DE10196234B4 - Verfahren zur Herstellung eines Verbundprodukts aus Kollagen für die Gewebebildung und seine Verwendung - Google Patents
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Abstract
a) zuerst die im wesentlichen kompakte Kollagen-Membran hergestellt wird entweder durch Trocknen eines ersten Kollagengels oder durch Komprimieren eines Kollagenschwamms, der durch Lyophilisieren eines Kollagengels hergestellt wurde, mit einem Druck von mindestens 50 bar;
b) ein zweites Kollagengel getrennt hergestellt wird;
c) entweder die im wesentlichen kompakte Membran auf dem zweiten Kollagengel abgeschieden wird oder das zweite Kollagengel auf die im wesentlichen kompakte Membran gegossen wird, und schließlich
d) das Ganze lyophilisiert wird zur Herstellung des Verbundprodukts.
Description
- Seit vielen Jahren hat sich Kollagen als nicht ersetzbares Substrat für die Herstellung von lebende Zellen enthaltenden künstlichen Geweben erwiesen.
- Die erhaltenen Biomaterialien werden in steigendem Umfang auf dem Gebiet der Pharmazeutika verwendet und sie scheinen eine vielversprechende Zukunft für die Herstellung von geschädigten Bindegeweben oder für die Gentherapie zu haben, da sie die Einführung und das Überleben von modifizierten (veränderten) Zellen in einem lebenden Organismus erlauben.
- Außerdem wird für "in vitro"-Tests in der Kosmetik- und dermopharmazeutischen Industrie in zunehmendem Maße rekonstruierte Haut verwendet, insbesondere da immer weniger Tierversuche in diesen Disziplinen angewendet werden.
- Aus diesem Grund haben mehrere Forscherteams der ganzen Welt sich bemüht, auf Kollagen basierende Träger für die Herstellung von lebenden künstlichen Geweben, wie z.B. Haut, Knorpel, Knochen, Sehnen oder rekonstruierter Cornea, zu entwickeln, sodass diese neuen Biomaterialien zahlreiche Anwendungsgebiete haben.
- Es sei darauf hingewiesen, dass die Hauptstudien, die auf diesem Gebiet, auf dem die vorliegende Erfindung liegt, durchgeführt wurden, hauptsächlich auf die folgenden Forscherteams zurückgehen: I. Yannas, C. Collombel, E. Tinois, S. Boyce, H. Eisenberg, E. Bell, Y. Koroyanagi, T. Maruguchi, M. Hanthamrongwit, F.A. Auger und C.S. Osborne (vgl. z.B. das
US-Patent 5 273 900 A ). - Alle diese Forscher verwenden entweder Gele oder Kollagenschwämme, wobei letztere durch Gefriertrocknen (Lyophilisierung) erhalten werden.
- Aus
WO 99/19 005 A1 - Diese Sperrschicht dient dazu, das Eindringen und damit das Wachstum von nativen Gewebezellen zu verhindern, weil diese Membran für die Rekonstruktion des Knochens oder insbesondere des Knorpels bestimmt ist, sodass es erforderlich ist, als Material, das in dieser porösen Schicht vorherrscht, Kollagen II zu verwenden, das aus Knorpel, vorzugsweise aus dem Hyalin-Knorpel von Schweinen gewonnen wurde (vgl. Seite 7, Zeilen 14-16).
- Es sei darauf hingewiesen, dass die Knorpelzellen oder die Chondrozyten eine viel niedrigere Vermehrungs- oder Regenerierungsgeschwindigkeit aufweisen als die Regenerierungsgeschwindigkeit der Zellen von weichen Geweben, wie z.B. Fibroblasten, sodass es erforderlich ist, sie zu isolieren, um ihre Züchtung zu ermöglichen bei gleichzeitiger Vermeidung der Invasion der Zellen von weichen Geweben mit einem schnellen Wachstum. In diesem Dokument wird die Lösung vorgeschlagen, eine Sperrschicht zu verwenden benachbart zu den Zellen, die das Wachstum der Kollagen II-Zellen schützen, die das Wachstum der Chondrozyten fordern (vgl. Seite 2, Zeilen 15 bis 20).
- Innerhalb des Rahmens der weiter unten beschriebenen Erfindung wird zuerst ein Zweischichtenmaterial hergestellt, wobei jede Schicht in der Lage ist, das Wachstum von lebenden Humanzellen zu ermöglichen, was eine nicht offensichtliche und vollständig unerwartete Lösung im Vergleich zum Stand der Technik darstellt.
- Das Dokument
WO 96/08277 A2 - Aus Beispiel II ergibt sich jedoch, dass der erhaltene Schwamm 15 Sekunden lang mit einem Druck von 150 bar gepresst wird und dass die gemischte Membran hergestellt wird durch Ablagern eines Kollagengels mit 1% Kollagen auf diesem gepressten Schwamm, wobei dieses Gel dann bei Umgebungsluft getrocknet wird.
- Entsprechend der Schwammkompression, die während der 15 Sekunden unter einem Druck von 150 bar erhalten wird, wird die erhaltene gemischte Membran tatsächlich hergestellt aus zwei primär gepressten Schichten, sodass eine Struktur vorliegt, die verschieden vom Gegenstand dieser Erfindung ist. Außerdem wurde im Falle dieser Erfindung auf überraschende Weise gefunden, dass die beanspruchte Zweischichten-Struktur mit dem Impfen mindestens einer Schicht mit lebenden Human-Zellen kompatibel ist, wodurch sowohl ihre Konservierung als auch ihre Vermehrung (Vervielfältigung) möglich ist.
- Es sei darauf hingewiesen, dass das Dokument
FR 2 679 778 A1 - Das Dokument
EP 0 686 402 A1 stellt ebenfalls ein älteres Dokument des gleichen Anmelders dar, das sich auf eine postoperative Antihaft-Kollagen-Membran bezieht, die zwei Schichten umfasst, einen Träger, der Kollagen enthält und vollständig bedeckt ist mit einer Gelatineschicht, wobei die Mischung im gefriergetrockneten Zustand vorliegt. Es sei darauf hingewiesen, dass hier der kritische Zweck der Gelatineschicht der ist, einen Effekt der Verlimung der Membran unter Vermeidung einer Anhaftung durchzuführen und dass die Gelatine eine schnelle Resorption erfahrt durch die Auflösung in Gegenwart von Zellen bei 37°C. -
WO 98/22154 A2 WO 98/22154 A2 WO 98/22154 A2 WO 98/22154 A2 -
WO 96/24310 A1 WO 96/243 10 A1 -
DE 689 08 300 T2 beschreibt zwar eine kompakte Kollagenmembran, die jedoch nicht getrennt von einer porösen Kollagenschicht erzeugt wird sondern vielmehr durch Gießen eines Kollagens auf die poröse Kollagenschicht und Trocknen derselben zusammen mit dem Kollagen erzeugt wird. - Abschließend offenbart
WO 95/18638 A1 WO 95/18638 A1 - Das Dokument
EP 0 789 074 A1 von L'OREAL bezieht sich auf ein Haut-Äquivalent, das die Langerhans'schen Zellen umfasst. - Es sei darauf hingeweisen, dass bei dieser Anmeldung der in Spalte 4, Zeile 3, beschriebene Träger selbst ein nicht spezifizierter Träger des Standes der Technik ist. Er kann hergestellt sein aus gemischten Kollagen/Fibroblasten-Gitterstrukturen, einer Dermis, die zuerst deepidermisiert wird, einer künstlichen Membran, einem subkutanen Ersatzstoff, der Kollagen enthält, einem Kunststoff oder einem anderen Träger, der mit der Lebensfähigkeit von Zellen kompatibel ist (vgl. Spalte 4, Zeilen 3 bis 12).
- Dieses Dokument unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung insofern, als in ihm eine Dermis verwendet wird, die erhalten wurde durch Delaminieren einer Haut, die bedeckt ist mit einer Mischung von Human-Keratinozyten, die vorher unter Anwendung eines traditionellen Verfahrens abgetrennt worden sind, gemischt mit Humanmelanozyten, die ebenfalls vorher unter Anwendung eines bekannten Verfahrens abgetrennt worden sind und die dann einer Co-Kultivierung unterworfen werden. In diesem Dokument wird keine kompakte Schicht vorgeschlagen, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung angegeben wird, die mit lebenden Human-Zellen beimpft werden kann, und auf kritische Weise kombiniert ist mit einer porösen Unterlagenschicht, die von der deepidermisierten Dermis eindeutig verschieden ist.
- Schließlich werden in dem Dokument
WO 91/16010 A1 - Nach der Inkubation wird der Schwamm umgedreht und auf die obere Oberfläche wird nicht-poröses Kollagen auflaminiert, das mit Pepsin behandelt werden kann (vgl. Seite 8, letzter Absatz), wie dies allgemein bei Rinder-Kollagen der Fall ist. Es wird darauf hingewiesen, dass der Zweck der Behandlung mit Pepsin darin besteht, die Telopeptide zu entfernen (Seite 9, Zeilen 1 bis 4). Der pH-Wert der Kollagen-Lösung wird auf einen neutralen pH-Wert eingestellt, der die Ausfällung von Kollagen erlaubt. Das Kollagen bildet auf dem Schwamm eine Schicht aus einem dünnen Film und das Ganze wird 60 min lang bei 37°C kultiviert (Seite 9, letzter Satz des ersten Absatzes).
- Dann werden die gezüchteten Keratinozyten auf die auflaminierte Schicht inokuliert (überimpft) und es wird eine neue Kultivierung bei einem pH-Wert von 7,2 und bei 35°C 10 Tage lang durchgeführt.
- Innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, wie er sich aus der nachfolgenden Beschreibung ergibt, wird zuerst die Zweischichten-Struktur hergestellt und in einer kritischen Weise aufgebaut aus einem Kollagenschwamm, der mit einer kompakten (dichten) Schicht bedeckt ist, wobei diese kompakte Schicht überraschende technische Effekte ergibt, wie in der nachfolgenden Beschreibung angegeben.
- Die Hauptschwierigkeiten, die bei der Herstellung von Trägern für die Produktion von lebenden künstlichen Geweben zu überwinden waren, sind folgende: eine gute mechanische Festigkeit, eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Temperaturen von etwa 37°C, biologische Eigenschaften, die günstig sind für die Zellentwicklung und für den Stoffwechsel, eine geringe Empfindlichkeit für enzymatischen Abbau und schließlich für bestimmte Anwendungen und insbesondere für rekonstruierte Haut, vorzugsweise die Anwesenheit einer Zweischichten-Struktur, in der eine der Schichten so kompakt (dicht) wie möglich ist und die andere porös ist.
- Die bisher durchgeführten Forschungsarbeiten haben nicht zu Kollagenträgern geführt, die in zufriedenstellender Weise allen oben genannten Einschränkungen Rechnung tragen.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diese Probleme zu lösen, die sowohl vom technischen als auch vom industriellen Standpunkt aus betrachtet übrig geblieben sind.
- Durch die vorliegende Erfindung ist es möglich, alle diese technischen Probleme auf eine besonders einfache, wirtschaftliche Weise zu lösen, die anwendbar ist für die Durchführung in industriellem Maßstab, insbesondere in der Kosmetik-, dermopharmazeutischen oder pharmazeutischen Industrie.
- Gemäß einem Gegenstand betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Komposit- bzw. Verbundprodukts, das mindestens eine poröse Kollagenschicht umfasst, die auf mindestens einer Seite mit einer im wesentlichen kompakten (dichten) Kollagen-Membran bedeckt ist, wobei:
- a) zuerst die im wesentlichen kompakte (dichte) Kollagen-Membran hergestellt wird entweder durch Trocknen eines ersten Kollagengels, vorzugsweise an der Luft oder mit Hilfe eines Gasfluids, oder durch Komprimieren eines Kollagenschwamms, der durch Gefrier-Lyophilisierung eines Kollagengels erhalten worden ist mit einem Druck von mindestens 50 bar;
- b) ein zweites Kollagengel getrennt hergestellt wird;
- c) entweder die im wesentlichen kompakte (dichte) Membran auf dem zweiten Kollagengel abgeschieden wird oder das zweite Kollagengel auf die im wesentlichen kompakte (dichte) Membran gegossen wird, und schließlich
- d) das Ganze lyophilisiert wird zur Herstellung des Verbund- bzw. Kompositprodukts.
- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform dieses durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts umfasst mindestens eine der beiden Schichten des Produkts, d.h. die poröse Schicht und/oder die im wesentlichen kompakte (dichte) Membran, normale, genetisch modifizierte (veränderte) oder maligne (bösartige) lebende Zellen, die insbesondere von jungen oder älteren Lebewesen stammen.
- Gemäß einer vorteilhaften Variante werden die lebenden Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten, Langerhans'schen Zellen, die aus dem Blut stammen, Endothelzellen, die aus dem Blut stammen, Blutzellen, insbesondere Makrophagen oder Lymphozten, Adipozyten (Fettzellen), Sebozyten, Chondrozyten (Knorpelzellen), Osteozyten (Knochenzellen), Osteoblasten (Knochenmutterzellen) und Merkel-Zellen, die aus dem Blut stammen, wobei diese Zellen normale, genetisch modifizierte (veränderte) oder maligne (bösartige) Zellen sind.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform enthält das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Verbundprodukt normale, genetisch modifizierte oder maligne Fibroblasten in der porösen Schicht und normale, genetisch modifizierte oder maligne lebende Zellen auf der Oberfläche der kompakten (dichten) Membran, wobei diese Zellen insbesondere ausgewählt werden aus Keratinozyten, Melanozyten, Merkel-Zellen, die aus dem Blut stammen, Langerhans'schen Zellen, die aus dem Blut stammen, Sebozyten, Zellen, die aus dem Blut stammen, und Nervenzellen.
- Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann es besonders wertvoll sein, entweder eine "junge" rekonstruierte Haut unter Verwendung von Zellen, die im wesentlichen ausschließlich aus jungen Lebewesen entnommen wurden, oder eine "gealterte (reife)" rekonstruierte Haut, unter Verwendung von Zellen, die im wesentlichen ausschließlich aus älteren Lebewesen entnommen wurden, herzustellen. Diese Modelle machen es möglich, die Kenntnisse über den Hautalterungsprozess zu verbessern und den Einfluss von Wirkstoffen (aktiven Agentien) auf diesen Prozess zu untersuchen.
- Bei noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die im wesentlichen kompakte (dichte) Membran hergestellt werden, bevor sie mit der porösen Schicht kombiniert wird, die vorzugsweise einen Kollagenschwamm umfasst, insbesondere durch Herstellung der Membran und Abscheidung derselben auf einem Kollagengel, bevor das Ganze eingefroren und lyophilisiert wird, um das Verbundprodukt zu ergeben.
- Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform enthält das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Verbundprodukt, der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran dieses Produkts Kollagen, das aus einem Säugetier, insbesondere einem Rind, stammt.
- Gemäß noch einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform enthält das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Verbundprodukt, der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagenmembran, Kollagen, das aus dem Meer, d.h. aus Meeresorganismen, stammt, vorzugsweise aus den Häuten von Knochenfischen, insbesondere Fischen, die nicht-pigmentierte Hautbereiche aufweisen, ganz besonders bevorzugt aus Plattfischen, noch besser aus solchen, die auf industrielle Weise gefischt werden, wie z.B. Seezunge, Scholle, Steinbutt, Glattbutt, deren nicht-pigmentierte Bauchhäute beim Aufschneiden leicht abgetrennt werden können. Die bevorzugte Fischhaut, die als Quelle für die Extraktion des erfindungsgemäß verwendbaren Kollagens verwendet wird, ist die Haut der Seezunge. Die Herstellung von Kollagen aus Fischhäuten ist insbesondere in dem oben genannten Dokument der Anmelderin
EP 0 592 586 A1 =US-A-5 420 248 A beschrieben, auf das der Fachmann auf diesem Gebiet Bezug nehmen kann. Es ist insbesondere überraschend, dass ein solcher Kollagenschwamm und/oder ein solcher Kollagenfilm und/oder eine solche Kollagen-Membran, der (die) aus Kollagen, das aus dem Meer, vorzugsweise aus Knochenfischen, stammt, biokompatibel sein kann mit lebenden Humanzellen, die für die Herstellung von rekonstruierten Häuten verwendet werden, und dass diese lebenden Humanzellen nicht nur am Leben bleiben können, sondern auch in der Lage sind, sich zu vermehren. - Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann das Kolla gen, das aus einem Säugetier, insbesondere aus einem Rind stammt, oder vorzugsweise das Kollagen, das aus dem Meer, insbesondere aus Knochenfischhäuten, stammt, entweder chemisch vernetzt werden oder physikalisch vernetzt werden, wie weiter unten innerhalb des Rahmens des Herstellungsverfahrens beschrieben. Es ist insbesondere überraschend, dass eine solche Vernetzung innerhalb des Rahmens der Herstellung eines biokompatiblen Materials mit Humanzellen angewendet werden kann, die in dem oben genannten Verfahren zur Herstellung von rekonstruierten Häuten verwendet werden.
- Unter dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausdruck "biokompatibel" ist zu verstehen, dass das Biomaterial gegenüber lebenden Humanzellen nicht toxisch ist und dass es außerdem ihr Wachstum oder ihre Vermehrung erlaubt. Es sei darauf hingewiesen, dass die Vernetzung im allgemeinen die Wirkung hat, ein Material nicht-biokompatibel und damit toxisch für lebende Zellen zu machen, das ihr Wachstum nicht erlaubt.
- Gemäß einer noch weiteren vorteilhaften Ausführungsform des durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts wird mindestens eine der beiden Schichten dieses Produkts aus einem Kollagengel hergestellt, das ein Gemisch von löslichem Kollagen und unlöslichem Kollagen, beispielsweise in Form von Fasern, enthält.
- Im Falle des durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts kann das Kollagen ein Kollagen vom Typ I und/oder vom Typ III sein.
- Bei einer vorteilhaften Variante dieses Verfahrens wird der zur Herstellung der kompakten Membran verwendete Kollagenschwamm bei einem Druck von mindestens etwa 50 bar (50·105 Pa), vorzugsweise bei einem Druck zwischen 50 und 200 bar (50·105-200·105 Pa), gepresst.
- Die Kompressionsstufe wird zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 20 und 80°C, vorzugsweise zwischen 40 und 60°C, durchgeführt.
- Bei einer anderen vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens wird der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran hergestellt, wobei man entweder Kollagen oder eine Mischung von Kollagen mit einem Polysaccharid, insbesondere einem Glycosaminoglycan, Chitosan oder einem Derivat davon, Cellulose oder einem Derivat davon, Dextran oder einem Derivat davon, einem Alginat oder einem Derivat davon oder einem Carrageenan verwendet.
- Gemäß einer anderen Variante des Verfahrens ist mindestens eine der beiden Schichten vernetzt oder es sind beide Schichten vernetzt.
- Bei einer weiteren vorteilhaften Variante ist die oben genannte Vernetzung eine physikalische Vernetzung, insbesondere eine thermische Dehydratation unter Vakuum oder TDH, oder eine chemische Vernetzung, insbesondere mit Diphenylphosphorylazid oder DPPA, mit einem Aldehyd wie Glutaraldehyd, mit Carbodiimid oder mit Succinimid.
- Bei einer weiteren vorteilhaften Variante dieses Verfahrens wird eine Verbindung, welche die Zellen-Entwicklung fördert, insbesondere ein Wachstumsfaktor und speziell ein Zytokin oder ein Chemokin, während der Herstellung zugegeben.
- Bei einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Stufe zur Einführung von normalen, genetisch modifizierten (veränderten) oder malignen (bösartigen) lebenden Zellen in mindestens eine der beiden Schichten vorgesehen.
- Bei einer vorteilhaften Variante werden diese lebenden Zellen ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten, Langerhans'schen-Zellen, die aus dem Blut stammen, Endothelzellen, die aus dem Blut stammen, Blutzellen, insbesondere Makrophagen oder Lymphozyten, Chondrozyten (Knorpelzellen), Osteozyten (Knochenzellen), insbesondere Osteoblasten (Knochenmutterzellen), Merkel-Zellen, die aus dem Blut stammen, Sebozyten, Adipozyten (Fettzellen) und Nervenzellen.
- Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Einführung von Fibroblasten in die poröse Schicht.
- Bei einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Abscheidung von lebenden Zellen auf der Oberfläche der kompakten (dichten) Membran, wobei diese Zellen insbesondere ausgewählt werden aus Keratinozyten, Melanozyten, Merkel-Zellen, die aus dem Blut stammen, Langerhans-Zellen, die aus dem Blut stammen, Sebozyten, Zellen, die aus dem Blut stammen, und Nervenzellen.
- Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die lebenden Zellen bereitgestellt entweder durch eine sequentielle Kultivierung oder durch eine gleichzeitige Kultivierung unterschiedlicher Zell-Typen, wobei diese Zellen aus einer Kultur oder einer Biopsie stammen.
- Gemäß einem dritten Merkmal betrifft die vorliegende Erfindung außerdem die Verwendung des Komposit- bzw. Verbundprodukts, das einen Kollagenträger bildet, wie er vorstehend definiert ist oder wie er nach dem vorstehend definierten Verfahren erhalten wird, für die Herstellung einer künstlichen Haut, die insbesondere bestimmt ist für die Durchführung von in vitro-Tests zur Bestimmung der Wirksamkeit (des Wirkungsgrades) einer potentiell aktiven Substanz (Wirkstoff) oder zur in vivo-Rekonstruktion von beschädigten Hautflächen.
- Gemäß einer vorteilhaften Charakteristik kann die künstliche Haut erhalten werden im wesentlichen ausschließlich aus jungen Zellen oder im wesentlichen ausschließlich aus gealterten Zellen, insbesondere zur Untersuchung des Gewebe-Alterungsprozesses, speziell des Haut-Alterungsprozesses und gegebenenfalls zum Test der Wirksamkeit von Wirkstoffen (aktiven Prinzipien) bei diesem Prozess.
- Daraus ist zu ersehen, dass die Erfindung eine Lösung für die oben genannten technischen Probleme darstellt.
- Um die stabilsten Kollagen-Materialien zu erhalten, haben die Erfinder insbesondere das in dem
US-Patent 5 331 092 A (publiziert am 19. Juli 1994) beschriebene Verfahren durchgeführt. Dieses Verfahren liefert eine Mischung von löslichen und unlöslichen nativen Kollagenen vom Typ I und Typ III, die vom mechanischen Standpunkt aus betrachtet sehr beständig (stark) sind und gegenüber enzymatischem Abbau sehr beständig sind. Diese letztgenannten beiden Charakteristika können gegebenenfalls noch verbessert werden durch Anwendung eines Vernetzungs-Verfahrens oder durch die Zugabe von Substanzen, die mit Kollagen in eine starke Wechselwirkung treten und gegenüber Zellen nicht toxisch sind. Darüber hinaus ist es durch dieses Kollagen-Her stellungsverfahren möglich, die Gefahr einer biologischen Kontamination durch Bakterien, Viren oder Prionen praktisch zu eliminieren. - Für den Fall von Trägern, die für die Erzielung einer rekonstruierten Haut bestimmt sind, kam den Erfindern die Idee, ein Zweischichten-Material herzustellen, bei dem zuerst die kompaktere (dichtere) Schicht und dann die poröse Schwammschicht gebildet wird. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es zu einer viel kompakteren (dichteren) Oberflächenschicht führt als alle bisher beschriebenen Verfahren. Insbesondere können Schwämme, die durch hohe Kompression gepresst worden sind, oder Filme an den porösen Matrices fixiert werden.
- Die Verwendung der vorstehend beschriebenen Träger für Gewebeherstellungsanwendungszwecke umfasst die Inokulation (Überimpfung) von lebenden oder genetisch modifizierten Zellen, wobei es für die Zellen möglich ist, sich sowohl innerhalb des Kollagenträgers als auch auf seiner Oberfläche zu entwickeln.
- Die auf diese Weise erhaltenen rekonstruierten lebenden Gewebe können bei zahlreichen kosmetischen, dermopharmazeutischen oder pharmazeutischen Anwendungen eingesetzt werden, beispielsweise:
- – bei "in vitro"-Modellen zum Simulieren der Einflüsse der Bestandteile auf den Zellstoffwechsel zur Bewertung des Wirkungsgrades und der Toxizität der Ausgangsmaterialien oder von komplexeren Formulierungen;
- – in rekonstruierten Geweben, mit denen die Mangel von geschädigten Geweben beseitigt werden können: Haut, Knorpel, Knochen, Sehnen, Cornea; oder
- – in lebenden Implantaten, die modifizierte Zellen enthalten, mit denen bestimmte Mängel des Organismus überwunden werden können, insbesondere auf dem Gebiet der Gentherapie.
- Weitere Ziele, Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden erläuternden Beschreibung unter Bezugnahme auf verschiedene Ausführungsbeispiele der Erfindung hervor, die jedoch lediglich als Erläuterung angegeben sind und den Bereich der Erfindung keineswegs einschränken.
- Darüber hinaus beschreiben die Beispiele 6 bis 13 bevorzugte Ausführungsformen der durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Komposit- bzw. Verbundprodukte, die einen Kollagenträger bilden. Beispiel 14 bezieht sich auf Vergleichstests, die den Wert der durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhaltenen Komposit- bzw. Verbundprodukte als Kollagenträger für die Herstellung von künstlicher Haut zeigen, die insbesondere bestimmt ist zur Durchführung von in vitro-Tests in bezug auf die Wirksamkeit einer potentiell aktiven Substanz oder für die in vivo-Rekonstruktion von geschädigten Hautbereichen.
- In den beiliegenden Zeichnungen zeigen:
-
1 ist eine Schnittansicht, nach dem Markieren durch eine konventionelle histologische Färbung, eines durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhaltenen Komposit- bzw. Verbundprodukts das aus einer porösen unteren Schicht aus Rinder-Kollagen, die auf der Oberseite mit einer im wesentlichen kompakten (dichten) oberen Kollagen-Membran bedeckt ist, die aus einem Kollagenfilm, hergestellt durch Trocknen eines Kollagengels an der Luft unter den Bedingungen des Beispiels 6, besteht; -
2 eine ähnliche Schnittansicht, die mit einer einfachen porösen Matrix erhalten wurde, die mit dem gleichen Rinder-Kollagengel hergestellt worden ist, jedoch mit der Ausnahme, dass sie nicht bedeckt ist, d.h. unter den Bedingungen des Beispiels 1, das somit die Anwesenheit von tiefen Einschlüssen von Keratinozyten, die nicht auf die Oberfläche beschränkt sind, zeigt; -
3 die Menge an Lamininen, die in den rekonstruierten Haut-Inkubationsmedien vorhanden ist jeweils für eine junge rekonstruierte Haut, die aus Zellen hergestellt wurde, die aus Spendern mit einem Alter von 25 bis 35 Jahren entnommen wurden, und für eine reife oder gealterte rekonstruierte Haut, die aus Zellen hergestellt wurde, die aus Spender mit einem Alter von mehr als 55 Jahren entnommen wurden, um den Einfluss des Alters des Spenders zu zeigen, wobei die Ergebnisse in Form von "Blöcken" angegeben sind und die Menge der gebildeten Laminine auf der Ordinate als Prozentsatz der Kontrolle (YRS = junge rekonstruierte Haut) angegeben ist; -
4 den induktiven Effekt eines fermentierten Malzextrakts, der im Handel erhältlich ist unter dem Warenzeichen BASALINE®, COLETICA, Frankreich, auf die Herstellung von Lamininen in reifer rekonstruierter Haut, wobei die Menge der gebildeten Laminine wiederum der Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt ist; und -
5 den Kompensationseffekt des gleichen fermentierten Malzextrakts oder von BASALINE®, wobei die Menge der gebildeten Laminine auf der Ordinate als Prozentsatz der Kontrolle angegeben ist; -
6 die Proliferation von normalen Human-Fibroblasten in einem Dermis-Äquivalent, wobei die Zeit in Tagen auf der Abszisse angegeben ist und die optische Dichte × 1000 auf der Ordiante angegeben ist in Einheiten, die jeweils um 100 zunehmen; wobei die Kurve mit den Rhomben diejenige ist, die erhalten wird bei Verwendung einer aquatischen porösen Kollagen-Matrix, hier von Fischen, als Träger, und die Kurve mit den Quadraten mit Rinder-Kollagen erhalten wurde; und -
7 eine ähnliche Kurve der Proliferation von Fibroblasten in einem Dermis-Äquivalent, wobei die Zeit auf der Abszisse in Tagen angegeben ist und die Fluoreszenz auf der Ordiante in Internationalen Einheiten (IU) angegeben ist, beginnend bei 15 000 mit einer Steigerung der Einheiten um jeweils 10 000, wobei die Kurve mit den ausgefüllten Rhomben die Fluoreszenz darstellt, die im Rahmen des Tests 1 erhalten wurden, die Kurve mit den Quadraten diejenige darstellt, die in dem Test 2 erhalten wurde, die Kurve mit den nicht ausgefüllten Dreiecken diejenige ist, die im Test 3 erhalten wurde, und schließlich die Kurve mit den Kreuzen diejenige ist, die im Test 4 erhalten wurde. - Erfindungsgemäßes Beispiel 1
- Herstellung einer porösen Matrix aus nativem Kollagen nach dem Verfahren des
US-Patents Nr. 5 331 092 A - A – Herstellung des nativen Kollagens
- Ein Gel wird hergestellt aus Kalbshäuten, die vorher (2 h) gewaschen und dann mit einer Kalk/Sulfid-Mischung (3,5% Kalk, 2,5% Natriumsulfid) in einer Menge von 400 g Haut (Feststoffgehalt: etwa 30%) auf 250 ml Wasser enthaart wurden. Die Behandlung in diesem Bad dauerte 30 min unter Rühren mit 4 UpM. Die Gesamtenthaarungszeit beträgt 36 h.
- Die Häute werden dann in einem Bad, das Ammoniumchlorid (3%) und Natriummetabisulfit (0,5%) enthält, in einer Rate von 400 g Haut auf 50 ml Bad entkalkt. Die Gesamtdauer dieser Bad-Behandlung beträgt 2 h 30 min.
- Die Salze werden durch zwei aufeinanderfolgende Waschgänge mit Wasser (15 min pro Waschgang) in einer Rate von 200 ml Wasser auf 100 g Gewebe entfernt.
- Die Haute werden anschließend gemahlen und dann unter Rühren 1 h lang mit einem Phosphatpuffer von pH 7,8 (0,78 g/l Kaliumdihydrogenphosphat und 21,7 g/l Dinatri ummonohydrogenphosphat) in einer Rate von 5 l Puffer/kg gemahlenem Material gewaschen. Dann wird das Phosphat durch zwei aufeinanderfolgende Waschgänge mit enthärtetem Wasser und danach durch kontinuierliches Zentrifugieren mit 4000 UpM (Rousselet-Zentrifuge) in einer Rate von 5 l Wasser pro kg gemahlenem Material entfernt.
- Das gemahlene Material wird dann mit einer 10%igen Essigsäure-Lösung angesäuert, wobei die Essigsäuremenge 5%, bezogen auf das Kollagen, beträgt, und die Endmolarität etwa 0,08 M beträgt.
- Das gemahlene Material wird anschließend 1 h lang verknetet zur Herstellung einer Paste. Das Gel wird erhalten, indem man die Paste kontinuierlich durch eine UTL T/6-Ultraschall-Behandlungs-Vorrichtung passiert. Dieses Gel weist eine Kollagen-Konzentration zwischen 0,7 und 2% auf, wobei der Mengenanteil an säsurelöslichem Kollagen von 10 bis 20% variiert, bezogen auf das unlösliche Kollagen.
- B – Herstellung der porösen Matrix mit dem wie oben angegeben hergestellten Kollagengel
- 20 g/cm2 Kollagengel (Feststoffgehalt = 0,75%) werden in einen Lyophilisierungs-Trog eingeführt und durch Einfrieren bei –30°C lyophilisiert und dann auf +32°C erhitzt. Die gesamte Lyophilisierungszeit beträgt 16 h bei einem Druck von 400 Mikrobar. Das Lyophilisat wird nach einem physikalischen Verfahren (TDH) vernetzt, wobei das Lyophilisat 10 h lang in einen Ofen von 110°C unter einem Druck von 400 Mikrobar gestellt wird.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 2
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) nach dem in dem
Europäischen Patent Nr. 466 829 B1 - Das Kollagenlyophilisat wird 24 h lang in einer Lösung inkubiert, die 5 bis 250 μl DPPA/g Kollagen in 100 ml Dimethylformamid (DMF) enthält. Das Kollagen wird dann in 100 ml DMF gespült, um das DPPA zu entfernen. Dann wird das DMF durch Spülen in 100 ml einer Boratpuffer-Lösung von pH 8,9 (0,04 M Natriumtetraborat, 0,04 M Borsäure) entfernt.
- Schließlich wird das Kollagen über Nacht in dem gleichen Boratpuffer inkubiert, wobei der Boratpuffer dann durch 6-stündiges kontinuierliches Spülen mit enthärtetem Wasser entfernt wird.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 3
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid vernetzt ist.
- Das Kollagen wird mit EDC (Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid) in einer Konzentration von 0,23 bis 0,69 g/g Kollagen und mit NHS (N-Hydroxysuccinimid) in einer Konzentration von 0 bis 0,42 g/g Kollagen vernetzt. Nach dem Spülen mit enthärtetem Wasser wird das Kollagen erneut lyophilisiert.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 4
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Glutaraldehyd vernetzt ist
- Das Kollagen wird 24 bis 96 h lang in einer Lösung, die 0,6 bis 1% GTA enthält, bei 20°C vernetzt. Nach dem Spülen mit enthärtetem Wasser wird das Kollagen erneut lyophilisiert.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 5
- Herstellung einer porösen Matrix mit dem nativen Kollagen des Beispiels 1 in Kombination mit Chitosan und einem Glycosaminoglycan, wie in dem
Europäischen Patent Nr. 296 078 B1 - Eine Lösung von 2,5 g Chitosan in 356 ml Wasser und 1,9 ml Essigsäure und danach eine Lösung, die 1 g Chondroitin-4-sulfat in 400 ml enthärtetem Wasser enthält, werden zu 600 g 1,5%igem Kollagengel zugegeben. Die Mischung, die einen pH-Wert von etwa 4,0 hat, wird anschließend gerührt und dann lyophilisiert. Der erhaltene Schwamm wird durch TDH vernetzt.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 6
- Poröse Matrix, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, die mit einem Kollagenfilm bedeckt ist
- A – Herstellung des Films
- Ein Kollagengel mit einem Feststoffgehalt zwischen 0,3 und 0,8% wird in einem Ofen bei 30°C oder unter einer Haube mit einer Rate von 0,5 g Gel/cm2 Trog getrocknet. Zu dem Kollagengel können 10 bis 40% Glycerin zugegeben werden. Das unter diesen Bedingungen getrocknete Kollagen bildet einen transparenten Film.
- B – Kombination des Films mit der vorstehend beschriebenen porösen Matrix
- 0,5 g/cm2 Kollagengel des Beispiels 1 mit einem Feststoffgehalt von 0,75% werden in einen Lyophilisierungstrog gegeben, dann wird der Film auf dieses Gel aufgebracht und das Ganze wird lyophilisiert. Das erhaltene Lyophilisat wird durch TDH vernetzt.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 7
- Poröse Matrix, hergestellt mit einem säurelöslichen Kollagengel und bedeckt mit einem Kollagenfilm
- Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel 6 angegeben, der einzige Unterschied besteht in bezug auf die Art des Gels, das auf den Film gegossen wird, der aus säurelöslichem Kollagen besteht, das nach einem dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren hergestellt worden ist.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 8
- Poröse Matrix, hergestellt mit einem Atelokollagengel und bedeckt mit einem Kollagenfilm
- Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel 6, der einzige Unterschied besteht in bezug auf die Art des Kollagens, das auf den Film gegossen wird, das aus Atelokollagen, d.h. aus einem Telopeptid-freien Kollagen besteht, das nach einem dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren hergestellt worden ist.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 9
- Poröse Matrix, die besteht aus Kollagen in Kombination mit Chitosan und einem Glycosaminoglycan und mit einem Kollagenfilm bedeckt ist
- Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, dass in diesem Fall das auf den Kollagenfilm gegossene Gel aus Kollagen, Chitosan und einem Glycosaminglycan besteht. Die Herstellung dieses Gels ist in Beispiel 5 beschrieben.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 10
- Alle vorstehend beschriebenen porösen Matrices, die mit einem Kollagenfilm bedeckt sind, können nach Verfahren vernetzt werden, wie sie in den Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben sind.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 11
- Poröse Matrix nur aus Kollagen, wie in Beispiel 1 beschrieben, die mit einem komprimierten (gepressten) Kollagenschwamm bedeckt ist
- A – Herstellung des komprimierten Schwammes
- Ein Kollagengel, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden ist, mit einem Feststoffgehalt zwischen 0,3 und 1,5% wird lyophilisiert zur Bildung eines Schwammes mit einem Gewicht zwischen 0,5 und 2 g/cm2.
- Das Lyophilisat wird 5 bis 60 Sekunden lang bei einer Temperatur zwischen 20 und 60°C und einem Druck zwischen 50 und 200 bar (50-200·105 Pa) komprimiert.
- B – Kombination des komprimierten Schwammes mit der porösen Matrix
- Das in Beispiel 1 beschriebene Kollagengel wird in einem Lyophilisierungstrog in einer Rate von 0,5 g/cm2 abgeschieden. Der komprimierte Schwamm wird dann auf die sem Gel abgeschieden und das Ganze wird lyophilisiert zur Bildung eines porösen Kollagenschwammes, der mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt ist. Das Ganze wird durch TDH vernetzt wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 12
- Poröse Matrix, die aus Kollagen, Chitosan und Glycosaminoglycan besteht, wie in Beispiel 5 angegeben, die mit einem komprimierten Schwamm bedeckt ist
- Das nach dem Verfahren des Beispiels 5 hergestellte Kollagen, Chitosan und Glycosaminoglycangel werden in einem Lyophilisierungstrog mit einer Ratevon 0,5 g/cm2 abgeschieden, der komprimierte Schwamm wird dann auf dieses Gel aufgebracht und das Ganze wird lyophilisiert. Danach wird das Lyophilisat durch TDH vernetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 13
- Alle vorstehend beschriebenenen porösen Matrices, die mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt sind, können nach Verfahren vernetzt werden, wie sie in den Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben sind.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 14
- Eine rekonstruierte Haut wird hergestellt entweder mit Hilfe der mit DPPA vernetzten porösen Matrix, wie in Beispiel 2 beschrieben, oder mit Hilfe der mit DPPA vernetzten porösen Matrix gemäß Beispiel 2, die mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt ist, wobei das Ganze mit DPPA gemäß Beispiel 13 vernetzt wird hergestellt, um einen Vergleich zwischen einem durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellten Komposit- bzw. Verbundprodukt, das eine poröse Kollagenschicht umfasst, die mit einer im wesentli chen kompakten (dichten) Membran bedeckt ist, und einem Produkt, das nur eine poröse Kollagenschicht ohne Abdeckung umfasst, durchführen zu können.
- Herstellung von rekonstruierter Haut
- a) Kultivierung von normalen Human-Fibroblasten
- Es werden normale Human-Fibroblasten verwendet, die willkürlich aus älteren oder jungen Personen entnommen worden sind; sie werden gewonnen und entwickelt auf konventionelle Weise wie für den Fachmann auf dieses Gebiet bekannt, zur Gewinnung zwischen der sechsten und zehnten Passage.
- Es wird eine Inokulation mit einer Rate von 205 000 Zellen pro cm2 der porösen Matrix durchgeführt, wobei letztere entweder das Vergleichsprodukt ist, das nur die mit DPPA vernetzte poröse Matrix gemäß Beispiel 2 umfasst, oder das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Verbundprodukt ist, das die mit DPPA vernetzte poröse Matrix gemäß Beispiel 2, umfasst, die mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt ist, wobei das Ganze mit DPPA gemäß Beispiel 13 vernetzt worden ist.
- Das Kulturmedium besteht aus DMEM/HAM F12 50/50 (Vol./Vol.), ergänzt mit einem 10 gew.-%igen fetalen Kalbsserum, 100 IU/ml Penicillin, 25 μg/ml Gentamycin, 1 μg/ml Amphotericin B und 50 μg/ml Vitamin C.
- Es wird eine drei Wochen lange Kultivierung durchgeführt, wobei das Medium dreimal pro Woche gewechselt wird.
- b) Kultivierung von normalen Human-Keratinozyten
- Dann werden normale Human-Keratinozyten, die willkürlich aus jungen oder älteren Personen entnommen wurden, kultiviert; sie werden gewonnen und kultiviert unter Anwendung von Kultivierungsverfahren, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, zur Gewinnung zwischen der ersten und dritten Passage.
- Es wird eine Inokulation mit einer Rate von 205 000 Zellen pro cm2 der porösen Matrix durchgeführt, wobei es sich entweder um die Oberfläche der mir DPPA vernetzten porösen Matrix des Beispiels 2 oder um die Oberfläche des durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts, das die mit DPPA vernetzte poröse Matrix des Beispiels 2, bedeckt mit einem komprimierten Kollagenschwamm umfasst, wobei das Ganze mit DPPA vernetzt worden ist gemäß Beispiel 13, handelt, wobei in diesem Fall die Keratinozyten auf die Oberfläche der im wesentlichen kompakten (dichten) Kollagen-Membran inokuliert (überimpft) werden.
- Die Kultivierung dieser Produkte, die ehre Inokulation sowohl von Fibroblasten als auch von Keratinozyten umfasst, erfolgt in einem Green-Medium, das besteht aus:
DMEM, ergänzt mit
30% HAM F12,
10% fetalem Kalbsserum,
100 IU/ml Penicillin,
100 μg/ml Streptomycin,
1 μg/ml Amphotericin B,
2 μmol/ml L-Glutamin,
10 ng/ml EGF (epidermaler Wachstumsfaktor),
0,12 IU/ml Insulin, im Handel erhältlich unter dem Warenzeichen UMULINE®,
400 ng/ml Hydrocortison,
10–12 mol/ml Choleratoxin,
5 μg/ml Transferrin,
2·10–9 M Triiodothyronin,
1,8·10–7 mol/ml Adenin,
50 μg/ml Vitamin C. - Diese Kultivierung wird eine Woche lang durchgeführt, wobei die Medien jeden Tag gewechselt werden.
- c) Kultivierung des durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts und des nicht von einer porösen Schicht bedeckten Vergleichsprodukts
- Nachdem die Kultivierung der Stufe (b) eine Woche lang durchgeführt worden ist, wobei die Medien jeden Tag gewechselt werden, wird dafür gesorgt, dass die Oberflächenschicht, welche die Keratinozyten enthält, an der Luft/Flüssigkeits-Grenzfläche austritt, während die Schicht, welche die Fibroblasten enthält, untergetaucht bleibt, und die Kultivierung wird dann drei Wochen lang in einem Emersion-Medium durchgeführt, das besteht aus
DMEM, ergänzt mit:
10% fetalem Kalbsserum,
100 IU/ml Penicillin,
100 μg/ml Streptomycin,
1 μg/ml Amphotericin B,
2 μmol/ml L-Glutamin,
10 ng/ml EGF
0,12 IU/ml Insulin mit dem Warenzeichen UMULINE®,
400 ng/ml Hydrocortison,
50 μg/ml Vitamin C. - Die gesamte Kultivierungsdauer von 7 Wochen, die aus den Stufen (a) bis (c) resultiert, ergibt eine rekonstruierte Haut, die besteht aus einer rekonstruierten Dermis, wo bei die Fibroblasten die dreidimensionale Kollagen-Matrix kolonisiert haben, wobei die Dermis mit einer Mehrschichten-Epidermis bedeckt ist.
- Die Dermo/Epidermal-Grenzfläche zeigt die Anwesenheit einer basalen Membran, in der es möglich ist, die Anwesenheit von Laminin-1, Laminin-5, Kollagen vom Typ IV und Kollagen vom Typ VII durch Immunmarkierung zu identifizieren.
- Auf diese Weise erhält man nach dreiwöchiger Herstellung des Dermis-Äquivalents und nach dem Bedecken der porösen Matrices mit einer im wesentlichen kompakten (dichten) Schicht zur Erzielung eines durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhaltenen Verbundprodukts, eine größere Menge an Fibroblasten auf der Oberfläche der Kollagen-Matrices vor der Epidermisierung.
- Im Falle der Verwendung nur einer porösen Matrix, d.h. ohne Abdeckung, können dann, wenn die Oberflächenschicht aus Fibroblasten nicht vollständig zusammenhängend ist, Keratinozyten in das darunterliegende Dermis-Äquivalent infiltrieren und Inselchen aus Keratinozyten bilden, die vollständig abnorme Merkmale darstellen.
- Daraus ist zu ersehen, dass die Erfindung, in der mehr kompakte Schichten verwendet werden als sie früher für die Verwendung gemäß Stand der Technik zur Verfügung standen, eine höhere Sicherheit gegen das Eindringen von Keratizozyten ergibt.
- Es sei darauf hingewiesen, dass die Abkürzung DMEM in der Beschreibung für das Dulbecco-modifizierte Eagle-Medium steht.
- Erfindungsgemäßes Beispiel 15
- Studie zum Vergleich einer Haut, die aus Zellen von jungen Spendern rekonstruiert wurde, und einer Haut, die aus Zellen von älteren Spendern rekonstruiert wurde, mit den nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbundprodukten, um die Wirksamkeit der Wirkstoffe auf die Bildung von Lamininen zu bestimmen.
- Das Verfahren dieses Beispiels ist im Wesentlichen das Gleiche wie in Beispiel 14 in Bezug auf Kultivierungen beschrieben, in dem das Gleiche nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Verbundprodukt verwendet wird, das eine mit DPPA vernetzte poröse Kollagenschicht oder eine Matrix, wie in Beispiel 2 beschrieben, bedeckt mit einem komprimierten Kollagen schwamm, wobei das Ganze mit DPPA vernetzt ist wie in Beispiel 13 beschrieben, verwendet wird. Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
- 1) Herstellung der rekonstruktierten Haut
- Junge rekonstruktierte Haut wurde nach dem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass die Fibroblasten und Keratinozyten jeweils aus jungen Spender, d.h. solchen mit einem Alter zwischen 25 und 35 Jahren, stammten. Eine gealterte oder reife rekonstruktierte Haut wurde erhalten durch Verwendung von Fibroblasten oder Keratinozyten, die aus älteren Spendern mit einem Alter von mehr als 55 Jahren stammten.
- a) Materialien und Verfahren
- Wie in Beispiel 14, Stufe a, angegeben wurden zuerst poröse Matrices des durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Verbundprodukts mit normalen Human-Dermal-Fibroblasten inokuliert, die entweder aus einem Pool von jungen Zellen oder aus einem Pool von reifen oder gealterten Zellen stammten, und die Kultivierung wurde 21 Tage lang unter den in Beispiel 14, Stufe a, angegebenen Bedingungen durchgeführt.
- b) Nach der oben genannten 21-tägigen Kultivierung wurden epidermale Schichten, getrennt hergestellt aus Keratinozyten, die entweder aus dem Pool von jungen Zellen oder aus dem Pool von reifen Zellen stammten, auf die Oberfläche der im wesentlichen kompakten (dichten) Kollagen-Membran des Verbundprodukts inokuliert.
- Die Kultivierung wurde 14 Tage lang unter den in Beispiel 14b angegebenen Bedingungen durchgeführt.
- 2) Quantitative Bestimmung der Laminine
- Nach 14-tägiger Kultivierung des Fibroblasten-Keratinozyten-Verbundmaterials wurden die in den Inkubationsmedien der resultierenden jungen oder reifen rekonstruktierten Haut enthaltenen Laminine mit Hilfe eines handelsüblichen ELISA-Kits (Takara, Japan) quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in der
3 dargestellt. - Die
3 zeigt, dass die reife rekonstruktierte Haut etwa halb so viele Laminine enthält wie die junge rekonstruktierte Haut (YRS), die als 100%-Kontrolle verwendet wird. - 3) Bestimmung des induktiven Effekts eines Wirkstoffes, beispielsweise eines fermentierten Malzextrakts, wie er von der Firma COLETICA unter dem Warenzeichen BASALTNE® auf den Markt gebracht worden ist, auf die Bildung von Laminen in junger und reifer rekonstruktierter Haut
- In diesem Vergleichstest wird das vorstehend beschriebene Verfahren durchgeführt, jedoch mit Ausnahme der 14-tägigen Kultivierung mit Keratinozyten; die junge oder reife rekonstruktierte Haut wird 14 Tage lang entweder in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Anwesenheit von 0,5 Gew.-% fermentierten Malzextrakten, im Handel erhältlich unter dem Warenzeichen BASALTNE®, COLETICA, Frankreich, kultiviert.
- Am Ende der Inkubationsperiode wurden wie in dem obigen Beispiel die in den Inkubationsmedien enthaltenen Laminine durch ELISA quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse sind in der
4 dargestellt. - Die 100%-Kontrolle besteht aus dem Mengenanteil der Laminine in gealterter rekonstruktierter Haut oder ARS.
- Die
4 zeigt, dass der Wirkstoff, der aus fermentiertem Malz extrahiert wurde, oder BASALINE® in der Lage war, die Laminin-Bildung in reifer rekonstruktierter Haut zu stimulieren. Unter den gleichen Bedingungen führt der Wirkstoff, der aus fermentiertem Malz extrahiert worden ist, oder BASALINE® zu keiner signifikanten Veränderung der Laminin-Bildung in junger rekonstruktierter Haut, wie in der5 dargestellt. - Daraus ist zu ersehen, dass der aus fermentiertem Malz extrahierte Wirkstoff oder BASALINE® die Laminin-Bildung in reifer rekonstruktierter Haut um 65% erhöht.
- Dieser Wirkstoff beeinflusst die physiologischen Prozesse, die an der Regulierung der Laminin-Bildung in junger rekonstruktierter Haut beteiligt sind, jedoch nicht.
- Diese Versuche machen es möglich, die Größenordnung des Kompensationseffekts des fermentierten Malzextrakts oder von BASALINE®, definiert als die Fähigkeit dieses Wirkstoffs, die relative Differenz, die zwischen der Laminin-Bildung in junger rekonstruktierter Haut und derjenigen in reifer rekonstruktierter Haut festgestellt worden ist, zu bewerten.
- Die
5 zeigt, dass die Differenz zwischen der Laminin-Bildung in junger rekonstruktierter Haut und in reifer rekonstruktierter Haut, die um 65% herabgesetzt werden kann, wenn der Wirkstoff in einer Konzentration von 0,5% verwendet wird. - Beispiel 16
- Herstellung einer porösen Matrix aus aquatischem nativem Kollagen
- Das Kollagen wird erhalten nach dem Verfahren des
US-Patents Nr. 5 331 092 A , erteilt am 19. Juli 1994. - A – Herstellung des aquatischen nativen Kollagens
- Ein Kollagengel wird hergestellt aus der Bauchhaut einer Seezunge, die gemahlen und dann mit einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,8 mit der folgenden Zusammensetzung: 0,78 g/l Kaliumdihydrogenphosphat und 21,7 g/l Dinatriummonohydrogenphosphat, gewaschen wird. Das Waschen wird 1 h lang unter Rühren in einer Rate von 5 l Puffer pro kg gemahlenem Material durchgeführt. Dann wird das Phosphat durch zwei aufeinanderfolgende Waschgänge mit enthärtetem Wasser entfernt, woran sich ein kontinuierliches Zentrifugieren mit 4000 UpM (Rousselet-Zentrifuge) in einer Rate von 5 l Wasser pro kg gemahlenem Material anschließt. Dann wird das gemahlene Material mit 0,25 M Essigsäure-Lösung in einer Rate von 1 kg gemahlenem Material auf 10 l Lösung angesäuert. Das Gel wird danach 5 min lang bei 4000 UpM zentrifugiert.
- Das zu verwendende Gel besteht aus der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit, die eine Kollagen-Konzentration zwischen 0,5 und 2% aufweist.
- B – Herstellung der porösen Matrix aus dem oben erhaltenen Kollagengel
- Dieses Gel wird in einen Lyophilisierungstrog mit einer Rate von 20 g/cm2 gegossen. Dann wird es nach dem Einfrieren bei –30°C und nach dem Erhitzen auf +32°C lyophilisiert. Die gesamte Lyophilisierungszeit beträgt 16 h bei einem Druck von 400 Mi krobar. Die erhaltene Matrix wird dann durch thermische Dehydratation (TDH) vernetzt, die besteht in einem Erhitzen in einem Ofen von 110°C unter einem Vakuum von 400 Mikrobar für 16 h.
- Beispiel 17
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) nach dem in dem
Europäischen Patent Nr. 466 829 B1 - Die Kollagen-Matrix des Beispiels 1 wird 24 h lang in einer Lösung inkubiert, die 5 bis 250 μl DPPA/g Kollagen in 100 ml Dimethylformamid (DMF) enthält. Dann wird das Kollagen in 100 ml DMF gespült, um das DPPA zu entfernen. Das DMF wird dann durch Spülen in 100 ml einer Boratpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 8,9 (0,04 M Natriumtetraborat, 0,04 M Borsäure) entfernt. Schließlich wird das Kollagen über Nacht in dem gleichen Boratpuffer inkubiert, dann wird der Boratpuffer durch 6-stündiges kontinuierliches Spülen mit enthärtetem Wasser entfernt.
- Beispiel 18
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid vernetzt ist
- Die aquatische Kollagen-Matrix des Beispiels 1 wird mit EDC (Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid) in einer Konzentration von 0,23 bis 0,69 g/g Kollagen und mit NHS (N-Hydroxysuccinimid) in einer Konzentration von 0,42 g/g Kollagen vernetzt. Nach dem Spulen mit enthärtetem Wasser wird das Kollagen erneut lyophilisiert.
- Beispiel 19
- Herstellung einer porösen Matrix, die mit Glutaraldehyd vernetzt ist
- Die poröse Matrix des aquatischen Kollagens des Beispiels 1 wird 24 bis 96 h lang in einer 0,6 bis 1% GTA enthaltenden Lösung von 20°C vernetzt. Nach dem Spülen mit enthärtetem Wasser wird das Kollagen erneut lyophilisiert.
- Beispiel 20
- Poröse Matrix, hergestellt aus dem aquatischen nativen Kollagen gemäß Beispiel 16 in Kombination mit Chitosan und einem Glycosaminoglycan wie in dem
Europäischen Patent Nr. 296 078 B1 - Eine Lösung von 2,5 g Chitosan in 356 ml Wasser und 1,9 ml Essigsäure und danach eine Lösung, enthaltend 1 g Chondroitin-4-sulfat in 400 ml enthärtetem Wasser werden zu 600 g 1,5%igem Kollagengel zugegeben. Die Mischung, die einen pH-Wert von etwa 4,0 hat, wird anschließend gerührt, dann lyophilisiert. Der erhaltene Schwamm wird durch TDH vernetzt.
- Beispiel 21
- Poröse Matrix wie in Beispiel 16 beschrieben, bedeckt mit einem Kollagenfilm
- A – Herstellung des Films
- Das Kollagengel, das einen Feststoffgehalt zwischen 0,3 und 0,8% aufweist, wird in einem Ofen bei 30°C oder unter einer Haube mit einer Rate von 0,5 g Gel/cm2 Trog getrocknet. Dem Kollagengel können 10 bis 40% Glycerin zugesetzt werden. Das unter diesen Bedingungen getrocknete Kollagen bildet einen transparenten Film.
- B – Kombination des Films mit der vorstehend beschriebenen porösen Matrix
- Das aquatische native Kollagengel mit einem Feststoffgehalt von 0,5 bis 2% wird in einem Lyophilisierungstrog in einer Rate von 0,5 g/cm2 abgeschieden, dann wird der Kollagenfilm auf dieses Gel aufgebracht und das Ganze wird lyophilisiert. Das erhaltene Lyophilisat wird mit TDH vernetzt.
- Beispiel 22
- Poröse Matrix nur aus Kollagen, wie in Beispiel 16 beschrieben, die mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt ist
- A – Herstellung des komprimierten Schwammes
- Das wie in Beispiel 1 hergestellte Kollagengel mit einem Feststoffgehalt zwischen 0,3 und 1,5% wird lyophilisert, wobei man einen Schamm mit einem Gewicht zwischen 0,5 und 2 g/cm2 erhält.
- Das Lyophilisat wird 5 bis 60 Sekunden lang bei einer Temperatur zwischen 20 und 60°C und einem Druck zwischen 50 und 200 bar (50-200·105 Pa) gepresst.
- B – Kombination des komprimierten Schwammes mit der porösen Matrix
- Das in Beispiel 1 beschriebene Kollagengel wird in einem Lyophilisierungstrog in einer Rate von 0,5 g/cm2 abgeschieden. Der komprimierte Schwamm wird dann auf dieses Gel aufgebracht und das Ganze wird lyophilisiert, wobei man einen poröses Kollagenschwamm erhält, der mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt ist. Das Ganze wird durch TDH wie in Beispiel 1 beschrieben vernetzt.
- Beispiel 23
- Poröse Matrix, bestehend aus Kollagen, Chitosan und Glycosaminoglycan, wie in Beispiel 20 beschrieben, bedeckt mit einem komprimierten Schwamm
- Das nach dem Verfahren des Beispiels 20 hergestellte Gel aus Kollagen, Chitosan und Glycosaminoglycan wird in einem Lyophilisierungstrog mit einer Rate von 0,5 g/cm2 abgeschieden, der komprimierte Schwamm wird dann auf dieses Gel aufgebracht und das Ganze wird lyophilisiert. Das Lyophilisat wird danach durch TDH vernetzt, wie in Beispiel 16 beschrieben.
- Beispiel 24
- Alle vorstehend beschriebenen porösen Matrices, die mit einem komprimierten Kollagenschwamm bedeckt sind, können nach den Verfahren vernetzt werden, wie sie in den Beispielen 17, 18 und 19 beschrieben sind.
- Beispiele 25 bis 27: Tests zum Vergleich des Zellstoffwechsels von Rinder- und aquatischen Kollagen-Matrices
- Beispiel 25: Test zur Bestimmung der Zellen-Lebensfähigkeit von Fibroblasten
- I. Herstellung der Dermis-Äquivalente
- Für diesen Vergleichstest wird zuerst eine mit DPPA vernetzte aquatische poröse Matrix nach Beispiel 17 hergestellt.
- Zu Vergleichszwecken wird außerdem eine poröse Vergleichs-Matrix, als Rinder-Matrix bezeichnet, die ebenfalls mit DPPA vernetzt ist, aus Rinder-Kollagen unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 17 hergestellt.
- Normale Human-Fibroblasten, die aus einem jungen Spender-Pool entnommen sind, die in der 7. Passage verwendet werden, werden auf jede der aquatischen und Rinder-Matrices in einer Rate von 250 000 Zellen/cm2 inokuliert im Falle der Proliferations- und Proteinsynthese-Studien und in einer Rate von 300 000 Zellen/cm2 inokuliert im Falle der aquatischen und Rinder-Matrices, die für die histologischen Studien bestimmt sind.
- Diese aquatischen und Rinder-Matrices werden in einem Medium kultiviert, das besteht aus DMEM/HAM F12 in einem Vol./Vol.-Verhältnis von 50/50, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum, 100 IU/ml Penicillin, 25 μg/ml Gentamycin, 1 μg/ml Amphotericin B und 50 μg/ml Vitamin C.
- Diese Kultivierung wird einen Monat lang durchgeführt, wobei das Kulturmedium dreimal wöchentlich ausgetauscht wird.
- II. Durchgeführte Analysen
- 1) Bestimmung der Zellen-Lebensfähigkeit durch Umsetzung mit MTT
- Dem Kulturmedium wird 1 Gew.-% MTT (d.h. 3-(4-(Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) zugesetzt. Die Inkubation wird 2,5 h lang bei 37°C durchgeführt.
- Nach dieser Inkubationsdauer wird das Umwandlungsprodukt (Formazan-Blau) in DMSO solubilisiert und seine optische Dichte wird bei 550 nm abgelesen.
- Die erhaltene optische Dichte ist proportional zur Aktivität der Succinatdehydrogenasen, die das hellgelbe Tetrazoliumsalz MTT in blaue Formazan-Kristalle umwandeln können.
- Die Zellen-Lebensfähigkeit wurde nach 1-, 5-, 7- und 22-tägiger Kultivierung und nach 1-monatiger Kultivierung bestimmt. Zur Bestimmung der Mittelwerte wurden für jede Matrix 6 Proben hergestellt. Tabelle I Ergebnisse
Tage aquatische Matrix mittlere Standardabweichung Rinder-Matrix mittlere Standardabweichung 1 487 24 403 40 5 604 19 393 59 7 520 56 398 64 22 608 30 680 40 - Diese Ergebnisse werden auch verwendet für die Kurven in der beiliegenden
6 . - Es sei darauf hingeweisen, dass die Kurve mit den Rauten diejenige ist, die mit der aquatischen Matrix erhalten wurde, und dass die Kurve mit den Quadraten diejenige ist, die mit der Rinder-Matrix erhalten wurde.
- Die Ergebnisse zeigen völlig überraschend, dass die aquatische Matrix einen Träger darstellt, der nicht nur das Überleben von normalen Human-Fibroblasten, sondern auch die Proliferation (Vermehrung) dieser normalen Human-Fibroblasten erlaubt, der gleichzeitig sogar einen viel besseren Kulturträger während der ersten drei Wochen darstellt.
- Aus diesen Tests kann geschlossen werden, dass aquatisches Kollagen überraschenderweise besonders geeignet ist für die Herstellung eines Gewebebildungs-Trägers, insbesondere für in vitro-Anwendungen und sogar, vor allem, in vivo-Anwendungen zur Herstellung von Biomaterialien, die lebende Zellen, insbesondere und vorzugsweise solche von Menschen, enthalten.
- 2. Bestimmung der Proteinsynthese
- Die Synthese von Proteinen, die innerhalb von 3 Tagen in einem Kulturmedium sekretiert wurden, das frei von fetalem Kalbsserum war, wurde nach 1-monatiger Reifung der Dermis-Äquivalente, wie sie nach 1-monatiger Kultivierung unter den oben bei der Herstellung der Dermis-Äquivalente angegebenen Bedingungen erhalten wurden, bewertet. Die Bestimmung wurde nach dem Mikro-BCA-Verfahren von Pierce durchgeführt.
- Die Zelldichte wurde parallel durch einen MTT-Test unter den vorstehend angegebenen Bedingungen bestimmt.
- Der relative Proteingehalt entspricht dem Proteingehalt pro Einheit der Zelldichte, ausgedrückt durch die optischen Dichte oder OD, sodass die fragliche Zellen-Konzentration äquivalent ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben. Tabelle II Ergebnisse der Proteinsynthesen
Kollagen des Trägers aquatische Matrix Rinder-Matrix Mittelwert * Mittelwert * Zellendichte (OD) 2,12 0,09 1,91 0,13 Proteine (μg/ml) 494 48 499 32 relativer Proteingehalt 233 18 262 23 - *mittlere Standardabweichung
- Wie in der Tabelle I basiert der Mittelwert auf 6 Proben.
- 3. Histologie
- Die nach 21-tägiger Kultivierung der aquatischen und Rinder-Kollagen-Matrices erhaltenen Dermis-Äquivalente werden in einer 2%igen Paraformaldehyd-Lösung fixiert und dann in einer Osmiumtetroxid-Lösung nachfixiert, dehydratisiert, in Epon eingeschlossen, es wird ein Schnitt-Präparat hergestellt und in einem Transmission-Elektronenmikroskop (Jeol 1200) bei CMEAGB (Lyon, Frankreich) betrachtet.
- Schlussfolgerungen
- Diese Ergebnisse weisen auf eine sehr gute Kolonisierung der dreidimensionalen Matrices hin, ob sie nun aquatisch sind oder vom Rind stammen. Nach 3-wöchiger Kultivierung ist die Zellendichte in beiden Matrix-Typen äquivalent. Die aquatische Matrix scheint jedoch eine bessere Zellenadhäsion zu Beginn des Versuchs zu erlauben, was durch die Proliferations-Untersuchung in der ersten Woche der Kultivierung angezeigt wird, und somit eine bessere Kolonisierung bei kurzen Kultivierungszeiten zu erlauben.
- Was die Protein-Synthesen angeht, so sind die Fibroblast-Synthese-Fähigkeiten (die relativen Protein-Gehalte) nach 1-monatiger Kultivierung ebenfalls äquivalent.
- Diese Ergebnisse zeigen, dass die entwickelten aquatischen Kollagen-Matrices die Herstellung von Dermis-Äquivalenten einer guter Qualität ermöglichen, wobei die mit diesen Matrices erhaltenen Ergebnisse vergleichbar sind mit denjenigen, die mit Rinder Kollagen-Matrices erhalten werden.
- In dem Transmission-Elektronenmikroskop konnten Fibroblasten in den Matrices aus dem Rind und solchen aquatischen Ursprungs festgestellt werden. Bei beiden Matrix-Typen wurde die Anwesenheit einer in großer Menge vorhandenen neu synthetisierten extrazellulären Matrix festgestellt. Die neu synthetisierte extrazelluläre Matrix kann aufgrund der periodischen Streifung der Fasern aus abgeschiedenem Kollagen im Vergleich mit den Kollagen-Klustern, welche die dreidimensionale Matrix des ursprünglichen Schwammes bilden, differenziert werden.
- Beispiel 26
- Einfluss der verschiedenen Arten der Vernetzung der aquatischen Kollagen-Matrices auf die Lebensfähigkeit der Zelle
- Es werden die folgenden Tests durchgeführt, um den Einfluss der verschiedenen Arten der Vernetzung der aquatischen Kollagen-Matrices auf die Lebensfähigkeit der Zelle zu untersuchen.
- I) Herstellung der Dermis-Äquivalente
- a) verwendete(r) Träger oder Matrix
- Es werden verschiedene Kollagen-Träger oder -Matrices hergestellt unter Verwendung verschiedener Mengenanteile an Kollagen in dem Kollagengel zur Herstellung der porösen Schicht oder Matrix und gegebenenfalls unter Verwendung eines unterschiedlichen Vernetzungsmittels, wie nachstehend angegeben:
- 1) Test 1
- Für diesen Test wird eine poröse Matrix in Form eines porösen Schwammes aus einem aquatischen Kollagengel hergestellt, das aus 1,3 Gew.-% aquatischem Kollagen hergestellt worden ist, das bei –80°C eingefroren wurde, einer Standard-Lyophilisierung nach Beispiel 17 unterworfen wurde und dann mit DPPA in einem Mengenanteil von 250 μl/g Schwamm im trockenen Zustand vernetzt wurde.
- 2) Test 2
- Für diesen Test wird ein poröser Träger in Form eines aquatischen Schwammes aus einem aquatischen Kollagengel hergestellt, das 0,7 Gew.-% aquatisches Kollagen umfasst, das bei –80°C eingefroren und dann einer Standard-Lyophilisierung unterzogen und mit DPPA in einem Mengenanteil von 250 μl/g trockenem Schwamm wie in Test 1 vernetzt wurde.
- 3) Test 3
- Für diesen Test ist die Arbeitsweise die gleiche wie im Test 1, jedoch mit der Ausnahme, dass die Vernetzung mit EDC gemäß Beispiel 2 in einem Mengenanteil von 0,46 g/g trockenem Schwamm durchgeführt wird.
- 4) Test 4
- Es wird ein poröser Träger hergestellt, der einen Schwamm aus aquatischem Kollagen umfasst, das hergestellt wurde aus einem aquatischen Kollagengel, das 1,1 Gew.-% aquatisches Kollagen enthielt, das bei –80°C eingefroren und dann einer Standard-Lyophilisierung unterworfen und mit DPPA in einem Mengenanteil von 250 μl/g trockenem Schwamm wie im Test 2 vernetzt wurde, wobei der Unterschied in dem Mengenanteil von 1,1 Gew.-% aquatisches Kollagen besteht.
- In allen diesen Tests stammt das aquatische Kollagen aus der Bauchhaut der Seezunge, wie in Beispiel 17 angegeben.
- b) Kultivierung von Fibroblasten auf diesen Matrices
- Wie in Beispiel 25 werden normale Human-Fibroblasten verwendet, diese stammen jedoch aus der achten Passage.
- Die Inokulation wird in einer Rate von 275 000 Zellen pro cm2 durchgeführt.
- Das Kulturmedium besteht aus DMEM/HAM F12 (Vol./Vol.) 50/50, ergänzt mit 10 Gew.-% fetalem Kalbsserum, 100 IU/ml Penicillin, 25 μg/ml Gentamycin, 1 μg/ml Amphotericin B und 50 μg/ml Vitamin C.
- Die Kultivierung wird einen Monat lang durchgeführt, wobei das Medium dreimal pro Woche gewechselt wird.
- Für jeden Test werden vier Matrices verwendet, um einen Mittelwert für jeden Test-Typ zu bilden, und es wird die mittlere Standard-Abweichung bestimmt.
- II) Durchgeführte Analysen
- Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zelle durch Umsetzung mit Alamar-Blau (Redoxmarker)
- Alamar-Blau wird in einer Menge von 2 Gew.-% dem verwendeten Kulturmedium zugesetzt in dem Augenblick, in dem es erwünscht ist, die Lebensfähigkeit der Zelle einer aus dem Kulturmedium entnommenen Probe zu bestimmen.
- Nach einer Inkubation von 2 h 20 min bei 37°C wird die Fluoreszenz auf der Basis einer Erregung bei 530 nm und einer Emission bei 590 nm abgelesen. Die Intensität der erhaltenen Fluoreszenz ist proportional zur Stoffwechsel-Aktivität der Zellen.
- Die Lebensfähigkeit der Zellen wird bei 10 Proben nach 1-, 4-, 6-, 11- und 17-tägiger Kultivierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben
- Die Ergebnisse zeigen die Fluoreszenz in Internationalen Einheiten (IU) in Abhängigkeit von der Zeit. Tabelle III Lebensfähigkeit der Zellen (IU Fluoreszenz)
Zeit (Tage) Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Mittelwert SD* Mittelwert SD* Mittelwert SD* Mittelwert SD* 1 21,734 1184 30,535 1888 25,528 6820 28,461 3805 4 31,611 920 35,623 3544 36,404 3570 45,126 2930 6 43,144 2500 35,244 2095 37,819 4170 41,254 3396 11 42,808 1481 38,532 2537 42,442 3112 44,508 2329 17 45,484 2426 45,094 1470 43,963 8285 43,939 4521 Reihenfolge 1 2 3 4 - *Standard-Abweichung
- Die Ergebnisse in der Tabelle III werden auch in der beiliegenden
7 verwendet. Sie zeigen die Kurven der Fibroblast-Proliferation in Dermis-Äquivalenten. - Die Kurve mit ausgefüllten Rauten entspricht dem Test 1, die Kurve mit ausgefüllten Quadraten entspricht dem Test 2, die Kurve mit Dreiecken entspricht dem Test 3 und die Kurve mit Kreuzen entspricht dem Test 4.
- Die Zeit ist in Tagen auf der Abszisse angegeben und die Fluoreszenz ist in IU (Internationalen Einheiten) auf der Ordinate angegeben in einer Skala, die bei 15 000 beginnt und in Stufen von 10 000 Einheiten bis auf 55 000 ansteigt. Die Ergebnisse erlauben es, die folgenden Schlussfolgerungen zu ziehen.
- Schlussfolgerungen
- Die Ergebnisse zeigen, dass die hergestellten verschiedenen Matrices ein gutes Wachstum von Fibroblasten nach 17-tägiger Kultivierung erlauben. Unabhängig von der Herstellung der aquatischen Kollagen-Matrices haften die Fibroblasten gut an ihrem dreidimensionalen Träger und teilen sich sehr schnell, wobei sie die Matrix kolonisieren.
- Das Proliferationsprofil variiert sehr wenig von einem Matrix-Typ zum anderen, die Fibroblastendichte ist jedoch nach 17-tägiger Kultivierung vergleichbar, unabhängig von dem Herstellungsverfahren.
- Die angewendeten verschiedenen Arten der Vernetzung, die entweder mit DPPA oder mit EDC durchgeführt wurde, scheinen die Zellenerneuerung nicht zu beeinflussen Nach praktisch 3-wöchiger Kultivierung ist die Stabilität der Matrices ausgezeichnet, es tritt eine geringe Digestion und eine geringe Kontraktion auf.
- Beispiel 27
- Test zur Demonstration der Vorteile von aquatischem Kollagen für die Identifizierung und die Bestimmung von neu synthetisiertem Human-Kollagen
- Dieser Test ähnelt demjenigen des Beispiels 25, jedoch mit der Ausnahme, dass eine Histologie mit einer Immunmarkierung durchgeführt wird. Der Test wird wie folgt durchgeführt:
- 1) Herstellung der Dermis-Äquivalente
- Dabei handelt es sich um die Dermis-Äquivalente des Beispiels 25, wobei die Kultivierung unter den Bedingungen des Beispiels 25 durchgeführt wird.
- Diese Kultivierung wird daher drei Wochen lang durchgeführt, wobei das Medium dreimal wöchentlich gewechselt wird, nachdem normale Human-Fibroblasten in einer Rate von 300 000 Zellen/cm2 inokuliert worden sind, wie in Beispiel 25 angegeben.
- 2) Histologie
- a) Konventionelle Histologie
- Die Fixierung wird mit Paraformaldehyd in einer Konzentration von 4 Gew.-% durchgeführt, nachdem das Material dehydratisiert und in Paraffin eingeschlossen worden ist.
- Darauf folgen die Herstellung von 7 μm-Schnittpräparaten und die Mallory Haidenhain-Färbung nach der Entfernung des Paraffins und der Rehydratation.
- b) Immunmarkierung
- Eine Fixierung wird erneut mit 4 Gew.-% Paraformaldehyd durchgeführt, das Material ist in einer Tissue Tek OCT-Verbindung, d.h. in einer Einschluss-Flüssigkeit enthalten, die von der Firma Miles, Elkhart, Indiana, USA, geliefert wird, und in der Kälte wird ein 7 μm-Schnittpräparat hergestellt.
- Die Immunmarkierung wird wie folgt durchgeführt:
- i. ein erster Kollagen-Antikörper vom Kaninchen-Antihuman-Kollagen vom Typ I-Antikörper (Verdünnung 1/40) und
- ii. ein zweiter Antikaninchen-Antikörper werden gekuppelt mit FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) (Verdünnung 1/160).
- Als Gegenfärbung wird DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindoldilactat) verwendet.
- 3) Ergebnisse
- Es wurde gefunden, dass Träger, die aus einer aquatischen Matrix und einer Rinder-Matrix bestehen, mehr oder weniger lose Poren bilden, an denen die Fibroblasten haften.
- Ein größerer Anteil der Fibroblasten ist auf der Oberfläche festzustellen, wobei sie einen vorteilhaften Überzug auf dem Dermis-Äquivalent für die Herstellung von rekonstruktierter Haut bilden. Die Verteilung der Fibroblasten ist in aquatischen und Rinder-Schwammen homogen.
- Bei der Immunmarkierung wurde festgestellt, dass die aus Rinder-Kollagen hergestellte Matrix durch den Anti-Human-Kollagen Typ I-Antikörper (Kreuzung) markiert ist.
- Andererseits ist die Matrix aquatischen Ursprungs nur sehr schwach markiert durch den Anti-Human-Kollagen-Antikörper.
- Die Verwendung von Schwämmen, die aus aquatischem Kollagen bestehen, begünstigen daher die Identifizierung der neu synthetisierten extrazellulären Matrix.
- Diese Ergebnisse werden erläutert durch die Untersuchungen von Professor Hartmann über die Reaktionen von verschieden Antigenen mit verschieden Antikörpern, die bestimmt wurden durch optische Dichtemessungen nach der Immunmarkierung, die in der nachstehenden Tabelle IV oder der Hartmann-Tabelle angegeben sind: Tabelle IV Kreuzreaktion mit Human-, Rinder- und Fischkollagen (Elisa)
Antigen Seezungen-Kollagen vom Typ I Human-Kollagen vom Typ I Rinder-Kollagen vom Typ I Antikörper 20111 (225) 1/25 190 > 815 1/50 210 > 548 1/100 73 1233 234 1/200 43 605 136 1/400 56 326 165 50121 (03) 1/25 180 1550 > 1/50 130 1094 > 1/100 158 536 > 1/200 96 305 967 1/400 109 215 728 50171 (01) 1/25 1880 64 73 1/50 1043 193 32 1/100 571 51 33 1/200 523 51 87 - (>: die optische Dichte beträgt mehr als 2000)
- Die Ergebnisse sind ausgedrückt durch die OD × 103 (optische Dichte bei λ = 450 nm).
- Schlüssel: 20111 (225): Anti-Human-Kollagen vom Typ I
- 50121 (03): Anti-Rinder-Kollagen vom Typ I
- 50171 (01): Anti-Fisch (Seezungen)-Kollagen vom Typ I
- Diese Ergebnis-Tabelle zeigt, dass unabhängig von dem Antikörper (Anti-Human-Kollagen vom Typ I), Anti-Rinder-Kollagen vom Typ I, Anti-Seezungen-Kollagen vom Typ I) bei der Immunmarkierung der Unterschied zwischen Human-Kollagen und Seezungen-Kollagen viel größer ist als zwischen Human-Kollagen und Rinder- Kollagen. Infolgedessen kann in einer Fisch-Kollagen-Matrix das durch Human-Fibroblasten synthetisierte Kollagen viel leichter identifiziert werden. Dies bestätigen die vorstehend angegebenen Ergebnisse, die durch Immunmarkierung von Kollagen erhalten wurden, die in der Fisch-Kollagen-Matrix mit dem Anti-Human-Kollagen vom Typ I-Antikörper synthetisiert wurden, was ein besonders unerwartetes und vorteilhaftes Ergebnis der Erfindung darstellt.
Claims (22)
- Verfahren zur Herstellung eines Verbundprodukts, das mindestens eine poröse Kollagen-Schicht umfasst, die auf mindestens einer Seite mit einer im wesentlichen kompakten Kollagen-Membran bedeckt ist, wobei: a) zuerst die im wesentlichen kompakte Kollagen-Membran hergestellt wird entweder durch Trocknen eines ersten Kollagengels oder durch Komprimieren eines Kollagenschwamms, der durch Lyophilisieren eines Kollagengels hergestellt wurde, mit einem Druck von mindestens 50 bar; b) ein zweites Kollagengel getrennt hergestellt wird; c) entweder die im wesentlichen kompakte Membran auf dem zweiten Kollagengel abgeschieden wird oder das zweite Kollagengel auf die im wesentlichen kompakte Membran gegossen wird, und schließlich d) das Ganze lyophilisiert wird zur Herstellung des Verbundprodukts.
- Verfahren nach Anspruch 1, worin der zur Herstellung der kompakten Membran verwendete Kollagenschwamm mit einem Druck zwischen 50 und 200 bar komprimiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 2, worin die Kompressionsstufe bei einer Temperatur zwischen 20 und 80°C durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran hergestellt werden unter Verwendung entweder von Kollagen oder einer Mischung von Kollagen mit einem Polysaccharid, einem Glycosaminoglycan, Chitosan oder einem Derivat davon, Cellulose oder einem Derivat davon, Dextran oder einem Derivat davon, einem Alginat oder einem Derivat davon oder einem Carrageenan.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin ein Kollagen verwendet wird, das aus einem Säugetier stammt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran ein Kollagen umfasst, das aus Meeresorganismen stammt.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin mindestens eine der beiden Schichten oder beide Schichten vernetzt werden.
- Verfahren nach Anspruch 7, worin die Vernetzung eine physikalische Vernetzung, eine thermische Dehydratation unter Vakuum oder eine chemische Vernetzung ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem eine Verbindung, welche die Zellen-Entwicklung fördert, ein Wachstumsfaktor und speziell ein Cytokin oder ein Chemokin, während der Herstellung zugegeben wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Verfahren eine Stufe zur Einführung von normalen, genetisch modifizierten oder malignen lebenden Zellen in mindestens eine der beiden Schichten umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die lebenden Zellen ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten, Langerhans'schen-Zellen, die aus Blut stammen, Endothelzellen, die aus Blut stammen, Blutzellen, Makrophagen oder Lymphozyten, Chondrozyten, Osteozyten, Osteoblasten, Merkel-Zellen, die aus Blut stammen, Sebozyten, Adipozyten und Nervenzellen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem Fibroblasten in die poröse Kollagen-Schicht eingeführt werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem lebende Zellen auf der Oberfläche der kompakten Membran abgeschieden werden, wobei diese Zellen ausgewählt werden aus Keratinozyten, Melanozyten, Merkel-Zellen, die aus Blut stammen, Langerhans'schen-Zellen, die aus Blut stammen, Sebozyten, Zellen, die aus Blut stammen, und Nervenzellen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem lebende Zellen entweder durch eine sequenzielle Kultivierung oder durch gleichzeitige Kultivierung unterschiedlicher Zelltypen bereitgestellt werden, wobei diese Zellen aus einer Kultur oder Biopsie stammen.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran Kollagen umfasst, das aus Fischen stammt, die nicht-pigmentierte Hautbereiche aufweisen.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Kollagenschwamm und/oder der Kollagenfilm und/oder die Kollagen-Membran Kollagen umfasst aus Seezunge, Scholle, Steinbutt, Glattbutt.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin mindestens eine der beiden Schichten aus einem Kollagengel hergestellt ist, das eine Mischung von löslichem Kollagen und unlöslichem Kollagen enthält.
- Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, worin das Kollagen ein Kollagen vom Typ I und/oder ein Kollagen vom Typ III ist.
- Verfahren nach Anspruch 10, worin die lebenden Zellen von jungen Lebewesen stammen.
- Verfahren nach Anspruch 10, worin die lebenden Zellen von älteren Lebewesen stammen.
- Verwendung des Verbundprodukts, das einen Kollagen-Träger entfält wie es bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20erhalten wird, zur Herstellung von künstlicher Haut, die zur Durchführung von in vitro-Tests in bezug auf den Wirkungsgrad eines potentiellen Wirkstoffes oder zur in vivo-Rekonstruktion von geschädigten Hautbereichen, bestimmt ist.
- Verwendung nach Anspruch 21, worin die künstliche Haut entweder im wesentlichen ausschließlich aus jungen Zellen oder ausschließlich aus gealterten Zellen hergestellt wird zur Untersuchung des Gewebealterungsprozesses, speziell des Hautalterungsprozesses, oder zur Bestimmung des Wirkungsgrades von Wirkstoffen.
Applications Claiming Priority (7)
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FR0006748A FR2809412A1 (fr) | 2000-05-26 | 2000-05-26 | Utilisation de collagene d'origine aquatique pour la realisation de supports destines a l'ingenierie tissulaire, et supports et biomateriaux obtenus |
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FR0006743 | 2000-05-26 | ||
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