, ist, können diese Materialien durch die kohäsiven mechanischen Kräfte, die von der Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix bei einem pH von etwa 7,0 (d. h. 6,5 – 7,13) auf diese Wirk stoffmaterialien ausgeübt werden, in die Kollagenteilchen-Transportsystem- oder -depot-Matrix eingearbeitet werden.
Der Teilchendurchmesser der Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix der vorliegenden Erfindung ist wichtig. Trockene Kollagenteilchen mit Durchmessern von mehr als 850 μm sind im Allgemeinen ineffektiv hinsichtlich der Bildung einer kohäsiven pastenartigen Matrix und daher hinsichtlich ihrer Verabreichungsfähigkeit. Dies ist auf die Verminderung von Oberflächenbereichen der großen Teilchen zurückzuführen, bei denen Wechselwirkungen zwischen den Teilchen vermindert werden. Wenn die Teilchendurchmesser andererseits zu klein sind, zum Beispiel weniger als 5 μm, können die Teilchen durch die inflammatorischen Zellen in vivo phagozytiert werden oder vorn Abgabeort fort wandern, wodurch die Verweilzeit der Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix in situ minimiert wird und was zu einer raschen Verteilung der assoziierten Wirkstoffe führt. Zum Beispiel tendieren Kollagenteilchen, die größer als 850 μm sind, dazu, im hydratisierten Zustand sandartige Charakteristika auszubilden, statt eine kohäsive pastenartige Substanz zu bilden.
Die wirkstoffenthaltende Kollagenmatrix kann an dem bestimmten Gewebeoder Organort durch direkte Implantation, durch Verwendung einer Spritze, einer-Kanüle oder eines Katheters über eine perkutane Vorgehensweise oder durch eine arthroskopisch unterstützte chirurgische Vorgehensweise verabreicht werden, so dass das pastenartige Material dem jeweiligen Gewebe- oder Organort verabreicht und angepasst wird.
Wenn zum Beispiel zur Herstellung der Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix der vorliegenden Erfindung Kollagen vom Typ 1 verwendet wird, kann es aus beliebigen Geweben, die reich an Kollagen vom Typ 1 sind, erhalten werden, entweder von Menschen oder von Tieren. Diese Gewebe umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Haut, Knochen, Sehne und Ligament ein. Tierische Gewebe sind aufgrund der leichten Erhältlichkeit frischer Gewebe in großen Quantitäten unter kontrollierten Bedingungen bevorzugt. Die folgenden Verfahrensweisen können zur Herstellung der Kollagen-Typ-I-Teilchen-Transportsystem- oder -depot-Matrix aus Sehnenmaterial angewendet werden:
Das Sehnenmaterial wird zunächst von der Faszia und Fremdgeweben gesäubert und zerkleinert. Das zerkleinerte Sehnenmaterial wird in 1 M NaCl, pH 7,0 extrahiert, um einen kleinen Teil der Kollagenmoleküle, die neu synthetisiert sind und noch nicht in die stabilen Fibrillen eingearbeitet wurden, sowie Glycoproteine und Proteoglycane, die durch nichtkovalente Wechselwirkungen mit Kollagen assoziiert sind, zu entfernen. Andere Salze, wie etwa Kaliumchlorid und dergleichen, können als ein Ersatz für Natriumchlorid verwendet werden.
Mit den Zellmembranen oder kollagenen Geweben assoziierte Lipide werden entfernt, indem man zunächst mit Detergentien, wie etwa Triton X-100 (Sigma Chemical Co., St: Louis, Mo.) extrahiert und anschließend mit Ether-Ethanolmischungen, extrahiert. Die Konzentration von Triton X-100 ist gewöhnlich etwa 2% bis 4%, aber bevorzugt etwa 3%. Die-bevorzugte Mischung Ether-Ethanol weist gewöhnlich etwa ein Verhältnis von 1 : 1 (V/V) auf. Die Extraktionsdauer beträgt gewöhnlich etwa 8 Stunden bis etwa 96 Stunden, aber bevorzugt etwa 24 bis 48 Stunden.
Eine weitere Reinigung kann durch Extraktion des Sehnenmaterials unter sauren und basischen Bedingungen erzielt werden. Sowohl saure als auch basische Extraktionen schwächen die nicht-kovalenten zwischenmolekularen Wechselwirkungen, wodurch die Freisetzung nicht-kovalent gebundener Glycoproteine, Glucosaminoglykane („GAGS") und anderer nicht-kollagener Moleküle erleichtert wird.
Die Extraktion von Sehnenmaterial in einem alkalischen Milieu wird erzielt, indem, man das Sehnenmaterial für eine Dauer von 8 bis 96 Stunden bei einem pH zwischen 12 bis 13 in Gegenwart eines Struktur-stabilisierenden Salzes, wie etwa (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄ und dergleichen, mit Ca(OH)₂, NaOH oder dergleichen, behandelt, so dass das potentielle Risiko der Denaturierung des Kollagens minimiert wird. Behandlung mit Alkali trennt die nicht-vernetzten Glycoproteine und GAGs von den Kollagenmatrizes und trennt auch das restliche Lipid durch Verseifung.
Die Säureextraktion kann bei einem pH < 3 in Gegenwart eines Strukturstabilisierenden Salzes ausgeführt werden. Säuren, wie etwa Essigsäure, Salzsäure oder dergleichen, können verwendet werden: Wie die basische Extraktion entfernt die saure Extraktion nicht-vernetzte Glycoproteine und GAGs.
Die Anteile des Kollagenmoleküls, die nicht in der Form einer Tripelhelix vorliegen (Telopeptide), sind an der Bildung der zwischenmolekularen Vernetzung beteiligt. Sie stellen schwache Antigene dar und sind für einen Angriff durch Proteasen, wie etwa Pepsin, Trypsin und dergleichen, zugänglich. Fortgesetzter Verdau mit sol chen Proteasen spaltet die Fibrillen in einzelne Moleküle. Wenn der Verdauungsvorgang jedoch in der richtigen Weise so kontrolliert wird, dass maximal Telopeptide entfernt werden, ohne dass eine vollständige Spaltung-erfolgt, kann die lmmunogenität der Fibrillen weiter reduziert werden, ohne die mechanische Stärke signifikant zu beeinträchtigen. Um zum, Beispiel Kollagenmonomere (ungeeignet in einer Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix) zu isolieren, wird der Verdau von Haut oder Sehne mit Pepsin gewöhnlich bei einem Enzym : Kollagen-Verhältnis von etwa 1 : 10 (Gewicht/Gewicht) etwa 24 bis 96 Stunden unterhalb Raumtemperatur durchgeführt. Andererseits können Kollagenfibrillen, die zur Verwendung in einer Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix geeignet sind, durch einen begrenzten Verdau mit Pepsin erhalten werden, den man bei einem Verhältnis von etwa 1 : 200 (Enzym : Kollagen, Gewicht/Gewicht) für etwa 10 bis 48 Stunden bei 4°C erzielt.
In einer Ausführung wird das gereinigte Kollagen zur Herstellung von Teilchen mit passenden Durchmessern weiter verarbeitet, bevor chemische Modifizierungen vorgenommen werden. Die gereinigten Kollagenfasern werden zum Beispiel zuerst mit Luft oder unter Vakuum getrocknet und dann Schneide- oder Mahl- und Sieb- Verfahren unterzogen, so dass Teilchen mit Durchmessern zwischen 5 μm und 850 μm erzeugt werden. Für diesen Zweck können beliebige kommerzielle Mahlmaschinen verwendet werden: Das Mahlen oder Schneiden von Kollagenmaterialien auf Faserbasis, wie etwa die aus Sehne oder Haut hergestellten, erzeugt unregelmäßig geformte faserige Teilchen mit verschiedenen Durchmessern, auf die men dann ein Verfahren zur Größentrennung anwendet, um Teilchen mit vorbestimmten Durchmessern zu erhalten. Kommerzielle Siebe mit verschiedenen Maschenweiten sind für diese Verfahren zur Größentrennung geeignet.

Veranschaulichende Beispiele chemischer Modifizierungen, die zur Änderung, der Nettoladungsdichte von Kollegenteilchen verwendet werden können, sind in der Tabelle unten aufgelistet:

Chemische Modifizierung (mol/mol)	Nettoladungschichte^t
Desamidierung^a	–70
Acetylierung^b	–100
Succinylierung^c	–200
Desguanidinierung^d + Acetylierung^b	–250
Desguanidinierung^d + Succinylierung^c	–500
Methylierung^e	+250
Methylierung^e + Acetylierung^b	+150

Es wird davon ausgegangen, dass der Fachmann die vorliegende Erfindung auf Basis der Beschreibung hierin ohne weitere Darlegung in ihrer gesamten Breite nutzen kann. Die folgenden speziellen Ausführungen sind daher als lediglich veranschaulichend auszulegen und stellen in keiner Weise eine Beschränkung der übrigen Offenbarung dar.
Beispiel 1
Herstellung von Kollagenteilchen A. Mechanische Zerlegung
Achillessehne vom Rind wurde von einem USDA-anerkannten Schlachthaus erhalten. Während des Reinigungsvorgangs wurde das Gewebe, außer wenn anders angegeben, kalt gehalten, um eine Kontamination mit Bakterien und eine Zersetzung des Gewebes zu minimieren. Die anhaftenden Gewebe sorgfältig ausgewählter Sehnen wurden zunächst
mechanisch abgeschabt. Die Sehnen, wurden in feine Stücke geschnitten und in Überschussmengen (10 Volumina) kalten Wassers gewaschen, um restliche Blutproteine und wasserlösliche Materialien zu entfernen.
B. Salzextraktion
Die gewaschenen Sehnen wurden in 10 Volumina 5% NaCl, 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 für 24 Stunden extrahiert, um salzlösliche Materialien zu entfernen. Die mit Salz extrahierten Sehnen wurden wiederholt in etwa 10 Volumina Wasser gewaschen, um das Salz zu entfernen:
C. Lipidextraktion
Das Material wurde in 3 % Triton X-100 für 24 Stunden extrahiert. Das Detergens wurde durch ausgiebiges Waschen mit Wasser entfernt. Das Material wurde dann in 3–4 Volumina Ether-Ethanol (1 : 1 VN) für 24 (± 2) Stunden extrahiert, um den Lipidgehalt weiter zu minimieren. Das der Lipidextraktion unterzogene Material wurde ausgiebig in Wasser gewaschen, um den Ether und das Ethanol zu entfernen.
D. Säure- und Baseextraktion
Auf das Material wurden Säure- und Baseextraktianen angewendet, um nichtkollagene Materialien zu entfernen. Die Extraktion mit Base wurde mit 3–4 Volumina 0,4 M NaOH bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1,0 M Na₂SO₄ für 24 (± 2) Stunden unter mildem Rühren ausgeführt. Im Anschluss an die Extraktion mit Base wurde der pH mit 0,1 M HCl neutralisiert. Der pH wurde dann auf 2,5 eingestellt, indem man konzentrierte Milchsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,2 M hinzugegeben hat. Die Säureextraktion wurde für 24 (± 2) Stunden unter Rühren fortgesetzt. Die mit Säure extrahierten Kollagenfasern wurden ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen.
E. Koazervierung
Das teilweise gequollene faserige Material wurde dann durch Einstellung des pHs mit 0,1 M NaOH auf seinen isoelektrischen Punkt zwischen pH 6,5 – 7,0 koazerviert. Die koazervierten Kollagenfasern wurden durch Filtration geerntet, und das gefilterte Material wurde ausgiebig mit kaltem, destilliertem Wasser gewaschen. Das hochgradig gereinigte Kollagen (Kollagen vom Typ I) wurde gefriergetrocknet (zunächst bei –10°C, < 200 μm Hg Vakuum für 24 Stunden, und dann bei 20°C < 200 μm Hg Vakuum für 24 Stunden) und bei Raumtemperatur als trockene Fasern gelagert.
F. Mahlen und Sieben
Das gereinigte Kollagenfasern-Material wurde zunächst vakuumgetrocknet (bei 20°C, < 200 μm Hg Vakuum für 24 Stunden), um die während der Lagerung absorbierte Feuchtigkeit zu entfernen, und dann in einer Thomas-Wiley-Mühle (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) gemahlen. Die gemahlenen Kollagenteilchen wurden zwischen Maschengröße 40 (450 μm) und Maschengröße 400 (40 μm) gesiebt, um die Teilchen mit Durchmessern zwischen 40 bis 450 μm selektiv zu sammeln.
Änderung der Nettoladungsdichte auf –40 – –70 mol/mol
Zehn Gramm derart erhaltener Kollagenteilchen wurden für 24 Stunden bei Raumtemperatur unter stetem Rühren in 1,1 M NaOH-Lösung in Gegenwart von 1,0 M Na₂SO₄ als ein Tripelhelix-stabilisierendes Salz desamidiert. Die desamidierten Kollagenfasern wurden ausgiebig mit deionisiertem Wasser, das zur Minimierung der Quellung auf etwa pH 5 voreingestellt wurde, gewaschen. Die desamidierten, gewaschenen Kollagenfasern wurden gesammelt und luftgetrocknet.
Das Verfahren zur Bestimmung der Nettoladung (Z) basiert darauf, dass man die Bedingung der elektrischen Neutralität sowohl auf die geladenen Proteinmoleküle als auch auf das zwischenmolekulare Lösungsmittel anwendet. Die Nettoladung wird auf Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: Z = Γ_CL – Γ_Na, wobei Γ den Überschuss an Natrium- oder Chloridionen im zwischenmolekularen Raum (pro Kollagenmolekül) gegenüber der Menge, die vorhanden gewesen wäre, wenn Kollagen keine polaren Reste aufwiese, darstellt. Ein typisches T wird wie folgt bestimmt: Ein Gramm einer Probe vakuumgetrockneter Kollagenteilchen wird für 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln in Gegenwart radioaktiven Natriums (²²Na) oder Chlorids (³⁶Cl) mit einer Überschussmenge 0,16 M NaCl-Lösung äquilibriert. Ein gewogenes Aliquot des Überstands wird dann zur Bestimmung der Mole Radioaktivität pro ml Lösung entnommen. Die feuchte Kollagenprobe wird dann in ein Polypropylen-Teströhrchen eingewogen, und die Radioaktivität wird für 24 Stunden mit einer spurenfreien Lösung extrahiert. Diese Lösung wird dann auf Radioaktivität analysiert. Betastrahlung wird unter Verwendung eines flüssigszintillationszählers analysiert, und Gammastrahlung wird unter Verwendung eines Gammaspektrometers analysiert. Das Gewicht des Kollagens wird erhalten, indem die umgesetzte Kollagenprobe für 72 Stunden über P₂O₅ getrocknet wird. Ein T wird entsprechend der folgenden Formel berechnet:
Γ (mol/mol = [m⋆/C⋆ – gt/ρ] C × Mc × 10–3 / gc
wobei g_c und g_t das Gewicht des Kollagens bzw. der Lösung in der analysierten Probe sind; m⁺ die Menge des vorhandenen ²²Na oder ³⁶Cl ist; C^⋆ und C die molale Konzentration des ²²Na und Na⁺ oder ³⁶Cl und Cl^– in der Reaktionslösung im Gleichgewicht darstellen, M_c die relative Molekülmasse des Kollagens ist und p die Dichte der Äquilibrationslösung ist. Es wurde gefunden, dass die Nettoladung der desamidierten Kollagenteilchen aus verschiedenen Ansätzen, bestimmt nach der obigen Methode, im Bereich zwischen –40 mol/mol bis –70 mol/mol liegt.
Der durchschnittliche isoelektrische Punkt der Kollagenteilchen wurde wie folgt bestimmt: Ein Gramm Kollagenprobe wurde in 100 ml 0,07 M Milchsäure-Lösung, pH 2,5, einheitlich dispergiert und homogenisiert. Eine 0,5%ige NH₄OH-Lösung wurde langsam zu dem dispergierten Kollagen hinzugefügt. Der pH der Kollagendispersion wurde fortlaufend überwacht, bis eine vollständige Phasenseparation auftrat. Der pH der Lösung bei vollständiger Phasentrennung wurde als Schätzwert des durchschnittlichen isoelektrischen Punkts der Kollagenzubereitung angenommen. Es wurde gefunden, dass der isoelektrische Punkt der desamidierten Kollagenteilchen aus verschiedenen Ansätzen im Bereich von etwa pH 4,4 bis etwa 5,0 liegt.
Eine Probe von 1 g der vakuumgetrockneten Kollagenteilchen wurde in ein Teströhrchen eingewogen und eine phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4, wurde langsam hinzugefügt. Nach jeder Zugabe von 0,25 ml der Lösung wurde das Teströhrchen umgewendet. Der Sättigungspunkt war erreicht, als die maximale Menge der Lösung von der Probe absorbiert war, ohne dass beim Umwenden des Teströhrchens eine klare Phasentrennung zwischen den Kollagenteilchen und der Lösung vorlag. Das Maximalvolumen der ohne Phasentrennung absorbierten Lösung wurde als das Absorptionsvermögen der Kollagen-Transportsystem- oder -depot-Matrix angenommen, in Einheiten von Gramm Lösung pro Gramm trockenes Kollagen. Es wurde gefunden, dass die Probe ein Lösungs-Absorptionsvermögen von etwa 10 g Lösung pro Gramm Kollagen aufweist.
Beispiel 2
Herstellung von Kollagenteilchen
Kollagenteilchen wurden in einer Weise, die mit der in Beispiel 1 oben beschriebenen identisch ist, hergestellt.
Änderung der Nettoladungsdichte auf –40 – –100 mol/mol
Zehn Gramm derart erhaltener Kollagenteilchen wurden in 200 ml halb gesättigtem Natriumacetat, pH 8, bei Raumtemperatur für 2–4 Stunden inkubiert. In 4–8 Stunden wurden 20 ml Acetanhydrid langsam zu der die Kollagenteilchen enthaltenden Natriumacetat-Lösung hinzugegeben, wobei der pH der Lösung durch Einstellung mit 1 M NaOH bei etwa 8 gehalten wurde. Die acetylierten Kollagenteilchen wurden dann ausgiebig mit deionisiertem, destilliertem Wasser gewaschen und bis zur Verwendung luftgetrocknet.
Die Nettoladung der acetylierten Kollagenteilchen aus verschiedenen Ansätzen wurde durch dieselbe Methode, wie in Beispiel i oben beschrieben, bestimmt, und es wurde gefunden, dass sie im Bereich zwischen –40 mol/mol bis –100 mol/mol liegt.
Beispiel 3
Herstellung der Kollagenteilchen
Kollagenteilchen wurden in einer Weise, die mit der in Beispiel 1 oben beschriebenen identisch ist, hergestellt.
Änderung der Nettoladungsdichte auf –100 – –200 mol/mol
Zehn Gramm derart erhaltener Kollagenteilchen wurden in 200 ml einer 3%igen Natriumhydrogencarbonat-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Menge von 5 g fein gepulvertem Bernsteinsäureanhydrid wurde über eine Dauer von 4–8 Stunden unter Rühren nach und nach hinzugefügt. Das System wurde durch schrittweise Zugabe von 1 M NaOH im pH-Bereich 8–8,5 gehalten. Das Rühren wurde für weitere 4–8 Stunden fortgesetzt. Das succinylierte Kollagen wurde dann ausgiebig in deionisiertem, destilliertem Wasser gewaschen, luftgetrocknet und bis zur Verwendung aufbewahrt.
Die Nettoladung der succinylierten Kollegenteilchen aus verschiedenen Ansätzen wurde durch dieselbe Methode, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, bestimmt, und es wurde gefunden, dass sie im Bereich zwischen –100 mol/mol bis –200 mol/mol liegt.
Beispiel 4
Herstellung der Kollagenteilchen
Kollagenteilchen wurden in einer Weise, die mit der in Beispiel 1 oben beschriebenen identisch ist, hergestellt.
Änderung der Nettoladungsdichte auf +40 – +250 mol/mol
Zehn Gramm derart erhaltener Kollagenteilchen wurden in 500 ml Methylalkohol in Gegenwart von 0,1 N HCl für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das methylierte Kollagen wurde mit mehrfach ausgewechseltem Methanol gespült und luftgetrocknet.
Die Nettoladung der methylierten Kollagenteilchen aus verschiedenen Ansätzen wurde durch dieselbe Methode, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, bestimmt, und es wurde gefunden, dass sie im Bereich zwischen +40 mol/mol bis +250 mol/mol Liegt.
Beispiel 5
Verabreichung von Knochenmorphogenese-Protein
2.000 μg Knochenmorphogenese-Protein („BMP") wurden zunächst in 1 ml einer neutralen Salzlösung in einheitlicher Weise gemischt. 1 g der Kollagenteilchen aus Beispiel 1 wurde dann mit der BMP-Lösung vermischt (gelöst in 1 ml destilliertem Wasser). Ein zusätzlicher Milliliter der Salzlösung wurde langsam zu der Mischung hinzugefügt, um ein pastenartiges Material zu erhalten.
Das BMP-enthaltende pastenartige Material wurde entsprechend den folgenden Vorgehensweisen an ausgewachsene Beagle-Hunde verabreicht: Die Stellen der Lendenwirbelsäule wurden entsprechend chirurgischen Standardverfahren präpariert und abgedeckt, so dass die spinösen Fortsätze, dorsalen, vertebralen Schich ten und benachbarten Facetten freigelegt wurden. Die Oberflächen der spinösen Fortsätze, dorsalen Schichten und Facetten wurden mit einer Hochgeschwindigkeits-Knochenfräse entrindet, um frisch blutenden Knochen freizulegen. Die gründlich gemischten pastenartigen Matrizes wurden in die entrindeten Stellen der Schichten gegeben, um die Wirbelsäulenfusion zu fördern.
Andere Ausführungen Aus der obigen Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen Charakteristika der vorliegenden Erfindung ermitteln, und er kann verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit umfassen die Ansprüche auch andere Ausführungen.
Zum Beispiel könnten Kollagenteilchen mit einer sehr hohen Nettoladungsdichte (z. B. –1.000 oder +1.000 mol/mol) unter Verwendung eines polyanionischen oder polykationischen Polymers auf die unter der Unterüberschrift Detaillierte Beschreibung der Erfindung beschriebenen Weisen erhalten werden.

Claims

Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis, umfassend Kollagenteilchen, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen aufweist.
Kollagen-Transportsystem- oder Depot-Matrix nach Anspruch 1, wobei jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte-zwischen –100 mol/mol Kollagen und –300 mol/mol Kollagen aufweist.
Wirkstofftransportsystem- oder -depot-Matrix auf Kollagenbasis, umfassend Kollagenteilchen, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist.
Kollagen-Transportsystem- oder Depot-Matrix nach Anspruch 3, wobei jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen +50 mol/mol Kollagen und +200 mol/mol Kollagen aufweist.
Kollagen-Transportsystem- oder Depot-Matrix nach Anspruch 4, wobei jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen +l00 mol/mol Kollagen und +160 mol/mol Kollagen aufweist.
Verfahren zur Herstellung von Kollagenteilchen für eine Kollagen-Transportsystem- oder Depot-Matrix, bei dem man
eine Kollagenpräparation unter Bildung von Teilchen fragmentiert; und
die Teilchen chemisch so modifiziert, dass jedes der Teilchen im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mo1 Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man außerdem vor oder nach dem Modifizierungsschritt Teilchen auswählt, die Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm, aufweisen.
Verfahren zur Herstellung eines Kollagenteilchen umfassenden pastenartigen Materials, bei dem man die Kollagenteilchen, einen Wirkstoff und eine wässrige Lösung unter Bildung des pastenartigen Materials mischt, wobei jedes der Teilchen einen Durchmesser zwischen 40 μm und 450 μm aufweist und im suspendierten Zustand in einer wässrigen Lösung bei einem pH von etwa 7,0 eine Nettoladungsdichte zwischen –40 mol/mol Kollagen und –400 mol/mol Kollagen oder zwischen +40 mol/mol Kollagen und +250 mol/mol Kollagen aufweist.
Pastenartiges Material; erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 8, zur Verwendung als Arzneimittel.
Pastenartiges Material nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel mittels einer Spritze verabreichbar ist.
Pastenartiges Material nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel mittels einer Kanüle verabreichbar ist.
Pastenartiges Material nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel mittels eines Katheters verabreichbar ist,
Pastenartiges Material nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel durch chirurgische Implantation verabreichbar ist.