DE102009036995B4

DE102009036995B4 - Matrix auf Kollagenbasis zur Verwendung als Restaurationsmaterial und Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE102009036995B4
Application number: DE102009036995.3A
Authority: DE
Inventors: Seong-Ki Lee; Si-Nae Park; Sang-Hee Bae
Original assignee: Dalim Tissen Inc
Current assignee: Dalim Tissen Inc
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2009-08-12
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2029-08-13
Also published as: US8748579B2; KR100947765B1; DE102009036995A1; KR20100021763A; US20100040685A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: als ersten Schritt Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (A) oder der infektionshemmenden Kollagen-Dispersion (B) auf eine Petrischale oder eine lösbare Platte, um eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1 bis 2 Tage, um eine poröse Membran zu ergeben; als zweiten Schritt Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (E) auf eine lösbare Platte und Aufbringen eines Drucks von 1 bis 20 psi auf die aufgetragene Dispersion, um eine 0,05 bis 1 mm dicke dichte Membran zu bilden; als dritten Schritt Trocknen der dichten Membran für 10 bis 20 Minuten bei Zimmertemperatur, Auflegen der porösen Membran auf die dichte Membran und Lufttrocknen der Membranen für 1 bis 2 Tage bei Zimmertemperatur, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen; als vierten Schritt Verrühren einer 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C für 10 bis 15 Minuten; als fünften Schritt vollständiges Eintauchen der Doppelschichtstruktur in die EDC-Lösung bei 4°C für 1 bis 2 Tage, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen; als sechsten Schritt 4- bis 6-maliges Waschen der Doppelschichtstruktur mit destilliertem Wasser, um das EDC daraus zu entfernen; und als siebten Schritt Lyophilisieren der gewaschenen Doppelschichtstruktur bei –60 bis –80°C für 1 bis 2 Tage.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis gemäß Patentanspruch 1 und auf eine Matrix auf Kollagenbasis zur Verwendung als Restaurationsmaterial, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Matrix auf Kollagenbasis mit Doppelschichtstruktur, bestehend aus einer dichten Schicht und einer porösen Schicht, welche als Gewebe-Restorationsmaterial verwendbar ist und exzellente Haftfähigkeit und Heilwirkungen bietet. Typ-1-Kollagen, typischerweise aus tierischem Material gewonnen, wird in Atelokollagen umgewandelt, indem man die Telopeptiden daraus entfernt. Das Atelokollagen wird in destilliertem Wasser dispergiert und bildet eine poröse Schicht und eine dichte Schicht, die in Anwesenheit von EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimid] miteinander vernetzt werden, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen, welche sich unter wässrigen Bedingungen nicht trennt und in eine gitterförmige Matrix weiterverarbeitet wird. Somit befasst sich die vorliegende Erfindung auch mit einem Verfahren zur Herstellung der Matrix auf Kollagenbasis.
2. Beschreibung verwandter Produkte
Mit der Zunahme einer Patientenpopulation, die unter Verbrennungen, wundgelegenen Stellen, Wunden, hartnäckigen Geschwüren, ulceröser Dermalnekrose oder Epidermalnekrose leidet, sind große Fortschritte in der Behandlung verletzter Haut gemacht worden. Noch vor drei Jahrzehnten starben Patienten, deren Körperoberfläche zu 60% oder mehr verbrannt war, gewöhnlich an Blutvergiftung. Um Wasserverlust und bakterielle Infektion zu verhindern, ist in letzter Zeit jedoch künstliche Haut entwickelt worden, wodurch ein signifikanter Beitrag zu einer Reduktion der Sterblichkeit geleistet wurde.
Künstliche Haut wird hauptsächlich in Wundabdeckung und kultivierte Haut unterteilt. Erstere wird typischerweise bei lokalen oder nicht schwerwiegenden Wunden angewandt, um die Haut zu schützen, bevor dort eine Hauttransplantation durchgeführt wird oder bis man ein kultiviertes Autotransplantat erhält, was gewöhnlich 3 bis 4 Wochen dauert. Was die kultivierte Haut betrifft, so wird sie benutzt, um die Narbenbildung zu minimieren, wenn ein schwerwiegender Hautverlust auftritt oder eine Wunde über eine große Hautfläche zugefügt wird. Hierfür werden genügend Hautzellen durch die Benutzung von Zellkulturtechnik beschafft und für eine dauerhafte Implantation verwendet.
Die kultivierte Haut muss jedoch auf Sicherheit hinsichtlich verschiedener Pathogene einschließlich Viren (HIV 1&2, HTLV I & II, CMV-IgM, Hepatitis B & C und Adenovirus) wie auch hinsichtlich Bakterien, Pilzen, Endotoxinen und Mykoplasma untersucht werden. Wenn sie von einer Leiche genommen wird, verbleibt die Haut in einem unbekannten Gesundheitszustand, und es ist unmöglich, sie hinsichtlich der tödlichen Viren vollständig zu sterilisieren, weil das Körpergewebe nicht in dem gewünschten Maße thermisch behandelt werden kann. Außerdem dauert es wenigstens eine Woche, Zellen zu kultivieren und zu transplantieren, was zu lange ist, um damit einen Erste-Hilfe-Patienten zu behandeln.
Gegenüber gezüchteter Haut hat die Wundabdeckung die Vorteile, dass sie über eine breite Fläche der Haut benutzt wird, leicht zu handhaben ist und leicht bei Erste-Hilfe-Patienten angewendet werden kann. Sie kann jedoch nur zur vorläufigen Behandlung, nicht zur permanenten Transplantation eingesetzt werden. Aus natürlichen Polymeren wie Chitin, Chitosan, Kollagen usw. hergestellte Wundabdeckungen haben eine geringe mechanische Festigkeit, sind teuer und in großen Mengen schwierig herzustellen. Wenn sie andererseits aus synthetischen Polymeren wie Silikon oder Polyurethan hergestellt werden, besitzen die Wundabdeckungen eine schlechte Bioverträglichkeit und ein schlechtes Kontaktverhalten gegenüber Wunden.
Aus der DE 101 96 234 B4 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Verbundprodukts aus Kollagen für die Gewebebildung und eine entsprechende Verwendung bekannt, wobei zuerst eine im wesentlichen kompakte Kollagen-Membran hergestellt wird, indem ein Kollagenschwamm, der durch Lyophilisieren eines Kollagengels hergestellt wurde, bei einem Druck von mindestens 50 bar komprimiert wird. Außerdem wird ein zweites Kollagengel getrennt hergestellt, woraufhin entweder die im wesentlichen kompakte Membran auf dem zweiten Kollagengel abgeschieden oder das zweite Kollagengel auf die im wesentlichen kompakte Membran gegossen wird. Anschließend wird die ganze Anordnung zur Herstellung des Verbundprodukts lyophilisiert.
Aus der DE 600 18 480 T2 ist eine Mehrschicht-Kollagenmatrix zu Geweberekonstruktion bekannt, zu deren Herstellung gefriergetrocknete Kollagenschwämme, eine luftgetrocknete Kollagen-Membran und ein gefriergetrockneter vorgepresster Kollagenschwamm verwendet werden. Zur Herstellung des genannten Mehrschicht-Materials erfolgt eine Wärme- und Druckbehandlung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die beim gegenwärtigen Stand der Technik auftretenden Probleme zu überwinden und eine Matrix auf Kollagenbasis zur Verwendung als Restaurationsmaterial zu liefern, die eine Infektion mit Pathogenen verhindert und eine ausgezeichnete mechanische Festigkeit besitzt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis mit einer Doppelschichtstruktur aus einer porösen und einer dichten Schicht zu liefern, wobei die poröse und die dichte Schicht miteinander vernetzt sind, um eine mechanische Festigkeit sicherzustellen, die ausreicht, um in wässrigen Umgebungen standzuhalten und ihre Integrität zu bewahren.
Einem Aspekt entsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis geliefert, das folgendes umfasst: Einen ersten Schritt, in dem man eine aus einer Atelokollagen-Dispersion (A), einer infektionshemmenden Atelokollagen-Dispersion (B), einer Mischungs-Dispersion aus Hyaluronsäure und Atelokollagen (C) und einer Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) ausgewählte Dispersion als poröse Schicht so auf eine Petrischale oder eine lösbare Platte aufträgt, dass sich eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran bildet, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1–2 Tage, so dass sich eine poröse Membran ergibt; einen zweiten Schritt, in dem man eine Atelokollagen-Dispersion (E) als dichte Schicht auf eine lösbare Platte aufbringt und auf die aufgebrachte Dispersion einen Druck von 1–20 psi ausübt, um eine 0,05–1 mm dicke dichte Membran zu bilden; einen dritten Schritt, in dem man die dichte Membran bei Zimmertemperatur 10 bis 20 Minuten lang trocknet, die poröse Membran auf die dichte Membran legt und die Membranen bei Zimmertemperatur 1 bis 2 Tage lang lufttrocknet, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen; einen vierten Schritt, in dem man eine 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C 10 bis 15 Minuten lang verrührt; einen fünften Schritt, in dem man die Doppelschichtstruktur 1–2 Tage lang bei 4°C vollständig in die EDC-Lösung eintaucht, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen; einen sechsten Schritt, in dem die Doppelschichtstruktur 4–6 mal mit destilliertem Wasser gewaschen wird, um das EDC daraus zu entfernen; und einen siebten Schritt, in dem man die gewaschene Doppelschichtstruktur 1–2 Tage lang bei –60 bis –80°C lyophilisiert. Daran kann sich ein achter Schritt anschließen, in dem die lyophilisierte Doppelschichtstruktur auf Maße von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm zugeschnitten wird.
Ebenfalls geliefert wird die nach dem Verfahren hergestellte Matrix auf Kollagenbasis.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die oben erwähnten und andere Objekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen klarer verstanden werden. Dabei gilt folgendes:
1 zeigt eine Matrix auf Kollagenbasis mit einer Doppelschichtstruktur;
2 zeigt elektronische Fotografien von Matrizen auf Kollagenbasis mit darin integrierten Antibiotika: A: Tobramycin, B: Ciprofroxacin, C: Polymicin B; und
3 zeigt einen Querschnitt der Doppelschichtstruktur der Matrix auf Kollagenbasis.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSGESTALTUNGEN
Im Gegensatz zu konventionellen Matrizen auf Kollagenbasis, die synthetische Polymere in Kombination mit natürlichen Polymeren verwenden, besteht die Matrix auf Kollagenbasis nach vorliegender Erfindung nur aus dem natürlichen Polymer Kollagen und ist deshalb besser mit biologischen Geweben verträglich. Bei der Matrix auf Kollagenbasis garantiert die durch Vernetzen von zwei Schichtkomponenten unter Verwendung von EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimid] erzeugte Doppelschichtstruktur hohe mechanische Festigkeit und dass sie, auch dank der Verwendung von 90–99 % Alkohol (Äthylalkohol, Methylalkohol) bei der Vernetzung, ihre Integrität in wässrigen Umgebungen behalten wird. Dementsprechend kann die Doppelschichtstruktur zu einer Matrix, deren Maße von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm reichen und die selbst einem engen, gekrümmten Bereich, wie z. B. den unregelmäßigen Rändern einer Wunde, dem Handrücken, dem Gesicht, dem Fuß fest aufgelegt werden kann, verarbeitet werden, wobei darin ein feuchter Zustand erhalten bleibt. Außerdem kann die Matrix auf Kollagenbasis der vorliegenden Erfindung jederzeit problemlos benutzt werden, was eine Behandlung von Erste-Hilfe-Patienten damit ermöglicht.
Schweine-Kollagen wird Rinder-Kollagen hinsichtlich der Sicherheit vor TSE(Transmissible Spongiforme Encephalopathie)-Infektionen vorgezogen. Die Zugabe eines Antibiotikums zu der Matrix reduziert die Gefahr einer sekundären Infektion stark. Außerdem fördert Hyaluronsäure, weit verbreitet in den Feldern Tissue Engineering [Gewebezüchtung] und Drug Delivery Systems (DDS)[Dosiersysteme für Arzneimittel], in Verbindung mit Kollagenfasern die Zellmigration.
Einem Aspekt davon entsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis zur Verwendung als Restaurationsmaterial. Eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens wird untenstehend gegeben.
Die Matrix auf Kollagenbasis nach vorliegender Erfindung besitzt eine Doppelschichtstruktur bestehend au seiner porösen Schicht und einer dichten Schicht, die beide aus Atelokollagen-Dispersionen gewonnen werden. Für die poröse Schicht wird eine Atelokollagen-Dispersion in destilliertem Wasser (A), eine durch Hinzufügen eines Antibiotikums zur Dispersion (A) erhaltene infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion (B), eine Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (C), bei der Hyaluronsäure mit Kollagen verbunden wird, um die Struktur des Kollagen zu stärken und die Zellmigration zu verbessern, oder eine infektionshemmende Mischungs-Dispersion aus Kollagen und Hyaluronsäure (D), bei der der Dispersion (C) ein Antibiotikum zugegeben wird, bereitgestellt. Eine Kollagen-Dispersion (E) mit einem hohen Kollagengehalt für die Erzeugung einer dichten Membran wird ebenfalls geliefert.
Die bei der Bildung der porösen Schicht und der dichten Schicht verwendeten Kollagen-Dispersionen werden untenstehend beschrieben.
1. Herstellung von Atelokollagen-Dispersionen
1) Herstellung der Atelokollagen-Dispersionen für die poröse Schicht
(1) Kollagen-Dispersion für die poröse Schicht (A)
Atelokollagen wird wird in einer Menge von 1–3 Gewichts-% destilliertem Wasser zugegeben und 1–2 Tage lang bei 4°C verrührt, um eine Dispersion zu ergeben, gefolgt von der Einstellung des pH-Werts der Dispersion auf 7,4 mit 0,05–1 N NaOH.
(2) Infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion (B)
Der Atelokollagen-Dispersion (A) wird eine Spurenmenge eines Antiotikums zugesetzt, um eine infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion zu ergeben.
(3) Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (C)
Atelokollagen wird in einer Menge von 0,5–3 Gewichts-% destilliertem Wasser zugegeben und 1–2 Tage lang bei 4°C verrührt, um eine Atelokollagen-Dispersion zu ergeben. Separat davon wird Hyaluronsäure in einer Menge von 1–3 Gewichts-% destilliertem Wasser zugegeben und 13–24 Stunden lang bei 4°C verrührt. Die Atelokollagen-Dispersion wird mit der Hyaluronsäure-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 5–10:0,5–2 gemischt, gefolgt von 3–6 Minuten langem Rühren bei 4°C und 8.000–10.000 U/min. Der pH-Wert der resultierenden homogenen Mischung wird mit 0,05–1 N NaOH auf 7,4 eingestellt.
(4) Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D)
Eine Spurenmenge eines säureunlöslichen Antibiotikums wird homogen in der Mischungs-Dispersion (C) dispergiert, um eine Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure zu ergeben.
2) Herstellung der Atelokollagen-Dispersion für die dichte Schicht (E)
Atelokollagen wird destilliertem Wasser in einer Menge von 2–5 Gewichts-% zugegeben und 1–2 Tage lang bei 4°C verrührt, um eine Dispersion zu ergeben, gefolgt von der Einstellung des pH-Werts der Dispersion auf 7,4 mit 0,05–1 N NaOH.
2. Herstellung der Matrix auf Kollagenbasis als Restaurationsmaterial
Eine Matrix auf Kollagenbasis wird folgendermaßen aus der Atelokollagen-Dispersion (A) oder der infektionshemmenden Atelokollagen-Dispersion (B) für die poröse Schicht und der Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Schicht hergestellt.
Erster Schritt: Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (A) oder der infektionshemmenden Kollagen-Dispersion (B) auf eine Petrischale oder eine lösbare Platte, um eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1 bis 2 Tage, um eine poröse Membran zu ergeben,
Zweiter Schritt: Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (E) auf eine lösbare Platte und Aufbringen eines Drucks von 1 bis 2 psi auf die aufgetragene Dispersion, um eine 0,05 bis 1 mm dicke dichte Membran zu bilden,
Dritter Schritt: Trocknen der dichten Membran für 10 bis 20 Minuten bei Zimmertemperatur, Auflegen der porösen Membran auf die dichte Membran und Lufttrocknen der Membranen für 1 bis 2 Tage bei Zimmertemperatur, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen,
Vierter Schritt: Verrühren einer 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C für 10 bis 15 Minuten,
Fünfter Schritt: Vollständiges Eintauchen der Doppelschichtstruktur in die EDC-Lösung bei 4°C für 1 bis 2 Tage, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen,
Sechster Schritt: 4- bis 6-maliges Waschen der Doppelschichtstruktur mit destilliertem Wasser, um das EDC daraus zu entfernen,
Siebter Schritt: Lyophilisieren der gewaschenen Doppelschichtstruktur bei –60 bis –80°C für 1 bis 2 Tage,
Achter Schritt (optional): Schneiden der lyophilisierten Doppelschichtstruktur auf ein Maß von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm.
Alternativ kann eine Matrix auf Kollagenbasis aus einer Mischungs-Dispersion aus Hyaluronsäure und Atelokollagen (C) oder einer Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) für die poröse Schicht und einer Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Schicht wie folgt hergestellt werden. Wenn Kollagen, das bei der Gewebezüchtung (Tissue Engineering) und bei Dosiersystemen für Arzneimittel (Drug Delivery Systems – DDS) extensiv genutzt wird, damit zusammengebracht wird, kann das Mucopolysaccharid Hyaluronsäure die Zellmigration unterstützen.
Erster Schritt: Auftragen der Mischungs-Dispersion aus Hyaluronsäure und Atelokollagen (C) oder der Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) auf eine lösbare Platte, um eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1 bis 2 Tage, um eine poröse Membran zu ergeben,
Zweiter Schritt: Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (E) auf eine lösbare Platte und Aufbringen eines Drucks von 1 bis 20 psi auf die aufgetragene Dispersion, um eine 0,05 bis 1 mm dicke dichte Membran zu bilden,
Dritter Schritt: Trocknen der dichten Membran für 10 bis 20 Minuten bei Zimmertemperatur, Auflegen der porösen Membran auf die dichte Membran und Lufttrocknen der Membranen für 1 bis 2 Tage bei Zimmertemperatur, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen,
Vierter Schritt: Verrühren einer 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C für 10 bis 15 Minuten,
Fünfter Schritt: Vollständiges Eintauchen der Doppelschichtstruktur in die EDC-Lösung bei 4°C für 1 bis 2 Tage, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen,
Sechster Schritt: 4- bis 6-maliges Waschen der Doppelschichtstruktur mit destilliertem Wasser, um das EDC daraus zu entfernen,
Siebter Schritt: Lyophilisieren der gewaschenen Doppelschichtstruktur bei –60 bis –80°C für 1 bis 2 Tage,
Achter Schritt (optional): Schneiden der lyophilisierten Doppelschichtstruktur auf ein Maß von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann durch die folgenden Beispiele erreicht werden, die dargelegt werden, um die vorliegende Erfindung zu illustrieren, die jedoch nicht als diese begrenzend ausgelegt werden dürfen.
BEISPIEL 1
Herstellung der Atelokollagen-Dispersion (A) für die poröse Schicht
Atelokollagen wurde in einer Menge von 2 Gewichts-% destilliertem Wasser zugesetzt und 40 Stunden lang bei 4°C verrührt, um eine Dispersion zu ergeben, gefolgt von der Einstellung des pH-Wertes der Dispersion auf 7,4 mit 0,5 N NaOH.
Infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion (B)
Penicillin V wurde der Atelokollagen-Dispersion (A) in einer Spurenmenge zugesetzt, um eine infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion zu ergeben.
Herstellung der Atelokollagen-Dispersion für die dichte Schicht (E)
Atelokollagen wurde in einer Menge von 4 Gewichts-% destilliertem Wasser zugesetzt und 30 Stunden lang bei 4°C verrührt, um eine Dispersion zu ergeben, gefolgt von der Einstellung des pH-Wertes der Dispersion auf 7,4 mit 0,5 N NaOH.
Herstellung der Matrix auf Kollagenbasis für die Verwendung als Restaurationsmaterial aus der Atelokollagen-Dispersion (A) oder der infektionshemmenden Atelokollagen-Dispersion (B) für die poröse Membran und Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Membran

1. Die Atelokollagen-Dispersion (A) wurde auf eine lösbare Platte aufgetragen, um eine 0,5 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –70°C für 30 Stunden, um eine poröse Membran zu ergeben.
2. Die Atelokollagen-Dispersion (E) wurde auf eine lösbare Platte aufgetragen und einem Druck von 10 psi ausgesetzt, um eine 0,5 mm dicke dichte Membran zu bilden.
3. Die dichte Membran wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang getrocknet, mit der porösen Membran bedeckt und 30 Stunden lang bei Zimmertemperatur luftgetrocknet, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen.
4. Eine 50 mmol/l EDC-Lösung wurde in 95 Gewichts-% Äthanol bei 4°C 15 Minuten lang verrührt.
5. Die Doppelschichtstruktur wurde 40 Stunden lang bei 4°C vollständig in die EDC-Lösung eingetaucht, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen.
6. Die Doppelschichtstruktur wurde 5 mal 15 Minuten lang mit destilliertem Wasser gewaschen, um das EDC daraus zu entfernen.
7. Dann wurde die gewaschene Doppelschichtstruktur 30 Stunden lang bei –70°C lyophilisiert.
8. Die lyophilisierte Doppelschichtstruktur wurde auf ein Maß von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm zugeschnitten.

BEISPIEL 2
Eine infektionshemmende Matrix auf Atelokollagenbasis wurde in ähnlicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, dass die infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion (B) anstelle der Atelokollagen-Dispersion (A) verwendet wurde.
BEISPIEL 3
Herstellung der Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (C)
Atelokollagen wurde destilliertem Wasser in einer Menge von 2 Gewichts-% zugegeben und 30 Studen lang bei 4°C verrührt, um eine Atelokollagen-Dispersion zu ergeben. Hyaluronsäure wurde destilliertem Wasser in einer Menge von 2 Gewichts-% zugegeben und 20 Stunden lang bei 4°C verrührt, um eine Hyaluronsäurelösung zu ergeben. Die Atelokollagen-Dispersion wird mit der Hyaluronsäurelösung in einem Gewichtsverhältnis von 7:1 gemischt, gefolgt von 4 Minuten langem Rühren bei 4°C und 9.000 U/min. Der pH-Wert der resultierenden homogenen Mischung wird mit 0,5 N NaOH auf 7,4 eingestellt.
Herstellung der Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D)
Eine Spurenmenge Penicillin V wird in der Mischungs-Dispersion (C) homogen dispergiert, um eine Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure zu ergeben.
Eine Matrix auf Kollagenbasis wurde aus einer Atelokollagen-Dispersion, nämlich aus der Mischungs-Dispersion von Atelokollagen und Hyaluronsäure (C) oder der infektionshemmenden Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) für die poröse Schicht und aus der Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Schicht wie folgt hergestellt.

1. Die Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (C) wurde auf eine lösbare Platte aufgetragen, um eine 0,5 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –70°C für 40 Stunden, um eine poröse Membran zu ergeben.
2. Die Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Schicht wurde auf eine lösbare Platte aufgetragen und einem Druck von 14 psi ausgesetzt, um eine 0,4 mm dicke dichte Membran zu bilden.
3. Die dichte Membran wurde bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang getrocknet, mit der porösen Membran bedeckt und 15 Stunden lang bei Zimmertemperatur luftgetrocknet, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen.
4. Eine 50 mmol/l EDC-Lösung wurde in 95 Gewichts-% Äthanol bei 4°C 15 Minuten lang verrührt.
5. Die Doppelschichtstruktur wurde 40 Stunden lang bei 4°C vollständig in die EDC-Lösung eingetaucht, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen.
6. Die Doppelschichtstruktur wurde 5 mal 15 Minuten lang mit destilliertem Wasser gewaschen, um das EDC daraus zu entfernen.
7. Dann wurde die gewaschene Doppelschichtstruktur 40 Stunden lang bei –70°C lyophilisiert.
8. Die lyophilisierte Doppelschichtstruktur wurde auf Maße von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis 10 mm × 15 mm × 15 mm zugeschnitten.

BEISPIEL 4
Eine infektionshemmende Matrix auf Atelokollagenbasis wurde in ähnlicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, jedoch mit der Ausnahme, dass die infektionshemmende Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (C) anstelle der Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (A) verwendet wurde.
Antibiotika, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können Tetracycline wie Tetracyclin, Doxycyclin und Aureomycin, Penicilline wie Penicillin V, Ampicillin, Amoxicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Nafcillin and Oxacillin, Cephalosporine wie Cephalexin, Cephradin, Cefadroxil, Cefaclor, Cefuroxim, Axetil, Cefpodoxim, Loracarbef und Cefixim, Aminoglycoside wie Gentamycinsulfat, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin und Neomycin, Polymicine wie Polymicin B, Sulfonamide wie Mafenid, Silbersulfadiazin und Sulfasalazin, Zellwandsyntheseinhibitoren (cell wall inhibitors) wie Teicoplanin, Bacitracin und Novobiocin, Proteinsyntheseinhibitoren wie Clindamycin und DNA-Syntheseinhibitoren wie Norfloxacin, Enoxacin, Pefloxacin, Ciprofroxacin und Ofloxacin sein und können in einer Konzentration von 0,001 mg bis 10 mg/ml eingesetzt werden.
Wenn sie in einen Gefriertrockner gelegt wird, wird die auf eine lösbare Platte aufgetragene Atelokollagen-Dispersion sofort gefroren. In diesem Zustand, während die Trocknung über einen langen Zeitraum durchgeführt wird, verbinden sich zerstreute faserige Partikel, um einen schwammartigen porösen Film zu bilden. Andererseits wird die auf eine lösbare Platte aufgetragene Atelokollagen-Dispersion unter Druck gesetzt, wobei eine dichte poröse saugfähige Platte benutzt wird, so dass das Wasser herausgedrückt wird und die faserigen Kollagenpartikel miteinander in Kontakt gebracht werden, um eine dichte Kollagenmembran zu bilden.
Außer als Lösungsmittel für das EDC zu dienen und für die Vernetzung von Kollagenmembranen gebraucht zu werden bewirkt die hochreine Alkohollösung Veresterung mit der Carboxylgruppe (COOH) des Kollagens, um den Kollagenoberflächen kationische Eigenschaft zu verleihen, was sie fähig macht, sich mit negativ geladenen Blutplättchen zu verbinden.
Wenn sie dem Atelokollagen zugegeben wird, dient Hyaluronsäure als Verstärkung für die schwache Struktur der porösen Membran. Zusätzlich verbessert Hyaluronsäure in Verbindung mit Kollagenfasern die Zellmigration und steigert damit den Heilungseffekt.
Wie vorstehend beschrieben besteht die Matrix auf Kollagenbasis entsprechend gegenwärtiger Erfindung nur aus dem natürlichen Polymer Kollagen und ist deshalb verträglicher mit biologischen Geweben als konventionelle Matrizen auf Kollagenbasis, die synthetische Polymere in Kombination mit natürlichen Polymeren verwenden. Bei der Matrix auf Kollagenbasis garantiert die durch Vernetzen von zwei Schichtkomponenten unter Gebrauch von EDC [1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimid] aufgebaute Doppelschichtstruktur große mechanische Festigkeit und behält ihre Integrität in wässrigen Umgebungen dank der Verwendung von 90 bis 99% Alkohol (Äthylalkohol, Methylalkohol) bei der Durchführung der Vernetzung. Demzufolge kann die Doppelschichtstruktur zu einer Matrix mit Abmessungen, die von 200 μm × 200 μm × 200 μm bis zu 10 mm × 15 mm × 15 mm reichen, und die eng anliegend aufgebracht werden kann, um selbst schmale, gekrümmte Bereiche, wie z. B. die unregelmäßigen Ränder einer Wunde, den Handrücken, das Gesicht, einen Fuß usw. zu bedecken, verarbeitet werden, wobei darin ein feuchter Zustand erhalten bleibt. Außerdem kann die Matrix auf Kollagenbasis der vorliegenden Erfindung problemlos zu jeder Zeit verwendet werden, was eine akut notwendige Behandlung eines Erste-Hilfe-Patienten damit erlaubt. Sinnvoll ist die Verwendung von Schweine-Kollagen, welches dem Rinder-Kollagen hinsichtlich der Sicherheit vor TSE-Erregern vorgezogen wird. Wenn notwendig wird der Matrix ein Antibiotikum zugegeben, um die Gefahr einer Sekundärinfektion stark zu reduzieren. Ferner fördert Hyaluronsäure, die auf den Gebieten der Gewebezüchtung (Tissue Engineering) und der Dosiersysteme für Arzneimittel (Drug Delivery Systems – DDS) viel benutzt wird, in Verbindung mit Kollagenfasern die Zellmigration.
Obwohl die bevorzugten Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung zur Veranschaulichung offengelegt wurden, werden Fachleute verstehen, dass verschiedene Modifikationen, Ergänzungen und Substitutionen möglich sind. Folglich sollten die Modifikationen, Ergänzungen und Substitutionen als in den Geltungsbereich und Sinn der Erfindung fallend verstanden werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis, das folgendes beinhaltet: als ersten Schritt Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (A) oder der infektionshemmenden Kollagen-Dispersion (B) auf eine Petrischale oder eine lösbare Platte, um eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1 bis 2 Tage, um eine poröse Membran zu ergeben; als zweiten Schritt Auftragen der Atelokollagen-Dispersion (E) auf eine lösbare Platte und Aufbringen eines Drucks von 1 bis 20 psi auf die aufgetragene Dispersion, um eine 0,05 bis 1 mm dicke dichte Membran zu bilden; als dritten Schritt Trocknen der dichten Membran für 10 bis 20 Minuten bei Zimmertemperatur, Auflegen der porösen Membran auf die dichte Membran und Lufttrocknen der Membranen für 1 bis 2 Tage bei Zimmertemperatur, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen; als vierten Schritt Verrühren einer 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C für 10 bis 15 Minuten; als fünften Schritt vollständiges Eintauchen der Doppelschichtstruktur in die EDC-Lösung bei 4°C für 1 bis 2 Tage, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen; als sechsten Schritt 4- bis 6-maliges Waschen der Doppelschichtstruktur mit destilliertem Wasser, um das EDC daraus zu entfernen; und als siebten Schritt Lyophilisieren der gewaschenen Doppelschichtstruktur bei –60 bis –80°C für 1 bis 2 Tage.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Atelokollagen-Dispersion (A) durch Dispergieren von 1–3 Gewichts-% Atelokollagen in destilliertem Wasser unter 1–2 Tage langem Rühren bei 4°C und Einstellen eines pH-Werts der Lösung mit 0,05–1 N NaOH auf 7,4 gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Atelokollagen-Dispersion (E) für die dichte Schicht durch Dispergieren von 2–5 Gewichts-% Atelokollagen in destilliertem Wasser unter 1–2 Tage langem Rühren bei 4°C und Einstellen eines pH-Werts der Lösung mit 0,05–1 N NaOH auf 7,4 gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die infektionshemmende Atelokollagen-Dispersion (B) durch gleichförmiges Mischen eines Antibiotikums in einer Menge von 0,001 mg–10 mg/ml in die Atelokollagen-Dispersion (A) gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Antibiotikum aus einer Gruppe bestehend aus Tetracyclinen wie Tetracyclin, Doxycyclin und Aureomycin, Penicillinen wie Penicillin V, Ampicillin, Amoxicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Nafcillin und Oxacillin, Cephalosporinen wie Cephalexin, Cephradin, Cefadroxil, Cefaclor, Cefuroxim, Axetil, Cefpodoxim, Loracarbef und Cefixim, Aminoglycosiden wie Gentamycinsulfat, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin und Neomycin, Polymicinen wie Polymicin B, Sulfonamiden wie Mafenid, Silbersulfadiazin und Sulfasalazin, Zellwandsyntheseinhibitoren (cell wall inhibitors) wie Teicoplanin, Bacitracin und Novobiocin, Proteinsyntheseinhibitoren wie Clindamycin und DNA-Syntheseinhibitoren wie Norfloxacin, Enoxacin, Pefloxacin, Ciprofroxacin und Ofloxacin ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Matrix auf Kollagenbasis, dass folgendes beinhaltet: einen Schritt des Auftragens einer Mischungs-Dispersion aus Hyaluronsäure und Atelokollagen (C) oder einer Mischungs-Dispersion aus infektionshemmendem Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) auf eine lösbare Platte, um eine 0,05–1 mm dicke gleichförmige Membran zu bilden, gefolgt von Lyophilisierung bei –60 bis –80°C über 1 bis 2 Tage, um eine poröse Membran zu ergeben; einen Schritt des Auftragens einer Atelokollagen-Dispersion (E) auf eine lösbare Platte und Aufbringen eines Drucks von 1 bis 20 psi auf die aufgetragene Dispersion, um eine 0,05 bis 1 mm dicke dichte Membran zu bilden; als dritten Schritt Trocknen der dichten Membran für 10 bis 20 Minuten bei Zimmertemperatur, Auflegen der porösen Membran auf die dichte Membran und Lufttrocknen der Membranen für 1 bis 2 Tage bei Zimmertemperatur, um eine Doppelschichtstruktur zu erzeugen; als vierten Schritt Verrühren einer 10–100 mmol/l EDC-Lösung in 90–99 Gewichts-% Äthanol bei 4°C für 10 bis 15 Minuten; als fünften Schritt vollständiges Eintauchen der Doppelschichtstruktur in die EDC-Lösung bei 4°C für 1 bis 2 Tage, um die poröse Membran mit der dichten Membran zu vernetzen; als sechsten Schritt 4- bis 6-maliges Waschen der Doppelschichtstruktur mit destilliertem Wasser, um das EDC daraus zu entfernen; und als siebten Schritt Lyophilisieren der gewaschenen Doppelschichtstruktur bei –60 bis –80°C für 1 bis 2 Tage.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure gewonnen wird durch Dispergieren einer Menge von 0,5–3 Gewichts-% Atelokollagen in destilliertem Wasser unter 1–2 Tage langem Rühren bei 4°C, um eine Atelokollagen-Dispersion zu erhalten, Lösen von 1–3 Gewichts-% Hyaluronsäure in destilliertem Wasser unter 13–24 Stunden langem Rühren bei 4°C, um eine Hyaluronsäure-Lösung zu erhalten, Mischen der Atelokollagen-Dispersion mit der Hyaluronsäure-Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 5–10:0,5–2, Rühren der Mischung 3–6 Minuten lang bei 4°C und 8.000–10.000 U/min und Einstellen des pH-Werts der resultierenden homogenen Mischung auf 7,4 mit 0,05–1 N NaOH.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die infektionshemmende Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure (D) durch Hinzufügen eines Antibiotikums in einer Menge von 0,001 mg bis 10 mg/ml zu der Mischungs-Dispersion aus Atelokollagen und Hyaluronsäure gewonnen wird.
Matrix auf Kollagenbasis, hergestellt unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6.