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HINTERGRUND
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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung einer pektischen Substanz zur
Stabilisierung eines Pektin/Heparin-bindenden Proteins, die resultierende
Zusammensetzung und Formulierung und das Verfahren zur Stabilisierung
des Pektin/Heparin-bindenden Proteins.
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Folgende
Abkürzungen
werden für
diese Erfindung verwendet:
aFGF, azidischer Fibroblastenwachstumsfaktor;
bFGF, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor; BSA, bovines Serumalbumin;
Da, Dalton; DAc, Acetylierungsgrad; DM, Methylierungsgrad; EDTA,
Ethylendiamintetraessigsäure;
EGF, epidermaler Wachstumsfaktor; Gal A, Galakturonsäure; HM,
High Methoxyl; HMW, Hochmolekulargewicht; IL, Interleukin; kDa,
kiloDalton; KGF, Keratinozytenwachstumsfaktor; LM, Low Methoxyl;
LMW, Niedrigmolekulargewicht; PDGF, Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor;
SDS, Natriumdodecylsulfat; TGF-α, transformierender
Wachstumsfaktor-α;
TGF-β1,
transformierender Wachstumsfaktor-β1;
TN-Puffer; 25 mM Tris, 0,15 M NACL, pH 7,4; TNF-α, Tumornekrosefaktor-α.
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Pektin
ist eine Pflanzenzellwandkomponente. Die Zellwand ist in drei Schichten
geteilt, Mittellamelle, primäre
und sekundäre
Zellwand. Die Mittellamelle ist am pektinreichsten. Pektine werden
während
des Zellwandwachstums hergestellt und gespeichert und sind besonders
reichlich im weichen Pflanzengewebe unter schnellen Wachstumsbedingungen
und hohem Feuchtigkeitsgehalt vorhanden. In den Zellwänden sind
Pektine in Form von Kalziumkomplexen vorhanden. Die Beteiligung
von Kalzium-Kreuzverlinkung liegt in der Tatsache begründet, dass
die chelatbildenden Verbindungen die Freisetzung von Pektin aus
den Zellwänden
ermöglichen.
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Pektin
ist ein komplexes Polysaccharid. Es besteht aus einer 1–4 verknüpften Polygalakturonsäuregerüst, zwischengeschaltet
mit Rhamnoseresten und modifiziert mit neutralen Zuckerseitenketten
und Nicht-Zuckerkomponenten, wie Acetyl- Methyl- und Ferulasäureeinheiten. Die neutralen
Zuckerseitenketten, welche Arabinan und Arabinogalaktane (Typen
I und II) umfassen, sind mit den Rhamnoseresten im Molekülgerüst an der
O-3 oder O-4 Position geknüpft.
Die Rhamnosereste neigen dazu; am Molekülgerüst miteinander zu verklumpen.
Deshalb wird die mit den Seitenketten versehene als haarige Region
und der Rest des Molekülgerüstes als
glatte Region bezeichnet. Rhamnosereste sind 1-2 an Gal A-Resten
am Molekülgerüst gebunden und
die Konfiguration dieser Verknüpfung
wurde nun als α bestimmt.
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Aufgrund
der Präsenz
von neutralen Zuckerseitenketten und einigen anderen Nicht-Zuckerkomponenten
ist die Struktur der Pektine sehr komplex; tatsächlich besitzen keine zwei
Moleküle
eine identische Struktur.
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Rhamnose,
Galaktose, Arabinose, und Xylose sind die meist gebräuchlichen
neutralen Zuckerkomponenten von Pektinen. Die weniger gebräuchlichen
sind Glukose, Mannose und Fucose. Manche Xylose-Reste sind individuell
an Gal A-Reste an
der O-3 Position gebunden. Drei Typen von neutralen Zuckerseitenketten konnten
in den Pektinen identifiziert werden. Arabinan besteht aus α1-5 verlinkter
Arabinose. Arabinogalaktan besteht aus β1-4 verlinkter Galaktose mit
kurzen Arabinanketten, die an O-3 gebundensind. In Arabinogalaktan
II ist Galaktose β1-3&6 an Arabinose
gebunden.
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Methylierung
kommt an Carboxyl-Gruppen von Gal A-Resten vor. Der Methylisierungsgrad
ist definiert als der Prozentsatz der mit Methanol veresterten Carboxyl-Gruppen
(Gal A-Reste). Ein Pektin mit dem Methylisierungsgrad („DM") über 50%
gilt als ein High Methoxyl („HM") Pektin und mit
einem DM von < 50%
gilt als Low Methoxyl („LM") Pektin. Die meisten
neutralen Pektine sind HM, mit wenigen Ausnahmen wie Sonnenblumenpektin.
Der Acetylierungsgrad (DAc) ist definiert als der Prozentsatz von
mit einer Acetyl-Gruppe veresterten Gal A-Resten. Es ist anzunehmen,
dass nur die Hydroxyl-Gruppen acetyliert sind. Da jeder Gal A-Rest mehr
als eine Hydroxyl-Gruppe besitzt, kann die DAc über 100% beragen. DAc ist im
Allgemeinen in nativen Pektinen niedrig außer in solchen, wie im Rübenzucker-Pektin.
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Im
Allgemeinen sind die Pektine wasserlöslich und in meisten organischen
Lösungsmitteln
unlöslich.
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Pektine
mit einem sehr niedrigen Grad an Methyl-Veresterung und Pektinsäuren sind
nur löslich
als Kalium- oder Natriumsalze. Wie für andere Polymere, gibt es
keine Sättigungsgrenze
für Pektine,
aber es ist schwierig, eine echte Lösung zu erhalten, mit einer
höheren
Konzentration als 3–4%.
Kommerzielle Pektine haben eine Größenordnung von 7–14 × 104 Da, wobei der Wert bei Citrus-Pektinen
größer ist
als bei Apfel-Pektinen. Die Viskositäten von Pektinlösungen sind
im Allgemeinen niedrig und so werden Pektine selten als Verdickungsmitteln
eingesetzt. Die Viskosität
steht in direkter Beziehung mit der Größe, pH und der Anwesenheit von
Gegenionen. Der Zusatz monovalenter Kationen verringert die Viskosität.
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Die
Gal A-Reste im Pektingerüst
sind α1-4
verknüpft.
Beide Hydroxyl-Gruppen von D-Gal A an Kohlenstoffatomen 1 und 4
sind in der axialen Position. Die resultierende Bindung ist deshalb
trans 1-4. Dieser Bindungstyp verursacht die erhöhte Kettensteifheit des Polymers.
So sind Pektine mit einem Flexibilitätsparameter B zwischen 0,072–0,017 steife
Moleküle.
Es gibt Hinweise darauf, dass die Einfügung von Rhamnose-Reste in
das Gerüst
einen T-förmigen
Knick im Kettengerüst
verursacht. Eine Erhöhung
des Rhamnose-Bestandteils führt
zu Molekülen
mit größerer Flexibilität. Pektin
kann als ein Zickzack-Polymer bezeichnet werden, mit langen rigiden
und glatten Regionen und flexiblen und haarigen Regionen (reich
an Rhamnose), die als rotierende Gelenke dienen. Der DM hat ebenfalls
bestimmte Effekte auf die Kettenflexibilität. In Lösung konnten Pektin-Moleküle als rechtsgängige helikale
Struktur dargestellt werden.
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Pektine
sind am stabilsten bei einem pH von 3–4. Unter einem pH von 3 sind
Methoxyl- und Acetyl-Gruppen und neutrale Zuckerseitenketten entfernt.
Bei erhöhten
Temperaturen werden diese Reaktionen beschleunigt und es tritt eine
Spaltung in Glykosidbindungen im Galakturonan-Gerüst auf.
Unter neutralen und alkalischen Bedingungen werden die Methyl-Ester-Gruppen
verseift und das Polygalakturonan-Gerüst bricht durch β-Elimination-Spaltung
von Glykosidbindungen an den nicht-reduierenden Enden von methoxylierten Galakturonsäureresten
auf. Diese Reaktionen erfolgen auch schneller bei erhöhten Temperaturen.
Pektische Säuren
und LM Pektine sind resistent gegenüber neutralen und alkalischen
Bedingungen, da es keine oder nur eine begrenzte Zahl an Methylestergruppen
gibt.
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Sowohl
HM als auch LM Pektine können
Gele bilden, aber durch völlig
unterschiedlichen Mechanismen. HM Pektine bilden Gele bei der Anwesenheit
von hoch konzentrierten gelösten
Zusatzstoffen (Saccharose) bei niedrigem pH. LM Pektine bilden Gele
bei der Anwesenheit von Kalzium. Außerdem kann das Rübenzucker-Pektin
durch Kreuzverbindungen von Ferulat-Gruppen Gele bilden.
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Das
Kalzium-LM Pektingelnetzwerk wird durch Bildung der „Eierschachtel" Verbindungsbereiche
gebildet, in welchen Ca++-Ionen die Kreuzverlinkung
von zwei Strecken Polygalakturonsäure verursachen. In Apfel-
und Citrus-Pektinen haben Strecken von Polygalakturonsäure ohne
Rhamnosereste schätzungsweise eine
Länge von
72–100
Resten. Der Bereich wird durch den Rhamnoserest im Gerüst beendet.
Das Kalzium-LM Pektingel ist thermoreversibel. Das Kalzium kann
daher am Siedepunkt zugegeben werden und die Gelbildung geschieht
beim Abkühlen.
Es ist möglich,
ein festes, elastisches Gel mit 0,5% Pektin und 30–60 mg/g
Ca++ zu erhalten. Ein hoher Pektingehalt
mit wenig Kalzium ergibt ein elastisches Gel; wohingegen eine hohe
Kalziumkonzentration mit einem Minimum an Pektin zu einem spröden Gel
führt.
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Industrielle
Pektine, entweder HM oder LM, erhält man hauptsächlich aus
Apfel und Citrus durch Säureextraktion
und Alkoholpräzipitation.
LM Pektine erhält
man aus HM Pektinen durch Entesterung. Pektine haben einen günstigen
behördlichen
Status als Lebensmittelzusätze.
Sie sind in den Vereinigten Staaten als >>Generally
Recognized As Safe<< ("GRAS") und in Europa als >>Acceptable Daily Intake<< ("ADI")" klassifiziert. Dies bedeutet, dass
der Gebrauch lediglich durch die derzeitigen Anforderungen limitiert
wird, um die bestimmten Spezifikationen zu erfüllen. Diese Spezifikationen
beinhalten einen minimalen Gal A 65% (w/w).
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Viele
andere Pflanzenquellen wurden ebenfalls für die Pektin-Herstellung untersucht.
Zwei von ihnen, Zuckerrübenfleisch
und Sonnenblumenköpfe
wurden intensiv untersucht. Beide sind als Rohmaterial verbreitet.
Jedoch hat Zuckerrübenfleisch
eine geringe gelbildende Eigenschaft, hauptsächlich wegen seinem hohen Gehalt
an Acetyl-Gruppen und der geringen molekularen Größe (~5 × 104 Da). Die Sonnenblumen-Pektine sind von
Natur aus LM und können
gut mit Chelatbildner extrahiert werden. Chemisch hat das Sonnenblumenkopf-Pektin
einen sehr hohen Gal A Gehalt und ist ein natürliches LM Pektin, wohingegen
das Zuckerrüben-Pektin
einen relativ geringen Gal A Gehalt und einen hohen Anteil an Acetyl-
und Ferulasäure-Gruppen hat.
Die Strukturen von Apfel- und Citrus-Pektin sind sehr ähnlich.
Pektine werden traditionell als Nahrungsmittel-Zusatzstoffe verwendet.
Jedoch ist ihr Gebrauch genauso gut auf pharmazeutische Gebiete
ausgedehnt worden. Sie leiden oft an einer geringen Qualität der Rohmaterialien
und einer geringen Farbqualität
(normalerweise braun) der Pektin Endprodukte.
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Pektine
von unterschiedlichen Pflanzenquellen haben verschiedene Eigenschaften.
Im Allgemeinen haben alle kommerziellen Pektine, einschließlich derer,
die weiterverarbeitet wurden, als Endprodukt einen bestimmten Grad
an Färbung.
Die Farbe reicht von hellem Gelb/Braun (Citrus-Pektin) die zu dunklem
Braun (Apfel- und Sonnenblumenkopf-Pektine). Die Färbung wird
durch die Kombination von zwei Faktoren verursacht: Natürliche Farbe
(Pigmentierung) der Rohmaterialien und ihr Gehalt an Polyphenolen.
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Pektine
sind gegen gastrointestinale Ulcera und Enterocolitis wirksam. Pektine
beeinflussen ebenso die Zellproliferation in den Eingeweiden. Sie
haben ebenso einen Blutcholesterin senkenden Effekt und inhibieren
Atherosklerose. Die Wirkung ist das Ergebnis von Interaktionen zwischen
Pektinen und biliären
Salzen. Es wurde gezeigt, dass Pektine ebenso dass Fibrin-Netzwerk
bei Individuen mit erhöhtem
Cholesterinspiegel beeinflussen. Pektine sind ebenso wirksam bei
der Entfernung von Blei und Quecksilber aus dem Verdauungstrakt
und den respiratorischen Organen.
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Proteine
besitzen einzigartige chemische und physikalische Eigenschaften,
die verschiedene Stabilitätsprobleme
aufwerfen: Für
Proteine existieren eine Vielzahl von Abbauwegen, die sowohl die
chemische als auch physikalische Instabilität involvieren. Diese Makromoleküle unterliegen
ebenso dem Risiko mikrobiellen Abbaus wegen hinzukommender Kontamination
der Lösungen
während
der Reinigung oder Lagerung. All diese Gesichtspunkte sind besonders
für den
pharmazeutischen Hersteller kritisch, der diese Wirkstoffe formuliert und
verpackt. Deshalb ist ein gründliches
Vor-Formulierungsprogramm ein notwendiger Schritt für Proteinarzneimittel,
um ihre möglichen
Formulierungsprobleme zu lösen.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Zusammensetzung und das Herstellungsverfahren
eines stabilisierten Pektin/Heparin-bindenden Proteins mit einem
Pektin/Heparin-bindenden Protein und einer pektischen Substanz in
einer Menge, die in der Lage ist, das Pektin/Heparin-bindende Protein
zu stabilisieren. Verwendbares Pektin/Heparin-bindendes Protein
umfasst Pektin/Heparin-bindende Wachstumsfaktoren. Verwendbare pektische
Substanzen umfassen Aloe-Pektin, Low Methoxyl-Pektin, entestertes
Pektin, pektische Säure,
Pektat, pektinische Säure,
Pektinat, Pektin-Kalzium-Gel, Aloe-Pektin -Natrium-Gel, Aloe Vera
Inneres Gel-Zellwandfaser
und andere.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung,
die eine pektische Substanz, einen Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktor
und einen Verdicker aufweist.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines
Pektin/Heparin-bindenden Proteins.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die 1a–b. zeigen
die Bindung von Aloe Pektin an bFGF. Der Bindungs-Assay wurde mit
pektinreichen Aloe Vera Inneres Gel-Zellwandfasern wie in Beispiel
6 beschrieben durchgeführt.
Lösliches
Aloe Pektin (1a und 1b) oder
Heparin (1b) wurden als Inhibitor verwendet.
Eine Probe von bFGF (0,5 μg) wurde
als Standard für
den Vergleich der OD-Werte direkt auf das Gel geladen (1a),
die nicht Teil der Bindungs- oder Inhibierungsreaktion war, wie
mit „x" gekennzeichnet.
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2.
zeigt den Vergleich von Aloe Pektin mit anderen Pektinen verschiedener
DM Werte bei der Inhibierung der Bindung von bFGF an pektinreiche
Aloe Vera Inneres Gel-Zellwandfasern.
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3.
zeigt den Schutz von bFGF durch Aloe Pektin gegen enzymatischen
Abbau. bFGF (0,5 μg)
wurde mit Trypsin (0,5 μg)
in Anwesenheit oder Abwesenheit von Aloe Pektin gemischt, wie in
Beispiel 8 beschrieben. Nach der Inkubation bei 37°C für eine Stunde
wurde bFGF durch SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese aufgetrennt.
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4.
zeigt die Bindung von Aloe Pektin-Kalzium-Gel-Kügelchen an bFGF. Der Bindungs-Assay
wurde wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt. Ein Gel-Kügelchen wurde für jeden
Bindungs-Assay verwendet. Lösliches
Aloe Pektin wurde als Inhibitor verwendet.
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5.
zeigt die Affinitätschromatographie
mit Aloe Vera Inneres Gel-Zellwandfaser als pektinhaltige Matrix.
bFGF wurde auf eine Säule
geladen, die aus Inneres Gel-Zellwandfasern
bestand. Die Eluation wurde schrittweise mit 0,4 ml NaCl bei verschiedenen
molaren Konzentrationen durchgeführt.
Die Fraktionen wurden einer Gelelektrophorese zum Nachweis von bFGF
unterzogen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Der
allgemeine Begriff „pektische
Substanz", wie er
in dieser Erfindung benutzt wird, umfasst Pektin, Low Methoxyl-Pektin,
entestertes Pektin, Pektin-Kalzium-Gel, Aloe-Pektin-Natrium-Gel, pektische Säure, Pektat,
pektinische Säure,
Pektinat, Protopektin und pektinreiche Substanzen, wie Aloe Vera
Inneres Gel-Zellwandfaser, individuell, kollektiv oder in Kombination
davon. Wie oben diskutiert, ist Pektin ein Oberbegriff für die komplexen,
kolloidalen Kohlenhydratderivate, die in Pflanzen vorkommen oder
daraus hergestellt werden und einen großen Anteil Anhydrogalakturonsäureinheiten
enthalten, welche, wie man glaubt, in kettenähnlicher Kombination vorliegen.
Die Carboxyl-Gruppen im können
teilweise mit Methyl-Gruppen verestert und teilweise oder vollständig durch
eine oder mehrere Basen neutralisiert sein. Deshalb bedeutet „entestert" gewöhnlich,
dass einer oder mehrere Methylester-Gruppen aus den Pektin Molekülen entfernt
worden sind. „Pektische Säure" ist der Oberbegriff
für pektische
Substanzen, die hauptsächlich
aus kolloidalen Polygalakturonsäuren zusammengesetzt
und im Wesentlichen frei von Methylester-Gruppen sind. Das vollständig entesterte
Pektin ist pektische Säure
oder Polygalakturonsäure. „Pektate" sind entweder normale
oder saure Salze der Pektinsäuren. „Pektinsäuren" sind die kolloidalen
Polygalakturonsäuren,
die mehr als einen vernachlässigbaren
Anteil an Methylester-Gruppen enthalten. „Pektinate" sind entweder normale oder saure Salze
der Pektininsäuren. „Protopektin" wird auf das wasserunlösliche Vorgängerpektin
angewandt, dass in Pflanzen vorkommt und das bei eingeschränkter Hydrolyse
Pektine, Pektininsäuren
und anderes ergibt. Das wasserunlösliche Pektin kann mit in der
Pflanze vorkommender Zellulose assoziiert sein, so wie Aloe Vera
Inneres Gel-Zellwandfaser.
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Aloe Pektin
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Aloe
Vera Blätter
bestehen aus zwei Teilen, einer äußeren grünen Finde
und einem klaren inneren Gel, das auch als Mark bezeichnet wird.
Aloe Pektin wird aus der inneren Gel- oder äußeren Rinden-Zellwandfaser extrahiert.
Die Verwendung eines Chelatbildners bei einem leicht alkalischen
pH ist die am meisten ergiebige Extraktionsmethode. Aloe Pektin
ist einzigartig im Vergleich mit vorher beschriebenen Pektinen.
Es hat einen hohen Rhamnose-Gehalt, > 4% in der aufgereinigten Pektin-Präparation,
was mindestens zweimal mehr ist, als in anderen Pektinen, wie Citrus,
Apfel, Zuckerrübe
und Sonnenblume. Rhamnose ist ein Schlüsselzucker in dem Pektin-Gerüst, dessen
Gehalt die Flexibilität
des Moleküls
beeinflusst. Aloe Pektin besitzt ebenfalls einen seltenen Zucker,
3-OMe-Rhamnose, der nicht in anderen Pektinen beschrieben worden
ist. Aloe Pektin ist natürlicherweise
LM, mit einem DM von im allgemeinen < 30% und oftmals < 10%. Der Gal A Gehalt von Aloe Pektin
ist > 70%. Aloe Pektin
ist in der Lage, in der Gegenwart von Kalzium Gel zu bilden. Nur
Aloe Pektin, besonders die Form mit hohem Molekulargewicht (HMW)
hin, kann ebenfalls ein monovalentes kationenbasiertes reversibles
Gel bei niedriger Temperatur (4°C)
bei einer Pektin-Konzentration,
die so niedrig wie 1 mg/ml ist, bilden. Ein Beispiel für das monovalente
Kation ist Natrium. Eine derartige kalte Gelbildung ist nicht für andere
Pektine beschrieben worden.
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Aloe
Pektin, das von den Inneren Gelfasern extrahiert wurde, ist ein
cremefarbenes Pulver und produziert eine klare Lösung, verglichen mit den gelben
bis bräunlichen
Pulvern und wolkigen Lösungen
von den derzeitigen kommerziellen und experimentellen Pektinen aus
Citrus, Apfel, Zuckerrübe
oder Sonnenblume.
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Aloe
Pektin kann von anderen Pektinen durch eine oder mehrere der folgenden
Eigenschaften unterschieden werden:
- 1) Ein
hohes Molekulargewicht (> 1 × 106 Da) und eine hohe intrinsische Viskosität (> 550 ml/g).
- 2) Ein hoher Rhamnose Gehalt (> 4%).
- 3) Enthält
3-OMe-Rhamnose.
- 4) Ist natürliches
LM.
- 5) Fähig
zur Bildung von Kalziumgel.
- 6) Fähig
zur monovalenten kationenbasierten Gelbildung bei niedriger Temperatur
(4°C).
- 7) Cremefarbenes Pulver und klare Lösung (von den Inneren Gelfasern
extrahiertes Aloe Pektin).
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Pektin/Heparin-bindende
Proteine
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Im
Säugetiersystem
gibt es über
100 heparinbindende Proteine. Diese umfassen: (1) Zelluläre Matrixproteine,
wie Kollagen, Fibronectin, Vitronectin; (2) Cytokine wie IL-3, IL-8,
IFN-γ, PF-4,
MIP-1 und Mitglieder aus der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren
und der transformierenden β-Wachstumsfaktoren;
(3) Enzyme wie Elastase und Phospholipase A2; (4) An der Blutgerinnung
beteiligte Proteine wie Antithrombin, Thrombin und Fibrin; und andere.
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Es
gibt eine große
Anzahl an Cytokinen, die essenzielle Regulatoren von verschiedenen
biologischen Funktionen in einem Säugetier sind. Diese sind gewöhnlich Proteine
mit geringem Molekulargewicht oder Peptide. Einige dieser Cytokine
sind Wachstumsfaktoren. Wachstumsfaktoren sind Proteine oder Peptide,
die fähig
sind, die Zellteilung zu stimulieren. Sie sind wichtige Faktoren
bei der Zellproliferation und -entwicklung. Es gibt fünf größere Wachstumsfaktorfamilien,
epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktor
(PDGF), insulinähnlichen
Wachstumsfaktor (IGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF). Wachstumsfaktoren
sind ebenso wichtig für
die Wundheilung. bFGF und TGF-β sind
in großem
Umfang hinsichtlich einer beschleunigten Wundheilung untersucht
worden. In dieser Erfindung bezeichnet der Begriff „Wachstumsfaktor" einen natürlichen
und/oder rekombinanten Wachstumsfaktor, gereinigt oder ungereinigt,
in vitro, in vivo oder ex vivo.
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Viele
Wachstumsfaktoren binden Heparin, einschließlich der Mitglieder der TGF-β und FGF
Familien. Die Bindung ist entscheidend für ihre Funktionen. Heparin
ist ein Polymer mit einer sulfatierten Disaccharid Wiederholungssequenz
(→GlcAβ1-4GlcNAcα1→) (Casu,
(1989), Annals of New York Academy of Science 556, pp.1-17). Es ist von den
Polysaccharidketten von Proteoglykanen abgeleitet, die gewöhnlich auf
Zelloberflächen
gefunden werden, zum Beispiel Glycosaminoglycan (GAG). Wie Pektin
ist Heparin ein negativ geladenes Molekül. Die Wechselwirkung von Heparin
mit Heparin-bindenden Proteinen, einschließlich des sauren oder basischen
Fibroblastenwachstumsfaktors (aFGF oder bFGF) wurde intensiv untersucht.
Die Heparin-bindenden Domänen
auf aFGF und bFGF sind identifiziert worden. Solche Domänen betreffen
immer positiv geladene Aminosäurereste,
die eine größere Rolle
in der Vermittlung der Bindung von dem Heparin durch ionische Wechselwirkung
spielen (Cardin und Weintraub, (1988), Arteriosclerosis 9, pp. 21–32; Faham
et al., (1996), Science 271, pp. 11 16-1 120). Die kleinste Bindungsstelle
auf Heparin für
einige von diesen Wachstumsfaktoren ist ebenso identifiziert worden.
Es wurde gezeigt, dass diejenige für bFGF nur aus fünf oder
sechs Zuckern besteht. Wegen der Variationen im Umfang und der Position
der Sulfatierung können
die Proteinbindungs-Spezifitäten
in den verschiedenen Regionen eines einzelnen Heparin-Moleküls unterschiedlich
sein. Dies bedeutet, dass verschiedene Heparin-bindende Proteine an unterschiedliche
Bereiche von Heparin-Molekülen
binden können.
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Die
Bindung an Heparin stabilisiert Wachstumsfaktoren gegen Inaktivierung
durch Hitze, Säure
und Proteaseabbau und stellt einen Wachstumsfaktorreservoir und
ein Bioverfügbarkeitskontrollmechanismus
zur Verfügung.
Die Heparinbindung ermöglicht
ebenso die Bindung von Wachstumsfaktoren an ihre hochaffinen Signalrezeptoren
und die Induktion der Kreuzverlinkung der Rezeptoren für die Initiierung
der Signal Transduktion.
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Das
Innere Aloe Vera Gel, ein Wasser speicherndes Gewebe, besteht aus
großen
Mesophyllzellen, die nur eine sehr begrenzte Zahl an degenerierten
Zellorganellen enthalten. Nach dem Aufbrechen des Inneren Gels durch
Homogenisierung, können
Mesophyllzellwandfasern (aufgebrochene Mesophyllzellwandfragmente)
durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit oder Filtration
isoliert werden. Diese Fasern erscheinen unter dem Mikroskop als
klare, transparente Blätter.
Sie sind reich an Aloe Pektin (50%, w/w), die mit dem Chelatbildner
EDTA extrahiert oder solubilisiert werden können.
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Die
Inneres Gel-Zellwandfasern können
durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit schnell pelletiert
werden. Deshalb können
Bindungs-Assays, um zu bestimmen, ob Aloe Pektin an irgendwelche Wachstumsfaktoren
bindet, Cytokine oder andere Proteine, unter Verwendung dieser Fasern
durchgeführt werden.
Die tatsächliche
Bindung an Aloe Pektin wurde durch einen Inhibierungs-Assay unter
Verwendung von löslichem
Aloe Pektin durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass Aloe Pektin an Heparin-bindende Wachstumsfaktoren
band, an aFGF, bFGF, KGF der FGF Familie und TGF-β1 der TGF-β Familie,
aber nicht an getestete Heparin-nichtbindende
Proteine. Die Bindung wurde durch lösliches Aloe Pektin inhibiert,
was bestätigte,
dass die Bindung an die pektinreichen Zellwandfasern tatsächlich durch
Pektinmoleküle
vermittelt wurde. Die Bindung wurde ebenso durch Heparin inhibiert,
was mit der Natur der Heparinbindung dieser Wachstumsfaktoren konsistent
ist. Die getesteten kommerziellen LM oder NM Pektine zeigten keine
Bindungsaktivität
mit bFGF. Jedoch wurde eine schwache Bindung an bFGF mit einem entesterten
Citrus-Pektin beobachtet
(d.h. Polygalakturonsäure).
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Die
Bindung schützte
den Wachstumsfaktor vor Proteaseabbau, wie mit bFGF gezeigt wurde.
Sowohl das lösliche
Aloe Pektin und die pektinreichen Inneres Gel-Zellwandfasern zeigten den Schutzeffekt.
Ein, wenn auch schwächerer,
Schutzeffekt wurde auch mit der Polygalakturonsäure aus Citrus beobachtet.
Dies zeigt, dass Pektin als Stabilisator für diese Pektin/Heparin-bindenden
Wachstumsfaktoren verwendet werden kann. In dieser Erfindung wird
ein Heparin-bindendes Protein, das auch an ein Pektin bindet, als „Pektin/Heparin-bindendes
Protein" bezeichnet.
Deshalb ist ein „Pektin/Heparin-bindender
Wachstumsfaktor" ein
Wachstumsfaktor, der an ein Heparin und ebenso an ein Pektin bindet.
Die mit Aloe Vera präparierten
Kalzium-Gel-Kügelchen binden
ebenso an diese Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren. Deshalb
können
die vorgeformten Pektin-Kügelchen
mit solchen Wachstumsfaktoren für
Lieferzwecke beladen werden. Darüber
hinaus könnten die
Wachstumsfaktoren in das Pektin-Kalzium-Kügelchen für Lieferzwecke eingekapselt
werden. Weiterhin können
diese Wachstumsfaktoren auch in dem monovalenten, kationenbasierten
Gel als Speichermedium aufbewahrt werden, was den zusätzlichen
Vorteil hat, dass es die Aggregatbildung verhindert und den eventuellen Gebrauch
in einer Lösung
erlaubt. Deshalb kann Pektin in verschiedenen Formen zur Stabilisierung
und Lieferung von Pektin/Heparin-bindenden
Wachstumsfaktoren verwendet werden, das heißt, eine Lösung, ein vorgeformtes Kalzium-Gel,
ein in Anwesenheit von dem Wachstumsfaktor gebildetes Kalzium-Gel
und ein monovalentes kationenbasiertes Gel, das in Anwesenheit von
dem Wachstumsfaktor gebildet wurde. Schließlich kann die pektinreiche
Innere Gelfaser auch als Stabilisator für die Pektin/Heparin-bindenden
Wachstumsfaktoren verwendet werden.
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Die
Bindungsstärke
von diesen Wachstumsfaktoren an Aloe Pektin wurde durch Affinitätschromatographie
bestimmt, bei der Inneres Gel-Zellwandfaser als pektinhaltige Matrix
und bFGF als Bindungsligand verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten,
dass die Bindungsstärke
an Aloe Pektin gering war (0,5–0,7
M NaCl) und schwächer
(1,4–1,6
M NaCl für
bFGF) als an Heparin (0,3–0,4
M NaCl wird als schwache Bindung betrachtet und > 1,0 M NaCl wird als starke Bindung betrachtet;
Conrade, (1998), Heparin-binding Proteins, Academic Press, San Diego,
pp. 197–199).
Die schwächere
Affinität
zu Aloe Pektin macht es sogar geeigneter für die Verwendung von Aloe Pektin
als Stabilisator und Zuführungsmedium;
kommt der Wachstumsfaktor im Komplex mit Pektin einmal in Kontakt
mit Glycosaminoglycan (Heparin) auf der Zelloberfläche, bindet
er an das Letztere, seinen natürlichen
höher affinen
Liganden, um einen stimulierenden Effekt auf die Zellen auszulösen.
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Tabelle
1. Wechselwirkung von Aloe Pektin mit Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren.
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Material
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Aloe
Vera (Aloe Barberdensis Miller) Pflanzen (10'')
wurden von H&P
Sales, Inc (Vista, California) über Lowe's Store überzogen.
Als Bulkware acetyliertes Mannan ("BAM" auch
bekannt als Acemannan Hydrogel) ist eine Aloe Vera Inneres Gel-Zellwandfaser der
Carrington Laboratories, Inc. Es wurden verschiedene kommerzielle
Pektine und Polygalakturonsäuren
verwendet. Diese umfassen HM Citrus (P-9561 mit einem DM von 92%
und P-9436 mit einem DM of 64%), LM Citrus (P-9311 mit einem DM
von 28%), Polygalakturonsäuren (P-1879)
von Sigma Chemical Co., HM Citrus (PE100 mit einem DM von 67%) von
Spectrum Chemical Co., und HM Citrus (CU401) und Apfel (AU201) von
Herbstreith-Fox KG. Die folgenden Reagenzien wurden ebenso von Sigma
Chemical Co. bezogen; Dinatrium EDTA, Tetranatrium EDTA, Endo-Polygalacturonase
und alle verwendeten neutralen und sauren Zucker. Das alkalische
Phosphatase Substrat pNPP wurde von Pierce bezogen. Natriumhexametaphosphat
wurde von Fluka Chemie AG bezogen.
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Die
recombinanten Wachstumsfaktoren/Cytokine aFGF (Acidic fibroblast
growth factor), bFGF (Basic fibroblast growth factor), KGF (Keratinocyte
growth factor), EGF (epidermal growth factor), TGF-α (transforming
growth factor-α,
TNF-α (Tumornekrosefaktor-α) und IL-8
(Interleukin-8) wurden von Promega bezogen (Madison, WI). Recombinantes
TGF-β1 (Transforming
growth factor-β1),
IFN-γ (Interferon-γ), PDGF (platelet-derived
growth factor) und IL-1β (Interleukin-1β) wurden
von R&D Systems
bezogen (Minneapolis, MN). Fibronectin wurde von Gibco-BRL bezogen. Komplement
C3, Bovines Serumalbumin (BSA) und Heparin wurden von Sigma Chemical
Co (St. Louis, MO) bezogen. Alle Proteine waren menschlichen Ursprungs,
mit Ausnahme von TGF- β1,
was vom Schwein ist.
-
Im
Allgemeinen kann BAM wie folgt aus Aloe Blättern präpariert werden:
- 1. Aloe Blätter
werden gewaschen, aufgeschnitten und filetiert, um die Blattrinde
zu entfernen. Das reine (im wesentlichen anthrachinonfreie) innere
Gel wird aufbewahrt, während
die grüne
Rinde verworfen wird.
- 2. Das filetierte Material wird homogenisiert (Creparo) und
intensiv mit einem Finisher Modell 75 (FMC, Chicago, Illinois) gefiltert
um die meisten Fasern zu entfernen.
- 3. Das klare, viskose Gel wird mit verdünnter HCl auf einen pH von
ungefähr
3,2 angesäuert.
- 4. Das angesäuerte
Gel wird dann mit vier Volumeneinheiten 95% Methanol bei Raumtemperatur
extrahiert. Fließendes
Material wird entfernt, dann wird die Alkohol/Wasser Mischung umgefüllt, während das
feste Präzipitat
durch Zentrifugation gesammelt wird. Die meisten in Alkohol/Wasser
löslichen
Substanzen, wie organische Säuren,
Oligosaccharide, Monosaccharide, Anthrachinone und anorganische
Salze werden durch den Alkoholextraktionsprozess entfernt.
- 5. Der feste Aloe Vera Extrakt wird dann mit frischem Alkohol
gewaschen, zentrifugiert, gefriergetrocknet und zu einem weißen Pulver
gemahlen.
-
Das
Produkt ist in der gefriergetrockneten Form für mehrere Jahre bei Raumtemperatur
stabil, wenn es vor zusätzlicher
Feuchtigkeit geschützt
wird. Die detaillierten Prozeduren zur Herstellung von im wesentlichen
anthrachinonfreiem Aloe Gel, zur Herstellung von im wesentlichen
anthrachinonfreiem Saft, zur Präparation
von BAM und zur Extrahierung von im wesentlichen nicht abbaubaren,
lyophilisierten, linear angeordneten Mannose-Polymeren aus einem
Aloe Blatt sind in Carringtons U.S. Patenten Nr. 4,735,935, 4,851,224, 4,917,890,
4,957,907, 4,959,214 und 4,966,892. beschrieben worden. Die Verwendung
von Aloe Produkten sind in Carringtons U.S. Patenten Nr. 5,106,616,
5,118,673, 5,308,838, 5,409,703, 5,441,943 und 5,443,830 beschrieben
worden.
-
Ein
Detergenz (oder ein protektives Kolloid, ein Stellmittel, ein Stabilisator,
oder ein an Emulgator) kann aus einer großen Anzahl von Materialien
ausgewählt
werden. Nicht beschränkende
Beispiele umfassen Glycerin, ein Polyvinylpyrrolidon ("PVP"), oder ein PVP K
Homopolymer, wie: PVP K-15 Pulver mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
("Mg") von 8000 Dalton;
PVP K-30 Pulver, Mg 38.000 Dalton; PVP K-60, 45% Lösung, Mg,
216.000 Dalton; PVP K-90 Pulver, Mg 630.000 Dalton; oder PVP K-120
Pulver, Mg 2.900.000 Dalton. Andere Detergentien umfassen eine Serie
von Vinylpyrrolidon ("VP")Ninylacetat ("VA") Kopolymeren, wobei
die Kopolymere einen Bereich von VPNA Molverhältnissen [angegeben in Klammern]
abdecken, die entweder als Methanollösung bereitgestellt werden
("E"), als Isopropanollösung ("I"), oder als feste Substanz ("S"), PVPNA E-735 [70/30], PVPNA E-635
[60/40], PVPNA E-535 [50/50], PVPNA E-335 [30/70], als entsprechende
Isopropanollösung
und PVPNA I-235 [20/80], PVPNA S-630 [60/40]. Andere Detergentien umfassen:
Polyvinylpyrrolidon, pharmazeutischer Grad, bekannt als Povidon
USP oder Polyvidonum, einige von ihnen werden als Plasdone C-15,
Plasdone C-30, Plasdone K-25, Plasdone K-25, Plasdone K-26/28, Plasdone
K-29/32, Plasdone K-90 oder Plasdone K-120 angeboten. Eine andere
Klasse von Detergenzien ist unlösliches
Crospovidon NF Polyvidonum, kreuzverlinktes N-Vinyl-2-Pyrrolidon.
Noch andere Detergenzien umfassen: Poly(Methylvinylether/Maleinsäureanhydrid)
(lineares Interpolymer mit einem molaren Verhältnis von 1:1), eine Serie
von Kopolymeren, die als Gantrez® AN-119
angeboten werden, mit einem durch Membranosmometrie bestimmten Molekulargewicht
("M.Wt.") von 20.000, Gantrez® AN-139
M.Wt. 41.000, Gantrez® AN-149 M.Wt. 50.000 und
Gantrez® AN-169
M.Wt. 67.000.
-
Das
Detergenz wird manchmal als ein protektives Kolloid, als Stellmittel,
oder als Emulgator bezeichnet.
-
Beispielhafte
in dieser Erfindung verwendete Verdicker umfassen: Diejenigen die
organisch sind (wie Karayagummi, Acaciagummi, Tragantgummi, Methylcellulose,
Hydroxymethylcellulose und Natriumcarboxymethylcellulose) oder synthetische
Polymere (wie Polyethylenoxid, Methylvinylether/Maleinsäureanhydridverbindungen,
kationische Polyacylamidverbindungen oder essigsaures Polyvinylacetat).
Viele von diesen sind weitgehend Kohlenhydrate oder kohlenhydratähnlich und
quellen bei der Zugabe von Wasser. Vorzugsweise sind die Verdicker
Hydroxyethylcellulosen, wie Natrosol H (38000 cp), Natrosol 250
G Pharm (150–200
cp) und Natrosol 250 GL (75–150
cp).
-
Die
Erfindung wird besser verständlich
durch Bezug auf die folgenden Beispiele. Jedoch sollten diese nicht
als Beschränkung
des Schutzumfangs dieser Erfindung aufgefasst werden.
-
BEISPIEL 1
-
Extraktion von Aloe Pektinen
-
Präparation
von Zellwandfasern. Es wurden zwei Typen von Zellwandfasern verwendet,
alkoholbehandelte und nichtalkoholbehandelte. Die alkoholbehandelten
Fasern wurden aus BAM durch Zentrifugation isoliert. BAM wurde in
Wasser bei 2 mg/ml aufgelöst.
Die Lösung
wurde dann bei 180g für
10 min zentrifugiert. Das Pellet, bestehend aus Zellwandfibrose,
wurde geerntet und dreimal mit Wasser gewaschen, bevor es getrocknet
wurde. Da BAM einer Alkohol-Präzipitation
unterzogen worden war, sind diese Fasern deshalb ähnlich zu
jenen in Alkohol unlöslichen
Resten oder Festkörpern
(AlS), welche allesamt zur Extraktion von Pektinen aus anderen pflanzlichen
Geweben präpariert
wurden.
-
Die
nicht-alkoholisch behandelten Fasern umfassen die groben Mark- und
Rindenfasern. Grobe Markfasern sind solche, die bei grobem Filtrieren
während
der Produktion von BAM und anderen Markfasern-basierten Produkten übrig bleiben.
Sie sind dieselben, die in BAM gefunden werden, außer dass
sie eine größere Größe besitzen
und nicht alkoholisch behandelt wurden. Sie wurden mit einem Nr.
18 Sieb (1 mm Öffnung)
mit Minimalverlust gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die
grüne Rinde,
berechnet für
~60% des Nassgewichtes des gesamten Blattes, wird im Allgemeinen
als Abfall in Herstellung verworfen. Es enthält die grüne Rinde, sowie einige Markfasern,
die nach Filetieren zurückblieben.
Die Fasern wurden aus denen auf einem ähnlichen Weg isoliert, wie
jenen aus den Markfasern infolge von Homogenisieren. Sie wurden
ausgiebig gewaschen, mindestens dreimal, mit Wasser, danach trockengelegt
und bei Zimmertemperatur („RT") gelagert, bevor
sie zur Pektin-Extraktion verwendet wurden.
-
Extraktion
Die chelatbildende Substanz EDTA wurde zur Extraktion von Aloe-Pektin aus den Zellwandfasern
verwendet. Die Fasern wurden in Wasser bei 0,2–2% (W/V) suspendiert. Die
EDTA-Stammlösung
wurde bei 0,5 M und pH 7,0 oder 8,0 präpariert und zu der Fasersuspension
gegeben. Die Endkonzentration von verwendetem EDTA betrug 25 mM.
Der End-pH-Wert von der Fasersuspension wurde mit Hilfe von NaOH
auf den entsprechenden Wert eingestellt. Die Extraktion erfolgte
mit Rühren
entweder bei RT oder bei höheren Temperaturen
(„HT") von ~80°C, oder nacheinander – durch
RT-Extraktion gefolgt von der HT-Extraktion. HT wurde bis zu 80°C durchgeführt und
dann vor dem Auftrennungsschritt gestoppt. In der sequentiellen
Extraktion wurden die verbleibenden Fasern nach der RT-Extraktion, ohne
Waschen, im selben Volumen Wasser resuspendiert und frisches EDTA
wurde in der selben Konzentration wie für die RT-Extraktion dazugegeben. Nach
der Extraktion wurden die verbleibenden Fasern per Zentrifugation
(500 g, 15 min) oder durch Filtern mit einem Nr. 18 Sieb gefolgt
von Gazeschwamm Filtern entfernt. Die Gazeschwämme (4 × 4,8 ply) wurden als drei
Stück zusammen,
platziert in einem Spaltölfilterrahmen,
verwendet. Die Schwämme
wurden vor der Verwendung mit Wasser gewaschen. Das Filtern mit
Gazeschwamm war hocheffizient in Entfernung kleiner Faserreste nach
dem Siebfiltern. Wenn erforderlich, wurde der Extrakt zweimal durch
den Gazeschwamm gefiltert. Das Filtrat war im Wesentlichen klar.
Für quantitative
Untersuchungen über
die Ausbeute durch die sequentielle Extraktion wurden die Fasern
immer durch Zentrifugation entfernt, und zwar nach der ersten Runde der
Extraktion bei RT. Alkohol (Ethanol) wurde dem klaren Überstand
oder dem Filtrat bis zu einer Endkonzentration von 75% (V/V) zugegeben.
Die Präzipitate
wurden durch Zentrifugation (500g, 15 min) oder mit Hilfe von Sieb
Nr. 18 gesammelt und zweimal mit 75% Alkohol gewaschen. Der Alkoholwaschschritt
war erforderlich, um das restliche EDTA zu entfernen. Die Präzipitate
wurden dann gepresst, um den Alkohol zu entfernen, dann wurden sie
vor der Verwendung getrocknet und bei RT gelagert.
-
Es
konnte festgestellt werden, dass die Extraktion von Aloe-Pektin
mit Hilfe von chelatbildender Substanz EDTA hocheffizient und dabei
eine Ausbeute von 50% (W/W) zu erhalten ist. Das erhaltene Pektin
hat einen Durchschnittgehalt an Galakturonsäure von über 70% (W/W). Es wurde festgestellt,
dass der pH-Wert einen großen
Effekt auf die Pektin-Ausbeute durch die EDTA-Extraktion hat. Eine
5 mg/ml Fasersuspension im Wasser hat einen pH von ~3,7 (3-4). Der
pH der Fasersuspension betrug 7,7 (7,5–8,0) infolge der Gabe von EDTA-Stammlösung mit
pH von 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 25 mM. Ein pH von 6,4
(6,3–6,5)
wurde erreicht, wenn eine EDTA-Stammlösung mit pH von 7,0 verwendet
wurde, um eine Endkonzentration von 25 mM zu erreichen. Ein pH von
5,0 war erzielbar durch Verwendung von einem Natriumacetat-Puffer
mit pH von 5,0 bei einer Endkonzentration von 20 mM, eine übliche Bedingung
zur Pektin-Extraktion. Es wurde festgestellt, dass es keinen großen Unterschied
in der Ausbeute nach der RT-Extraktion
bei einem pH von 5,0–7,7 gab.
Ein großer
Einfluss des pH wurde jedoch während
der HT-Extraktion festgestellt. Eine Ertragserhöhung von > 20% wurde bei einem pH von 7,7 im Vergleich
zum pH von 5,0 oder 6,4 während
der HT-Extraktion von frischen Fasern beobachtet. Weiterhin wurde
eine fast zweifache Ausbeuteerhöhung
beobachtet, wenn die verbleibenden Fasern aus der ersten Runde der
RT-Extraktion unter HT extrahiert wurden, wenn man frisches EDTA
mit pH von 8,0 zugegeben hatte, im Vergleich mit Zugabe von EDTA
mit pH von 7,0. Die pH-Werte der Fasersuspensionen änderte sich
am Ende der RT-Extraktion nicht signifikant. Jedenfalls war der
pH (~8,5) der Suspension nach Resuspension in Wasser und Zugabe
von frischem EDTA tatsächlich
höher als
der der EDTA-Stammlösung (pH
von 8,0). Es wurde ferner festgestellt, dass bei der Extraktion
bei pH 8,5 durch Verwendung frischer Fasern unter HT-Extraktion
eine viel höhere
Ausbeute ergab; mehr als die zweifach so viel, wie bei pH 5,0 und
~40% höher,
als bei pH 7,7. Eine pH-Erhöhung
auf 9,0 konnte den Ertrag jedoch nicht weiter verbessern (< 10%), verglichen
mit pH 8,5. Darauf folgende Experimente zeigten, dass eine beträchtliche
Erhöhung
(20%) der Ausbeute auch bei der RT-Extraktion bei pH 8,5 erzielt
werden konnte.
-
RT
war weniger effizient als HT während
der Extraktion. Die Ausbeute war ähnlich wie zwischen diesen
zwei Bedingungen, vorausgesetzt die RT-Extraktion wurde zeitlich
verlängert.
Die Ausbeute durch die RT-Extraktion erreichte ein Maximum bei ~4
Stunden. Weitere Verlängerung
der Extraktionszeit konnte den Ertrag nicht signifikant verbessern.
Der Ertrag der zweiten Extraktion mit HT variiert abhängig von
der Länge der
ersten RT-Extraktion; aus diesem Grund würde der Ertrag mit HT höher sein,
wenn die RT-Extraktion für nur
eine Stunde erfolgte, oder niedriger, wenn die RT-Extraktion für 4 Stunden
oder länger
erfolgte.
-
Wiederholte
Extraktionen unter denselben Bedingungen produzierten einen fortschreitend
niedrigeren Ertrag. Mit jeder Extraktion verringerte sich der Ertrag
um etwa die Hälfte.
Die verbliebenen Fasern können deshalb
in der Hälfte
des Volumens der vorangegangenen Extraktion suspendiert werden.
-
EDTA-
und Faserkonzentrationen beeinflussen ebenfalls die Extraktionseffizienz.
Wenn 25 mM EDTA mit einer 2 mg/ml Fasersuspension verwendet wurde,
konnte ein Ertrag zwischen 50–60%
mit einer einzigen Extraktion unter HT erzielt werden. Wenn 5 mg/ml
einer Fasersuspension mit derselben EDTA-Konzentration verwendet
wird, verringert sich der Ertrag um ~30%. Mit der sequentiellen
Raumtemperatur-zu Hochtemperatur-Extraktion konnte leicht ein Kombinationsertrag
von 40–50%
erreicht werden. Kein Unterschied in der Ausbeute wurde zwischen
alkoholbehandelten und nicht-alkoholbehandelten Fasern beobachtet.
-
Andere
chelatbildende Substanzen waren ebenfalls für die Aloe-Extraktion in Erwägung gezogen
worden. Ammunium-Oxalat wurde nicht eingesetzt, weil es als giftige
Substanz bekannt ist. Wurde Natrium-Hexametaphosphat verwendet,
wurde eine beträchtliche
Ausbeute erzielt; jedenfalls war diese Substanz aufgrund ihrer Präzipitatbildung
in Alkohollösung
schwer zu entfernen und ein Säurepräzipitationsschritt
(HCL oder HNO3) war vor der Alkoholwäsche erforderlich.
-
Andere
Bedingungen wurden zur Aloe-Pektin-Extraktion ebenfalls untersucht.
Heiße
verdünnte
Säure und
kalte alkalische Lösungen
sind zwei weitere übliche
Bedingungen zur Pektin-Extraktion. Beide können ausgedehnte Abbauprozesse
verursachen. Handelsübliche
Pektine aus Citrus und Apfel wurden unter der heißen verdünnten Säure-Bedingung
extrahiert. Verwendet man diese Bedingung für Aloe-Pektin, wurde der pH der Fasersuspension
mit Hilfe von HCL auf 1,5 eingestellt, gefolgt von HT bis zu 80°C. Die so
erhaltene Ausbeute ist verglichen mit der EDTA-Extraktion sehr viel niedriger. Die
Extraktion bei HT in Wasser alleine ergab nahezu kein Alkohol-präzipitierbares
Material. Renault und Thibault (Renault und Thibault, Carbohydrate
research, 299, 244, pp. 99–114)
berichteten, dass die Extraktion von Apfel- und Zuckerrüben-Fasern
in PBS (pH 6,5) mit HT (80°C)
eine große
Ausbeute ergab, ähnlich
wie bei EDTA-Extraktion. Wurde diese Bedingung verwendet, erhielt
man nur einen niedrigen Ertrag aus Aloe Vera-Markfasern. Die kalte
alkalische Extraktion erfolgte mit 50 mM NaOH oder 50 mM Na2CO3 bei 4°C. Der pH
in der Suspension betrug 11,5 mit 50 mM NaOH und 10,5 mit 50 mM
Na2CO3. Nach 1 Stunde
bei 4°C
wurde mit 50 mM Na2CO3 eine
sehr niedrige Ausbeute erhalten. Mit 50 mM NaOH war kein Alkohol-präzipitierbares
Material erhältlich.
Wenn die Extraktion bei RT für 1
Stunde stattfand, konnte mit keiner der Substanzen eine Ausbeute
erhalten werden, was nahelegt, dass unter diesen Bedingungen Pektine
schnell abgebaut werden.
-
Zusammen
zeigen diese Ergebnisse, dass die Extraktion mit EDTA bei pH von
7,0-8,5 das beste
Extraktionsverfahren für
Aloe-Pektin darstellt. Mit der sequenziellen RT- zu HT-Extraktion
konnte ein hoher Ertrag (40–50%,
W/W) zusammen mit der Produktion von beiden HMW- und LMW-Aloe-Pektinen
erzielt werden. Die Einzigartigkeit dieser Extraktionsprozedur basiert
auf dem höheren
verwendeten pH (7,0–8,5).
Der Grund für diesen
höheren
pH ist, dass Aloe-Pektine natürliche
LM (siehe unten) sind, welche widerstandsfähiger gegenüber β-Elimination unter alkalischen
Bedingungen sind und dass EDTA bei einem pH von über 7,0 am effizientesten funktioniert.
Hinzu kommt, dass EDTA bei einem pH über 7,0 löslicher ist und deshalb während der
Alkoholpräzipitation
und der Waschschritte leichter zu entfernen ist.
-
Die
grünen
Rindenfasern produzieren eine ähnliche
Ausbeute an Pektin, verglichen mit den Markfasern, wenn sie mit
EDTA bei einem pH von 8,0 extrahiert worden sind. Dieses Rindenpektin
war entsprechend reich an Gal A. Die Menge von aus der Rinde erhaltenen
Fasern war mehr als zehnfach höher
als die vom Mark (pro Blatteinheit). Dies ist konsistent mit der
Tatsache, dass die Rinde aus viel kleineren Zellen besteht, als
im Vergleich das Mark. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass man
eine sehr große
Menge von Aloe-Pektin aus dem Rindenanteil des Blattes gewinnen
kann, welcher bis vor kurzem bei manchen Herstellern als Abfall
verworfen wurde.
-
Um
LM/HMW-Aloe-Pektin mit Hilfe von EDTA bei Raumtemperatur zu extrahieren,
scheint der funktionale pH-Wert zwischen 5 und etwa 8,5 zu liegen,
bevorzugt um etwa 8–8,5.
Um LM/HMW-Aloe-Pektin mit Hilfe von EDTA bei erhöhten Temperaturen zu extrahieren
(z.B. um 80°C),
scheint der praktikabelste pH-Wert zwischen 5 und etwa 8,5 zu liegen,
vorzugsweise bei etwa 8,0. Bei pH-Werten über 6,5 würde die EDTA Extraktion von
HM-Pektinen aus anderen Quellen bei erhöhten Temperaturen zum Abbau
der Produkte führen. Für die Extraktion
von Pektin aus anderen pflanzlichen Quellen unter Verwendung von
EDTA oder anderen chelatbildenden Substanzen liegen die berichteten
pH-Werte zwischen 4 und 6,5.
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BEISPIEL 2
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Pektin-Reinigung
durch Ionenaustauschchromatographie
-
Die
Ionenaustauschchromatographie wurde auf einem „Pharmacia Biotech AKTA Explorer
Chromatography System" durchgeführt. Die
Säule bestand
aus drei Pharmacia Hi-trap Q, 5 ml in Serien verbundenen Kartuschen.
Aloe-Pektine waren in Wasser bei 1 mg/ml gelöst und bei einem Flussrate
von 1 ml/min auf die Säule
geladen. Nach Waschen mit 15 ml Wasser wurden gebundene Materialien
mit einem linearen Gradient von NaCl (0–1,0 M) eluiert. Das Säuleneluat
wurde durch UV-Absorption
bei 215, 254 und 280 nm überwacht. Fraktionen
mit Pektininhalt bildeten Präzipitate,
welche durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gesammelt,
konzentriert und in Wasser resuspendiert wurden. Sie wurden anschließend durch
Lauf durch eine Sephadex G-25 Säule
entsalzt. Die pektinhaltigen Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet
und bei Zimmertemperatur gelagert.
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BEISPIEL 3
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Kalzium-Gel-Bildung
-
Aloe-Pektine
mit verschiedenen Konzentrationen wurden in Wasser mit Kalziumchloridlösung in
verschiedenen Konzentrationen zusammen mit handelsüblichen
LM- und HM-Pektinen gemischt. Nach stehen lassen bei RT für bis zu
24 Stunden, wurden die Röhrchen
umgedreht. Floss die Probe leicht herunter, wurde angenommen, dass
keine Gel-Bildung zustande gekommen war. Floss hingegen die Probe
nicht herunter oder verformte sich unter dem eigenen Gewicht, wurde
angenommen, dass Gel-Bildung entstand. Wenn die Probe nicht floss,
aber sich verformte (z.B. hielt die Oberfläche keine gerade Linie senkrecht
zur Seitenwand der Tube, wenn sie in einer horizontalen Position
gehalten wurde), wurde das System für ein weiches Gel gehalten. Die
Ergebnisse zeigten, dass sowohl bei RT oder HT extrahiertes Aloe-Pektin
aus Mark- oder Rinden-Fasern, genau wie LM-Citrus-Pektin und Polygalakturonsäure, festes
Gel in Anwesenheit von Kalzium bildet. Unter denselben Bedingungen
bildete das HM-Citrus-Pektin kein Gel. Dies stimmt mit der Tatsache überein,
dass Aloe-Pektin ein LM-Pektin ist. Pektine aus Citrus und Apfel
sind natürliche
HM-Pektine. LM-Pektine können durch
Demethylierung von HM-Pektinen gewonnen werden. Da keine harten
Bedingungen während
der Extraktion von Aloe-Pektinen angewendet werden, ist insbesondere
bei der RT-Extraktion das Aloe-Pektin ein natürliches LM-Pektin.
-
Mit
einer 0,2% Aloe-Pektin-Lösung
ist die für
Gel-Bildungen erforderliche minimale Konzentration von Kalziumchlorid
auf 1–2
mM (50–100
mg CaCl2/g Pektin) bestimmt worden. Ein
Gel kann ebenfalls durch die Verwendung von ZnCl2 mit
der gleichen Konzentration erhalten werden. Mit erhöhter Konzentration
von Pektin und/oder Kalziumchlorid wird das Gel graduell fester.
Es wurde berichtet, dass das HMW-Aloe-Pektin leichter Gel bildet, als LMW-Aloe-Pektin,
bei welchem weniger Zeit zur Gel-Bildung
beansprucht wird und das Gel fester ist.
-
Eine
Erhöhung
der Ionenstärke
unterstützte
die Kalzium-Gel-Bildung. Die Geschwindigkeit der Gel-Bildung wurde
graduell mit der Erhöhung
der NaCl-Konzentration
(0–0,2
M) nach Zugabe einer festen Menge von Kalziumchlorid erhöht.
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BEISPIEL 4
-
Monovalente Kation-basierte
Gel-Bildung
-
Aloe-Pektine
wurden in Wasser mit verschiedenen Konzentrationen gelöst. Die
Pektin-Lösungen
wurden bei RT mit gleichen Volumina von 0,3 M NaCl (2 × Salzlösung), 0,3
M NaCl und 40 mM Natriumacetat (pH 5,0), oder 2 × PBS (pH 7,4) gemischt. Die
Endvolumina waren 1 oder 2 ml. Die Röhrchen (12 × 75 mm) wurden im Kühlschrank
bei 4°C
gelagert oder aufs Eis gelegt (0°C).
Die Gel-Bildung wurde wie im Beispiel 3 beschrieben, beurteilt.
Die Röhrchen
wurden dann auf RT zurück
gebracht, um bestimmen zu können,
ob das Gel zur Lösung
zurück
verwandelt wird. Verschiedene NaCl-Konzentrationen (0,05–1 M) wurden
für die
Gel-Bildung getestet. Kaliumsalz (KCl) wurde ebenfalls getestet.
Die Salz- und Pektin-Lösung
wurden immer in gleichen Volumina (1:1) gemischt. Für die Bestimmung
der Wirkung von Endo-Polygalakturonase auf die Gel-Bildung, wurde
Acetat-Puffer mit pH 5,0 zu den Pektin-Lösungen bis zu einer Endkonzentration
von 20 mM gegeben. Das Enzym wurde dann in der genannten Konzentration
dazugegeben. Nach Stehenlassen bei RT für 30 min, wurde die Lösung mit
gleichen Volumina 0,3 M NaCl gemischt und dann auf Eis gelegt. Die
Gel-Bildung wurde wie oben überprüft.
-
Wenn
eine Aloe-Pektin-Lösung
in 0,15 M NaCl (physiologische Kochsalzlösung) auf 4°C gekühlt wurde, wurde ein Gel erhalten.
Das Gel war fest und frei stehend, wenn es bei 4°C, wie das Kalzium-Gel, gehalten wurde;
es wechselte schnell zurück
in den löslichem
Zustand, wenn seine Temperatur auf RT (22°C) erhöht wurde. Dieser reversible
Lösung-Gel Übergang
konnte viele Male durch Temperaturänderung wiederholt werden.
-
Im
Gegensatz zur Gel-Bildung bei der Anwesenheit von Kalzium, welches
mit beiden HMW- und LMW-Aloe-Pektin wirksam zu sein scheint, ist
die monovalente Kationbasierte Gel-Bildung nur mit HMW-Aloe-Pektin,
welches entweder aus Mark- oder Rindenfasern erhalten wurde, effizient.
Die Probe AP97-1 und ähnliche,
welche ein Molekulargewicht von > 1 × 106 Da besitzen, können festes Gel bei niedrigen Konzentrationen
wie bei 1 mg/ml bei der Anwesenheit von 0,15 M NaCl produzieren.
Solche Gele waren auch klar, wenn die Pektin-Konzentration 5 mg/ml
oder niedriger war. Bei höheren
Pektin-Konzentrationen (> 5 mg/ml),
waren Gele fester und leicht trübe.
Mit einem 1 ml Volumen kann ein Gel in ~15 min nach Platzierung des
Röhrchens
auf Eis gebildet werden und in derselben Zeit nach Rückkehr zur
RT zum löslichen
Zustand umkehren. Jedoch kehrte dass Gel nicht zum löslichen
Zustand bei Temperaturen bis zu 15°C um. Das Gel konnte bei pH
von 5,0 (in Salzlösung
mit 20 mM pH von 5,0 Natriumacetat) genauso gut wie bei pH von 7,4
(in PBS) gebildet werden.
-
Das
LMW-Aloe-Pektin (0,375–6,08 × 105 Da) bildet nur bei höheren Konzentrationen (≥ 5 mg/ml)
solche Gele. Bei 1 mg/ml konnten nur weiche Gele mit manchen der
LMW-Proben in 0,15 M NaCl erhalten werden. Die kleinste Aloe-Pektin-Probe
(0,375 × 105 Da) bildet kein Gel bei 1 mg/ml in 0,15
M NaCl. Ein weiches Gel wurde mit dieser Probe bei einer Pektin-Konzentration
von 10 mg/ml in 0,2 M NaCl erhalten. Dies weist darauf hin, dass
die Effizienz der monovalenten kationenbasierten Gel-Bildung von der Größe der Pektin-Moleküle abhängt. Aloe-Pektin
kann durch Endo-Polygalakturonase
abgebaut werden. Zu diesem Zweck wurden 300 μl einer 2 mg/ml AP97-1 Pektin-Lösung in
20 mM Natriumacetat mit pH von 5,0 mit diesem Enzym bei verschiedenen
Konzentrationen verdaut, bevor sie mit dem gleichen Volumen eines
0,3 M NaCl gemischt und aufs Eis gelegt wurden. Die Ergebnisse zeigten,
dass die Kontrollprobe (kein Enzym zugegeben) ein Gel bildete und
die Probe mit der höchsten
Enzym-Konzentration löslich
blieb. Zwischen der Kontrolle und der höchsten Enzym-Konzentration
war der Übergang
von der Löslichkeit
zum Gel evident, d. h. das Gel wurde mit Erhöhung der Enzym-Konzentration
immer weicher, bis bei der höchsten
Enzym-Konzentration die vollständige Löslichkeit
erreicht wurde. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die Größe der Aloe-Pektin-Moleküle ein wichtiger
Faktor in der monovalenten kationenbasierten Gel-Bildung ist.
-
Die
Gel-Bildung war ebenfalls abhängig
von der NaCl-Konzentration. In 0,1 M NaCl konnte nur weiches Gel
mit Proben wie AP97-1 erhalten werden. Das feste Gel konnte nur
in 0,15 M und 0,2 M NaCl gebildet werden. Während das Gel, das bei 0,15
M NaCl gebildet wurde, vollständig
reversibel war, wenn das Gel zu RT zurück gebracht wurde, war das
Gel, das bei 0,2 M NaCl gebildet wurde, nicht leicht reversibel,
insbesondere für
die HMW-Aloe-Pektine. Dieses Gel, das mit NaCl gebildet wird, ist
als Pektin-Natrium-Gel bekannt. Nach Stehenlassen bei RT für 1 Stunde
oder länger,
kam oft Synärese
vor, wenn das Gel bei 0,2 M NaCl gebildet wurde, z.B. löste sich
die Flüssigkeit
vom Gel. Die Präzipitate
waren bei hohen NaCl-Konzentrationen (0,6–1 M) weiß und amorph und lagen bei
0,4 M NaCl als feine Granulate vor.
-
Solche
kalte Gel-Bildung ist auch empfindlich hinsichtlich der Sorten von
monovalenten Kationen, die verwendet werden. Mit KCl (0,05–1 M) trat
keine kalte Gel-Bildung auf, obwohl bei höheren KCl-Konzentrationen (≥ 0 M) bei
RT Präzipitate
gebildet wurden.
-
Präzipitation
von Pektin bei höheren
Salz-Konzentrationen und RT wurden bereits früher beobachtet. Auf jeden Fall
ist solche reversible monovalente kationen-(NaCl)basierte kalte
Gel-Bildung unter physiologischen Bedingungen (0,15 M NaCl, pH 7,4)
mit anderen Pektinen vorher noch nicht beschrieben worden. Bisher ist
noch nie solch ein Gel-Bildungssystem mit irgendwelchen anderen
Polymeren oder Substanzen in der Literatur beschrieben worden. Unter
Verwendung handelsüblicher
Polygalakturonsäure,
LM- und HM-Pektine hat man keine solche monovalente kalte Gel-Bildung
erhalten.
-
BEISPIEL 5
-
Wachstumsfaktor-Bindung
durch Pektin
-
Im
Allgemeinen wird ein Heparin-bindender Wachstumsfaktor („HBGF") mit einem Pektin
in einer Lösung
aus Wasser, Puffer oder Salzlösung
gemischt, um den resultierten Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktor
(„PHBGF") zu erhalten. Die
Lösung
kann bei Temperaturen zwischen etwa –80°C und etwa 37°C, vorzugsweise
zwischen etwa –80°C und etwa
22°C, und
besonders vorzugsweise zwischen etwa – 80°C und etwa 4°C gelagert werden. Alternativ
kann die Lösung
bei denselben Temperaturen lyophilisiert und gelagert werden. Die
Konzentration oder Menge des Pektins in der Lösung kann von etwa 0,001 mg/ml
zu etwa 40 mg/ml, vorzugsweise von etwa 0,01 mg/ml zu etwa 20 mg/ml,
und besonders vorzugsweise von etwa 0,05 mg/ml bis zu etwa 10 mg/ml
reichen. Die Konzentration oder Menge von HBGH in der Lösung kann
von etwa 0,01 ng/ml bis zu etwa 500.000 ng/ml, vorzugsweise von
etwa 0,1 ng/ml zu etwa 250.000 ng/ml, und besonders vorzugsweise
von etwa 1 ng/ml zu etwa 100.000 ng/ml reichen.
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BEISPIEL 6
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Wachstumsfaktor Bindung
durch Aloe Pektin
-
Pektinreiche
Zellwandfasern wurden aus BAM oder aus homogenisiertem frischen
Innerem Aloe Vera Gel isoliert. BAM wurde in entionisiertem Wasser
bei 2 mg/ml suspendiert. Diese Lösungen
wurden bei Raumtemperatur („RT") für 3 Stunden
oder bei 4° über Nacht
gerührt.
Sie wurden dann bei geringer Geschwindigkeit (1000 U/min oder 180
g) für
10 Minuten zentrifugiert (Beckman TJ-6). Das Pellet oder die Zellwandfaser
wurde gesammelt, einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen und
getrocknet (Centrivap, Labconco). Für die Isolation von Zellwandfasern
aus frischem Inneren Gel wurden Aloe Vera Blätter durch Waschen mit Wasser
gereinigt und filetiert, um die äußere grüne Rinde
zu entfernen. Das klare Innere Gel wurde homogenisiert und die Zellwandfasern
wurden durch Zentrifugation bei 500 g für 15 min isoliert. Sie wurden
einmal mit 75% Alkohol gewaschen und dann dreimal mit entionisiertem
Wasser. Die isolierten Zellwandfasern wurden dann weiter homogenisiert,
um sicherzustellen, dass sie klein genug waren (200 um), so dass
sie unversehrt mit Pipettenspitzen gehandhabt werden konnten. Sie
wurden dann vor der Verwendung getrocknet. Diese Fasern waren reich
an Aloe Pektin (~50%, w/w). Sie wurden in dem Bindungs-Assay und
auch für
die Pektin Extraktion benutzt. Zellwandfasern wurden auch aus der
frischen Rinde in derselben Art und Weise isoliert und für die Pektin Extraktion
benutzt.
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Aloe
Pektin wurde aus dem Inneren Gel oder Rinden-Zellwandfasern extrahiert
wie in Beispiel 1 beschrieben. Kurz gesagt wurde die Extraktion
mit dem Chelatbildner (EDTA) entweder bei RT oder unter Erhitzen
(80°C) und
bei einem pH von 7,5–8,5
durchgeführt.
Pektin wurde mit Methanol (75%, Endkonzentration) präzipitiert
und zweimal mit 75% Methanol gewaschen. Es wurde bei RT getrocknet
und aufbewahrt. Die Extraktion bei RT ergab das Hochmolekulargewicht-Aloe
Pektin (HMW; 0,785–1,36 × 106 Da) Aloe Pektin und die Extraktion unter
Erhitzen ergab das mit Niedrigmolekulargewicht (LMW; 0,375–6,08 × 105 Da).
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Für die Bindungs-Assays
wurden die Proteine in TN-Puffer (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4)
bei 100 μg/ml
gelöst.
Die Proteine (1 μg)
wurden mit 20 μg
der Inneres Gel-Zellwandfasern in einem 200 μl Reaktionsvolumen gemischt.
BSA (20 μg),
das als nichtbindendes Protein bekannt ist, wurde ebenso in die
Redaktionsmischung gegeben, um eine nichtspezifische Bindung zu
vermeiden. Die Mischungen wurden sanft gevortext und bei 37°C für eine Stunde
inkubiert, wobei sie einmal alle 20 min sanft gevortext wurden.
Die Zellwandfasern wurden dann bei 500 g für 5 Minuten pelletiert und
dreimal mit TN-Puffer gewaschen. Sie wurden dann in Gelpuffer suspendiert
und für
3 Minuten in ein kochendes Wasserbad gebracht, bevor sie durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
aufgetrennt wurden. Es wurde ein 15% Gel benutzt. Die Proteinbanden
wurden durch Coomassie-Blau-Färbung
sichtbar gemacht. Für
die densitometrische Analyse der Proteinbanden wurden die mit Coomassie-Blau
gefärbten
Gelbilder unter Verwendung eines GS-5000 Digitalbildsystems (Alpha Infotech
Co.)angefertigt und die optischen Dichten (OD) der Proteinbanden
wurden unter Verwendung des NIH Bildprogramms (Version 1.6; National
Institute of Health) gemessen. Eine positive Bindung wurde durch
Nachweis der Proteinbande der Bindungsreaktion mit einem mindestens
zweimal höheren
OD-Wert als bei
der Kontrolle (d.h. Protein allein) identifiziert.
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Für die Inhibierungs-Assays
wurden verschiedene Mengen lösliches
Aloe Pektin oder Heparin, die in TN-Puffer präpariert waren, zu der Bindung
Reaktion gegeben. Die restlichen Schritte wurden wie oben beschrieben
durchgeführt.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass Aloe Pektin an aFGF, bFGF, KGF und TGF-β1, aber nicht
an IL-8, IL-1β, IFN-γ, EGF, TGF-α, TNF- α, PDGF, C3,
Fibronectin oder BSA band (Tabelle 1). aFGF, bFGF und KGF gehören zur
FGF Familie und TGF-β1
gehört
zur TGF-β Familie.
Mitglieder von diesen zwei Wachstumsfaktorfamilien sind alle heparinbindend.
aFGF, bFGF und KGF und TGF-β1
sind einige Beispiele für
die Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren. Daher zeigen diese
Ergebnisse, dass Aloe Pektin an die Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren
band. Die Bindung an die Heparin-bindenden Proteine war selektiv,
weil Aloe Pektin nicht an andere getestete Heparin-bindende Proteine
(IL-8, IFN-γ und
Fibronectin) band. Jedoch wurde keine Bindung mit irgendeinem der
getesteten nicht-heparin-bindenden Proteine (IL-1β, EGF, TGF-α, TNF- α, PDGF, C3 oder
BSA) nachgewiesen. Die Bindung an bFGF und KGF war besonders stark,
weil ~0,5 μg
des verwendeten 1 μg
Protein unter den benutzten experimentellen Bedingungen gebunden
war. Die Ergebnisse mit bFGF sind in 1 gezeigt.
Die Bindung wurde effektiv durch lösliches Aloe Pektin inhibiert.
Sowohl LMW und HMW Aloe Pektine von entweder dem Inneren Gel oder
der äußeren Rinde
inhibierten die Bindung. Dies bestätigte, dass die Bindung an
die pektinreichen Zellwandfasern durch die Pektinmoleküle vermittelt
wurde (1). Die Bindung wurde ebenso
durch Heparin inhibiert (1), was mit
den heparinbindenden Eigenschaften dieser Wachstumsfaktoren konsistent
ist.
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BEISPIEL 7
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Wachstumsfaktor
Bindung durch andere Pektine
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Verschiedene
kommerzielle Pektine wurden in dem Inhibierungs-Assay verwendet,
um zu bestimmen, ob sie ähnliche
Bindungsaktivitäten
haben. Sie umfassten entesterte Pektine (d.h. Polygalakturonsäure), die aus
Citrus-Pektin hergestellt waren, Citrus LM Pektin (DM, 28%) und
Citrus HM Pektine mit einem DM von 64% oder 92%. Alle ergaben wolkige
Lösungen,
wenn sie gelöst
waren. Vor der Verwendung wurden sie bei 25.000g für 30 min
zentrifugiert, um das unlösliche
Material zu entfernen. Die löslichen
Pektine wurden mit Ethanol (75% Endkonzentration) präzipitiert
und einmal mit 75% Ethanol gewaschen. Sie wurden dann getrocknet
und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
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Die
Inhibierungs-Assays wurden wie mit bFGF durchgeführt, wie oben beschrieben.
Aloe Pektin hatte eine Inhibierung von 52% bei 20 μg und 89%
bei 200 μg
(2). Keine Inhibierung (< 20%) wurde mit LM (DM, 28%) oder HM
(DM, 64% oder 92%) Pektinen bei entweder 20 oder 200 μg (2)
beobachtet, was zeigt, dass diese Pektine nicht an den Wachstumsfaktor
binden. Eine schwache Inhibierung wurde jedoch mit der Polygalakturonsäure beobachtet
verglichen mit Aloe Pektin, d.h. keine Inhibierung (< 20%) wurde bei
20 μg beobachtet,
aber eine signifikante Inhibierung (67%) wurde bei 200 μg (2)
beobachtet. Dies zeigt, dass Polygalakturonsäure ebenfalls an den Wachstumsfaktor
binden kann, wenn auch nicht so stark wie das Aloe Pektin.
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BEISPIEL 8
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Schutz des
Wachstumsfaktors vor Proteaseabbau
-
Es
wurde gezeigt, dass die Heparinbindung Wachstumsfaktoren gegen die
Inaktivierung durch Proteasen stabilisiert. Um zu bestimmen, ob
die Pektinbindung auf die Wachstumsfaktoren irgendeinen protektiven Effekt
hat, wurde bFGF einer Trypsin-Verdauung in Anwesenheit oder Abwesenheit
von Aloe Pektin oder Inneres Gel-Zellwandfasern unterzogen. bFGF
(0,5 μg)
wurde mit Aloe Pektin oder Inneres Gel-Zellwandfasern (0–16 μg) in 15 μl Reaktionsvolumen
gemischt und bei 37°C
für 10
min inkubiert, gefolgt durch Zugabe von Trypsin (0,5 μg). Die Mischungen
wurden bei 37°C
für eine
Stunde inkubiert und dann mit dem Gelpuffer gemischt und einer Elektrophorese
unterzogen wie oben beschrieben.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass unter den verwendeten Bedingungen bFGF
(0,5 μg)
fast vollständig durch
Trypsin in der Abwesenheit von Aloe Pektin abgebaut wurde, d.h.
nur 3,5% des bFGF war noch intakt (3). Jedoch
wurde das bFGF in der Anwesenheit von Aloe Pektin dosisabhängig geschützt. Ein
25, 27, 32, 40, oder 47% Schutz (Rest/Anfang × 100%) wurde mit 4, 8, 12
oder 16 μg
Aloe Pektin erzielt (3). Wenn das nicht bindende
Protein BSA an Stelle von bFGF benutzt wurde, wurde kein derartiger
Schutzeffekt beobachtet. Dies zeigt, dass die Bindung durch Aloe
Pektin einen stabilisierenden Effekt auf den Wachstumsfaktor hat.
Derselbe dosisabhängige
Schutz von bFGF gegen die Trypsin-Verdauung wurde auch mit Inneres Gel-Zellwandfasern
beobachtet.
-
Der
Schutz durch Polygalakturonsäure
war schwächer
verglichen mit Aloe Pektin, d.h. die Menge von durch Polygalakturonsäure geschütztem bFGF
war sehr viel geringer, als die durch Aloe Pektin bei jeder gegebenen
Menge, die verwendet wurde.
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BEISPIEL 9
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Bindung des
Wachstumsfaktors durch Pektin-Kalzium-Gel-Kügelchen
-
Um
einen Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktor ("PHBGH") mit einem Kalzium-Gel-Kügelchen zu
stabilisieren, wird das PHBGH mit Pektin-Kalzium-Gel-Kügelchen gemischt, die in einer
gepufferten oder nicht gepufferten Lösung suspendiert sind. Die
Mischung wird zwischen etwa 0°C
und etwa 37°C
geschüttelt, vorzugsweise
zwischen etwa 0°C
und etwa 30°C
und besonders vorzugsweise zwischen 4°C und etwa 22°C, für einen
Zeitraum von 5 Minuten bis etwa 24 Stunden, vorzugsweise von etwa
15 Minuten bis etwa sechs Stunden und besonders vorzugsweise zwischen
etwa 30 Minuten bis etwa 2 Stunden. Die behandelten Kügelchen
werden dann isoliert und in einer Lösung aufbewahrt. Alternativ
werden die Kügelchen
durch Lyophilisierung getrocknet. Die Konzentration oder Menge an
PHBGH, die in der Mischung verwendet werden kann, reicht von etwa
0,1 ng/ml bis etwa 500.000 ng/ml, vorzugsweise von etwa 1 ng/ml
bis etwa 250.000 ng/ml und besonders vorzugsweise von etwa 10 ng/ml
bis etwa 100.000 ng/ml. Die Konzentration oder Menge von dem Pektin
für die
Herstellung der Gel-Kügelchen
reicht von etwa 1 mg/ml bis etwa 40 mg/ml, vorzugsweise von etwa
5 mg/ml bis 30 mg/ml und besonders vorzugsweise von etwa 10 mg/ml
bis 20 mg/ml. Die größte der
in der Mischung verwendeten Kalzium-Gel-Kügelchen kann in Abhängigkeit
des verwendeten Tropfverfahrens von etwa 3–4 mm bis zu etwa 10 μm variieren.
Die erhaltenen behandelten Kügelchen
können
in einem Temperaturbereich von etwa –80°C bis etwa 37°C aufbewahrt
werden, vorzugsweise zwischen etwa –20°C bis etwa 22°C und besonders
vorzugsweise zwischen etwa 0°C
bis etwa 4°C.
-
Aloe
Pektin ist wie andere LM Pektine in der Lage, ein Gel in der Anwesenheit
von Kalzium (CaCl2) zu bilden. Die Aloe
Pektin-Kalzium-Gel-Kügelchen
wurden hergestellt, indem die Aloe Pektin Lösung (10 mg/ml) in eine 200
mM CaCl2 Lösung unter Rühren getropft
wurde. In Abhängigkeit
vom Tropfmechanismus konnte die Größe der Kügelchen von etwa 3–4 mm bis
zu < 10 μm variieren.
Tropfen durch eine Spritzennadel ergibt größere Kügelchen, wohingegen Sprühen mit
einem feinen Sprüher
kleinere Kügelchen
erzeugt. Die in diesem Experiment gebildeten Kügelchen hatten einen Durchmesser
von ~1 mm. Diese Kügelchen
wurden dann in dem Bindungs-Assay verwendet, wie in Beispiel 6
beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Bindungsreaktionsmischungen
für eine
Stunde unter konstantem Schütteln
bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass diese Kügelchen
an bFGF banden (4). Die Bindung wurde durch lösliches
Aloe Pektin inhibiert. Das gleiche Resultat wurde ebenso mit KGF
erhalten. Dieses zeigt, dass solche Kügelchen mit dem Wachstumsfaktor
beladen werden können.
Daher können
mit Aloe Pektin präparierte
Pektin-Kügelchen
als ein Zuführungsmedium
für das
PHBGH dienen.
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BEISPIEL 10
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Einkapselung des Wachstumsfaktors
in Pektin-Kalzium-Gel und monovalentes kationenbasiertes Gel
-
Um
einen Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktor ("PHBGH") mit einem monovalenten kationenbasierten
Gel, wie einem Aloe Pektin Natriumgel, zu stabilisieren, wird das
PHBGH im allgemeinen mit einem Pektin, wie einem Aloe Pektin, in
einer gepufferten oder nicht gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (etwa
0,15 M NaCl) gemischt. Die Mischung wird zwischen etwa 0°C und etwa
4°C aufbewahrt,
so dass sich das monovalente kationenbasierte Gel bilden kann. Die
Konzentration oder Menge an PHBGH, die in der Mischung verwendet
werden kann, ist in Beispiel 5 beschrieben. Die Konzentration oder
Menge von dem Pektin, die in der Mischung verwendet werden kann,
reicht von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 20 mg/ml, vorzugsweise von etwa 0,5
mg/ml bis etwa 10 mg/ml und besonders vorzugsweise von etwa 1 mg/ml
bis 5 mg/ml. Die erhaltene Mischung kann in einem Temperaturbereich
von etwa –80°C bis etwa
37°C aufbewahrt
werden, vorzugsweise zwischen etwa –20°C bis etwa 22°C und besonders
vorzugsweise zwischen etwa 0°C
bis etwa 4°C.
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Um
ein PHBGH mit einem Pektin-Kalzium-Gel zu stabilisieren, wird das
PHBGH im allgemeinen mit einem Pektin, wie einem Aloe Pektin, in
einer Kalziumsalzlösung
von etwa 0,1 mM bis etwa 500 mM, vorzugsweise von etwa 0,5 mM bis
etwa 100 mM und besonders vorzugsweise von etwa 1 mM bis etwa 20
mM gemischt. Alternativ wurde die Mischung aus Pektin und PHBGH
in ein 200 mM CaCl2 Bad getropft, damit sich die
Kügelchen
bilden, wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Konzentration oder Menge
an PHBGH, die in der Mischung verwendet werden kann, ist in Beispiel
5 beschrieben. Die Konzentration oder Menge von dem Pektin, die
in der Mischung verwendet werden kann, reicht von etwa 0,1 mg/ml
bis etwa 40 mg/ml, vorzugsweise von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 30 mg/ml
und besonders vorzugsweise von etwa 1 mg/ml bis 20 mg/ml. Die erhaltene Mischung
kann in einem Temperaturbereich von etwa –80°C bis etwa 37°C aufbewahrt
werden, vorzugsweise zwischen etwa –20°C bis etwa 22°C und besonders
vorzugsweise zwischen etwa 0°C
bis etwa 4°C.
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Aloe
Pektin Lösung
in entionisiertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung (0,15
M NaCl) wurde mit bFGF gemischt, so dass die endgültige Pektin
Konzentration 10 mg/ml und die endgültige bFGF Konzentration 100 μg/ml war.
Die Kügelchen
konnten ebenso durch Tropfen der BSA-haltigen Pektin Lösung in eine
200 mM ZnCl2 Lösung erhalten werden. Eine
solche Gel-Kügelchen
Bildung wurde ebenso mit dem entesterten Citrus-Pektin (Polygalakturonsäure) erreicht,
obwohl eine höhere
Konzentration (20 mg/ml) an Polygalakturonsäure verwendet worden war. Wachstumsfaktoren/Cytokine
werden generell bei einer Konzentration gut unter 100 μg/ml verwendet.
Darum ist die Proteinkonzentration kein limitierender Faktor für die Präparation
solcher Kalzium-Gel-Kügelchen.
Verglichen mit der Beladung der vorgeformten Pektin-Kügelchen
mit Wachstumsfaktoren, wie in Beispiel 9 beschrieben, ergibt der
Einbau in Kalzium-Gel wahrscheinlich eine besser schützendes
Zuführungsmedium,
weil die Wachstumsfaktoren innerhalb der Gelmatrix aufgenommen werden.
Diese Form eines Zuführungsmediums
ist für
den oralen Gebrauch besser geeignet.
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Für die monovalente
kationenbasierte Gelbildung wurde die Pektin und bFGF Mischung in
physiologischer Kochsalzlösung
(0,15 M NaCl) mit einem HMW Aloe Pektin bei einer Konzentration
von 1–2
mg/ml gemischt. Die bFGF Konzentration war dieselbe wie oben (100 μg/ml). Ein
Gel, was sich nach der Mischung bildete, wurde, in Abhängigkeit
von dem Volumen der Mischung, für
10–30
min bei 0–4°C aufbewahrt.
Bei Verwendung von BSA konnte ein solches Gel bei einer BSA-Konzentration von
20 mg/ml erhalten werden. Daher können diese Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren
in einem Gel aufbewahrt werden. Dieses bewirkt nicht nur einen direkten
stabilisierenden Effekt, sondern reduziert auch die Wahrscheinlichkeit
für eine
Aggregatbildung. Das Gel war reversibel und verwandelte sich schnell
in eine Lösung
zurück,
wenn es auf Raumtemperatur (22°C)
zurückgebracht
wurde und deshalb kann der Wirkstoff in Lösungsform verwendet werden.
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BEISPIEL 11
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Affinitätschromatographie
mit Inneres Gel-Zellwandfaser als eine pektinhaltige Matrix
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Um
die Bindungsstärke
zwischen Aloe Pektin und den Wachstumsfaktoren zu bestimmen, wurde
eine Affinitätschromatographie
mit Inneres Gel-Zellwandfaser als pektinhaltige Matrix durchgeführt. Inneres Gel-Zellwandfasern
(0,4 ml) wurden in eine 5 ml Säule
gepackt. Die Säule
wurde intensiv mit TN-Puffer gewaschen. bFGF (8 μg in 200 μl) wurde auf die Säule gebracht,
die dann mit 8 ml TN-Puffer bei einer Flussrate von 6 ml/h gewaschen
wurde. Die Eluierung wurde schrittweise jeweils mit 0,4 ml 0,15,
0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 und 2.0 M NaCl durchgeführt. Dass
Eluat wurde dann durch Gelelektrophorese analysiert, um wie oben
beschrieben bFGF nachzuweisen.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass bFGF bei 0,5–0,7 NaCl mit einem Peak bei
0,6 M (5) eluierte. Dies zeigte, dass die Bindungsstärke von
bFGF an Aloe Pektin moderater und schwächer war als die an Heparin; bFGF
eluiert von einer Heparin-Säule
bei 1,4–1,6
M NaCl und aFGF bei 0,8–1,0
M NaCl (0,3–0,4
M NaCl wird als schwache Bindung betrachtet und > 1,0 M NaCl wird als starke Bindung betrachtet;
Conrade, (1998), Heparin-binding Proteins, Academic Press, San Diego,
pp. 197–199).
-
Die
schwächere
Affinität
zu Aloe Pektin verglichen mit Heparin macht wahrscheinlich die Verwendung von
Aloe Pektin als Stabilisator und Zuführungsmedium geeigneter, d.h.
kommt der Wachstumsfaktor im Komplex mit Pektin einmal in Kontakt
mit Glycosaminoglycan (Heparin) auf der Zelloberfläche, bindet
er an das Letztere, seinen natürlichen
höher affinen
Liganden, um einen stimulierenden Effekt auf die Zellen auszulösen.
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BEISPIEL 12
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Kopplung von
Pektin an einen Träger
zur Isolation von Pektin/Heparin-bindenden
Proteinen
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Die
Carboxylgruppe des Gal A Restes in Pektin wird für die Kopplung von Pektin an
einen aminhaltigen Träger
mit einer Carbodiimid Verbindung EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid)
verwendet. Der aminhaltige Träger
kann kommerziell erhältliche
Aminohexylsepharose (Amersham Pharmacia Biotech) oder auf einem
3M Emphaze-Träger
(Pierce, Rockford, IL) immobilisiertes Diaminodipropylamin sein.
Pektin (1–20
mg/ml) wird in einem Puffer (0.1 M Mes, 0.15 M NaCl, pH 4.7) hergestellt
und mit der Matrix gemischt. Das EDC (0,1–20 mg/ml) wird zugegeben,
um die Kopplung einzuleiten, was drei Stunden bei RT unter Rühren dauert.
Nach dem sie mit 1 M NaCl gewaschen wurde, ist die Matrix gebrauchsfertig.
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BEISPIEL 13
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Pharmazeutische
Formulierung des Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktors
-
Eine
Ausführungsform
einer pharmazeutischen Formulierung eines Pektin/Heparin-bindenden Wachstumsfaktors
kann durch Mischen und Vermengung der folgenden Bestandteile hergestellt
werden:
Eine pektische Substanz in einem Mengenbereich von
etwa 0,001 mg/ml bis etwa 40 mg/ml;
Ein Pektin/Heparin-bindender
Wachstumsfaktor ("PHBGF") in einem Mengenbereich
von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 100.000 ng/ml. Das PHBGF kann aus der
Gruppe ausgewählt
sein, die aus einem azidischen Fibroblastenwachstumsfaktor; basischen
Fibroblastenwachstumsfaktor, einem Keratinozytenwachstumsfaktor
und einem transformierender Wachstumsfaktor-β1 besteht;
Ein Verdicker
in einem Mengenbereich von etwa 20 mg/ml bis etwa 150 mg/ml. Der
Verdicker kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Karayagummi,
einer kationischen Polyacrylamidverbindung und Natriumcarboxymethylcellulose
besteht;
Ein optionales Konservierungsmittel in einem Mengenbereich
von etwa 0,02 mg/ml bis etwa 5 mg/ml. Das optionale Konservierungsmittel
kann aus der Gruppe ausgewählt
sein, die aus einem Paraben, Benzethonium Halogenid, Benzoesäure, Benzoat,
Sorbinsäure,
Sorbat, Natriumborat und einem Antibiotikum besteht.
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Ein
optionales Detergenz in einem Mengenbereich von etwa 10 mg/ml bis
etwa 150 mg/ml. Das optionale Detergenz kann aus der Gruppe ausgewählt sein,
die aus PVP, Vinylacetat Kopolymer and Polyvinylpyrrolidon besteht.
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Der
Rest ist Wasser, Kochsalzlösung
oder eine Pufferlösung.
