DE69932113T2 - Pharmazeutische Zusammensetzungen von Hedgehog-Proteinen und deren Verwendung - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung von Hedgehog-Proteinen und deren Verwendung insbesondere zur lokalen Freigabe dieser Proteine an Knochen und Knorpeln.
  • Hedgehog-Proteine (Hh-Proteine) werden als eine Familie von sekretorischen Signalproteinen verstanden, welche für die Bildung von zahlreichen Strukturen in der Embryogenese verantwortlich sind (J.C. Smith, Cell 76 (1994), Seiten 193–196; N. Perrimon, Cell 80 (1995), Seiten 517–520; C. Chiang et al., Nature 83 (1996), Seite 407; M.J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996), Seite 296; A. Vortkamp et al., Science 273 (1996), Seite 613, C.J. Lai et al., Development 121 (1995), Seite 2349). Während seiner Biosynthese werden nach einer Spaltung der Signalsequenz und einer autokatalytischen Spaltung eine 20 kD N-terminale Domäne und eine 25 kD C-terminale Domäne erhalten. Die N-terminale Domäne wird in ihrer natürlichen Form mit Cholesterin modifiziert (J.A. Porter et al., Science 274 (1996), Seiten 255–259). Bei höheren Lebensformen ist die Hh-Familie aus mindestens drei Gliedern zusammengesetzt, nämlich aus Sonic, Indian und Desert Hh (SHh, IHh, DHh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994), Seiten 43–51). Unterschiede in der Aktivität von Hedgehog-Proteinen, die rekombinant erzeugt worden waren, wurden nach der Bildung in Prokaryonten und Eukaryonten beobachtet (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995), Seiten 35–44; und T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997), Seiten 465–469).
  • Hynes et al. vergleichen die Aktivität von Hh im Überstand von transformierten humanen embryonalen Nieren-293-Zellen (eukariontisches Hh) mit Hh, das aus E. coli erzeugt worden ist . Sie fanden eine vierfach höhere Aktivität von Hh aus den Überständen der Nierenzelllinie. Als Grund für diese erhöhte Aktivität wurden ein potentieller zusätzlicher akzessorischer Faktor, der nur in eukaryontischen Zellen exprimiert wird, eine post-translationale Modifikation, ein unterschiedlicher N-Terminus, da das aus E. coli isolierte Hh 50% eines Hh enthält, das zwei zusätzliche N-terminale Aminosäuren (Gly-Ser) trägt oder um 5 bis 6 Aminosäuren gekürzt ist, oder ein höherer Aggregatzustand (z.B. durch Bindung an Nickelagarose-Perlen) diskutiert.
  • Nakamura et al. vergleichen die Aktivität von SHh in dem Überstand von transformierten Hühnerembryofibroplasten mit einem aus E. coli isolierten SHh-Fusionsprotein, das noch einen N-terminalen Polyhistidinteil aufweist. Das SHh in dem Überstand der Fibroplasten hat eine siebenfach höhere Aktivität als das gereinigte E. coli-Protein bezüglich der Stimulierung von alkalischer Phosphatase (AP) in C3H10T 1/2 Zellen. Moleküle, wie morphogenetische Knochenproteine (BMPs), die nur im Überstand von eukaryontischen Zellen vorliegen, und die stärkere Induktion von AP verursachen, wurden als der Grund für die erhöhte Aktivität diskutiert.
  • Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997), Seiten 319–323, berichten, daß Fibroplasten, die Hh abscheiden, eine ectopische Knochenbildung bei einer intramuskulären Implantation an Kollagen induzieren. Deshalb haben Hedgehog-Proteine eine osteoinductive Aktivität.
  • Ein Verfahren zum Herstellen eines Abgabesystems für Proteine mit verzögerter Freigabe unter Verwendung eines Alginats ist aus der WO 90/08551 bekannt. Bei diesem Verfahren wird ein Zweiphasensystem gebildet, in dem die erste Phase eine hohe Konzentration des Proteins (gesättigte Lösung) und die zweite Phase ein Alginat enthält. Jedoch ist eine solche Phasentrennung schwierig und kompliziert durchzuführen, wenn pharmazeutische Zusammensetzungen in großen Mengen hergestellt werden.
  • Eine stoßweise Freigabe von Dextran aus Calciumalginatkomplexen ist durch A. Kikuchi et al., J. Controlled Release 47 (1997), Seiten 21–29, bekannt. Jedoch beschreibt Kikuchi nicht die Kupplung von Hedgehog-Proteinen an solche Komplexe.
  • C.J. Robinson et al. beschreiben in Trends in Biotechnology 14 (1996), Seiten 451–452, die intraventrikuläre Implantation von Alginatmikrokugeln als Methode zur lokalen Anwendung von NGF- oder NGF-abgebenden Zellen. Jedoch wird eine Anwendung auf Hedgehog-Proteine nicht beschrieben.
  • E.C. Downs et al. beschreiben in J. Cell. Physiol. 152 (1992), Seiten 422–429, die Anwendung von Calciumalginatkugeln als Abgabesystem für Angiogenesefaktoren. Jedoch wird die Anwendung dieses Verfahrens oder dieses Abgabesystems Hedgehog-Proteine nicht beschrieben.
  • C.J. Crey und J. Dowsett beschreiben in Biotechnol. Bioeng. 31 (1988), Seiten 607–612, die Verwendung von Calcium/-Zinkkugeln als Abgabesystem für Insulin. Jedoch ist daraus die Anwendung dieses Verfahrens zur Herstellung von Abgabesystemen für Hedgehog-Proteine nicht bekannt.
  • Von Yang et al., Development 124 (1997), Seiten 4393–4404, ist es bekannt, daß an der Stelle der Wirkung einer pharmazeutisch wirksamen in-vivo-Aktivität im Körper hohe lokale Hedgehogkonzentrationen über einen Zeitraum von mindestens 16 Stunden aufrecht erhalten werden müssen. Das von Yang et al. beschriebene Trägersystem, z.B. das mit Hedgehog beladene Chromatographiemedium Affigel CM, die von Marti et al. in Nature 375 (1995), Seiten 322–325, beschriebene Ni-Agarose oder das gemäß Lopez-Martinez et al. in Curr. Biol. 5 (1995), Seiten 791–796, beschriebene Affigel Blue oder die Heparin-Agarose-Teilchen, welche darin verwendet wurden, sind für eine pharmazeutische Anwendung ungeeignet, da sie immunogenetisch sind und Entzündungsreaktionen verursachen können.
  • Die internationale Patentanmeldung Nr. PCT/SE95/00011 (WO 95/18635) beschreibt Faktoren, wie GH, IGF-I, IGF-II und EGF, die unter Verwendung einer niedermolekularen Hyaluronsäurezusammensetzung abgegeben werden können. Jedoch wird eine Anwendung auf Hedgehog-Proteinenicht beschrieben.
  • Die Erfinder haben festgestellt, daß auch das von Kinto et al. beschriebene biokompatible und biologisch abbaubare Trägerkollagen für Hh-exprimierende Zellen für eine optimale pharmazeutische Anwendung von Hedgehog-Proteinen ungeeignet ist, so lange diese Hedgehog-Proteine an die Träger nur über ionische Wechselwirkungen gebunden sind. Es wurde gefunden, daß dann, wenn Kollagenträger unter physiologischen Bedingungen (pH etwa 7 und in schwachen Säuren bis zu pH 4,5) mit Hedgehog-Proteinen beladen werden, der Hauptteil des angewandten Hedgehog-Proteins innerhalb von Minuten aus der Matrix freigegeben wird. Gemäß den Feststellungen der Erfinder ist diese unzureichende Bindung auf das Fehlen von ausreichenden ionischen Wechselwirkungen zwischen dem Hedgehog-Protein und dem Träger zurückzuführen. Im Fall des Beladens unter sauren Bedingungen (unter pH 4,5) wird eine große Menge des angewandten Hedgehog-Proteins denaturiert und irreversibel an den Träger gebunden.
  • Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung eines Hedgehog-Proteins mit einem biokompatiblen Träger bereitzustellen, worin der Träger das Hedgehog-Protein in seiner aktiven, gefalteten Struktur bindet und es in vivo in seiner aktiven Form auf verzögerte Weise freigeben kann. Derartige Formulierungen sind besonders zur Reparatur von Knochen- und Knorpelschäden geeignet, können aber auch zum Reparieren von neuronalen Defekten oder für eine systemische Freigabe verwendet werden.
  • Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch eine pharmazeutische Zusammensetzung eines Hedgehog-Proteins gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das Hedgehog-Protein an einen hydrophilen Träger gebunden ist, der biokompatibel ist, wobei der Träger ein Polymer ist, das
    • – das Hedgehog-Protein als einen negativ geladenen Träger als Ergebnis ionischer Wechselwirkungen bindet,
    • – das Hedgehog-Protein nicht denaturiert, wenn sich dieses an den Träger bindet,
    • – unter neutralen Bedingungen mindestens 0,1 bis 1, vorzugsweise 0,1 bis 2, negativ geladene Reste pro Monomer enthält,
    • – die Ladung in Form von sauren Gruppen, wie Sulfat, z.B. in Form einer Sulfat-, Carbonsäure- oder Phosphatgruppe, vermittelt,
    • – und ein Durschnittsmolekulargewicht von mindestens 50.000 Da aufweist.
  • Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Hedgehog-Proteine reversibel von einem Träger in vivo in einer aktiven Form und auf verzögerte Weise freigesetzt werden kann, ohne in vivo homogene Reaktionen oder Entzündungsreaktionen hervorzurufen, wenn sie an eine negativ geladene lösliche oder unlösliche Polymermatrix gebunden sind.
  • Vorzugsweise wird eine hydrophile Trägermatrix, insbesondere eine lösliche oder unlösliche organische hydrophile Trägermatrix, verwendet. Die Trägermatrix ist insbesondere zusammengesetzt aus einem anionischen Polysaccharid, unter Bevorzugung von Hyaluronsäure (sowie chemisch vernetzten Formen hiervon), Chondroitinsulfat, Polyvinylsulfat, Keratinsulfat, Dextransulfat, Pektin, Carragenen und anderen Hydrokolloiden, sulfatiertem Alginat, Dermatansulfat, Alginat, vorzugsweise Calciumalginat oder einer Kombination aus mindestens zwei solcher anionischer Polysaccharid oder einer Kombination dieser geladenen Polysaccharid mit anderen Polymeren, insbesondere Kollagen, worin der Gewichtsprozentsatz der geladenen Polysaccharid 10–50 % beträgt. Eine unlösliche Matrix im Sinne der Erfindung bedeutet, daß die Matrix in einer gepufferten Lösung in vitro innerhalb von 10–20 Stunden bei Raumtemperatur im Wesentlichen nicht zersetzt oder nicht sichtbar aufgelöst wird. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, daß der erfindungsgemäß verwendete Träger weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 20%, eines neutralen Polysaccharids, ganz besonders bevorzugt kein solches Polysaccharid, enthält. Als Trägermatrix ist Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von mindestens 106 Dalton, insbesondere mit einem Molekulargewicht von 4 × 106 Dalton, besonders geeignet.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform hat sich gezeigt, daß erfindungsgemäß auch hydrophile Träger auf der Basis eines anorganischen unlöslichen Phosphats, wie Hydroxylapatit oder Tricalciumphosphat, als unlösliche Trägermatrix geeignet sind.
  • Unter einer verzögerten Freigabe gemäß der Erfindung ist eine Freigabe des Hedgehog-Proteins in einer pharmakologisch wirksamen Dosis während eines definierten Zeitraums von mindestens 14 Stunden zu verstehen. Unter einer pharmakologischen Wirkung ist eine neurologische Wirkung auf Nervenzellen, eine Chondrogenese und/oder die Induktion einer Chondrogenese sowie vorzugsweise eine Osteogenese und/oder eine Osteoinduktion zu verstehen, wie von Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997), Seiten 319–323, für eine Knocheninduktion, von Miao et al. in J. Neurosci. 17 (1997), Seiten 58915899, für die Wirkung auf Nervenzellen und von Stott et al. in J. Cell. Sci. 110 (1997), Seiten 2691–2701, für die Knorpelzellinduktion beschrieben worden ist.
  • Als Träger wird vorzugsweise ein enzymatisch abbaubarer Träger verwendet, der von abgesonderten Enzymen (z.B. Proteasen) abgebaut werden kann, die aus Zellen stammen, auf denen die lokale in vivo-Anwendung erfolgt. Jedoch soll die Halbwertzeit des Trägers mindestens 12 Stunden betragen, kann aber auch bei mehreren Wochen liegen. Wenn der Träger aus einem Polysaccharid besteht, wird er vorzugsweise durch Glycosidasen und Hydrolasen abgebaut, die in der Zelle vorliegen und abgesondert werden. Eine solche biologische Abbaubarkeit des Trägers ist jedoch nicht in jedem Fall erforderlich. Wenn die Freigabe durchgeführt wird, um Osteoporosekrankheiten oder neuronale Krankheiten zu behandeln, ist eine biologische Abbaubarkeit nicht nötig. Jedoch sind solche Träger vorzugsweise unter physiologische Bedingungen schlecht löslich und werden folglich über einen relativ langen Zeitraum (während mehrerer Wochen bis Monaten) vom Körper absorbiert.
  • Es ist Lösungen von Hedgehog-Proteinen in hohen Konzentrationen notwendig, um Trägermatrizes zu bilden, die mit Hedgehog-Proteinen beschichtet sind, und zwar in einer solchen Weise, daß sie bei lokaler Anwendung eine angemessene pharmazeutische Wirkung entfalten. Es hat sich gezeigt, daß Träger, die mit einem Hedgehog-Protein beschichtet sind, das pharmazeutisch angewandt werden kann, vorzugsweise eine Konzentration des Hedgehog-Proteins von 1 bis 5 mg/ml Träger, insbesondere von 3 mg/ml Träger, oder mehr enthalten soll. Es sind Träger besonders bevorzugt, die Hedgehog-Proteine mit einer Konzentration von 10 mg/ml oder mehr beinhalten. Hedgehog-Proteine sind eigentlich schlecht löslich. Jedoch hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die Löslichkeit der Hedgehog-Proteine in Lösungen, die Arginin oder Argininiumionen (vorzugsweise Argininiumsulfat) enthalten, drastisch zunimmt. Deshalb besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung in wäßrigen Lösungen von Hedgehog-Proteinen mit einer Konzentration von 3 mg/ml und mehr, die Arginin und Argininiumionen enthalten und vorzugsweise gepuffert sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer Trägermatrix, die mit einem Hedgehog-Protein beschichtet ist, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die Trägermatrix mit einer Hedgehogproteinlösung mit einer Konzentration von 3 mg/ml und einem Gehalt an Arginin oder Argininiumionen inkubiert und die auf diese weise beschichtete Trägermatrix isoliert wird.
  • Derartige Lösungen eignen sich zum Herstellen von Trägermatrizes, die Hedgehog-Proteine in pharmazeutisch wirksamen Konzentrationen enthalten und für eine pharmazeutische Anwendung geeignet sind.
  • Unter einer Aktivität im Sinne der Erfindung wird die Aktivität von alkalischer Phosphatase verstanden (Simulierung der Expression von alkalischer Phosphatase), die das Polypeptid in Säugetierzellen induzieren kann (Aktivität in der alkalischen Phosphataseprobe). Zu diesem Zweck wird eine mesenchymale Zelllinie in einem Medium gezüchtet, das fötales Kalbserum enthält. Nachfolgend wird eine steril filtrierte Probe hinzugefügt, die Zellen werden nach 5 Tagen aufgelöst, und in dem Zelllysat wird die alkalische Phosphatase mit Hilfe der Spaltung eines chromogenen Substrats (pNP, p-Nitrophenol) bestimmt (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996), Seiten 38–47 und T. Nakamura (1997)).
  • Gemäß der Erfindung wird unter einem Hedgehog-Protein ein abgesondertes Signalprotein verstanden, das für die Bildung zahlreicher Strukturen bei der Embryogenese verantwortlich ist. Vorzugsweise werden das Sonic, das Indian und das Desert Hh verwendet (M. Fietz, et al., Development (Suppl.) (1994), Seiten 43–51). Ein Hh-Protein mit einer Sequenz, wie sie in der EMBL-Datenbasis unter der Nr. L38518 beschrieben ist, wird bevorzugt verwendet. Proteine der Hedgehog-Familie zeigen eine ausgesprochene Homologie in ihrer Aminosäuresequenz, weshalb es auch bevorzugt ist, jene Nukleinsäuren, die für Hedgehog-Proteine kodieren, welche zu 80% oder mehr homolog sind, mit der oben genannten Sequenz des Sonic Hedgehog-Proteins auszudrücken.
  • Das humane Sonic Hedgehog-Vorläuferprotein besteht aus den Aminosäuren 1 bis 462 der Sequenz, die in der EMBL-Datenbasis unter der Nr. L38518 beschrieben ist. Die Aminosäuren 1–23 repräsentieren das Signalpeptid, die Aminosäuren 24–197 repräsentieren die vollentwickelte Signaldomäne, die Aminosäuren 32–197 repräsentieren die um 8 Aminosäuren verkürzte Signaldomäne und die Aminosäuren 198 bis 462 repräsentieren die selbstverarbeitende Domäne nach der autoproteolytischen Spaltung.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 enthält vorzugsweise ein zusätzliches Polymer, das im wesentlichen als tragende Struktursubstanz wirkt, die auch eine Haftfunktion gegenüber Zellen aufweist, sich aber nicht an Hedgehog-Proteine auf der Basis von Ionenwechselwirkungen bindet. Vorzugsweise ist diese Substanz ein biologisch abbaubares Protein oder ein hydrolytisches Abbauprodukt, das z.B. in Form von intakten Proteinfasern als solubilisiertes Protein oder als partiell hydrolysiertes Protein eingesetzt werden kann. Eine derartige tragende Struktursubstanz ist vorzugsweise Collagen, Gelatine, Elastin oder Fibrin. Die tragende Struktursubstanz liegt vorzugsweise in einer geringeren Menge vor als der beschriebene hydrophile biokompatible Träger gemäß der Erfindung. Der Anteil der tragenden Struktursubstanz liegt deshalb vorzugsweise bei 30% oder weniger, bevorzugt bei 10% oder weniger. Jedoch kann die tragende Struktursubstanz auch im Überschuß bezüglich des hydrophilen Trägers vorliegen. Es muß in diesem Zusammenhang nur sichergestellt sein, daß die Menge des hydrophilen Trägers in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung genügend hoch ist, um zu garantieren, daß an den hydrophilen Trägern eine therapeutisch wirksame Menge des Hedgehog-Proteins gebunden ist. Es ist deshalb bevorzugt, bezüglich des Hedgehog-Proteins mindestens einen fünffachen Überschuß des hydrophilen Trägers zu verwenden. Ferner soll die Bindung des Hedgehog-Proteins an den Träger zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bei einem pH-Wert von 4,5 oder höher erfolgen. Wie oben erwähnt, wurde gefunden, daß Hedgehog-Proteine bei einem pH-Wert unter 4,5 denaturiert werden und sich irreversible an einen proteinartigen Träger, wie Collagen, bindet. Deshalb soll die Bindung des Hedgehog-Proteins an den Träger im neutralen pH-Bereich durchgeführt werden.
  • Träger, die außer dem hydrophilen Träger noch stützende Strukturverbindungen enthalten, sind beispielsweise Protein-Polysaccharid-Komplexe. Bevorzugte Komplexe sind in dem US-Patent 4614794 beschrieben.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung wird durch Inkubieren des Hedgehog-Proteins mit dem hydrophilen Träger bei einem pH-Wert von 4,5 oder höher, vorzugsweise bei einem pH-Wert innerhalb des neutralen Bereiches (pH 6 bis 8) hergestellt, wobei die Bindung des Hedgehog-Proteins an den Träger eintritt. Die Inkubation wird vorzugsweise in einer gepufferten Lösung ausgeführt. Wenn als Träger eine Matrix benutzt wird, die zusätzlich ein biologisch abbaubares Protein, wie Collagen, enthält stellt die Inkubation bei einem pH-Wert von 4,5 oder höher sicher, daß die irreversible Bindung des Hedgehog-Proteins (das bei niedrigem pH-Wert denaturiert wird) an das biologisch abbaubare Protein verhindert wird. Es wurde gefunden, daß unter diesen Bedingungen keine Bindung oder nur eine vernachlässigbare Bindung des Hedgehog-Proteins an das biologisch abbaubare Protein erfolgt, solange das Hedgehog-Protein keine hydrophobe Modifikation enthält und somit das biologische abbaubare Protein nur als eine tragende Struktursubstanz wirkt.
  • Hydrophob modifizierte (lipophilisierte) Hedgehog-Proteine sind Hedgehog-Proteine, die im Vergleich zu unmodifizierten Hh-Proteinen (z.B. zu rekombinant in Prokaryonten erzeugten Proteinen) eine Zunahme der Oberflächenhydrophobizität aufweisen. Der Grad der Lipophilisierung eines Proteins wird gemäß Z. Haque et al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982), Seite 481, durch Integrieren in einer Lipidschicht gemessen. Derartige lipophilisierte Hh-Proteine werden gemäß der Erfindung in der gleichen Weise an den hydrophilen Träger gebunden wie nicht lipophilisierte Hh-Proteine, sie werden aber zusätzlich über hydrophobe Wechselwirkungen an das biologisch abbaubare Protein gebunden.
  • Für die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung ist es ferner bevorzugt, Hilfsstoffe zuzusetzen, wie Zucker (Mannit, Saccharose, Lactose, Glucose, Trehalose, vorzugsweise 20–100 mg/ml) oder Aminosäuren wie Glycin oder Arginin, sowie Antioxidationsmittel, wie EDTA, Citrat, Polyethylenglykol (1–10 Gew%), Detergentien, vorzugsweise nicht-ionische Detergentien (vorzugsweise 0,005–1 Gew%), wie Polysorbate (Tween®20 oder Tween®80) oder Polyoxyethylene, entzündungshemmende Bestandteile, Lokalanästhetika, Antibiotika und/oder Stabilisatoren, wie Lipide, Fettsäuren und Glycerin.
  • Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung des Hedgehog-Proteins gemäß der Erfindung zusammen mit Suramin bevorzugt und kann mit Vorteil eingesetzt werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 kann zusätzliche pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung das Hedgehog-Protein mit einer Konzentration von 0,1–100 mg/ml.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch verträglichen Puffer, der in einem Bereich zwischen pH 4 und 10, vorzugsweise in einem Bereich zwischen pH 6 und 8, insbesondere bei einem pH-wert von etwa pH 7, biokompatibel ist. Der pH-Wert der pharmazeutischen Zusammensetzung soll zweckmäßigerweise über pH 4 betragen, um eine Denaturierung und ein Ablösen des in dem Hedgehog-Protein komplexierten Zinks zu verhindern. Die Konzentration des Puffers beträgt vorzugsweise 1 bis 500 mmol/l, insbesondere 5 bis 150 mmol/l, besonders bevorzugt 10–100 mmol/l. Bei einer geeigneten Ausführungsform werden 20 mmol/l Kaliumphosphatbuffer, pH 7,2, oder 100 mmol/l Argininchlorid, pH 7,2, als Puffer eingesetzt.
  • Die folgenden Beispiele, Veröffentlichungen und Figuren erläutern weiter die Erfindung und den Schutzumfang, der sich aus den Patentansprüchen ergibt. Die beschriebenen Methoden sind als Beispiele zu verstehen, welche auch den Gegenstand der Erfindung nach Durchführung von Modifikationen beschreiben.
  • Beschreibung der Figuren:
  • 1 In-vitro-Freigabe von SHh aus einer Collagenmatrix.
  • 2 In-vitro-Freigabe von SHh aus Calciumalginatkapseln.
  • 3 In-vitro-Freigabe von SHh aus Hyaluronsäuregelen.
  • 4 In-vitro-Freigabe von SHh aus einer Alginat-Collagen-Matrix.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines Alginatgels mit einem Gehalt an einem Hh-Protein.
  • Ein aliquoter Teil einer Hh-Proteinlösung (1 mg/ml SHh-Lösung in 50 mg/ml Saccharose, 50 mmol Kaliumphosphat, pH 7,2) wird mit einer Na-Alginat Vorratslösung (Pronova, Biopolymer, NO) (in Wasser, mehr als 0,1%) in einer solchen Wiese gerührt, daß ein gelartiges Alginat-Protein-Gemisch gebildet wird. Dieses Gel kann entweder direkt als eine injizierbare Matrix benutzt oder zu Calciumalginatkapseln verarbeitet oder als ein Lyophilisat gelagert werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines Collagengemisches mit einem Gehalt an Hh-Protein (Vergleichsbeispiel).
  • 100 μl einer Hh-Lösung (1 mg/ml Hh) in
    • a) 20 mmol Kaliumphosphat, pH 7,4 oder
    • b) in 50 mmol Natriumacetat, pH 4,5 oder
    • c) in 0,1% Trifluoressigsäure, pH 2
    werden tropfenweise auf Collagen-Schwämme (Helistat, Integra Life Sciences, USA) mit einer Größe von 10 × 10 × 3 mm aufgebracht. Die beladenen Träger wurden dann eingefroren (–70°C), lyophilisiert und analysiert. Dazu wurden die beladenen Schwämme in einem geeigneten Volumen eines Puffers (10 mmol/l Kaliumphosphat, 150 mmol/l NaCl, pH 7,2) bei 37°C inkubiert. Die Menge des freigegebenen Hh wird mittels RP-HPLC bestimmt.
  • Beispiel 3 3.1 Herstellung von Ca-Alginatkapseln
  • Das im Beispiel 1 beschriebene Alginatgel, welches Hh-Protein enthält, wird unter kontinuierlichem Rühren zu einer CaCl2-Lösung (etwa 1,5%) gegeben. Es bilden sich spontan Ca-Alginatkomplexe, welche das Protein enthalten. Die Größe der Kapseln, welche gebildet werden, hängt von der Größe der Tropfen ab und kann wunschgemäß variiert werden. Nach einer Inkubation von 5 bis 10 Minuten in der CaCl2-Lösung werden die Kapseln filtriert und in einem Puffer (20 mmol/l Kaliumphosphat, pH 7,2) gewaschen. Diese Kapseln können entweder direkt als Implantate verwendet oder durch Lyophilisierung weiterbehandelt werden.
  • 3.2 Lyophilisierung
  • Die Ca-Alginatkapseln werden bei –70°C eingefroren und anschließend lyophilisiert. Die Lyophilisierung ermöglichst eine stabile Lagerung der Kapseln und erleichtert zusätzlich die Implantation, da die Kapseln im trockenen Zustand leichter zu handhaben sind.
  • Beispiel 4
  • In-vitro-Freigabe von SHh
  • Die Analyse der Kinetik der in-vitro-Freigabe zeigt, daß das SHh in verzögerter Weise aus den Ca-Alginatkapseln während eines Zeitraums von mindestens 70 Stunden (2) freigegeben wird, während die Freigabe von SHh aus einer Collagenmatrix in einem Zeitraum zwischen wenigen Minuten bis zu etwa 20 Minuten erfolgt (1). Lyophilisierte Alginatkugeln, die SHh enthalten, wurden bei 37°C in 10 mmol Kaliumphosphat, 150 mmol NaCl, pH 7,2 (Rotaterm) inkubiert . Nach 5 min, 1 h, 5 h, 10 h, 1 d, 34 h, 2 d, 3 d und 6 d werden Proben genommen und mittels der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (2) auf ihren Gehalt an SHh analysiert. Die kumulative Menge der aus den Alginatkapseln freigegebenen Menge an SHh wird gegen die Zeit aufgetragen.
  • Die Prüfung der Freigabekinetik von SHh aus 2,5% Hyaluronsäuregelen unter Verwendung von Hyaluronsäurearten mit einem niedrigen Molekulargewicht (LMW; Molekulargewicht etwa 1,3 × 106 Da) oder mit einem hohen Molekulargewicht (HMW; Molekulargewicht etwa 4 × 106 Da) ist in der 3 dargestellt. Hierfür werden Hyaluronsäuregele, die mit SHh beladen sind, in Dialyseröhrchen (Trennungsgröße 300.000 Da) gefüllt, und die Röhrchen werden in PBS bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten werden Proben des Freigabemediums entnommen und mittels Umkehrphasen-HPLC auf ihren Gehalt an SHh analysiert. Es ist klar, daß ein Anteil des als Beladung vorliegenden Hedgehog-Proteins in verzögerter Weise freigegeben wird. Ein anderer Anteil des Proteins bleibt an die Hyaluronsäure gebunden und könnte in vivo durch Abbau der Hyaluronsäure freigegeben werden.
  • Die Prüfung der Kinetik der Freigabe von SHh aus einer Collagen-Alginat-Matrix (Fibracol®, siehe US-Patent 4614794) wird in 4 dargestellt. Dazu wurde ein Fibracol-Schwamm (1 × 1 × 0,3 cm3) mit 0,2 mg SHh in PBS beladen. Die beladenen Schwämme wurden eingefroren (–70°C), lyophilisiert und in einem geeigneten Volumen von PBS bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten wurden aus dem Freigabemedium Proben entnommen und mit Hilfe der Umkehrphasen-HPLC auf ihren Gehalt an SHh analysiert. Es ist klar, daß nur etwa 10 bis 20% der als Beladung vorliegenden Hedgehog-Proteine in das Medium abgegeben und ein größerer Anteil an die Collagen-Alginat-Matrix gebunden bleibt. Dieser Anteil könnte in vivo durch Abbau der Matrix freigegeben werden.
  • Liste der Druckschriften
    • Asahina, J., Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38–47
    • Bitgood, M.J. et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296
    • Chiang, C., et al., Nature 83 (1996) 407
    • Crey, C.J. et al., Biotechnol. Bioeng. 31 (1988) 607–612
    • Downs, E.C. et al., J. Cellular Physiology 152 (1992) 422–429
    • Fietz, M. et al., Development (Suppl) (1994) 43–51
    • Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982) 481
    • Hynes, M. et al., Neuron 15 (1995) 35–44
    • Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277–289
    • Kikuchi, A. et al., J. Controlled Release 47 (1997) 21–29
    • Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319–323
    • Lai, C.J. et al., Development 121 (1995) 2349
    • Lopez-Martinez et al., Curr. Biol. 5 (1995) 791–796
    • Marti et al., Nature 375 (1995) 322–325
    • Miao et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891–5899
    • Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465–469
    • Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517–520
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    • Robinson, C.J. et al., Trends in Biotechnology 14 (1996) 451–452
    • Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193–196
    • Stott et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691–2701
    • U.S. Patent 4,614,794
    • Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613
    • WO 90/0851
    • Yang et al., Development 124 (1997) 4393–4404

Claims (12)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung für die verzögerte Freigabe eines Hedgehog-Proteins in einer pharmakologisch wirksamen Dosis während eines Zeitraums von mindestens 14 Stunden, dadurch gekennzeichnet, daß das Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,1–100 mg/ml vorliegt und an einen hydrophilen Träger gebunden ist, der biokompatibel ist, wobei der Träger ein Polymer ist, welches – das Hedgehog-Protein als einen negativ geladenen Träger als Ergebnis ionischer Wechselwirkungen bindet, – das Hedgehog-Protein nicht denaturiert, wenn sich dieses an den Träger bindet, – unter neutralen Bedingungen mindestens 0,1 bis 2 negativ geladene Reste pro Monomer enthält, – die Ladung in Form von sauren Gruppen enthält, – ein Durchschnittsmolekulargewicht von mindestens 50.000 Da aufweist sowie – keine Agarose enthält, und wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur Aufrechterhaltung eines pH-Werts im Bereich zwischen 4 und 10 gepuffert ist.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 3 mg/ml vorliegt.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Träger aus einer organischen hydrophilen Trägermatrix oder einem anorganischen unlöslichen Phosphat besteht.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Träger aus einem anionischen Polysaccharid oder einem anorganischen unlöslichen Phosphat besteht.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 4, worin der hydrophile Träger Hyaluronsäure ist.
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 5, worin die Zusammensetzung Arginin oder Argininiumionen enthält.
  7. Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine verzögerte Freigabe eines Hedgehog-Proteins in einer pharmakologisch wirksamen Dosis während eines Zeitraums von mindestens 14 Stunden, wobei die Zusammensetzung ein Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,1–100 mg/ml enthält und an einen hydrophilen Träger gebunden ist, der biokompatibel ist, wobei der Träger ein Polymer darstellt, welches – das Hedgehog-Protein als einen negativ geladenen Träger als Ergebnis ionischer Wechselwirkungen bindet, – das Hedgehog-Protein nicht denaturiert, wenn sich dieses an den Träger bindet, – unter neutralen Bedingungen mindestens 0,1 bis 2 negativ geladene Reste pro Monomer enthält, – die Ladung in Form von sauren Gruppen enthält, – ein Durchschnittsmolekulargewicht von mindestens 50.000 Da aufweist sowie – keine Agarose enthält, und wobei als wesentliche Komponente dieser pharmazeutischen Zusammensetzung ein Hedgehog-Protein in einer pharmazeutisch wirksamen Menge verwendet wird sowie die pharmazeutische Zusammensetzung zum Aufrechterhalten eines pH-Werts im Bereich zwischen 4 und 10 gepuffert ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin ein Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,1–100 mg/ml verwendet wird.
  9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 8, worin der hydrophile Träger Hyaluronsäure ist.
  10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, worin das Binden des Hedgehog-Proteins an den hydrophilen Träger durch Inkubation bei einem pH-Wert von 4,5 oder höher bewirkt wird.
  11. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die verzögerte Freigabe eines Hedgehog-Proteins im menschlichen Körper, wobei das Hedgehog-Protein lokal angewandt wird.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,1–100 mg/ml angewandt wird.
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