DE69730835T2

DE69730835T2 - Methode zur verhinderung von hautreizungen durch fäkale enzyme

Info

Publication number: DE69730835T2
Application number: DE69730835T
Authority: DE
Inventors: A. Anthony SCHULZ
Original assignee: Sued Chemie Inc
Current assignee: Sued Chemie Inc
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-10
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-04-11
Also published as: US6051749A; EP0914167A4; ATE276776T1; AU2610197A; WO1997038735A1; DE69730835D1; CA2251587C; EP0914167B1; CA2251587A1; US6331295B1; US5869033A; EP0914167A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung von Hautirritationen durch Windelausschlag und insbesondere zur Verhinderung und zur Behandlung von Windelausschlag, welcher durch Enzyme aus Fäkalien verursacht wird.
Kurzbeschreibung des Stands der Technik
Windelausschlag ist eine Form von Hautentzündung, die Kinder betrifft, deren nasse und/oder beschmutzte Windeln nicht umgehend gewechselt werden. Da es praktisch unmöglich ist, allen Bedürfnissen eines Kindes unverzüglich nachzukommen, leiden auch gut behütete Kinder von Zeit zu Zeit an Windelausschlag.
Seit kurzer Zeit besteht die Einsicht, dass das Anfangsstadium von einigen Formen von Windelausschlag das Resultat einer Hautreizung ist, die durch Nahrungsenzyme in den Fäkalien der Kinder, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin und Elasthase, verursacht wird. Diese Enzyme sind proteolytische Enzyme, die im Magen-Darm-Trakt zur Verdauung von Nahrung erzeugt werden. Der Stuhl von Kindern ist meist wässrig und enthält unter anderem Bakterien und einen gewissen Anteil unzerstörter Verdauungsenzyme. Es wurde herausgefunden, dass für den Fall, dass diese Enzyme für eine hinreichende Zeitdauer in Kontakt mit der Haut verbleiben, eine Hautirritation entsteht, die für sich alleine bereits unangenehm ist, und die den Boden für eine Infektion für Mikroorganismen bereiten kann.
Konventionelle Methoden, um Windelausschlag zu verhindern oder zu lindern, bestanden bisher in der Anwendung von Pudern, um die Haut trocken zu halten, und Cremen und Wundsalben, um die Haut vor dem Kontakt mit den irritierenden Stoffen zu schützen. Dennoch bleibt Windelausschlag ein Problem für Kinder und Eltern.
Eine entsprechende Problematik, die auf Hautirritationen durch proteolytische Enzyme in Fäkalien zurückzuführen ist, wurde bei Patienten mit einem künstlichen Darmausgang gefunden. Solche Patienten würden ebenfalls von verbesserten Behandlungsmethoden zur Verhinderung von Hautirritationen aufgrund von Enzymen in Fäkalien profitieren.
Entsprechend bestand weiterhin die Notwendigkeit zusätzlicher Verfahren zur Verhinderung und Behandlung von Windelausschlag und vergleichbaren Hautirritationen anzugeben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dem Bedarf zusätzlicher Methoden zur Verhinderung von Windelausschlag wurde mit der vorliegenden Erfindung Rechnung getragen, wobei proteolytische Enzyme aus Fäkalien durch den Kontakt mit behandelten organophilen Tonen inaktiviert werden.
Eine Mischung zur Umsetzung der Erfindung umfasst einen Anteil eines behandelten, organophilen Tons, der geeignet ist, irritierend wirkende proteolytische Enzyme aus Fäkalien zu inaktivieren und der in einem pharmazeutisch anwendbaren, nicht giftigen dermatologischen Trägerstoff verteilt ist.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird eine Mischung, die behandelten organophilen Ton enthält, beispielsweise ein superabsorbierendes Polymer mit organophilem Ton, in ein Gewebe zur Herstellung von Kleidungsstücken, beispielsweise Windeln, eingebracht, welche in Kontakt mit Fäkalien, die Haut reizende Enzyme enthalten, kommen kann.
Entsprechend offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung von organophilem Ton, der ein Reaktionsprodukt eines Tons ist, der aus der Gruppe ausgesucht wird, die aus natürlich vorkommenden und synthetischen Montmorillonit, Bentonit, Beidellit, Hektorit, Saponit und Stevensit mit einer langkettigen organischen quaternären Ammoniumverbindung gebildet wird, und der zur Herstellung eines Mittels zum Schutz von menschlicher Haut und der Haut von Säugetieren gegen Reizungen verwendet wird, welche durch den Kontakt mit proteolytische Enzyme enthaltenden Fäkalien verursacht werden.
Nach einem Aspekt der Erfindung umfasst das Mittel eine Mischung, die den organophilen Ton verteilt in einem pharmazeutisch verwendbaren dermatologischen Trägerstoff enthält.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist das Mittel eine Mischung, die den organophilen Ton verteilt in einer wasserdurchlässigen Matrix enthält.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist das Mittel ein Stoff, der ein verwobenes oder nicht verwobenes Gewebe mit dem darin enthaltenen organophilen Ton umfasst.
Weitere Aspekte der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der Erfindung offenbart.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Bei der Verwendung der Erfindung werden die reizenden Einflüsse durch proteolytische Enzyme aus Fäkalien dadurch abgemildert, dass die Enzyme mit Materialien in Kontakt gebracht werden, welche die Enzyme durch Adsorption inaktivieren oder es so verhindern, dass diese ihre natürliche proteolytische Aktivität entfalten. Insbesondere wurde gefunden, dass bestimmte organophile Tone Enzyme aus Fäkalien absorbieren können und damit verhindern, dass diese in Kontakt mit der Haut treten, ferner können die Enzyme auch inaktiviert werden, so dass diese so umgewandelt werden, dass sie ihre Fähigkeit, Hautirritationen auszulösen, verlieren.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die Fäkalien, welche die reizend wirkenden proteolytischen Enzyme enthalten, in Kontakt zu einer solchen Menge behandeltem organophilem Ton gebracht, die ausreicht, um die enzymatische Aktivität zu reduzieren, um so deren Fähigkeit, Hautirritationen auszulösen, zu verringern oder zu beseitigen.
Um sicherzustellen, dass der organophile Ton in Kontakt mit den proteolytischen Enzymen kommt, wird er in einen anatomischen Bereich gebracht, bei dem der Kontakt mit Fäkalien wahrscheinlich ist, beispielsweise durch Verwendung in Bereichen der Haut, die normalerweise von einer Windel bedeckt sind oder durch die Anwendung in der Windel selbst oder durch die Aufnahme im Aufbau der Windel.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der organophile Ton in ein pharmazeutisch geeignetes Material zum Auftragen auf die Haut, beispielsweise der eines Kindes, und zwar in einem Bereich, der einem Kontakt mit Fäkalien unterliegt, eingebracht. Der den organophilen Ton enthaltende Stoff wird hinreichend häufig aufgetragen, beispielsweise nach jedem Windelwechsel, und zwar in einer ausreichenden Menge, um eine effektive Menge organophilen Tons auf die Haut aufzubringen, die Enzyme aus Fäkalien absorbieren und deaktivieren kann.
Die genaue Menge des behandelten organophilen Tons, die auf die Haut aufgebracht wird, ist selbstverständlich nicht kritisch, vorausgesetzt, dass eine solchermaßen ausreichende Menge verwendet wird, die geeignet ist, eine wesentliche Verringerung von Hautirritationen zu bewirken, die durch Enzyme aus Fäkalien verursacht wird. Typischerweise ist die auf die Haut aufgebrachte Menge organophilen Tons wenigstens 0,25 mg/cm².
Der für die vorliegende Erfindung verwendete behandelte organophile Ton wird typischerweise auf die Haut mittels einer dermatologisch geeigneten Mischung aufgebracht, die eine Suspension organophilen Tons in einen pharmakologisch geeigneten Trägerstoff umfasst. Geeignete Trägerstoffe sind unter anderem organische und wässrige flüssige Trägerstoffe, Lotionen, Cremen, Emulsionen oder Gele. Der organophile Ton kann ebenso in einer fein verteilten Form als Mischung in einem Puder, beispielsweise einer Mischung aus Talkum oder eines fein verteilten Stärkepuders, angewandt werden.
Die schützende Mischung kann auch eine Wirkung als Barriere haben, welches es verhindert, dass Enzyme aus Fäkalien in direkten Kontakt mit der Haut treten. Die Trägerstoffe können Weichmacher enthalten, um die Heilung irritierter Haut zu unterstützen, und Emulgatoren, für den Fall dass es notwendig ist, den organophilen Ton in Suspension zu halten. Der Trägerstoff sollte vorzugsweise inert im Hinblick auf den organophilen Ton sein, d. h. er sollte frei sein von Stoffen, welche ihrerseits vom organophilen Ton aufgenommen werden, und die so die Adsorptions- und Inaktivierungseigenschaften des organophilen Tons deaktivieren, welche die Voraussetzung für die Fähigkeit zur Bindung von proteolytischen Enzymen aus Fäkalien ist. Im Allgemeinen haben die Inhaltsstoffe relativ lange Kohlenwasserstoffketten, d. h. C-8 oder länger, und sollten von der schützenden Mischung ausgenommen werden, da solche Kohlenwasserstoffketten dazu neigen, mit dem organophilen Ton wechselzuwirken und so die Adsorptionsfähigkeit für proteolytische Enzyme aus Fäkalien zu reduzieren oder zu zerstören.
Entsprechend enthält die dermatologische Mischung gemäß der vorliegenden Erfindung organophilen Ton mit einem Anteil von 3–50 Gew.-% in einem üblichen dermatologischen Trägerstoff. Bevorzugt umfasst die Mischung 3–20 Gew.-% und insbesondere bevorzugt von etwa 5 bis etwa 10 Gew.-% organophilen Ton.
Geeignete Trägerstoffe umfassen hydrophobe Trägerstoffe, wie beispielsweise Petrolatum oder Mineralöl oder Mischungen daraus, oder hydrophile Trägerstoffe wie wasserbasierte Cremen einschließlich Emulsionen aus Petrolatum und/oder Mineralöl in Wasser sowie wasserbasierte Medien, die durch Mittel zur Viskositätseinstellung eingedickt sind. Geeignete Stoffe zur Eindickung von wasserbasierten Trägerstoffen umfassen Polyoxyethylen, beispielsweise Polyethylenglykol und deren Derivate mit einem Molekulargewicht von 3000 bis 20000; Polycarbonsäure, beispielsweise Polyacrylsäure und deren Salze; Derivate aus Zellulose wie etwa Hydroxyethyl Zellulose, Hydroxypropyl Zellulose, Hydroxypropyl Methylzellulose, Methylzellulose, Natrium-Carboxymethylzellulose und hydrophile organische Polymere wie etwa Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidon und Natriumsalz der Polyacrylsäure. Natürliche Gummistoffe, wie beispielsweise Xanthan Gummi, Carragenan, Traganath, sind ebenfalls nützliche Substanzen zum Einlegen von wasserbasierten Trägerstoffen. Das Eindickungsmittel kann auch eine kolloidale Dispersion eines hydrophilen Tons sein, beispielsweise natürlich vorkommende Montmorillonit, Bentonit, Beidellit, Hektorit, Saponit und Stevensit und synthetisch produzierte analoge Substanzen.
Die dermatologische Mischung mit einem organophilen Ton sollte eine so hinreichende Viskosität aufweisen, dass eine einfache Verteilung auf der Haut erlaubt ermöglicht wird und gleichzeitig eine im Allgemeinen durchgehende Schicht der aktiven Stoffe auf der zu schützenden Haut gewährleistet ist. Dermatologische Trägerstoffe sind dem Fachmann bekannt und die Auswahl und Zubereitung eines geeigneten Trägerstoffs kann von einem Fachmann ohne umfangreiche Experimente ausgeführt werden.
Organophiler Ton, der als Grundmaterial für die Barrierewirkung und/oder als absorbierendes und inaktivierendes Material für fäkale Enzyme in der erfindungsgemäß schützenden Erfindung verwendet wird, kann ein konventioneller handelsüblicher organophiler Ton sein, der zur Verwendung als Arzneimittel geeignet ist. Solche organophile Tone sind wohl bekannt und können von einem der Tone aus der Smektit-Klasse hergestellt werden, die dafür bekannt sind, dass sie in Wasser und/oder einem hydrophilen Lösungsmittel zu einer viskosen Suspension anschwellen. Geeignete Tone umfassen natürlich vorkommende Montmorillonite, Bentonite, Beidellite, Hektorite, Saponite und Stevensite und ihre entsprechenden synthetischen Äquivalente. Diese Tone haben eine lamellare Struktur, wobei Alkalimetallionen in den Lamellen verteilt sind. Die Behandlung des Tons mit einer langkettigen quarternären Ammoniumverbindung führt zu einem Austausch der Alkalimetallionen durch positiv geladene (kationisch) organische Moleküle und macht so den Ton organophil.
Die quarternären Ammoniunverbindungen, die zur Behandlung des organophilen Tons der Mischung zum Hautschutz verwendet werden, haben typischerweise ein oder zwei langkettige Substituenten, beispielsweise 14–20 Kohlenstoffatome, und zwei oder drei kurzkettige Substituenten, wie beispielsweise eine Methylgruppe. Eine bevorzugte quarternäre Ammoniumverbindung ist dehydrogenierter Dimethyl-Talg aus Ammoniumchlorid. Da der Talg einen hohen Anteil von Stearinsäure mit 18 Kohlenstoffatomen enthält, wird der resultierende Ton oft als Quaternium-18 Ton, beispielsweise Quaternium-18 Bentonit oder Quaterinum-18 Hektorit, bezeichnet. Die Zusammensetzung und Herstellung eines solchen organophilen Tons wird in der US 4,861,584 aufgezeigt. Ein bevorzugter organophiler Ton zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren ist Quaternium-18 Bentonit.
Organophiler Ton, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird bevorzugt durch Dispersion mit einem Lösungsmittel, wie etwa Propyplencarbonat, aktiviert, welches dafür bekannt ist, dass es die Adsorptionsfähigkeit von Ton für organische Materialien verbessert.
Der behandelte organophile Ton wird in der vorliegenden Erfindung auch zur Einbringung in Kleidungsstücke verwendet, beispielsweise einer Windel, welche in Kontakt mit Fäkalien treten können. Enzyme aus Fäkalien, die mit dem organophilen Ton auf einer Windel in Kontakt kommen, werden inaktiviert und folglich führen sie nicht zur Irritationen der an das Kleidungsstück angrenzenden Haut. Der organophile Ton kann in das Gewebe aufgenommen werden, beispielsweise das einer Windel, und zwar durch das Auftragen desselben als Beschichtung auf den Fasern des Gewebes oder nachträglich als Beschichtung auf dem Gewebe, nachdem das Kleidungsstück hergestellt wurde. Das Kleidungsstück kann auch mit organophilem Ton imprägniert werden, entweder durch Eintauchen in einen flüssigen Trägerstoff, in den der organophile Ton suspendiert ist, und durch das nachfolgende Entfernen des Trägerstoffs, beispielsweise durch Verdunstung, oder durch das Bepudern des Kleidungsstücks mit einem organophilem Ton selbst oder in einer Mischung mit einem puderförmigen Trägerstoff, wie voranstehend beschrieben.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der behandelte organophile Ton in ein stark absorbierendes Polymer eingebracht, wobei die so hergestellte Mischung in ein Gewebe eingebracht werden kann, aus dem ein Kleidungsstück wie beispielsweise eine Windel etwa aus einem nicht verwobenen Stoff, hergestellt werden kann und zwar durch konventionelle Verfahren, die zur Einbringung von stark absorbierenden Polymeren in solche Stoffe angewandt werden. Diese stark absorbierenden Polymere sind wohlbekannt und umfassen unter anderem vernetzte Polymere wie Acrylsäure, Carboxymethyl Zellulose, die mittels Epichlorhydrin vernetzt wurde, Polyaminosäure, beispielsweise Polyasparaginsäure, die beispielsweise mittels Lysin, Zellstoffpolymeren aus Zellulose, beispielsweise Holzfasern und Carbonsäure Monomeren, vernetzt wurde. Die Herstellung eines solchen stark absorbierenden Monomers ist konventionell und wird im Allgemeinen durch die Polymerisierung des Monomers in einer wässrigen Lösung oder in einer Suspension eines organischen Lösungsmittels unter Einwirkung eines geeigneten Initiators für eine auf freien Radikalen basierende Polymerisation bewirkt. Der organophile Ton kann durch ein beliebiges Mittel, welches eine hinreichende Verteilung in der Polymermatrix bewirkt, mit dem stark absorbierenden Polymer kombiniert werden. Beispielsweise kann ein organophiler Ton, beispielsweise Quaternium-18 Bentonit, als fein verteilte Suspension in eine wässrige Suspension eines stark absorbierenden Polymers verteilt werden, die wiederum durch die Herstellung eines solchen Polymers mittels Polymerisation aus einem konventionellen hydrophilen Monomer in einer wässrigen Lösung oder einer Suspension hergestellt wird. Diese Dispersion kann mittels konventionellen Mixens basierend auf hoher Scherrate bewirkt werden. Ein Feststoffpulver, das den organophilen Ton dispergiert, indem es stark absorbierendes Polymer enthält, kann dann durch ein konventionelles Trocknungsverfahren wie Sprühtrocknen oder Freistrahltrocknung hergestellt werden. Das stark absorbierende Polymer, das einen organophilen Ton enthält, kann durch ein konventionelles Verfahren in ein zur Herstellung von absorbierenden Kleidungsstücken geeignetes Gewebe eingebracht werden. Beispielsweise kann das stark absorbierende Polymer als Beschichtung auf ein gewebtes oder nicht gewebtes Tuch oder dessen Fasern aufgebracht werden, es kann in die Zwischenräume des Tuchs oder zwischen einzelne Lagen des gewebten oder ungewebten Tuchs in Form eines Kompositgewebes aufgenommen werden. Das stark absorbierende Polymer kann in ein Gewebe aufgenommen werden, und zwar durch Imprägnierung des Gewebes mit einer Lösung oder einer Suspension des Polymers in Wasser oder einem anderen geeigneten Trägerstoff, gefolgt von einem Trocknungsschnitt des imprägnierten Gewebes. Das stark absorbierende Polymer umfassend einen organophilen Ton kann ferner in eine Schaumschicht, beispielsweise eine Polyurethan-Schaumschicht, welche auf der Tuchlage befestigt ist oder zwischen den Lagen des Tuchs platziert wird, aufgenommen werden, um ein zur Herstellung eines Kleidungsstücks, wie einer Windel, geeignetes Gewebe zu erzielen. Das stark absorbierende Polymer, welches einen organophilen Ton umfasst, kann auch in einem nicht gewebten Stoff aufgenommen werden, und zwar durch die Auflösung des Polymers in fein verteilter Form in einer Suspension aus Precursorfasern, um dann nicht gewebten Stoff durch eine konventionelle Feuchtlagenbehandlung herzustellen. Windeln, die aus einem Gewebe hergestellt sind, welches organophilen Ton enthält, können dazu beitragen, Hautirritationen durch fäkale Enzyme bei Kindern, welche diese Windeln tragen, zu verhindern.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL
Das nachfolgende Ausführungsbeispiel illustriert die Wirksamkeit von Quaternium-18 Bentonit als absorbierenden Stoff und als Deaktivator für proteolytische Enzyme aus Fäkalien.
Die Test wurden an Lösungen von drei verschiedenen proteolytischen Verdauungsenzymen, Chymotrypsin, Trypsin und Elasthase, durchgeführt, um die Wirksamkeit von Bentonit-Ton zur Adsorption und/oder Deaktivierung dieser Enzyme zu demonstrieren, wobei der Ton durch eine Behandlung mit Quaternium-18 organophil gemacht wurde (im Folgenden wird dieser als „Quaternium-18 Bentonit" oder als „Q-18B" bezeichnet). Die Menge der durch Adsorption im Q-18B immobilisierten Enzym wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt und der neutralisierende Effekt von Q-18B wurde durch die Messung des Verlusts an enzymatischer Aktivität mittels Standardaktivitätstests ermittelt und diese Verringerung in der Aktivität mit der Neutralisierung der Enzyme durch Adsorption verglichen.
Um die Tests zur Bestimmung der Adsorption und der Neutralisierungseffizienz von Q-18B durchzuführen, wurden wässrige Lösungen von Chymotrypsin, Trypsin, Elasthase mittels eines Phosphatpuffers bei einem pH-Wert 8 hergestellt, bei diesem pH haben diese Enzyme nachgewiesenermaßen ihre maximale proteolytische Aktivität. Die Testlösungen enthielten 0,4 mg/0,4 ml (mg/ml) Trypsin, 0,2 mg/ml Trypsin und 1,0 mg/ml Elasthase. Diese Konzentrationen entsprechen den durchschnittlichen Konzentrationen dieser drei hauptsächlichen proteolytischen Enzyme aus Fäkalien von Kindern.
Die enzymatische Gesamtaktivität für jede Lösung wurde durch die Verwendung eines Aliquots von 1,0 ml gemessen, wobei drei Experimente durchgeführt wurden und der Mittelwert aus den drei gemessenen Werten ermittelt wurde.
Der adsorbierende und inaktivierende Effekt von Q-18B für jede der Enzymlösungen wurde mittels des folgenden Verfahrens ermittelt. Die Testlösungen umfassen 10,0 ml der von jedem der Enzyme hergestellten Enzymlösungen. Zu jeder Testprobe wurden 1,0 Gramm Q-18B hinzugefügt und die so erhaltene Mischung wurde mittels eines Magnetrührers für 10 Minuten bei geringer Geschwindigkeit durchmischt. Die Mischung wurde dann mittels eines vorgewaschenen Nr. 1 Filterpapiers gefiltert und das Filtrat gesammelt und dessen Volumen sorgsam gemessen. Eine entsprechende Kontrollprobe wurde durch Filtration von 10 ml einer Enzymlösung durch Filterpapier hergestellt. Das Filtrat wurde dann zu einer Dialyseröhre mit einer Dialyseschwelle von 2000 Daltons transferiert und eine Dialyse für 4 Stunden bei 4°–6°C gegen deioniertes Wasser durchgeführt. Der Rückstand aus dem Dialyseschritt wurde gefriergetrocknet, um so das zurückbleibende Enzympulver zu sammeln. Das einer Gewichtsbestimmung unterzogene zurückbehaltene Enzym wurde in einer Phosphatpulverlösung bei einem pH-Wert 8 aufgelöst und die enzymatische Aktivität wie voranstehend beschrieben bestimmt. Da durch die Testprozedur ein gewisser Verlust an Enzymen und an enzymatischer Aktivität resultiert, wurde eine Kontrollprobe durch Auflösen eines weiteren Aliquots aus gefriergetrockneten zurückbehaltenen Enzymen in einer geeigneten beweglichen Phase durchgeführt und der Enzymanteil durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) gemessen. Die Adsorption und der inaktivierende Effekt von Q-18B wurden durch den Vergleich des Verlusts an Enzymen von enzymatischer Aktivität der behandelten Testproben mit dem entsprechenden Verlust bei den Kontrollproben bestimmt.
Details des analytischen Verfahrens und der so erzielten Resultate werden nachfolgend beschrieben.
Um Proben zur Analyse einer bestimmten Menge von Protein und dessen enzymatischer Aktivität herzustellen, wurde das gefriergetrocknete Filtrat in 6,0 ml Wasser aufgelöst und in zwei Teile mit je 3,0 ml aufgeteilt. Diese Lösungen wurden wiederum gefriergetrocknet, um einen Festkörper zu erhalten. Folglich ergab jede experimentelle Bestimmung zwei zurückbehaltene Stoffmengen gleichen Gewichts, die zur Bestimmung des Anteils an Proteinen und der enzymatischen Aktivität des nach der Behandlung mit Q-18B in der Enzymlösung verbleibenden Enzyms herangezogen werden konnten.
Bestimmung der Enzymmenge in Form von Protein
Chymotrypsin
Eine Standard-Chymotrypsin-Lösung wurde durch Auflösen von 2,30 mg Chymotrypsin in 2,30 ml Wasser hergestellt, um eine Enzymlösung mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml zu erhalten. Eine Menge mit 50 Mikrolitern (μl) dieser Lösung wurde in einen Hochleistungsflüssigchromatographen eingeführt, wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren unter Verwendung einer beweglichen Phase mit einer ursprünglichen Zusammensetzung von 2,3 M Ammoniumsulfat in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8 und einer Endzusammensetzung bestehend aus einem reinen Phosphatpuffer Anwendung fand, wobei als Gradientenzeit 10 Minuten angesetzt wurden. Die Laufzeit wurde mit 6,1–6,2 Minuten bestimmt.
Die gefriergetrockneten zurückbehaltenen Stoffe der Kontroll- und der Testproben wurden in 2,0 ml Wasser aufgelöst und jede der Lösungen wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem oberen Protokoll unterzogen. Die aufgefundenen Resultate werden in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Trypsin
Eine Standard-Trypsinlösung wurde durch das Auflösen von 2,50 mg Trypsin in 2,50 ml Wasser hergestellt, wobei sich eine Lösung mit einer Enzymkonzentration von 1,0 mg/ml ergab. Eine Menge mit 50 Mikrolitern (μl) dieser Lösung wurde in einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen eingeführt, wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren Verwendung fand, wobei die bewegliche Phase mit einer ursprünglichen Zusammensetzung von 2 M Ammoniumsulfat in einem Tris HCl Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 verwendet wurde und als Endzusammensetzung der reine Puffer ohne das Ammoniumsulfat resultierte, und wobei eine Gradientenzeit von 10 Minuten angesetzt wurde. Die Laufzeit wurde mit 6,61 Minuten für Beta-Trypsin und 7,72 Minuten für alpha-Trypsin bestimmt.
Die gefriergetrockneten zurückbehaltenen Anteile der Kontroll- und der Testproben wurden jeweils in 2,0 ml Wasser aufgelöst und jede der Lösungen wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem voranstehend beschriebenen Protokoll unterzogen. Diese aufgefundenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt, wobei die Gesamtkonzentration von Trypsin (alpha- und beta-Trypsin) angegeben ist.
Elasthase
Eine Standard-Elasthaselösung wurde durch das Auflösen von 1,90 mg Elasthase in 0,95 ml Wasser hergestellt, wobei sich eine Lösung mit einer Enzymkonzentration von 2,0 mg/ml ergab. Eine Menge mit 50 Mikrolitern (μl) dieser Lösung wurde in einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen eingeführt, wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren Verwendung fand, und wobei die bewegliche Phase mit einer ursprünglichen Zusammensetzung von 2 M Ammoniumsulfat in einem Tris HCl Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 verwendet wurde und als Endzusammensetzung der reine Puffer ohne das Ammoniumsulfat resultierte und, wobei eine Gradientenzeit von 10 Minuten verwendet wird. Die Laufzeit wurde mit 7,75 Minuten für alpha-Trypsin bestimmt.
Die gefriergetrockneten zurückbehaltenen Anteile der Kontroll- und der Testproben wurden jeweils in 2,0 ml Wasser aufgelöst und jede der Lösungen wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem voranstehend beschriebenen Protokoll unterzogen. Diese aufgefundenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1 Verlust an Enzymproteinen einer Lösung, die einer Behandlung mit Q-18 unterzogen wurde
Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Chymotrypsin
Eine Standard-Chymotrypsin-Lösung wurde durch Auflösung von 0,40 mg Chymotrypsin in 5,0 ml Phosphatpuffer hergestellt. Die enzymatische Konzentration wurde durch das folgende Verfahren analysiert:

Folgende Reagenzien wurden hergestellt:

Reagenz A:	80 mM Tris HCl-Puffer, pH 7,8 bei 25°C;
Reagenz B:	1,18 mM Natriumbenzoyl Tyrosin Ethylester-Lösung, hergestellt durch das Auflösen der Reagenzien in 31,7 ml Methanol und Verdünnung bis zu einem Volumen von 50 ml mit deioniziertem Wasser;
Reagenz C:	1 mM Wasserstoffchloridsäure Lösung;
Reagenz D:	Phosphatpuffer (die Chymotrypsinlösung wurde mit einer Konzentration von 2–5 Einheiten/ml in Reagenz D verwendet.)

Eine Reaktionslösung wurde durch die Mischung von 1,42 ml Reagenz A, 1,40 ml Reagenz B und 0,08 ml Reagenz C hergestellt. Die Lösung wurde durch Rotation vermischt und die optische Adsorption bei einer Wellenlänge von 256 nm (A_256nm) solange beobachtet, bis diese konstant war. Daraufhin wurde 0,1 ml Enzymlösung in Reagenz D zur Reaktionslösung hinzugefügt, die Lösung wurde durch Rotation gemischt und die A_256nm Adsorption wurde für ungefähr 5 Minuten beobachtet. Die maximale Abnahmerate der optischen Adsorption (ΔA_256nm/min) wurde als Messgröße der Enzymkonzentration angenommen. Ein Vergleichsdurchgang wurde durch die Verwendung von ausschließlich Reagenz D ohne Enzym durchgeführt und der Vergleichswert für ΔA_256nm/min wurde für jede der Enzymlösungen subtrahiert, um so zu einem Wert zu kommen, welcher proportional zur Konzentration des Enzyms ist.
Die Testproben wurden durch Auflösung des gefriergetrockneten Rückstands des aufgeteilten Dialyserückbehalts analysiert, wobei dieser einen Maximalwert von 2,0 mg Chymotrypsin in 5,0 ml Reagenz D enthielt, daraufhin wurde die tatsächliche Konzentration von Chymotrypsin gemäß der voranstehend beschriebenen Vorgehensweise bestimmt, wobei eine Menge von 0,1 ml der Lösung verwendet wurde. Die Resultate des Tests sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt.
Trypsin
Eine Standard-Trypsin-Lösung wurde durch die Auflösung von 0,40 mg Trypsin in 10,0 ml Phosphatpufferlösung (kalt) hergestellt. Die Enzymkonzentration wurde durch die folgende Vorgehensweise bestimmt:

Folgende Reagenzien wurden hergestellt:

Reagenz E:	67 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,6 bei 25°C;
Reagenz F:	0,25 mM Natriumbenzoyl L-Arginin Ethylester-Lösung;
Reagenz G:	Trypsin-Enzym-Lösung mit 350–700 Einheiten/ml des Reagenz E.

Eine Reaktionslösung wurde durch die Stabilisierung von 3,00 ml des Reagenz E bei 25°C hergestellt, wobei die optische Adsorption bei einer Wellenlänge von 253 nm (A_253nm) solange beobachtet wurde, bis diese konstant blieb. Daraufhin wurde eine Menge von 0,2 ml des Reagenz G zur Reaktionslösung hinzugefügt, die Reaktionslösung wurde durch Rotation gemischt und der A_253nm-Wert wurde für ungefähr 5 Minuten beobachtet. Die maximale Abnahmerate der optischen Adsorption (ΔA_253nm/min) wurde als Messgröße für die Enzymkonzentration angenommen. Ein Vergleichsdurchgang wurde mit dem Reagenz G ohne Enzym durchgeführt, wobei der ΔA_253nm/min-Wert der Testprobe für jede der Enzymlösungen subtrahiert wurde, um so zu einem Wert zu gelangen, welcher proportional zur Konzentration des Enzyms ist.
Die Testproben wurden durch die Auflösung des gefriergetrockneten Rückstands des aufgeteilten Dialyserückbehalts analysiert, welche einen Maximalanteil von 1,0 mg Chymotrypsin in einer Menge von 10,0 ml des Reagenz E enthielten, wobei die tatsächliche Konzentration von Chymotrypsin durch die voranstehend beschriebene Vorgehensweise mittels Verwendung von 0,2 ml der Testlösung bestimmt wurde. Die Resultate des Tests sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt.
Elasthase
Ein kaliometrisches Endpunktverfahren wurde zur Bestimmung der in den Testproben, d. h. des gefriergetrockneten Stoffs aus dem aufgeteilten Dialyserückbehalt, befindlichen Elasthasemenge herangezogen.
Folgende Reagenzien wurden hergestellt:

Reagenz H: 200 mM Tris Puffer, pH 8,8 bei 37°C;

Reagenz I: Elasthase-Orcein-Substrat;

Reagenz J: Elasthase-Enzym-Lösung mit 25–100 Einheiten/ml im Reagenz H.
Eine Serie von Elasthase-Substrat-Lösungen wurde durch das Auflösen abgewogener Menge von Reagenz I in Reagenz H hergestellt. Eine Menge der Standard- oder der Vergleichslösung wurde dann mit den Substratlösungen wie folgt vermischt:
Die Standardlösung mit Elasthase wurde durch die Auflösung von 12,06 mg Elasthase in 2,0 ml Puffer hergestellt, was eine Lösung mit 1,03 mg Elasthase pro Milliliter ergab. Eine Menge von 0,01 ml der Standard-Elasthase-Lösung wurde zu der Substratlösung hinzugefügt, die Lösung wurde durch Verquirlen vermischt und für 12–16 Stunden bei 37°C einer Wärmebehandlung unterzogen. Es wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 590 Nanometern (A₅₉₀) des Standards gemessen und eine Standardkurve hergestellt.
Die Testproben wurden durch die Auflösung des gefriergetrockneten Rückstands des aufgeteilten Dialyserückbehalts analysiert, wobei diese einen Maximalwert von 5,0 mg (600 Einheiten) Elasthase in 2,0 ml des Pulvers enthielten, dann wurden 0,01 ml der Testlösungen mit der Substratmischung für 20 Minuten bei 37°C einer Wärmebehandlung unterzogen. Der A₅₉₀-Wert wurde für die Testproben bestimmt und die Standardlösung wurde gemäß der voranstehend beschriebenen Vorgehensweise hergestellt, dann wurde die enthaltene Enzymmenge berechnet. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 Verlust an Enzymprotein durch Behandlung einer Lösung mit Q-18
Die in dem Ausführungsbeispiel dargestellten Daten zeigen, dass ein wesentlicher Anteil der proteolytische Enzyme aus Enzymen, welche für Hautirritationen beim Windelausschlag und dergleichen verantwortlich sind, durch den Kontakt mit organophilen Tonen wie Quaternium-18 Bentonit inaktiviert werden.

Claims

Verwendung eines organophilen Tons, welcher ein Reaktionsprodukt eines Tons, ausgewählt aus der Gruppe, die aus natürlich vorkommenden und synthetischen Montmorillonit, Bentonit, Beidellit, Hektorit, Saponit und Stevensit gebildet wird, mit einer langkettigen organischen quaternären Ammoniumverbindung ist, zur Herstellung eines Mittels zum Schutz der Haut von Menschen und Säugetieren gegen Irritationen verursacht durch den Kontakt mit Fäkalien, die proteolytische Enzyme enthalten.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Mittel eine Mischung ist, die eine Verteilung des organophilen Tons in einer pharmazeutisch verwendbaren, dermatologischen Trägersubstanz enthält.
Verwendung nach Anspruch 2, bei welcher die Trägersubstanz eine Lotion, ein Gel, eine Creme oder ein Puder ist.
Verwendung nach Anspruch 3, bei welcher der organophile Ton mit einem Anteil von 3 Gew.-% bis 20 Gew.-% vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher der oragnophile Ton aktiviert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher der organophile Ton ein Reaktionsprodukt von Bentonit mit einer langkettigen organischen quaternären Ammoniumverbindung ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher der organophile Ton ein Quaternium-18 Bentonit ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Mittel ein Feststoff ist, der den organophilen Ton verteilt in einer wasserdurchlässigen Matrix enthält.
Verwendung nach Anspruch 8, bei welcher die Matrix ein stark saugfähiges Polymer ist.
Verwendung nach Anspruch 9, bei welcher das stark saugfähige Polymer ein vernetztes Polymer aus ungesättigter Carbonsäure oder ein vernetztes Polymer einer Aminosäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Mittel ein Gewebe ist, das ein gewebtes oder ungewebtes Geflecht zur Aufnahme des organophilen Tons enthält.
Verwendung nach Anspruch 11, bei welcher der organophile Ton in einer wasserdurchlässigen Matrix verteilt ist.
Verwendung nach Anspruch 12, bei welcher die Matrix ein stark saugfähiges Polymer ist.
Verwendung nach Anspruch 13, bei welcher das stark saugfähige Polymer ein vernetztes Polymer aus ungesättigter Carbonsäure oder ein vernetztes Polymer einer Aminosäure wie Asparaginsäure ist.