ITUA20164153A1 - Composizioni polisaccaridiche impiegabili nella riparazione tissutale - Google Patents
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Description
Composizioni polisaccaridiche impiegabili nella riparazione tissutale
Campo dell’invenzione
L’invenzione è relativa a composizioni polisaccaridiche comprendenti una miscela di polisaccaridi solubile in acqua impiegabili nella modulazione dei processi di proliferazione cellulare ed al loro uso nella riparazione tissutale con inibizione dei processi fibrotici. Tali proprietà di modulazione possono essere utilmente impiegabili nella riparazione tissutale e per la prevenzione della fibrosi e/o di adesioni tissutali.
Stato della tecnica
La matrice extracellulare è un insieme dinamico di molecole interagenti tra di loro ed ha un ruolo fondamentale nella regolazione e modulazione delle funzioni cellulari nei processi riparativi tissutali. In tali processi di riparazione, che fanno seguito a traumi di varia origine, si verificano una sequenza di eventi che coinvolgono diversi tipi cellulari, dai macrofagi, a cellule endoteliali vascolari ai fibroblasti, tutti immersi in una matrice extracellulare composta da una molteplicità di componenti, tra cui ad esempio in via principale fibronectina, collagene, proteoglicani e glicosamminoglicani (e.g. acido ialuronico), che hanno numerose funzioni di regolazione delle cellule. Il collagene è riconosciuto essere il componente più abbondante della matrice extracellulare. Le cellule connettivali, quali ad esempio i fibroblasti ed i sinoviociti, sono le cellule coinvolte soprattutto nella fase di rimodellamento tissutale necessaria nella riparazione e quindi in via principale nella sintesi e degradazione di proteine della matrice, tra cui predominano il collagene di tipo I e II. La loro regolazione funzionale in questa fase appare fondamentale, poiché nel caso in cui questa sintesi sia eccessiva e non controbilanciata da processi di degradazione del collagene, la produzione di collagene da parte di queste cellule determina la formazione di tessuti fibrotici. La fibrosi, infatti, consiste sostanzialmente in una eccessiva deposizione di componenti della matrice cellulare con conseguenze patologiche sulla architettura del tessuto e sulle sue funzioni (Mutsaers SE et al., Int J Biochem Cell Biol, 1997, 29, 5-17).
Nella riparazione tissutale, ad esempio dopo interventi di tipo chirurgico, è infatti necessario intervenire sia nella fase riparativa con la promozione della proliferazione e migrazione cellulare ma anche nella fase di rimodellamento tissutale prevenendo la deposizione eccessiva di matrice extracellulare, soprattutto collagene, al fine di evitare processi fibrotici che sono alla base di adesione tissutale e formazione di cicatrici ipertrofiche.
Tra le molecole formanti la matrice extracellulare sono presenti glicosamminoglicani che, come noto, sono coinvolti, in un gran numero di processi biologici, sia normali che patologici, delle cellule coinvolte nella riparazione tissutale, tra cui la migrazione, l’adesione, la differenziazione e la proliferazione delle stesse.
I glicosamminoglicani sono biopolimeri non ramificati composti da unità ripetute disaccaridiche con caratteristiche di elevata idrofilicità e sono a pH fisiologico dei polianioni per la presenza di gruppi carbossilici o solfati sui residui saccaridici. Questo permette agli stessi di adottare conformazioni adatte alla formazione di matrici resistenti alla compressione con caratteristiche reologiche di elevata viscosità e/o viscoelasticità. Tra questi biopolimeri, l’acido ialuronico (anche noto come ialuronato o HA) è il più semplice, consistendo in unità ripetute di N-acetilglucosamina e acido glucuronico. Il suo peso molecolare può variare da 400 daltons (il disaccaride) sino a oltre 10 milioni di daltons ed è presente in un molti tessuti e fluidi organici dei mammiferi, quali ad esempio lo strato dermico della pelle, la cartilagine delle articolazioni, nei fluidi endobulbari dell’occhio, dove costituisce un elemento chiave per l’organizzazione di altre molecole e quindi anche nella formazione della matrice extracellulare. Inoltre, nel tessuto connettivo, l’idratazione associata all’acido ialuronico determina un ambiente adatto alla mobilità e alla proliferazione cellulare.
È anche noto che l’acido ialuronico, in qualità di biopolimero endogeno, ha un ruolo nella mobilità e nell’adesione cellulare mediate da un recettore di superfice, il RHAMM (Receptor for Hyaluronan-Mediated Motility), e dal recettore transmembrana CD44. Da quanto brevemente esposto è, quindi, del tutto evidente che l’acido ialuronico ha un ruolo chiave in processi biologici associati alla riparazione tissutale (Jiang D, Liang J, Noble PW, Annu Rev. Cell Dev Biol, 2007, 23, 435-61).
Le peculiari attività fisiche e biologiche, insieme con l’elevata biocompatibilità e biodegradabilità ad opera delle ialuronidasi endogene, hanno determinato un vasto impiego di questo biopolimero con applicazioni in campo cosmetico, oftalmico, reumatologico, nel trasporto di principi attivi, nella riparazione tissutale e dell’ingegneria tissutale.
Un aspetto essenziale nell’uso dell’acido ialuronico è il suo peso molecolare medio, l’acido ialuronico è infatti un polimero costituito da frazioni aventi differenti pesi molecolari, poiché come noto è questa caratteristica tecnica che ne determina le proprietà fisiche, a loro volta determinanti per gli effetti biologici (EP 0138572; WO 2010/003797).
Le proprietà viscose e/o viscoelastiche, in particolare, sono state la base per il suo impiego nella visco-supplementazione in patologie osteoarticolari, uso che ha riguardato soprattutto frazioni di acido ialuronico ad alto peso molecolare (superiore a 2000 kDa) avendo le frazioni ad elevato peso molecolare un elevato modulo viscoelastico oltre che un’elevata viscosità.
Oltre all’acido ialuronico anche altri polisaccaridi hanno attratto l’attenzione per un uso applicativo per la loro biocompatibilità e la loro relativamente elevata disponibilità, e tra questi il chitosano risulta essere un biopolimero di particolare interesse.
Il chitosano è, infatti, un polisaccaride ampiamente disponibile in natura, essendo ottenibile tramite la deacetilazione chimica della chitina, ed è composto prevalentemente da unità di glucosamina ed unità di N-acetil-glucosamina residue dal trattamento di deacetilazione della chitina. A differenza dell’acido ialuronico è un policatione per la presenza dei gruppi amminici delle glucosamine derivate dalla deacetilazione della chitina.
Ad oggi è noto che il chitosano può avere un ruolo nella regolazione cellulare secondo meccanismi ancora sotto indagine. Sulla cartilagine del ginocchio del ratto, ad esempio, il chitosano si è mostrato in grado di indurre la formazione di un tessuto fibroso, la proliferazione di condrociti ed una ridotta diminuzione dello spessore della cartilagine epifiseale (Jian Xi Lu et al., Biomaterials, 1999, 20, 1937-1944).
Inoltre, idrogeli formati da un polimero in sé privo di attività biologica quale il polivinil pirrolidone in combinazione con chitosano hanno mostrato un’interessante attività di modulazione su tipi diversi di cellule. In particolare questi idrogeli si sono mostrati in grado di inibire la crescita e la proliferazione di fibroblasti ma di indurre l’attecchimento e la crescita di cellule epiteliali.
È da osservare però che il solo chitosano ha mostrato la capacità di indurre una diminuzione della crescita delle cellule epiteliali (Risbud M et al., J Biosci, 2000, 25, 25-31). Questo effetto del chitosano di inibizione della crescita cellulare si è confermato anche in un modello di danno del tendine di Achille dove il chitosano si è mostrato in grado di indurre un’azione di inibizione della crescita dei fibroblasti, intervenendo sui processi di adesione cellulare così significativi nelle sequele postchirurgiche di queste patologie (Qiang Chen et al., Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7, 8462-8470).
Il maggior problema nell’uso del chitosano è però la sua scarsa solubilità in acqua e per la sua dissoluzione è necessario che il pH sia portato ad un valore uguale o inferiore a 5 per aggiunta di acidi organici o inorganici. L’abbassamento del pH comporta la protonazione dei gruppi amminici dei residui glucosaminici conferendo così solubilità al sistema. Inoltre, in relazione alla sua elevata carica positiva in soluzioni acquose risulta essere scarsamente compatibile con polimeri polianionici dando origine a coacervati con separazione di fase.
In relazione al suo vasto impiego il chitosano è divenuto uno dei polisaccaridi più studiati anche dal punto di vista chimico ai fini di migliorarne le proprietà utili ai fini applicativi, in particolare la viscosità e la solubilità in acqua. Negli ultimi anni, diversi derivati del chitosano sono stati ottenuti attraverso modificazioni chimiche della catena polimerica. Comunemente, per queste modificazioni vengono sfruttate reazioni a carico dei residui amminici delle unità di glucosamina. In particolare, l’introduzione di unità saccaridiche (mono- e oligosaccaridi) in catena laterale ha reso possibile l’ottenimento di derivati del chitosano solubili in acqua senza la necessità dell’abbassamento del pH a valori acidi con conseguenti problemi di degradazione del polimero. La derivatizzazione del chitosano con gruppi saccaridici laterali, ad esempio tramite l’inserzione di unità di lattosio ottenuta attraverso una reazione di aminazione riduttiva, ha comportato, come riportato nel brevetto US 4,424,346 (Hall, L.D. e Yalpani, M.), una maggior solubilità dei derivati di questo polisaccaride in acqua ed è proprio in queste sue forme derivatizzate che il chitosano assume le proprietà più favorevoli per l’utilizzo come biomateriale di elevata biocompatibilità. Inoltre, tale derivatizzazione migliora la compatibilità in soluzioni acquose del chitosano con biopolimeri polianionici, quali l’acido alginico e l’acido ialuronico (EP 2021408). Miscele di tali polimeri hanno mostrato di dare origine a soluzioni acquose omogeneamente disperse e senza la formazione di coacervati caratterizzate da una elevata viscosità e viscoelasticità superiore a quella dei singoli polisaccaridi che le compongono.
Il derivato oligosaccaridico del chitosano ottenuto per funzionalizzazione del gruppo amminico della glucosamina con il lattosio ha, inoltre, mostrato interessanti proprietà dal punto di vista biologico. In particolare due derivati con diverso grado di funzionalizzazione si sono dimostrati in grado, diversamente dal chitosano non modificato, di indurre l’aggregazione cellulare di condrociti e di stimolare la produzione di glicosamminoglicani e collagene mediante un’interazione con la Galectina-1 (Donati I et al., Biomaterials, 2005, 26, 987-998; Marcon P et al., 2005, 26, 4975-4984). Questa attività è mantenuta anche quando il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è combinato in idrogeli con polisaccaridi anionici, quale l’acido alginico (Marsich E et al., J Biomed Mat Res Part A, 2007, DOI:10.1002/jbm.a31307).
Nel campo della riparazione tissutale è fortemente sentita l’esigenza di disporre di strumenti in grado di determinare una equilibrata riparazione dei tessuti lesi senza formazione di processi fibrotico e/o di adesione e per soddisfare tale bisogno è da tempo studiato l’impiego dell’acido ialuronico per le sue proprietà viscose e viscoelastiche da solo o in combinazione con altri composti.
In EP 059015, ad esempio, sono descritte composizioni comprendenti una colla a base di fibrina e fibrinogeno combinata con polimeri biodegradabili e biocompatibili in grado di incrementare la viscosità delle composizioni. Preferibilmente questi polimeri sono scelti tra proteoglicani e polisaccaridi, tra cui l’acido ialuronico, e per gli scopi dell’invenzione tali polimeri devono avere un elevato peso molecolare. Di questi polimeri viene, quindi, sfruttata la sola proprietà fisica ed, infatti, questi polimeri vengono definiti come “viscosity enhancing polymers”. Tale concetto è stato a lungo seguito nella messa a punto di composizioni adatte per prevenire le adesioni tissutali.
In tal senso la ricerca volta alla messa a punto di strumenti per la riparazione tissutale con inibizione dei processi fibrotici e di adesione tissutale è stata indirizzata soprattutto allo sviluppo di frazioni di acido ialuronico ad elevato peso molecolare o di suoi derivati resistenti alla degradazione ad opera delle ialuronidasi endogene per la promozione di un “effetto barriera”, dovuto all’elevata viscosità delle composizioni.
In WO 97/07833 sono descritti biomateriali consistenti in derivati dell’acido ialuronico esterificati con benzil alcol o cross-linkati, in alternativa a frazioni di acido ialuronico ad alto peso molecolare e quindi molto viscose, per un uso nella prevenzione di adesioni post-chirurgiche. La derivatizzazione dell’acido ialuronico è volta ad incrementare la resistenza alla degradazione dello stesso ed alla messa a punto di biomateriali in forma di gel, membrane, e tessuti.
Analogamente in EP 1207828 sono descritti gel impiegabili come barriere antiadesione ottenuti mescolando una schiuma di derivati cross-linkati dell’acido ialuronico e soluzioni acquose di acido ialuronico. Per l’ottenimento di tali gel è indicato l’impiego di un acido ialuronico con un peso molecolare compreso tra 1000 kDa e 2000 kDa.
Per questo uso è comunque ancora ritenuto valido sia l’impego di frazioni di acido ialuronico ad altissimo peso molecolare (e. g. da 3500 a 10000 kDa), come descritto nella recente domanda di brevetto EP 2977460, sia l’impiego di acidi ialuronici modificati per via chimica ed in particolare idrogeli consistenti in strutturalmente complessi derivati dell’acido ialuronico, dove acidi ialuronici aventi un peso molecolare compreso tra 50 e 3500 kDa sono legati a poliesteri biocompatibili e biodegradabili con un peso molecolare compreso tra 3 e 900 kDa, come descritto in WO 2012/014180.
Bisogna però osservare che, stante la complessità delle interazioni cellulari nei processi di riparazione tissutale, allo scopo di promuoverla senza incorrere in processi fibrotici e/o di adesione tissutale è necessario individuare una strategia non esclusivamente basata su un “effetto barriera” dell’acido ialuronico ad alto peso molecolare o di suoi derivati resistenti alla degradazione endogena. Per soddisfare il bisogno terapeutico, testimoniato dalla lunga ricerca nel settore, potrebbe essere più significativo ai fini terapeutici sfruttare le peculiari proprietà biologiche dell’acido ialuronico e di altri polisaccaridi biocompatibili ed intervenire nella modulazione dei processi di proliferazione dei diversi tipi di cellule coinvolte nella riparazione tissutale.
Sommario
Lo scopo della presente invenzione è quindi fornire composizioni in grado di modulare i processi di proliferazione cellulare per uso nella riparazione tissutale con inibizione dei processi fibrotici, sfruttando le proprietà biologiche di biopolimeri polisaccaridici.
Sono quindi un oggetto della presente invenzione composizioni polisaccaridiche comprendenti acido ialuronico ed un derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio ottenuto per reazione di aminazione riduttiva della D-glucosammina avente un grado di sostituzione del gruppo funzionale amminico della stessa con il lattosio almeno del 40% per uso nella riparazione tissutale e nella inibizione dei processi fibrotici e/o di adesioni tissutali mediante modulazione della proliferazione cellulare. L’acido ialuronico della composizione polisaccaridica oggetto dell’invenzione costituisce la matrice in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano è omogeneamente disperso.
Tali composizioni oggetto dell’invenzione possono in particolare essere impiegate per la riparazione tissutale e per la prevenzione della fibrosi e/o delle adesioni nelle lesioni tissutali traumatiche, post-chirurgiche ed infiammatorie croniche.
I vantaggi conseguibili con la presente invenzione risulteranno più evidenti ad un tecnico del settore dalla seguente descrizione dettagliata e con riferimento alle seguenti figure.
Breve descrizione delle figure
Figura 1. Nella figura sono mostrarti i risultati ottenuti sulla proliferazione di fibroblasti umani dopo incubazione a 24 ore, 3 e 6 giorni con acido ialuronico (HA), chitlac, acido ialuronico e chitlac a diverse concentrazioni: (A) HA alla concentrazione da 0,1 a 1,25 mg/ml; (B) chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,0 mg/ml; (C) HA alla concentrazione di 1,25 e chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,0 mg/ml.
Figura 2. Nella figura sono mostrarti i risultati ottenuti sulla proliferazione di condrociti umani dopo incubazione a 24 ore, 3 e 6 giorni con acido ialuronico (HA), chitlac, acido ialuronico e chitlac a diverse concentrazioni: (A) HA alla concentrazione da 0,25 a 1,25 mg/ml; (B) chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,5 mg/ml; (C) HA alla concentrazione di 0,5 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,5 mg/ml; (D) HA alla concentrazione d 1,0 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,0 mg/ml; (E) HA alla concentrazione di 1,25 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a1,0 mg/ml.
Figura 3. Nella figura sono mostrarti i risultati ottenuti sulla proliferazione di sinoviociti umani dopo incubazione a 24 ore, 3 e 6 giorni con acido ialuronico (HA), chitlac, acido ialuronico e chitlac a diverse concentrazioni: (A) HA alla concentrazione da 0,25 a 1,25 mg/ml; (B) chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,5 mg/ml; (C) HA alla concentrazione di 0,5 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,5 mg/ml; (D) HA alla concentrazione di 1,0 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a 1,0 mg/ml; (E) HA alla concentrazione di 1,25 mg/ml e chitlac alla concentrazione da 0,1 a1,0 mg/ml.
Figura 4. Nella figura sono mostrarti i risultati ottenuti nello scratch test su fibroblasti dermici trattati con acido ialuronico alla concentrazione di 1 mg/ml, chitlac alla concentrazione di 0,75 mg/ml e di una miscela degli stessi (HA 1 mg/ml, chitlac 0,75 mg/ml) a 0, 48 e 72 ore sulla migrazione cellulare in % (A) e chiusura del taglio in µm (B).
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Il derivato oligosaccaridico del chitosano, ottenuto per aminazione riduttiva del gruppo funzionale amminico della D-glucosammina con il lattosio, della composizione polisaccaridica oggetto dell’invenzione, di seguito indicato anche come chitlac, è stato valutato in vitro su diversi tipi cellulari di origine connettivale, poiché tali cellule sono le maggiormente coinvolte nei processi di riparazione e rimodellamento tissutale a seguito di lesioni tissutali. Tali lesioni possono essere di varia origine e possono variare da lesioni quali quelle di tipo chirurgico o traumatiche o a lesioni derivanti da processi infiammatori cronici.
In esperimenti in vitro, i cui risultati sono riportati in dettaglio di seguito, tale derivato del chitosano sostituito con lattosio (chitlac) ha mostrato di possedere interessanti proprietà biologiche sulla proliferazione di cellule diverse per origine.
In particolare, sia sui fibroblasti dermici e sui sinoviociti, che sui condrociti umani ha mostrato un effetto dose-dipendente di inibizione della proliferazione cellulare che però non interferisce con la vitalità delle cellule.
Su queste cellule, infatti, il chitlac mostra di esercitare un chiaro e significativo effetto inibitorio dose-dipendente della proliferazione cellulare dopo incubazione per sei giorni già alla concentrazione di 0,25 mg/ml. L’effetto è molto marcato alle concentrazioni più elevate (0,75 e 1,0 mg/ml per i fibroblasti e 1,0 e 1,5 mg/ml per i sinoviociti e i condrociti). Dopo incubazione per tre giorni, invece, non si ha un effetto significativo sui fibroblasti, mentre l’effetto è significativo per i condrociti ed i sinoviociti alle concentrazioni più elevate. Inoltre tra le concentrazioni di 1,0 e 1,5 mg/ml non si riscontrano effetti significativamente diversi. Dall’analisi dei dati, dunque, si osserva che il chitlac inibisce la proliferazione cellulare di condrociti e sinoviociti dopo tre giorni di incubazione alle concentrazioni di 1,0 e 1,25 mg/ml e dopo 6 giorni di incubazione già a 0,25 mg/ml su tutti e tre i tipi di cellule considerate. L’effetto è quindi non solo dose-dipendente ma anche tempo-dipendente.
Da questi risultati si deduce che il chitlac inibisce la proliferazione cellulare di qualsiasi tipo di cellula, ovvero sia cellule deputate al rimodellamento tissutale con deposito di collagene, quali i fibroblasti e i sinoviociti la cui iperattività è prodromica alla formazione di processi fibrotici, che su cellule invece che hanno una funzione indirizzata alla riparazione del tessuto leso come i condrociti che sono, come noto, cellule deputate nell’articolazione alla formazione di cartilagine.
Diversamente dal chitlac, l’acido ialuronico (di seguito indicato anche come HA) ha mostrato, invece, di non influenzare significativamente i processi di proliferazione cellulare di fibroblasti e di condrociti a nessuna delle concentrazioni impiegate né a nessuno dei tempi di incubazione considerati, fatta eccezione per un effetto inibitorio già a 0,75 mg/ml e significativo alla concentrazione maggiore (1,25 mg/ml) e dopo sei giorni di incubazione sui sinoviociti. Tale effetto non sembra legato ad un effetto barriera dell’acido ialuronico poiché la frazione di HA impiegata ha un pèeso molecolare non significativamente elevato.
Ai fini applicativi è particolarmente rilevante, però, l’effetto riscontrato sulla proliferazione cellulare, quando i due polisaccaridi sono combinati tra loro.
In proposito va, infatti, osservato che: i) la combinazione di HA alla concentrazione di 0,5 mg/ml non influenza in modo significativo l’effetto inibitorio esercitato dal chitlac a nessuna delle concentrazioni saggiate né a tre né a sei giorni di incubazione sui condrociti e sui sinoviociti; ii) la combinazione di HA alla concentrazione di 1,0 mg/ml previene l’effetto inibitorio del chitlac a tutte le concentrazioni totalmente sui condrociti e riduce in parte l’effetto inibitorio del chitlac alle concentrazioni più elevate sui sinoviociti; iii) la combinazione di HA alla concentrazione di 1,25 mg/ml previene l’effetto inibitorio del chitlac alle concentrazioni da 0,1 a 0,75 mg/ml sui condrociti ma non alla concentrazione più elevata del chitlac e riduce l’effetto del chitlac ma non lo abolisce sui sinoviociti, mentre sui fibroblasti non inibisce l’effetto del chitlac.
Dai risultati quindi emerge che l’effetto inibitorio del chitlac sulla proliferazione di cellule deputate alla sintesi di collagene, quali i fibroblasti e i sinoviociti, non viene abolito completamente dall’acido ialuronico, mentre lo stesso è in grado di prevenirlo su cellule la cui proliferazione è prodromica alla riparazione tissutale. È stato inoltre verificato che tale effetto inibitorio della proliferazione cellulare non altera la normale migrazione di fibroblasti dermici anche quando il chitlac è usato alla concentrazione più elevata in cui l’effetto inibitorio della proliferazione è più significativo. Tale processo non influenza quindi negativamente il processo di riparazione tissutale.
Senza voler essere legati a nessuna teoria, si può quindi ipotizzare che i due polisaccaridi intervengano nei processi di riparazione e rimodellamento cellulare mediante meccanismi differenziati e che quindi dalla loro combinazione si ottenga una modulazione dei processi di proliferazione cellulare utile per indurre una riparazione tissutale prevenendo i processi fibrotici dovuta ad una sovrapproduzione di collagene.
La presente invenzione concerne quindi una composizione polisaccaridica che comprende acido ialuronico ed un derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio ottenuto per reazione di aminazione riduttiva della D-glucosammina avente un grado di sostituzione del gruppo funzionale amminico della stessa con il lattosio almeno del 40% per uso nella riparazione tissutale e nella inibizione dei processi fibrotici mediante modulazione della proliferazione cellulare.
Come noto i due polisaccaridi hanno buone caratteristiche di solubilità in acqua e sono compatibili tra di loro, poiché soluzioni acquose degli stessi quando miscelate tra di loro non danno origine a precipitati in forma di coacervati, con separazione di fase, dovuti alle interazioni tra i gruppi anionici dell’acido ialuronico ed i gruppi cationici dei residui amminici comunque presenti nel derivato oligosaccaridico ottenuto a partire dal chitosano e dal lattosio (chitlac). Danno invece soluzioni caratterizzate da viscosità e viscoelasticità, in cui l’acido ialuronico di fatto costituisce la matrice in cui il derivato oligosaccaridico chitlac è omogeneamente disperso.
Per gli scopi della presente invenzione il chitosano impiegabile per l’ottenimento del derivato oligosaccaridico con il lattosio (chitlac) può essere ottenuto da varie fonti naturali (ad esempio per deacetilazione della chitina) o con metodi di tecnologia ricombinante ed ha un peso molecolare medio (di seguito codificato in MW) sino a 1.000 kDa. Il peso molecolare medio del chitosano di partenza è preferibilmente compreso nell’intervallo da 500 kDa a 700 kDa e più preferibilmente tra 200 e 400 kDa. Tale chitosano ha preferibilmente un grado di deacetilazione sino al 90% ed il preferito ha un grado di acetilazione residua compreso tra 10 e 20%.
Inoltre per gli scopi della presente invenzione il grado di sostituzione dei gruppi amminici della D-glucosammina del chitosano con il lattosio è almeno del 40%. Preferibilmente, il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con tale oligosaccaride è compreso nell’intervallo da 50% a 70% e più preferibilmente è del 60%.
Relativamente all’acido ialuronico, anche questo polisaccaride può essere ottenuto da varie fonti naturali o con metodi di tecnologia ricombinante per via fermentativa. È però significativo per questo polisaccaride il peso molecolare medio che è per gli scopi dell’invenzione non superiore a 2.000 kDa e compreso tra 1.000 kDa e 1.600 kDa in modo di avere dopo sterilizzazione a calore umido, processo che come noto determina una certa degradazione del biopolimero, un acido ialuronico con un peso molecolare compreso tra 800 kDa e 1.000 kDa.
L’aspetto più significativo delle composizioni polisaccaridiche oggetto dell’invenzione è il contenuto dei due polisaccaridi poiché come osservato sperimentalmente tali contenuti hanno un effetto significativo per il perseguimento degli scopi dell’invenzione.
In particolare l’acido ialuronico nelle composizioni polisaccaridiche da impiegare ai fini riparativi e preventivi dei processi fibrotici deve essere in una concentrazione compresa tra 10 e 20 mg/ml (1-2 % p/v) ed il derivato oligosaccaridico chitlac tra il 2,5 ed i 7,5 mg/ml (0,25-0,75% p/v). Preferibilmente l’acido ialuronico è 10 mg/ml o 12,5 mg/ml ed il chitlac è tra 2,5 e 7,5 mg/ml. Nella forma più preferita l’acido ialuronico è 10 mg/ml mentre il chitlac può variare da 2,5 a 5 mg/ml a seconda degli effetti perseguiti.
Le composizioni oggetto dell’invenzione possono essere usate per promuovere la riparazione tissutale e prevenire i processi fibrotici in lesioni traumatiche cutanee con interessamento dermico, tendinee ed articolari, nelle lesioni post-chirurgiche addominali, tendinee, articolari, nelle lesioni infiammatorie croniche delle patologie autoimmuni caratterizzate da processi fibrotici come l’artrosi psoriasica.
Per gli usi sopra previsti, le composizioni oggetto dell’invenzione possono essere usate in combinazione con eccipienti e/o diluenti adatti all’uso farmaceutico per preparare biomateriali, adatti alla somministrazione per via topica, intradermica o intrarticolare, sottoforma di soluzioni acquose, tessuto non tessuto, membrane, idrogel o preparazioni ottenute dagli stessi per freeze-drying.
ESEMPI
Le prove sperimentali di seguito riportate negli esempi sono state condotte impiegando i seguenti polisaccaridi:
Acido Ialuronico (HA): 1-1,6 MDa (1000-1600 kDa) di grado farmaceutico adeguato per la somministrazione intrarticolare ed intraoculare ottenuto per biofermentazione; Chitlac Idroclururo (CTL): il chitlac idrocloruro è stato ottenuto tramite addizione di acido cloridrico acquoso ad una soluzione di Chitlac in acqua sino al raggiungimento di pH 2,5. Successivamente il sale del polimero è stato precipitato con metanolo, filtrato su un filtro di vetro sinterizzato (gooch) e il solido collezionato lavato con metanolo (3x) ed essiccato. Il Chitlac impiegato per la preparazione del sale è caratterizzato da un grado di sostituzione con il lattosio compreso tra il 50 e il 70 % ed è stato ottenuto da un chitosano di 200-400 kDa con un grado di acetilazione residua pari al 15 % circa.
Soluzioni madre dei polisaccaridi a titolo noto sono state preparate impiegando acqua per soluzioni iniettabili come di seguito descritto.
Acido Ialuronico 1% in PBS 1X: 800 mg di acido ialuronico sono stati sciolti in 72 mL di acqua per preparazioni iniettabili. La soluzione così realizzata è stata additivata di 8 mL di tampone fosfato salina 10 X (PBS 10 X: NaCl 1370 mM, KCl 27 mM, Na2HPO481 mM, NaH2PO417,6 mM) e quindi sterilizzata in autoclave a 121°C per 15 minuti (EP 5.1.1).
Chitlac 1% in PBS 1X: 800 mg di chitlac idrocloruro sono stati sciolti in 69,04 mL di acqua per soluzioni iniettabili e, alla soluzione realizzata sono stati successivamente addizionati goccia a goccia 2,96 mL di NaOH 0,5 M. La soluzione è stata quindi additivata di 8 mL di tampone fosfato salino 10 X (PBS 10 X: NaCl 1370 mM, KCl 27 mM, Na2HPO4 81 mM, NaH2PO417,6 mM) e successivamente sterilizzata in autoclave a 121°C per 15 minuti (EP 5.1.1).
Esempio 1: saggio sulla proliferazione di fibroblasti da derma umano
I fibroblasti umani sono stati isolati da campioni di pelle di donatori sani (57 - 62 anni) sottoposti ad interventi di chirurgia plastica.
In breve, la pelle è stata posta per un’ora in PBS sterile con 3% di penicillina e streptomicina, in modo da abbattere la carica batterica. Successivamente i campioni sono stati tagliati in piccoli pezzi e posti in una soluzione di dispasi II (2,5 mg/ml HBSS, Hank's balanced salt solution) per 4 ore a 37°C, per ottenere il distacco dell'epitelio dal derma sottostante. I frammenti di derma sono stati digeriti con collagenasi I (80 U/ml in HBSS) per 12 ore in incubatore a 37°C, pCO2 al 5%. La digestione è stata bloccata con terreno Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) completo del 10% siero fetale bovino (FCS), 4mM glutamina, 100IU/ml di penicillina/streptavidina e la sospensione è stata filtrata e centrifugata a 1200 rpm. I fibroblasti presenti nel pellet sono stati risospesi in terreno DMEM completo e seminati su piastre di coltura sterili in incubatore a 37°C, con una percentuale di CO2 del 5% ed umidità relativa del 90%.
Il fenotipo delle cellule è stato confermato osservando la forma delle cellule al microscopio ottico invertito e mediante analisi immunocitochimica per la prolil-4-idrossilasi. Il terreno è stato cambiato ogni due giorni e le colture a confluenza sono state staccate dal fondo della piastra con una soluzione di tripsina 0,05% e EDTA 0,02% e successivamente divise 1:3. Per gli esperimenti sono stati utilizzate cellule dal terzo al quinto passaggio.
I fibroblasti sono stati seminati alla concentrazione di 2500 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Il giorno successivo alla semina le cellule sono state trattate con le sostanze in esame alle seguenti concentrazioni: acido ialuronico (HA) da 0,1 a 1,25 mg/ml; Chitlac (CTL) da 0,1 a 1,0 mg/ml; miscela di HA e CTL, costituita da HA a concentrazione fissa di 1,25 mg/ml, e quantità crescenti di CTL (da 0,1 a 1,0 mg/ml). Ogni due giorni è stato rinnovato il terreno con le sostanze in esame.
Gli effetti del trattamento sulla vitalità cellulare, sono stati analizzati a 1 g, 3 gg, 6 gg mediante il saggio MTT (4-5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), secondo il metodo di Denizot e Lang (Denizot et al., J Immunol Meth, 1986, 89, 271-277). Questo saggio misura l'attività della succino-deidrogenasi presente nei mitocondri cellulari delle cellule e si basa sulla riduzione del bromuro di (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a sali di formazano insolubili. La quantità di sali di formazano prodotta è determinata spettrofotometricamente ed è proporzionale alla quantità di enzima e quindi, indirettamente, al numero di cellule vitali.
In breve, dopo aver rimosso il terreno di coltura, i monostrati cellulari sono stati lavati con PBS ed è stata loro aggiunta la soluzione MTT per 3 ore a 37°C. Al termine dell’incubazione, l‘MTT è stato rimosso e sostituito con una soluzione estraente (90% isopropanolo, 10% DMSO) per 15 minuti a 37°C. La misurazione dell'assorbanza è stata effettuata allo spettrofotometro a 570 nm.
L’analisi statistica è stata fatta mediante t-test a due code e sono state considerate significative le differenze con un valore del t- test <0,05.
Gli esperimenti sono stati allestiti in triplo ed eseguiti per tre volte.
In figura 1A e nella tabella 1A sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alle concentrazioni menzionate.
Tabella 1A
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,134 0,017 0,274 0,033 0,678 0,161 0,1 mg/ml 0,135 0,01 0,284 0,039 0,637 0,027 0,25 mg/ml 0,118 0.003 0,285 0,013 0,696 0,002 0,5 mg/ml 0,131 0,01 0,276 0,006 0,713 0,009 1 mg/ml 0,122 0,006 0,301 0,006 0,731 0,44 1,5 mg/ml 0,124 0,004 0,275 0,014 0,752 0,023
In figura 1B e nella tabella 1B sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con il chitlac alle concentrazioni menzionate.
Tabella 1B
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,116 0,004 0,271 0,015 0,662 0,003 0,1 mg/ml 0,121 0,013 0,266 0,025 0,598 0,058 0,25 mg/ml 0,133 0.018 0,289 0,027 0,554 0,026 0,5 mg/ml 0,139 0,011 0,274 0,027 0,512 0,031 1 mg/ml 0,130 0,008 0,270 0,011 0,406 0,043 1,5 mg/ml 0,127 0,002 0,282 0,009 0,370 0,024
In figura 1C e nella tabella 1C sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 1,25 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti da 0,1 a 1,0 mg/ml alle concentrazioni menzionate.
Tabella 1C
CHITLAC 24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,100 0,002 0,300 0,001 0,627 0,002 0,1 mg/ml 0,114 0,008 0,273 0,021 0,579 0,006 0,25 mg/ml 0,129 0.016 0,289 0,002 0,471 0,025 0,5 mg/ml 0,127 0,012 0,241 0,046 0,401 0,028 0,75 mg/ml 0,122 0,003 0,238 0,029 0,345 0,039 1,0 mg/ml 0,122 0,008 0,231 0,043 0,328 0,014
Esempio 2: saggio sulla proliferazione di condrociti da cartilagine articolare
I condrociti umani sono stati isolati da una biopsia cartilaginea prelevata da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per sostituzione della cartilagine del ginocchio. La biopsia è stata finemente tagliata e successivamente trasferita in una soluzione di tripsina 0,25% per 15 minuti a 37°C. Al termine, la cartilagine è stata trasferita in una soluzione di collagenasi I 300U/ml per 12 ore in incubatore a 37°C, pCO2 al 5%. Dopo filtrazione, la soluzione è stata centrifugata a 1200 rpm e le cellule del pellet risospese in terreno Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) completo del 10% siero fetale bovino (FCS), 4mM glutamina, 100IU/ml di penicillina/streptavidina, in presenza di 50 mg/ml di acido ascorbico. Le cellule sono state mantenute in coltura cambiando il terreno ogni due giorni. A confluenza le cellule sono state staccate dal fondo della piastra di coltura con una soluzione di tripsina 0,05% ed EDTA0,02%, divise 1:3 ed utilizzate per gli esperimenti dal secondo al terzo passaggio.
I condrociti sono stati seminati alla concentrazione di 3000 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Il giorno successivo alla semina sono state trattate con le sostanze in esame alle seguenti concentrazioni: CTL da 0,1 a 1,5 mg/ml; HA da 0,1 a 1,25 mg/ml; miscela di HA e CTL, costituita da HA a concentrazione fissa (0,5 mg/ml, 1 mg/ml o 1,25 mg/ml) e quantità variabili di CTL. Ogni due giorni è stato rinnovato il terreno con le sostanze in esame.
Gli effetti del trattamento sulla vitalità cellulare, sono stati analizzati a 1 g, 3 gg, 6 gg mediante il saggio MTT (4-5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), secondo il metodo di Denizot e Lang come al precedente esempio.
In breve, dopo aver rimosso il terreno di coltura, i monostrati cellulari sono stati lavati con PBS ed è stata loro aggiunta la soluzione MTT per 3 ore a 37°C. Al termine dell’incubazione, l‘MTT è stato rimosso e sostituito con una soluzione estraente (90% isopropanolo, 10% DMSO) per 15 minuti a 37°C. La misurazione dell'assorbanza è stata effettuata allo spettrofotometro a 570 nm.
L’analisi statistica è stata fatta mediante t-test a due code e sono state considerate significative le differenze con un valore del t- test <0,05.
Gli esperimenti sono stati allestiti in triplo ed eseguiti per tre volte.
In figura 2A e nella tabella 2A sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare dopo incubazione e 1, 3 e 6 giorni con l’acido ialuronico alle concentrazioni menzionate.
Tabella 2A
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,069 0,012 0,169 0,019 0,250 0,024 0,25 mg/ml 0,086 0,003 0,173 0,016 0,278 0,007 0,5 mg/ml 0,091 0.009 0,177 0,005 0,264 0,017 0,75 mg/ml 0,087 0,011 0,145 0,008 0,251 0,001 1 mg/ml 0,081 0,006 0,135 0,019 0,226 0,005 1,25 mg/ml 0,087 0,008 0,146 0,011 0,235 0,004
In figura 2B e nella tabella 2B sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con il chitlac alle concentrazioni menzionate.
Tabella 2B
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,066 0,008 0,178 0,011 0,426 0,020 0,1 mg/ml 0,065 0,006 0,170 0,019 0,402 0,24 0,25 mg/ml 0,067 0,007 0,169 0,018 0,313 0,014 0,5 mg/ml 0,065 0,002 0,180 0,016 0,266 0,009 1 mg/ml 0,076 0,008 0,166 0,026 0,199 0,009 1,5 mg/ml 0,064 0,009 0,131 0,021 0,218 0,004
In figura 2C e nella tabella 2C sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 0,5 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti da 0,1 a 1,5 mg/ml alle concentrazioni menzionate.
Tabella 2C
CHITLAC 24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl (0 mg) 0,076 0,009 0,12 0,09 0,212 0,010 0,1 mg/ml 0,081 0,007 0,132 0,001 0,179 0,024 0,25 mg/ml 0,089 0,007 0,125 0,001 0,173 0,026 0,5 mg/ml 0,094 0,005 0,0106 0,007 0,158 0,014 1 mg/ml 0,085 0,005 0,0119 0,001 0,130 0,005 1,5 mg/ml 0,087 0,007 0,097 0,007 0,115 0,010
In figura 2D e nella tabella 2D sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 1,0 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti da 0,1 a 1,0 mg/ml alle concentrazioni menzionate.
Tabella 2D
CHITLAC 24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl (0 mg) 0,085 0,003 0,173 0,008 0,23 0,016 0,1 mg/ml 0,09 0,001 0,148 0,013 0,265 0,006 0,25 mg/ml 0,094 0,007 0,165 0,007 0,267 0,008 0,5 mg/ml 0,097 0,01 0,151 0,017 0,277 0,1019 0,75 mg/ml 0,088 0,009 0,162 0,004 0,277 0,067 1,0 mg/ml 0,092 0,01 0,154 0,015 0,232 0,585
In figura 2E e nella tabella 2E sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 1,25 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti da 0,1 a 1,0 mg/ml alle concentrazioni menzionate.
Tabella 2E
CHITLAC 24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl (0 mg) 0,089 0,006 0,149 0,005 0,29 0,003 0,1 mg/ml 0,093 0.002 0,147 0,004 0,313 0,016 0,25 mg/ml 0,099 0,015 0,176 0,008 0,312 0,004 0,5 mg/ml 0,094 0,006 0,175 0,021 0,264 0,037 0,75 mg/ml 0,100 0,041 0,176 0,019 0,271 0,008 1,0 mg/ml 0,092 0,007 0,166 0,013 0,229 0,012
Esempio 3: saggio sulla proliferazione di sinoviociti da sinovia umana
I sinoviociti umani sono stati ottenuti da sinovie di pazienti sottoposti a chirurgia per la riparazione dei legamenti.
Le cellule sono state estratte mediante trattamento con una prima soluzione di collagenasi I, 40U/ml, per 12 ore in incubatore a 37°C, con una percentuale di CO2 del 5% ed umidità relativa del 90%. L’azione enzimatica è stata bloccata con l’aggiunta del terreno DMEM completo, la soluzione filtrata e centrifugata a 1200 rpm. Le cellule del pellet sono state risospese in DMEM, 10% siero fetale bovino, 4mM glutamina, 100IU/ml di penicillina/streptavidina e seminate su piastre di coltura sterili in incubatore a 37°C, con una percentuale di CO2 del 5% ed umidità relativa del 90%. Il fenotipo cellulare è stato confermato mediante analisi morfologica al microscopio ottico e mediante analisi immunocitochimica per la prolil-4-idrossilasi. Il terreno è stato cambiato ogni due giorni e le colture a confluenza sono state staccate con una soluzione di tripsina 0,05% ed EDTA al 0,02%, e passate in nuove piastre dividendole 1:3. Per gli esperimenti sono stati utilizzate cellule dal quarto al sesto passaggio.
I sinoviociti sono stati seminati alla concentrazione di 3000 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Il giorno successivo alla semina sono state trattate con le sostanze in esame alle seguenti concentrazioni: CTL da 0,1 a 1mg/ml; HA da 0,1 a 1,25 mg/ml; miscela di HA e CTL, costituita da HA a concentrazione fissa (0,5 mg/ml, 1 mg/ml o 1,25 mg/ml) e quantità variabili di CTL. Ogni due giorni è stato rinnovato il terreno con le sostanze in esame.
Gli effetti del trattamento sulla vitalità cellulare, sono stati analizzati a 1 g, 3 gg, 6 gg mediante il saggio MTT (4-5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), secondo il metodo di Denizot e Lang come descritto all’esempio 1.
In breve, dopo aver rimosso il terreno di coltura, i monostrati cellulari sono stati lavati con PBS ed è stata loro aggiunta la soluzione MTT per 3 ore a 37°C. Al termine dell’incubazione, l‘MTT è stato rimosso e sostituito con una soluzione estraente (90% isopropanolo, 10% DMSO) per 15 minuti a 37°C. La misurazione dell'assorbanza è stata effettuata allo spettrofotometro a 570 nm.
L’analisi statistica è stata fatta mediante t-test a due code e sono state considerate significative le differenze con un valore del t- test <0,05.
Gli esperimenti sono stati allestiti in triplo ed eseguiti per tre volte.
In figura 3A e nella tabella 3A sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alle concentrazioni menzionate.
Tabella 3A
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,116 0,012 0,234 0,010 0,370 0,028 0,25 mg/ml 0.140 0,005 0,218 0,009 0,373 0,010 0,5 mg/ml 0,134 0,016 0,208 0,011 0,357 0,006 0,75 mg/ml 0,132 0,023 0,229 0,012 0,302 0,011 1 mg/ml 0,139 0,014 0,227 0,016 0,274 0,023 1,25 mg/ml 0,124 0,018 0,211 0,003 0,280 0,003 In figura 3B e nella tabella 3B sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con il chitlac alle concentrazioni menzionate.
Tabella 3B
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl 0,090 0,005 0,183 0,015 0,319 0,005 0,1 mg/ml 0,096 0,007 0,195 0,020 0,303 0,023 0,25 mg/ml 0,092 0,006 0,154 0,011 0,282 0,020 0,5 mg/ml 0,087 0,007 0,132 0,011 0,257 0,004 1 mg/ml 0,093 0,012 0,114 0,011 0,184 0,008 1,5 mg/ml 0,087 0,009 0,117 0,002 0,166 0,026
In figura 3C e nella tabella 3C sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 0,5 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti da 0,1 a 1,5 mg/ml alle concentrazioni menzionate.
Tabella 3C
CHITLAC 24 h SD 3 gg SD 6 gg SD Ctrl (0 mg) 0,086 0,016 0,142 0,014 0,227 0,003 0,1 mg/ml 0,092 0,009 0,141 0,007 0,211 0,012 0,25 mg/ml 0,095 0,003 0,134 0,019 0,226 0,016 0,5 mg/ml 0,091 0,001 0,120 0,015 0,177 0,009 1 mg/ml 0,080 0,001 0,105 0,006 0,148 0,012 1,5 mg/ml 0,079 0,007 0,107 0,008 0,124 0,009
In figura 3D e nella tabella 3D sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 1,0 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti alle concentrazioni menzionate.
Tabella 3D
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD CHITLAC
Ctrl (0 mg) 0,102 0,003 0,224 0,013 0,487 0,001 0,1 mg/ml 0,109 0,001 0,217 0,006 0,46 0,014 0,25 mg/ml 0,108 0,001 0,202 0,008 0,410 0,007 0,5 mg/ml 0,107 0,006 0,211 0,012 0,401 0,011 0,75 mg/ml 0,113 0,009 0,208 0,012 0,367 0,023 1 mg/ml 0,104 0,007 0,205 0,007 0,372 0,010
In figura 3E e nella tabella 3E sono riportati i risultati ottenuti sulla proliferazione cellulare con l’acido ialuronico alla concentrazione di 1,25 mg/ml e chitlac a concentrazioni crescenti alle concentrazioni menzionate.
Tabella 3E
24 h SD 3 gg SD 6 gg SD CHITLAC
Ctrl (0 mg) 0,101 0,006 0,228 0,024 0,535 0,021 0,1 mg/ml 0,108 0,005 0,206 0,013 0,476 0,002 0,25 mg/ml 0,114 0,004 0,208 0,007 0,409 0,011 0,5mg/ml 0,106 0,003 0,199 0,013 0,385 0,008 0,75 mg/ml 0,104 0,003 0,201 0,013 0,381 0,001 1 mg/ml 0,108 0,008 0,197 0,011 0,346 0,008
Esempio 4: saggio sulla migrazione cdi fibroblasti dermici in vitro – scratch test L’influenza del trattamento con HA e CTL sulla velocità di migrazione e di proliferazione dei fibroblasti in coltura è stata valutata su cellule preparate come descritto all’esempio 1 e portate a semiconfluenza su piastre da coltura cellulare da 6 pozzetti. Il monostrato cellulare è stato inciso per dividerlo in due parti e quindi trattato con le sostanze oggetto dello studio da sole (HA alla concentrazione di 1 mg/ml; CTL alla concentrazione di 0,75 mg/ml) o con la miscela di HA 1 mg/ml e CTL alla concentrazione di 0,75 mg/ml). La chiusura dell'interruzione creata nel monostrato cellulare è stata monitorata al microscopio ottico a 48 e 72 ore dal trattamento. Gli esperimenti sono stati allestiti in triplo ed eseguiti per tre volte. I risultati ottenuti sono riportati nella figura 4A come % della velocità di migrazione nel tempo delle cellule mentre in figura 4B sono riportati i risultati come chiusura del taglio in µm nel tempo a 0, 48 e 72 ore.
Claims (20)
- Rivendicazioni 1. Una composizione polisaccaridica comprendente acido ialuronico e un derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio ottenuto per una reazione di aminazione riduttiva della D-glucosammina avente un grado di sostituzione del gruppo funzionale amminico della stessa con il lattosio almeno del 40% per uso nella riparazione tissutale e nella prevenzione dei processi fibrotici e/o di adesioni mediante modulazione della proliferazione cellulare.
- 2. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui l’acido ialuronico è la matrice in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è omogeneamente disperso.
- 3. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui l’acido ialuronico è almeno al 1% in peso ed il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è sino al 0,75% in peso.
- 4. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui l’acido ialuronico è compreso tra l’1 ed il 2% in peso ed il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è compreso tra il 0,25 ed il 0,75% in peso.
- 5. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 3, in cui l’acido ialuronico è al 1 % in peso.
- 6. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 3, in cui l’acido ialuronico è al 1,25 % in peso.
- 7. La composizione polisaccaridica secondo una delle rivendicazioni 5 o 6, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è al 0,25% in peso.
- 8. La composizione polisaccaridica secondo una delle rivendicazioni 5 o 6, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è al 0,5% in peso.
- 9. La composizione polisaccaridica secondo una delle rivendicazioni 5 o 6, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è il 0,75% in peso.
- 10. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 5, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è al 0,25% in peso.
- 11. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 5, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio è al 0,5% in peso
- 12. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui l’acido ialuronico ha un peso molecolare medio compreso tra 1.000 e 1.600 kDa.
- 13. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui l’acido ialuronico ha un peso molecolare medio compreso tra 800 e 1.000 kDa.
- 14. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui il chitosano del derivato oligosaccaridico con il lattosio ha un peso molecolare medio compreso tra 500 e 600 kDa.
- 15. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui il chitosano del derivato oligosaccaridico con il lattosio ha un peso molecolare tra 200 e 400 kDa.
- 16. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio ha un grado di sostituzione compreso tra 50 e 70%.
- 17. La composizione polisaccaridica secondo la rivendicazione 1, in cui il derivato oligosaccaridico del chitosano con il lattosio ha un grado di sostituzione di 60%.
- 18. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui l’uso è nelle lesioni tissutali traumatiche, post-chirurgiche ed infiammatorie croniche.
- 19. La composizione secondo la rivendicazione 18, in cui le lesioni traumatiche post-chirurgiche ed infiammatorie croniche sono scelte tra lesioni traumatiche cutanee con interessamento dermico, tendinee ed articolari; lesioni post-chirurgiche addominali, tendinee, articolari; e lesioni infiammatorie croniche delle patologie autoimmuni caratterizzate da processi fibrotici, artrosi psoriasica.
- 20. La composizione secondo la rivendicazione 1, per uso nella preparazione di biomateriali sottoforma di soluzioni acquose, tessuto non tessuto, membrane, idrogel o preparazioni ottenute dagli stessi per freeze-drying.
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