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Hintergrund
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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
Antiadhäsionssperre
aus Hyaluronsäure,
die dadurch gebildete Antiadhäsionssperre
und Verfahren zur Verwendung der Antiadhäsionssperre.
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Hintergrund
des Standes der Technik
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Hyaluronsäure ist
ein viskoses Mucopolysaccharid, das in Geweben von Tier und Mensch
gefunden wird, wie Nabelschnur, Glaskörperflüssigkeit, Gelenkschmiere, Blutgefäßwänden und
anderen Bindegeweben. Das Polysaccharid besteht aus Disaccharidstruktureinheiten,
die aus alternierenden D-Glucuronsäure- und N-Acetyl-D-glucosaminresten
hergestellt sind, und besitzt ein Molekulargewicht im Bereich von
ca. 40.000 bis 8.000.000, abhängig
von Ursprung und Extraktionsverfahren. Hyaluronsäure wird zwischen Zellen gefunden, komplexiert
mit Proteinen, und bildet aufgrund seiner Wasserrückhaltefähigkeit
ein Gallert. Sie spielt eine bedeutende Rolle in verschiedenen biologischen
Prozessen, wie Zellmigration, Schmierung, Anfeuchtung von Geweben
und Aufrechterhaltung der Zellmorphologie (Meyers, Physiol. Rev.,
27:335, 1947).
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Ihr
natürliches
Vorkommen im Körper
und ihre Wasserrückhaltefähigkeit
haben zur Entwicklung und Verwendung von Hyaluronsäure für verschiedene
therapeutische Anwendungen geführt,
z.B. die Behandlung von Arthritis, die Verwendung von Hyaluronsäure als
Glaskörperflüssigkeitsersatz,
die Prävention
oder Inhibierung von Adhäsionen
im Anschluss an eine Operation und der Schutz von Wunden während der
Heilung. Jedoch erfährt
Hyaluronsäure
bei Verabreichung an ein Individuum einen enzymatischen Abbau durch
verschiedene Enzyme, z.B. Hyaluronidase, Glucuronidase und Glucosidase,
oder einen nicht-enzymatischen Abbau (Pigman et al., Arthritis Rheumatism
4:240, 1961) und behält
deshalb seine ursprüngliche
Viskosität
oder die gewünschte
Verweilzeit in vivo nicht bei.
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Ein
erfolgreicher Ansatz zur Verzögerung
des Abbaus von Hyaluronsäure
bei Verabreichung an den Körper
und somit zur Bewahrung seiner ursprünglichen Viskosität und Verweilzeit
in vivo besteht in der Modifizierung von Hyaluronsäure mit
einem Vernetzungsmittel. Verschiedene Vernetzungsmittel und Verfahren
werden zur Vernetzung von Hyaluronsäure zur Verwendung in verschiedenen
therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Zum Beispiel beschreibt
US-PS 4 716 224 die Vernetzung von Hyaluronsäure unter Verwendung von polyfunktionellen
Epoxyverbindungen, worin die Hyaluronsäure in einem alkalischen Medium
gelöst
und mit den Epoxyverbindungen umgesetzt wird. Die vernetzte Hyaluronsäure wird
als nützlich
in der Behandlung von Arthritis und als Bestandteil von Kosmetika
beschrieben.
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US-PS 4 886 787 beschreibt
die Vernetzung von Hyaluronsäure
mit di- oder polyfunktionellen Epoxiden, worin die Hyaluronsäure in saurer
Lösung
gelöst
und mit den Epoxiden in Gegenwart eines sauren Katalysators umgesetzt
wird. Die vernetzte Hyaluronsäure
wird als nützlich
in der Behandlung von Arthritis, als Wirkstoffübertragungsträger, zur
Reduzierung post-operativer Adhäsionen,
zur Förderung
der Wundheilung und als Komponente von Kosmetika vorgeschlagen.
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Die
US-PSen 4 582 865, 4 605 691 und 4 636 524 beschreiben die Reaktion
von Divinylsulfon als Vernetzungsmittel mit Hyaluronsäure in wässriger
alkalischer Lösung.
Die vernetzte Hyaluronsäure
wird als nützlich
in kosmetischen Formulierungen und Wirkstoffübertragungssystemen beschrieben.
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US-PS 5 356 883 beschreibt
die Vernetzung von Hyaluronsäure
mit dem Vernetzungsmittel Carbodiimid, um Hydrogele zu erzeugen,
die nützlich
als biologisch kompatible Gele, Filme oder Schwämme sein sollen.
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US-PS 4 957 744 beschreibt
die Vernetzung von Hyaluronsäure
mit mehrwertigen Alkoholen zur Erzeugung vernetzter Hyaluronsäureester,
die als nützlich
zur Behandlung von Arthritis und als Komponenten für Kosmetika
beschrieben werden. Die Vernetzungsreaktion wird durch Auflösen und
Umsetzen von Hyaluronsäure
mit einem Vernetzungsmittel in polaren und nicht-polaren Lösungsmitteln
bewirkt.
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US-PS 5 690 961 beschreibt
die Vernetzung von Hyaluronsäure
mit Di- oder Polyanhydriden in einem polaren aprotischen Lösungsmittel.
Die Anhydrid-vernetzte Hyaluronsäure
wird als nützlich
in der Behandlung von Arthritis, als Wirkstoffübertragungsträger, zur
Reduktion der Bildung postoperativer Adhäsionen, zur Förderung
der Wundheilung und als Bestandteil in Kosmetika vorgeschlagen.
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US-Patent
5 532 221 beschreibt die Herstellung von ionisch vernetzter Hyaluronsäure, worin
eine wässrige
Lösung
von Hyaluronsäure
mit einer wässrigen
Polykation-Lösung
in Verbindung gebracht wird. Die ionisch vernetzte Hyaluronsäure wird
als nützlich
in der Prävention
post-operativer Adhäsionen
beschrieben.
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In
der oben beschriebenen Literatur, unabhängig vom besonderen verwendeten
Vernetzungsmittel, wird die Vernetzung von Hyaluronsäure in einem
Zustand einer homogenen Lösung
durchgeführt,
worin Hyaluronsäure
mit dem Vernetzungsmittel in einer Lösung gelöst und umgesetzt wird. Da die
Löslichkeit
von Hyaluronsäure
in wässriger
Lösung
sehr gering ist, sind die in solchen homogenen Lösungen durchgeführten Reaktionen
nicht effizient. Entsprechend kann die Gewinnung des Reaktionsprodukts
schwierig sein.
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Zusammenfassung
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Ein
Verfahren zur Herstellung einer Antiadhäsionssperre wird bereitgestellt,
das das Gefriertrocknen einer Lösung,
die Hyaluronsäure
einschließt,
zur Bildung eines Schaums, das Umsetzen des Schaums mit einem Vernetzungsmittel
zur Bildung eines vernetzten Schaums und das Vermischen des vernetzten
Schaums mit einer wässrigen
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält,
zur Bildung der Antiadhäsionssperre
umfasst.
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In
einem anderen Aspekt wird eine Antiadhäsionssperre bereitgestellt,
die ein Gel ist, das durch Kombinieren eines gefriergetrockneten
und anschließend
vernetzten Hyaluronsäureschaums
und einer wässrigen Lösung, die
Hyaluronsäure
einschließt,
hergestellt wird.
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In
noch einem anderen Aspekt wird ein zweiteiliges Kit bereitgestellt,
das ein erstes Teil, das gefriergetrockneten und anschließend vernetzten
Hyaluronsäureschaum
einschließt,
und ein zweites Teil umfasst, das eine Lösung einschließt, die
Hyaluronsäure
einschließt.
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Wie
zuvor angegeben wurde, beinhalten Verfahren des Standes der Technik
zur Herstellung von vernetzter Hyaluronsäure allgemein einen Vernetzungsschritt,
der in einem Zustand einer homogenen Lösung durchgeführt wird,
d.h. Hyaluronsäure
wird mit einem Vernetzungsmittel in einer Lösung gelöst und umgesetzt. Im Gegensatz
dazu beinhaltet das vorliegende Verfahren der Herstellung der Antiadhäsionssperre
eine besondere Vernetzungsreaktion im festen Zustand, worin Hyaluronsäure als
Feststoff hergestellt wird, d.h. als gefriergetrockneter Schaum,
der dann mit einem unverdünnten
flüssigen
Vernetzungsmittel umgesetzt wird, um einen vernetzten Hyaluronsäureschaum
zu liefern. Dieses Verfahren eliminiert die Bedenken der geringen
Löslichkeit
von Hyaluronsäure
in verschiedenen Lösungsmitteln.
Auch weil die Vernetzungsmittel nur mit den auf Oberflächen zugänglichen
funktionellen Gruppen reagieren, liefert die Verwendung eines gefriergetrockneten Hyaluronsäureschaums
eine relativ große
Oberfläche,
die Stellen enthält,
an denen eine Vernetzung erfolgen kann.
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Die
Herstellung von vernetztem Hyaluronsäureschaum gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung führt
zu einer annähernd
quantitativen Gewinnung von vernetztem Hyaluronsäureschaum. Die überschüssigen Vernetzungsmittel
und etwaige Nebenprodukte der Reaktion können leicht durch einfaches
Spülen entfernt
werden. Im Gegensatz ist die Gewinnung von vernetzter Hyaluronsäure, die
durch die Verfahren des Standes der Technik hergestellt wird, worin
die Vernetzung im Zustand einer homogenen Lösung durchgeführt wird,
weniger effizient, und die Entfernung von überschüssigen Vernetzungsmitteln und
Nebenprodukten der Reaktion ist zeitaufwendiger.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Beispiel für
eine nadellose Spritze, die zur Vermischung von Hyaluronsäureschaum
mit einer wässrigen
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält,
zur Bildung der Antiadhäsionssperre
verwendet werden kann.
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2A und B zeigen
zwei nadellose Spritzen und ein Luer-Lock (Zuspritzventil), die zum Vermischen
einer wässrigen
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält,
und von vernetztem Hyaluronsäureschaum
verwendet werden können,
um eine Antiadhäsionssperre
zu bilden. 2A zeigt zwei separate Spritzen,
die vernetzten Hyaluronsäureschaum
bzw. eine wässrige
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält,
enthalten, und ein Luer-Lock, das zur Kupplung der zwei Spritzen
verwendet wird. 2B zeigt die über ein
Luer-Lock gekuppelten Spritzen. Die flüssigen und festen Komponenten
werden durch Vor- und Zurückdrücken der
Kolben zur Bildung eines Gels vermischt. Das Gel wird in einer der
Spritzen vor seiner Auftragung auf eine Wundstelle gesammelt.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Das
vorliegend offenbarte Verfahren zur Herstellung einer Antiadhäsionssperre
schließt
einen neuen Vernetzungsschritt ein, worin ein gefriergetrockneter
Hyaluronsäureschaum
mit einem Vernetzungsmittel umgesetzt wird, um einen vernetzten
Hyaluronsäureschaum
zu erzeugen, der dann mit einer wässrigen Lösung vermischt wird, die Hyaluronsäure umfasst,
um eine Hydrogel-Antiadhäsionssperre
zu bilden.
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Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Hyaluronsäure" Hyaluronsäure und ihre Salze, wie die
Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalze etc. Zur Bildung
einer Antiadhäsionssperre,
wie sie im vorliegend beanspruchten Verfahren dargestellt wird,
wird Hyaluronsäure
oder ein biologisch kompatibles Salz davon, z.B. Natrium, Kalium,
Calcium oder Magnesium, in einer wässrigen Lösung gelöst, die bevorzugt pyrogenfrei
ist. Das Molekulargewicht von Hyaluronsäure kann von ca. 40.000 bis
8.000.000 reichen, abhängig vom
Ursprung und den verwendeten Reinigungsverfahren. Geeignete Quellen
für Hyaluronsäure schließen ein,
aber nicht beschränkt
auf Nabelschnur, Hahnenkamm, Bakterien etc. Zum Beispiel beschreibt
US-PS 4 141 973 ein
Verfahren zur Extraktion von Hyaluronsäure aus Hahnenkämmen, und
US-PS 4 517 295 beschreibt
ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure. Hyaluronsäure ist
ebenfalls gewerblich erhältlich,
z.B. von Genzyme Corp., Cambridge, MA und Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO.
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Das
Molekulargewicht von Hyaluronsäure
beeinflusst die Menge der Hyaluronsäure, die zum Erreichen der
Gelbildung erforderlich ist. Entsprechend wird die Konzentration
der Hyaluronsäure,
die zur Bildung eines Schaums im vorliegenden Verfahren verwendet
wird, gemäß dem Molekulargewicht
der verwendeten Hyaluronsäure
eingestellt werden. Wenn z.B. eine Hyaluronsäure mit höherem Molekulargewicht verwendet wird,
ist eine geringere Konzentration von Hyaluronsäure erforderlich, um eine Gelbildung
zu erreichen. Wenn Hyaluronsäure
mit einem Molekulargewicht von ca. 1 × 106 bis
ca. 2 × 106 verwendet wird, wird die Lösung, die
Hyaluronsäure
einschließt,
typischerweise ca. 0,5 bis ca. 4,0 Gew.-% Hyaluronsäure enthalten.
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Die
Lösung,
die Hyaluronsäure
einschließt,
wird dann eingefroren, bevorzugt auf eine Temperatur von ca. –94 bis
ca. –130°C schockgefroren,
z.B. durch Eintauchen eines Kolbens, der die Lösung enthält, die Hyaluronsäure einschließt, in ein
Aceton-Trockeneis-Bad. Durch Schockgefrieren der Lösung, die
Hyaluronsäure einschließt, kann
ein poröser
Hyaluronsäureschaum
beim Gefriertrocknen der gefrorenen Lösung, die Hyaluronsäure einschließt, erhalten
werden. Die Bildung eines Schaums vergrößert die Oberfläche, die
dem Vernetzungsreagens ausgesetzt ist. Die Bildung eines porösen Schaums
erlaubt es dem Vernetzungsmittel, die gesamte Oberfläche zu erreichen.
Die gefrorene Hyaluronsäurelösung wird
gefriergetrocknet, bevorzugt bei einer Temperatur von ca. 0 bis
ca. –10°C und bei
einem Druck von ca. 50 × 10–3 bis
ca. 1 × 10–3 Torr,
um einen porösen
Schaum zu bilden.
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Anschließend wird
der Schaum mit einem flüssigen
Vernetzungsmittel umgesetzt, um vernetzten Schaum zu erzeugen. Geeignete
Vernetzungsmittel sind allgemein fachbekannt und schließen ein,
aber sind nicht beschränkt
auf Diepoxide, polyfunktionelle Epoxide, Diisocyanate, Polyisocyanate,
mehrwertige Alkohole, wasserlösliche
Carbodiimide, Diamine, Diaminoalkane, Polycarbonsäuren, Disäurehalogenide
und Dimethylolharnstoff. Bevorzugt ist das Vernetzungsmittel ein
Disäurehalogenid,
das einschließt,
aber nicht beschränkt
ist auf Diglycolylchlorid, Adipoylchlorid und Sebacylchlorid. Besonders
bevorzugt ist das Disäurehalogenid
Diglycolylchlorid. Das Vernetzungsmittel kann eine Flüssigkeit
sein oder, falls erforderlich, durch Auflösen des Vernetzungsmittels
in einem geeigneten Lösungsmittel,
z.B. Methylenchlorid oder N,N-Dimethylformamid,
flüssig
gemacht werden. Wenn ein Lösungsmittel
verwendet wird, beträgt
die Konzentration des Vernetzungsmittels ca. 1,0 bis ca. 99,0 Gew.-%,
bevorzugt ca. 10 bis ca. 80 Gew.-% der Lösung. Es ist in der Durchführung der
vorliegenden Erfindung bevorzugt, im wesentlichen reine Vernetzungsmittel
einzusetzen.
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Zur
Bewirkung der Vernetzung wird der Schaum in das flüssige Vernetzungsmittel
getaucht und für
einen angemessenen Zeitraum gerührt,
gewöhnlich
für ca.
24 bis ca. 48 Stunden. Die Reaktion wird gewöhnlich bei Raumtemperatur durchgeführt, d.h,
bei ca. 23°C,
jedoch ist die Temperatur, bei der die Vernetzungsreaktion durchgeführt wird,
nicht kritisch.
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Das
Verhältnis
von Schaum zu Vernetzungsmittel beträgt ca. 3,0 bis ca. 100 g Schaum/g
Vernetzungsmittel.
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Wenn
ein Disäurehalogenid
als Vernetzungsmittel eingesetzt wird, kann ebenfalls ein Säurefänger, z.B.
Triethylamin, zur Vernetzungsreaktionsmischung hinzugegeben werden,
um die Salzsäure
zu neutralisieren, die während
der Vernetzungsreaktion gebildet wird. Der vernetzte Schaum wird
einige Male gewaschen, um etwaiges nicht-umgesetztes Vernetzungsmittel
zu entfernen, im Vakuum getrocknet und sterilisiert.
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Anschließend wird
der vernetzte Schaum mit einer sterilisierten wässrigen Lösung vermischt, die ca. 0,5
bis ca. 4,0 Gew.-% Hyaluronsäure
und bevorzugt ca. 2,0 Gew.-% Hyaluronsäure enthält. Typischerweise reicht das
Verhältnis
von vernetztem Schaum zu wässriger
Lösung,
die Hyaluronsäure enthält, die
in der Mischung eingesetzt wird, von ca. 0,2 bis ca. 1,0 g vernetzter
Schaum/ml Hyaluronsäurelösung. Wenn
der vernetzte Schaum mit Diglycolylchlorid vernetzt wird, wird allgemein
die wässrige
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält,
die ca. 0,5 bis ca. 2,0 Gew.-% Hyaluronsäure enthält, mit dem vernetzten Schaum
vermischt. Das Verhältnis
von mit Diglycolylchlorid vernetztem Schaum zur Hyaluronsäurelösung beträgt bevorzugt
0,2 g vernetzter Hyaluronsäureschaum/ml
einer Hyaluronsäurelösung, die
1,0 Gew.-% Hyaluronsäure
enthält.
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Der
vernetzte Hyaluronsäureschaum
und die Lösung
können
durch jedes zweckmäßige Verfahren vermischt
werden. Zum Beispiel können
der Schaum und die Lösung
jeweils in eine mit einem Luer-Lock gekuppelte Spritze gegeben werden
und die Inhalte jeder Spritze durch Vor- und Zurückdrücken der Kolben vermischt werden.
Die resultierende Hydrogel-Antiadhäsionssperre kann dann in einer
der Spritzen aufgefangen werden.
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Die
Antiadhäsionssperre
ist biologisch abbaubar und wird deshalb über einen Zeitraum reabsorbiert, was
die Notwendigkeit zur anschließenden
operativen Entfernung der Sperre ausräumt. Die Geschwindigkeit des
Abbaus der Antiadhäsionssperre
kann durch Erhöhung
des Vernetzungsgrads gesteuert werden.
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In
einem anderen Aspekt kann die Antiadhäsionssperre zur Verhinderung
oder Inhibierung der Bildung von Adhäsionen in einem Tier im Anschluss
an jede Art von Operation oder Trauma verwendet werden, indem eine
wirksame Menge der oben beschriebenen Antiadhäsionssperre auf eine Wundstelle
appliziert wird. Die Wundstelle bezeichnet einen Gewebeort, der
in beliebiger Weise verletzt wurde, z.B. durch Operation, Prellung,
Abrasion usw., und bezeichnet ebenfalls Gewebe oder Organe, die
zum verletzten Gewebe benachbart sind. Zum Beispiel kann die Sperre
zur Prävention
oder Inhibierung von Adhäsionen
verwendet werden, die sich in Bezug auf intestinale Operation bilden,
z.B. Darmresektion, Operation von Leistenbruch etc., was eine Verstopfung
der Eingeweide verursachen kann. Die Sperre kann ebenfalls Adhäsionen vorbeugen
oder inhibieren, die sich in der Nähe eines Knochenbruchs bilden,
was die normale Bewegung des Reparaturgebiets reduzieren oder behindern
kann, indem die natürliche
Bewegung von Sehnen über
benachbarte Knochen eingeschränkt
wird.
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Eine
effektive Menge einer Antiadhäsionssperre
ist diejenige Menge, die zur Prävention
und Inhibierung von Adhäsionen
erforderlich ist. Bevorzugt sollte die Menge ausreichend sein, um
die gesamte Wundstelle zu bedecken. Eine zusätzliche Menge kann ebenfalls
auf Körpergewebe
oder Organe appliziert werden, die zur Wundstelle benachbart sind.
Die effektive Menge kann leicht durch einen Fachmann bestimmt werden.
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In
einer Ausführungsform,
wie oben beschrieben, werden der vernetzte Schaum und die Hyaluronsäurelösung außerhalb
des Körpers
vermischt, um eine Hyaluronsäure-Antiadhäsionssperre
zu bilden. Die Sperre wird dann auf die Wundstelle durch jeden zweckmäßigen Modus
appliziert. Bevorzugt wird die Antiadhäsionssperre direkt auf die
Wundstelle durch Injektion durch eine nadellose Spritze, wie in
Beispiel 2 dargestellt, appliziert.
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In
einem anderen Aspekt kann die Sperre zur Förderung der Heilung einer Wunde
verwendet werden, indem eine effektive Menge der oben beschriebenen
Sperre auf die Wunde appliziert wird. Eine zusätzliche Menge kann ebenfalls
auf das zur Wunde benachbarte Körpergewebe
appliziert werden. Die effektive Menge kann leicht durch einen Fachmann
bestimmt werden.
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Die
Sperre wird auf die Wunde durch jeden zweckmäßigen Modus verabreicht, z.B.
durch Applizieren des Gels direkt auf die Wunde, oder das Gel kann
mit einem Wundverband oder einer Bandage kombiniert werden, der/die
auf die Wunde appliziert wird, oder durch jeden anderen zweckmäßigen Modus.
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Die
zur Prävention
oder Inhibierung von Adhäsionen
oder zur Förderung
der Heilung einer Wunde verwendete Antiadhäsionssperre, wie oben beschrieben,
kann in Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger eingeschlossen
werden, z.B. Wasser oder ein nicht-wässriges Lösungsmittel, und/oder mit wenigstens
einem medizinischen Mittel. Geeignete medizinische Mittel können in
den Zusammensetzungen durch Hinzugeben des medizinischen Mittels
zur Hyaluronsäurelösung vor
dem Vermischen der Lösung
mit dem vernetzten Schaum zur Bildung der Antiadhäsionssperre
oder nach der Bildung der Antiadhäsionssperre eingeschlossen
werden.
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Der
Begriff "medizinisches
Mittel", wie er
hier verwendet wird, soll breit interpretiert werden und schließt jeden
Stoff oder jede Mischung von Stoffen ein, der/die eine beliebige
klinische Verwendung in der Medizin aufweisen kann/können. Somit
schließen
medizinische Mittel Wirkstoffe, Enzyme, Proteine, Peptide, Glycoproteine
oder diagnostische Mittel ein, wie freisetzbare Farbstoffe, die
keine biologische Aktivität
als solche aufweisen mögen.
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Beispiele
für Klassen
von medizinischen Mitteln, die verwendet werden können, schließen Antimikrobiotika,
Analgetika, Antipyretika, Anästhetika,
Antiepileptika, Antihistaminika, antiinflammatorische Mittel, Blutgerinnungshemmer,
kardiovaskuläre
Wirkstoffe, diagnostische Mittel, Sympathomimetika, Cholinomimetika, Antimuskarinika,
Antispasmodika, Hormone, Wachstumsfaktoren, Muskelrelaxantien, adrenerge
Neuronenblocker, antineoplastische Mittel, Immunsuppressiva, gastrointestinale
Wirkstoffe, Diuretika, Steroide und Enzyme ein. Es ist ebenfalls
beabsichtigt, dass Kombinationen von medizinischen Mitteln verwendet
werden können.
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Durch
Einfügen
eines medizinischen Mittels (medizinischer Mittel) in die Hyaluronsäure-Antiadhäsionssperre
dieser Erfindung wird eine fokussierte Übertragung und Applikation
eines medizinischen Mittels (medizinischer Mittel) auf eine Wunde
erreicht. Die fokussierte Applikation von Wachstumsfaktoren, anti-inflammatorischen
Mitteln, Immunsuppressiva und/oder Antimikrobiotika durch die Antiadhäsionssperre
ist ein ideales Wirkstoffübertragungssystem,
um die Heilung einer Wunde oder eines Einschnittes zu beschleunigen. Die Übertragung
geeigneter Gerinnungshemmer in der Prävention der Fibroblastenbildung
unterstützt
somit die Wirkung der physikalischen Sperre in der Prävention
oder Inhibierung von Adhäsionen.
Das medizinische Mittel (die medizinischen Mittel) diffundiert (diffundieren)
aus der Hydrogel-Sperre und/oder wird (werden) freigesetzt, wenn
die Sperre biologisch abgebaut und absorbiert wird.
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In
einem anderen Aspekt wird ein zweiteiliges Kit bereitgestellt, das
ein erstes Teil, das einen gefriergetrockneten vernetzten Hyaluronsäureschaum
einschließt,
und ein zweites Teil einschließt,
das eine Lösung einschließt, die
Hyaluronsäure
einschließt.
Das Kit kann ebenfalls wenigstens ein medizinisches Mittel wie oben
beschrieben einschließen,
das separat von den anderen Komponenten im Kit eingeschlossen werden kann
oder zur Lösung
gegeben werden kann, die Hyaluronsäure einschließt und im
Kit geliefert wird. Das Kit kann ebenfalls jedes zweckmäßige Mittel
zum Vermischen des vernetzten Hyaluronsäureschaums mit der Lösung einschließen, die
Hyaluronsäure
einschließt.
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Ein
Beispiel für
ein Mittel zur Kombination des vernetzten Hyaluronsäureschaums
mit der wässrigen Lösung, die
Hyaluronsäure
enthält,
ist eine modifizierte Version der in
US-PS 3 682 174 (das hier durch Verweis eingeführt wird)
beschriebenen Spritze. Unter Bezugnahme auf
1 schließt die modifizierte
Spritze, d.h. die nadellose Spritze, ein äußeres Gehäuse
1 aus einem röhrenförmigen Element
mit einer Bohrung
2 ein, das die gepulverte Substanz
3,
d.h. Hyaluronsäureschaum,
aufnimmt. Ein zweites röhrenförmiges Element
4 nimmt
die Flüssigkeit
5 auf,
d.h. eine wässrige
Lösung,
die Hyaluronsäure
enthält.
Die pulverförmige
Substanz
3 ist vom zweiten röhrenförmigen Element unter Verwendung
eines gleitenden Versiegelungselements
6 und eines Versiegelungselements
7 abgetrennt.
Dadurch ist das im ersten Element enthaltene Pulver vollständig vom
zweiten Element getrennt. Wenn ein Auslöser (in dieser Figur nicht
gezeigt), der mit dem oberen Teil der Spritze verbunden ist, herabgedrückt wird,
dann wird der Stopfen
8 verschoben, was wiederum die Flüssigkeit
5 unter
Druck setzt. Das Versiegelungselement
7 wird deformiert,
was es der Flüssigkeit
erlaubt, in die Bohrung
2 des ersten röhrenförmigen Elements zu fließen. Die
Flüssigkeit
vermischt sich mit dem Pulver, falls erforderlich unter Schütteln, um
eine frisch zubereitete Suspension bereitzustellen, d.h. eine Gel-Antiadhäsionssperre. Das
Gel wird durch eine Abdeckung
9 festgehalten, die am Bodenteil
der Spritze gesichert ist. Die Abdeckung wird entfernt, damit das
Gel abgegeben und an den gewünschten
Ort verabreicht werden kann.
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In
einem zweiten Beispiel werden der vernetzte Hyaluronsäureschaum
und die Hyaluronsäurelösung vermischt,
indem sie jeweils in eine getrennte nadellose Spritze gegeben werden,
die an ein Luer-Lock, wie oben beschrieben, gekoppelt ist, gefolgt
von Vermischen der Inhalte. Unter Bezugnahme auf 2a enthält die Spritze 1 eine
wässrige
Lösung
aus Hyaluronsäure 2,
und Spritze 3 enthält
einen vernetzten Hyaluronsäureschaum 4.
Das Luer-Lock 5 wird zur Kupplung von Spritze 1 mit
Spritze 3 verwendet. 2B zeigt
die Kupplung von Spritze 1 mit Spritze 3 unter
Verwendung des Luer-Locks 5. Die wässrige Lösung von Hyaluronsäure 2 und
der vernetzte Hyaluronsäureschaum 4 werden
durch Vor- und Zurückdrücken der
Kolben 6 und 7 vermischt, um die Gel-Antiadhäsionssperre
zu bilden. Vor dem Applizieren des Gels auf eine Wundstelle wird
es entweder in Spritze 1 oder in Spritze 3 aufgefangen.
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Damit
die Fachleute die vorliegende Erfindung besser ausführen können, werden
die folgenden Beispiele als Veranschaulichungen der Herstellung
einer Antiadhäsionssperre
und für
Verfahren ihrer Verwendung gemäß der vorliegenden
Offenbarung angegeben. Es sollte bemerkt werden, dass die Erfindung
nicht auf die spezifischen Einzelheiten beschränkt ist, die in den Beispielen
ausgeführt
werden.
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Beispiel 1
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A. Herstellung von Hyaluronsäureschaum
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Hyaluronsäure kosmetischer
Qualität
(5,0 g; Genzyme Corp., Cambridge, MA) wurde in destilliertem Wasser
(1000 ml) gelöst.
Die Hyaluronsäurelösung (0,5
%) wurde bei Raumtemperatur für
ca. 12 Stunden gerührt.
Hyaluronsäurelösung (125
ml) wurde in einen 250 ml-Kolben gegeben, gefolgt von schnellem
Einfrieren der Lösung
bei ca. –94°C, indem
der Kolben in ein Aceton/Trockeneisbad getaucht wurde. Die gefrorene
Lösung
wurde dann in einen Lyophilisator bei einem Vakuum von weniger als
1 Torr für
3 bis 4 Tage gestellt, um einen Hyaluronsäureschaum zu bilden.
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B. Herstellung von Diglycolylchloridlösung
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Ein
Dreihals-Rundkolben (21), ausgerüstet mit einem 300 ml-Tropftrichter und
einem Kondensator mit Wasserstoffstrom, wurde mit Diglycolsäure (100
g) und Toluol (1000 ml) gefüllt,
gefolgt von Zugabe von N,N-Dimethylformamid (1–2 ml), einem Katalysator.
Aus dem Tropftrichter wurde Thionylchlorid (275 ml) unter Rühren in
den Rundkolben getropft. Die Mischung wurde auf 50°C erwärmt und
dann über
Nacht erwärmt
gehalten. Man ließ die
Reaktion bei Raumtemperatur für
2 Tage fortsetzen. Toluol und Thionylchlorid wurden bei 50°C unter Vakuum
abdestilliert, gefolgt von Erwärmen
der Mischung auf 80°C
unter Vakuum. Das Diglycolylchlorid wurde in einem Aufnahmekolben
aufgefangen. Bei Destillation wurde das Diglycolylchlorid (125 g)
zu einer rosafarbenen Flüssigkeit
umgewandelt. Kernspinresonanz bestätigt, dass das gesamte Toluol
abdestilliert war.
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C. Herstellung von vernetztem
Hyaluronsäureschaum
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Hyaluronsäureschaum
(0,325 g), hergestellt in Schritt A, wurde in ein Becherglas getaucht,
das Diglycolylchlorid (100 g) enthielt, das in Schritt B hergestellt
worden war. Triethylamin (1,0 ml) wurde in das Becherglas getropft,
um etwaige Salzsäure
zu neutralisieren, die während
der Vernetzungsreaktion erzeugt wurde, und die Mischung wurde für 24 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt.
Der vernetzte Schaum wurde dann vom Diglycolylchlorid unter Verwendung
eines Glasfiltertiegels abgetrennt. Der aufgefangene vernetzte Schaum wurde
drei Mal mit 200 ml Isopropanol gewaschen, um nicht-umgesetztes
Diglycolylchlorid zu entfernen, gefolgt von einer Spülung mit
200 ml Ethanol. Der gewaschene vernetzte Schaum wurde dann unter
Vakuum bei –40°C für 24–48 Stunden
getrocknet, um ca. 0,3 g von vernetztem Hyaluronsäureschaum
zu liefern.
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D. Formulierung und Übertragung
des vernetzten Hyaluronsäuregels
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Der
vernetzte Hyaluronsäureschaum
wurde mit Ethylenoxid sterilisiert, und 1%ige Hyaluronsäurelösung wurde
mit Dampf für
120 Minuten bei 121°C
sterilisiert. Unter aseptischen Bedingungen wurde Hyaluronsäureschaum
(0,2 g) in eine sterile 3 ml-Spritze gepackt, und Hyaluronsäurelösung (1
ml) wurde in eine andere Spritze gegeben. Beide Spritzen wurden
von der Kappe befreit, mit einem Luer-Lock gekuppelt, und die Inhalte jeder
Spritze wurden durch Vor- und Zurückdrücken der Kolben vermischt.
Das Gel wurde in einer der Spritzen gesammelt und dann an die Operationsstelle übertragen.
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Beispiel 2
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Vernetztes
Hyaluronsäuregel,
das als Antiadhäsionssperre
in Ratten eingesetzt wird
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Die
Fähigkeit
des vernetzten Hyaluronsäuregels
aus Beispiel 1 zur Prävention
oder Inhibierung der Bildung von postoperativen Adhäsionen wurde
unter Verwendung eines standardisierten Bauchdeckenadhäsionsmodells
der Ratte untersucht.
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Die
im Modell eingesetzten Testmaterialien waren wie folgt:
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Hyaluronsäuregel,
acht individuell versiegelte Packungen, die jeweils zwei Spritzen
mit den separaten Komponenten für
eine einzelne (oder halbe) Applikation von Gel enthalten (vor der
Operation vermischt).
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Die
nassen und trockenen Komponenten des Hyaluronsäuregel-Kits wurden vor der Verwendung unter
Verwendung eines Spritzenkupplers vermischt, um die Komponenten
zu belüften
und zu kombinieren, als sie von einer Spritze in die andere gelangten.
Das vermischte Gel wurde in eine der Spritzen zur Applikation übertragen.
Bei drei Tieren wurde der gesamte Inhalt der Spritze auf den Bauchdeckendefekt
("abdominal wall defect", AWD) appliziert,
wodurch er mit einem Rand von 5 mm über jede Kante des Defekts
bedeckt wurde. Bei fünf
Tieren wurde nur die Hälfte
des Volumens des Gels auf den AWD jedes Tieres appliziert. Bei allen Tieren
wurde Kochsalzlösung
auf die exponierte Oberfläche
des Gels getropft.
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Weibliche
Sprague-Dawley-Ratten (225–249
g) wurden in diesen Experimenten verwendet. Jedes Tier erhielt einen
operativen Defekt von 2 × 1
cm auf der peritonealen Oberfläche
ihrer rechten Bauchdecke und einen Defekt ähnlicher Größe auf ihrem Blinddarm. Die
Tiere wurde in zwei Behandlungsgruppen unterteilt. In der ersten
Gruppe wurde der AWD mit einer Schicht aus Hyaluronsäuregel bedeckt.
Die Tiere in der zweiten Gruppe dienten als Kontrolle ohne eine
auf einen Defekt applizierte Behandlung. Alle Tiere wurden vernäht und bandagiert.
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Die
Einzelheiten des Modells werden in Surgery 117:663–9, 1995
beschrieben, dessen Inhalte hier durch Verweis eingeführt werden.
Kurz gesagt wurden die Tiere mit Natriumpentobarbital anästhesiert
(43 mg/kg intraperitoneal), ihr Unterleib wurde rasiert, und eine
Einschnittslinie von 6 cm wurde auf der Haut markiert, die oberhalb
der Linea alba auf der ventralen Medianlinie liegt. Die Haut wurde
mit Iodophorlösung
vorbereitet, mit 70%igem Isopropylalkohol gespült und eingeschnitten. Bei
exponierter Muskelwand wurde ein Einschnitt von 5 cm in den Muskel
entlang der Linea alba hindurch zur peritonealen Höhle gemacht.
Die rechte Bauchdecke wurde zurückgeschlagen,
und eine Oberfläche
von 2 cm × 1
cm wurde entblößt, indem
das Peritoneum und einige assoziierte Muskelfasern entfernt wurden.
Die mediale Kante dieses Defekts befand sich parallel zu und 1 cm
lateral zum Mittellinieneinschnitt. Der Inhalt des Blinddarms wurde
durch Abmelken des Materials aus dem terminalen Ende des Blinddarms
entfernt.
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Ein
Defekt wurde am Blinddarm geschaffen, indem ein angefeuchtetes Gazekissen
auf der Oberfläche des
Blinddarms gerieben wurde, bis eine Fläche von 2 cm × 1 cm der
Tunica serosa, die den Blinddarm bedeckt, abgezogen war. Sowohl
die Bauchdecke als auch der Blinddarm wurden leicht mit einer Skalpellklinge #15
geschabt, um ein flohstichartiges Bluten zu fördern, dann freigelegt und
für 15
Minuten an der Luft trocknen gelassen. Die nicht-defekten Flächen der
Bauchwand und des Blinddarms wurden vor dem Austrocknen geschützt, indem
eine feuchte Gaze während
des Trocknungszeitraums über
sie gelegt wurde.
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Das
vorbereitete Hyaluronsäuregel
wurde schnell durch die (nadellose) Spritze auf den Baumdeckendefekt
appliziert. Ein Überrand
von Gel wurde wenigstens 5 mm über
die Defektfläche
erstreckt. Die Bauchdecke wurde mit einem laufenden 4/0-Polypropylennahtfaden
verschlossen, und die Haut wurde mit einem laufenden absorbierbaren
4/0-Nahtfaden verschlossen. Die Ratten wurden bandagiert und nach
der Erholung aus der Anästhesie
in ihre Käfige
zurückgebracht.
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Das
Vorhandensein von Adhäsionsbildung
zwischen dem Blinddarm und der peritonealen Wand wurde 7 Tage nach
der Operation bewertet. Die Tiere wurden unmittelbar vor der Analyse
getötet.
Die Haut- und Muskelschichten des Unterleibs wurden lateral und
distal zum Ort der ursprünglichen
Defekte eingeschnitten. Die resultierende U-förmige Lasche wurde langsam
angehoben, um die Adhäsion
zu zeigen, falls vorhanden. Nach dem vorsichtigen Feststellen und
Trennen etwaiger fremder Adhäsionen
(d.h. retroperitoneales Fett, Darm, Omentum etc.) wurden zwei große Schleifen
aus Seidennahtfaden in das terminale Ende des Blinddarms platziert.
Dies erlaubte es, den Blinddarm mit einem Kraftaufnehmer zu verbinden,
der an der Gewindespindel eines Tensiometers montiert war. Die schwanzartige
Kante der U-förmigen
Lasche wurde in einer Nadelklemme gesichert, so dass die peritoneale
Wand ca. 40–45° aus der
Horizontalen war. Als die Gewindespindel mit 8,8 cm/min fortbewegt
wurde, zog sich der Blinddarm vom peritonealen Defekt ab. Die zur
Entfernung des Blinddarms erforderliche Kraft wurde gegen die Zeit
auf einem kalibrierten X-Y-Schreiber aufgetragen. Nachdem die zwei
Defektoberflächen
getrennt waren, wurden die Länge
und Breite der an der Adhäsion beteiligten
peritonealen Fläche
mit einem Greifzirkel gemessen.
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Die
folgenden Werte wurden für
jedes Tier mit einer Adhäsion
berechnet: Fläche
der Adhäsion,
Prozentwert der vollständigen
Adhäsionsbildung,
maximale Kraft, die während
der Trennung angetroffen wird, maximale Breite der Adhäsion, durchschnittliche
Kraft der Trennung, Arbeit zur Trennung und normalisierter Arbeitswert.
Der normalisierte Arbeitswert wurde berechnet, weil die Arbeit zur
Trennung jede Adhäsion
mit der Adhäsionsfläche verbunden
ist. Deshalb wurde jeder Arbeitswert auf die Arbeit normalisiert,
die erforderlich gewesen wäre,
falls die gesamte Oberfläche
an der Adhäsion
beteiligt gewesen wäre,
indem die tatsächliche Arbeit
durch den tatsächlichen
Prozentwert der beteiligten Oberfläche geteilt wurde.
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Zur
Berechnung von Arbeit und normalisierter Art wurde die Fläche jeder
Kraft-Zeit-Kurve auf dem X-Y-Schreiber mit einem Planimeter gemessen,
mit einem Faktor multipliziert, der die Kurvenhöhe in die Kraft in Gramm umwandelt,
und durch die Kurvenlänge
geteilt, um einen Wert der Durchschnittskraft in Gramm für jede Adhäsion zu
erhalten. Die Arbeit zum Ziehen der Adhäsion wurde unter Verwendung
der Formel W = F · d
berechnet, wobei W = Arbeit, F = Durchschnittskraft und d = gemessene
Länge der
peritonealen Fläche,
die an der Adhäsion
beteiligt ist. Die normalisierte Arbeit wurde dann als Arbeit W
berechnet, geteilt durch den Prozentwert der vollständigen Adhäsionsbildung.
Bei der Angabe wurden Kräfte
aus Gramm zu Newton (N) unter Verwendung der Beschleunigung aufgrund
der Schwerkraft umgewandelt.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
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Tabelle
1: Auftreten von Adhäsionsbildung
am Tag 7 zwischen einer Bauchdeckenwunde und einem Blinddarmdefekt
in der Ratte im Anschluss an ein Material auf absorbierbarer Hyaluronsäurebasis
(Hyaluronsäure).
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Mit
Hyaluronsäuregel
entwickelten zwei von acht behandelten Tieren Adhäsionen;
eines in der Gruppe mit voller Dosis und eines in der Gruppe mit
halber Dosis. Eine der Adhäsionen
beinhaltete nur 4 % der Wundfläche
und wurde als eine äußerst geringfügige Adhäsion betracht
(Tabelle 1).
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Im
Gegensatz zu den behandelten Tieren entwickelten alle Tiere, die
keine Behandlung erhielten, Adhäsionen
(Tabelle 1). Alle Kontrolltiere entwickelten starke 1:1-Adhäsionen mit
einem mittleren normalisierten Arbeitswert von 1,61 + 0,74 N-cm,
einer mittleren Fläche
von 1,29 cm2 und einer mittleren maximalen
Kraft von 1,07 N. Diese Adhäsionen
beinhalteten einen Mittelwert von 42 % der Wundfläche und
erforderten einen Mittelwert von 0,83 N·cm zur Trennung.
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Man
wird einsehen, dass verschiedene Modifikationen an den hier offenbarten
Ausführungsformen vorgenommen
werden können.
Deshalb sollte die obige Beschreibung nicht als beschränkend aufgefasst
werden, sondern bloß als
exemplarische Darstellungen von bevorzugten Ausführungsformen. Die Fachleute
werden sich andere Modifikationen im Umfang der hier anhängenden
Ansprüche
vergegenwärtigen.