CN104857578B - 一种高强度的组织再生膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高强度的组织再生膜。该材料包括致密层和疏松层，在制备过程中，通过梯度透析过程，分子重新变成有序排列的结构，具有更一致、更广泛的胶原纤维取向，从而提高材料的力学性能。该材料的力学性能与人体组织具有近似，能够使用缝合线进行缝合操作，可用于引导组织再生或引导骨组织再生。本发明还提供了这种高强度组织再生膜的制备方法。

Description

一种高强度的组织再生膜及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种高强度的组织再生膜及其制备方法，该材料可用于诱导牙周组织再生或诱导骨组织再生。

背景技术

引导组织再生(Guide Tissue Regeneration，GTR)技术是80年代末90年代初发展起来的一项新技术。其原理是利用膜的物理屏障功能将病损区与周围组织隔离，创造一个相对封闭的组织环境，从而使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥。该技术最初用于牙周病治疗的动物实验及临床研究，随后又被用于促进骨组织的修复、再生(即诱导骨组织再生技术，Guide Bone Regeneration，GBR)。它的应用为牙周病的治疗、牙种植区骨量不足及其它骨缺损的修复、骨折的愈合提供了一个新的有效途径。(可吸收性GTR膜材料的研究现状与进展中国口腔种植学杂志，2002年3月第7卷第1期)GTR膜材料可分为可吸收性和不可吸收性膜两大类。它们都具有细胞阻隔和引导特定组织再生的功能。然而，不可吸收性膜不能自行降解,需二次手术去除；且细胞亲和性差，易导致伤口裂开，膜早期暴露，影响伤口的愈合。

因此认为治疗牙周病的GTR膜至少得保持其结构3～4周，应用于骨缺损修复的理想膜材料，其降解时间应为4个月左右。若膜保存的时间短于骨形成的生理周期，骨再生的质量将受到影响一种理想的GTR膜材料就应当是在适当的组织愈合过程中或结束后能自行降解吸收、且其产物对机体无害的物质。

不可吸收膜主要有钛膜、聚四氟乙烯膜，由于需要二次手术去除，现在临床上已经被淘汰。可吸收性GTR膜材料主要有两类：一类是可生物降解的合成高分子材料，另一类是天然生物材料制成的胶原膜。

合成高分子聚合物膜，通常由聚乳酸、聚氨基甲酸酯、Polyglatin-910、PCL等组成，由于存在降解吸收慢，与组织修复速度不匹配，并且帖附性不佳手术操作不方便等原因，临床上已经大幅减少了使用。胶原膜有以动物组织为原料制成的胶原膜和以同种异体组织制成冻干骨膜等。现在临床应用最多的是瑞士Geistlich公司生产的BIO-GIDE膜，是通过以猪皮为原材料，它是将猪胶原经过加工合成,达到高度纯化后制成的具有致密结构的双层生物膜。靠近周围组织面的纤维排列致密,具有良好的细胞阻隔作用；紧贴骨缺损区纤维排列疏松,有较多的孔隙,起到稳定血凝块的作用并有利于骨细胞与膜结合。该膜的组织相容性好、抗原性低、韧性强、易于操作,降解时间为4～6个月,具有良好的引导组织再生能力,是目前最受欢迎的GTR膜材料。烟台正海生物公司董群等申请的公布号CN1775189一种脱细胞真皮基质及其制备方法，是通过以牛皮等为原料，用去污剂、氢氧化钠浸泡等工艺制备成的真皮脱细胞基质。

脱细胞基质材料的共同特点是，没有通过酶解消化，未取出异体或异种胶原的端肽，因此无法彻底去除材料的免疫原性，造成材料植入人体时，会有一定的免疫排斥反应。

对于现有材料及其制作工艺，亟待解决的问题有：脱细胞基质材料无法使用胶原的酶切工艺，无法彻底去除胶原的端肽，也就无法取出异种或异体材料的免疫原性，造成植入体内有免疫排斥反应。国内专利公开号CN102716517A号佘振定以I型胶原蛋白或透明质酸钠为原料，通过溶解、冻干等传统工艺制作出的胶原膜或胶原/透明质酸钠复合膜，虽然去除胶原材料的免疫原性，但是材料力学性能差，断裂拉伸强度仅达到10～20MPa，植入过程中无法使用缝合线与组织进行缝合，并且为了延长降解时间，需要使用戊二醛等交联剂进行化学交联反应，这样就增加化学试剂残留毒性的风险，而且透明质酸钠材料无法耐受高剂量的Co60辐照灭菌，在Co60辐照灭菌后，材料的力学强度大幅下降，无法满足手术缝合的要求。为了增加材料强度，该组织再生膜的增加了致密层和疏松层的厚度，致密层厚度为0.3-1毫米，疏松层厚度1-2毫米，在使用时吸水后，材料厚度达到3毫米以上，甚至超过5毫米，这一特点造成组织肿胀影响组织修复效果，同时疏松层呈海绵状。国内专利公开号CN103191085A号佘振定等以胶原和可降解高分子网为材料，制备的含致密层和疏松层的复合再生膜，为了增加致密层胶原膜的强度，引入了可降解高分子材料，这会降低材料的组织相容性，而且致密层厚度为0.5-2毫米，吸水后依然会因为厚度过厚影响临床效果。因此，临床上急需一种无免疫原性、厚度薄、力学性能优良且降解速度慢的引导组织再生膜产品。

发明内容

本发明针对以上产品的缺陷，目的在于提供一种高强度的组织再生膜及其制备方法，该再生膜吸水后，变得柔软，且具有很好的组织帖附性，可以对折、弯曲等操作贴附在任意形状的组织表面，而且材料厚度很薄，同时能保持很高的断裂拉伸强度，解决了材料无法与组织缝合、降解速度过快、胶原膜吸水后厚度过厚引起组织肿胀等问题，并且不需要冻干机等大型生产设备，易于生产推广。

本发明一种高强度的组织再生膜，包括致密层和疏松层，其特征在于：

一种组织再生膜，包括致密层和疏松层，其特征在于：

所述的致密层包括I型胶原或I型胶原蛋白复合III型胶原蛋白，组成该致密层的胶原分子具有一致的有序排列的胶原纤维取向，能够使用缝合线进行缝合操作，厚度为0.02-0.3mm；

所述的疏松层是包括I型胶原复合III型胶原，或包括I型胶原蛋白复合一定量的钙盐，或包括I型胶原复合III胶原同时复合一定量的钙盐，厚度为0.01-1mm；

疏松层和致密层在成型的过程中紧密的结合在一起。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于，该再生膜吸水后可自由弯曲和折叠，吸水后的湿态抗张强度可达40MPa以上，使用时能够使用缝合线进行缝合操作。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于：所述的致密层、疏松层包括I型胶原复合III型胶原时，I型胶原与III型胶原的重量比例范围为9:1～1:9；所述的疏松层包括胶原蛋白复合一定量的钙盐组成时，胶原与钙盐的重量比例范围10:1～1:2；疏松层呈白色或微黄色纤维状，含有气泡造成的空隙，与致密层紧密结合；致密层相对疏松层更为致密，无微孔存在，表面光滑，呈白色或微黄色，半透明。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于，致密层中的胶原蛋白是分子取向的，通过梯度透析过程，分子重新变成有序排列的结构。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于，致密层也包括II型胶原蛋白。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于：所述的I型胶原蛋白为提取自牛跟腱或猪跟腱的天然胶原或重组人类I型胶原蛋白中的至少一种；所述的III型胶原蛋白为提取自牛皮或猪皮的天然胶原或重组人类III型胶原蛋白中的至少一种；所述的钙盐为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸四钙、羟基磷酸钙、碳酸钙中的一种或多种，颗粒度为纳米或微米级。

如上所述的一种组织再生膜，其特征在于由以下步骤制得：

步骤S1、I型胶原蛋白凝胶或I型和III型胶原蛋白混合凝胶的制备，具体包括：

步骤S1-1、将一定量的I型胶原蛋白，或者I型和III型胶原混合，溶解在醋酸、盐酸、硝酸或柠檬酸中的一种，制备成胶原的酸溶液，胶原质量分数为0.1-2％；其中若为若为I型胶原与III胶原的混合溶液，则I型胶原与III型胶原的重量比例范围为9:1～1:9；

步骤S1-2、将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-3、步骤S1-2中所述的梯度透析，所使用的参数为：pH＝1-3.5酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

步骤S1-4、步骤S1-3中所述的梯度透析，所使用的参数为：pH＝3.5～6的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

步骤S1-5、步骤S1-4中所述的梯度透析，所使用的参数为：使用中性的纯化水透析1～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次，梯度透析完成后，可得均一稳定的胶原蛋白凝胶.

步骤S2、高强度双层引导组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、步骤S1所得的胶原溶液注入一定深度的模具中，在通风条件下自然干燥，制备致密层；

步骤S2-2、将步骤S1所得胶原溶液，置入容器中，使用搅拌桨或搅拌子旋转搅拌的方法，混入大量气泡，制备得含有大量气泡的泡沫状胶原溶液；或者在胶原溶液中加入钙盐后，快速搅拌混入大量气泡，制备得胶原与钙盐的混合溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-1制备的致密层未完全干燥前，将步骤S2-2所得的含大量气泡的胶原溶液，或胶原与钙盐的混合溶液，注入到步骤S2-1所得的致密层上，并使其在致密层上均匀分布；

步骤S2-4、将模具在通风条件下自然干燥，从而制备得到由致密层和疏松层构成引导再生膜；

步骤S2-5、材料通过无菌包装，经灭菌后使用。

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：步骤S-1所述的I型和III型胶原蛋白混合凝胶是经过酶解、透析、冻干后形成的干态胶原蛋白，然后单独或混合后通过酸溶所形成的胶原蛋白凝胶，也可以是直接经过酶解、透析后形成胶原蛋白凝胶，其中的胶原蛋白未经过高温、辐照、化学交联反应；

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：步骤S1-2～S1-5的梯度透析，也可分解为pH1～3.5、pH中性纯化水的两个梯度的透析，不需要步骤S1-4，或者pH1～2、pH2～4、pH4～6和pH中性纯化水的四个梯度的透析，四个梯度的透析包含如下步骤：

步骤S1-1、将一定量的I型和III型混合胶原，溶解在醋酸、盐酸、硝酸或柠檬酸中的一种，制备成胶原的酸溶液，其中I型胶原与III型胶原的质量分数分别为0.1-2％以及0.05-2％；

步骤S1-2、将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-a、步骤S1-2中所述的梯度透析，所使用的参数为：pH＝1-2的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

步骤S1-b、步骤S1-a中所述的梯度透析，所使用的参数为：pH＝2～4的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

步骤S1-c、步骤S1-b中所述的梯度透析，所使用的参数为：pH＝4～6的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

步骤S1-5、步骤S1-c中所述的梯度透析，所使用的参数为：使用中性的纯化水透析1～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次，梯度透析完成后，可得均一稳定的胶原蛋白凝胶。

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：步骤S2-2中，所述胶原与钙盐的混合溶液中，胶原与钙盐的重量比例范围10:1～1:2，钙盐为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸四钙、羟基磷酸钙、碳酸钙中的一种或多种，颗粒度为纳米或微米级。

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：步骤S2-1和步骤S2-4中，所述的通风干燥时间为8-96小时，所使用的温度为0～65℃。

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：在完成步骤S2-4后，不需要交联；或使用物理方法、化学方法或两者结合的方法进行进一步交联，以进一步增强材料的性能，物理方法有紫外辐照、热脱氢法、辐照灭菌法，化学交联方法有使用碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐DPPA、戊二醛、甲醛、乙醛酸或京尼平进行交联，使用化学交联剂后，需要经过洗脱程序去除交联剂的残留。

如上所述的再生膜制备方法，其特征在于：步骤S2-5中，所述的灭菌方法为Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌中的一种。

实施本发明，可以制备出高强度的胶原基组织再生膜，能够满足GTR或GBR临床手术中，再生膜与组织缝合的需求。该材料具有的胶原和羟基磷灰石为人体天然组织的主要成分，本发明的优点有：

1.通过梯度透析过程，分子重新变成有序排列的结构，具有更一致、更广泛的胶原纤维分子取向，胶原分子发生氢键交联作用，被破坏的胶原分子氢键再度结合，这样制成再生膜，具有胶原分子有序排列，且具有氢键交联作用，使得该再生膜具有很高的力学性能，吸水后的湿态抗张强度可达40MPa以上，和人体粘膜和皮肤具有近似的力学性能，能够使用缝合线进行缝合操作；

2.材料很薄且力学强度很高，很高的材料强度，允许致密层更薄，既满足了缝合的需求又利于提升临床应用效果；

3.使用的原材料，经过酶切反应，去除了胶原蛋白的端肽，无免疫原性不会形成交联剂带来的毒性和免疫原性风险；

4.加工过程中，在不使用碳化二亚胺、羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、甲醛、京尼平化学交联剂的情况下，依然可以达到很高的力学强度，这样能够避免交联剂残留所带来的毒性危害；

5.该再生膜复水后柔软、有韧性，具有很好的贴附性，可以进行弯曲、折叠、帖附在任意形状的组织表面，胶原经过氢键交联作用，具有很强的抗降解作用，在体内降解周期在6～10个月；

6.疏松层和致密层都使用胶原材料，结合力高，结合紧密，在使用中，不会造成疏松层和致密层轻易剥离的现象，影响使用效果。疏松层也加入了钙盐，增强了在再生膜的引导骨再生的能力；

7.生产工艺简单，易于大规模生产，不需要冻干过程，生产成本低，非常有利于降低患者的医疗成本。

附图说明

图1为实施本发明，高强度组织再生膜的制备方法流程图

图2为本发明实施再生膜在干态时的致密层的扫描电镜图

图3、图4为本发明实施再生膜在干态时的疏松层的扫描电镜图

图5为本发明实施再生膜在复水后湿态时的致密层的扫描电镜图

图6、图7为本发明实施再生膜在复水后湿态时的疏松层的扫描电镜图

具体实施方式

以下实施例，进一步的详细说明本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步的理解本发明，而不构成对其权利的限制。

图1为实施本发明，高强度组织再生膜的制备方法流程图；图2为本发明实施再生膜在干态时的致密层的250倍放大的扫描电镜图，由图可看出，胶原纤维要一定方向整齐排列，胶原纤维分子是取向性排列的；图3、图4分别为本发明实施再生膜在干态时的疏松层的250倍和5000倍放大的扫描电镜图，由图可看出，疏松层表面凹凸不平，胶原分子无规则排列，钙盐颗粒夹杂在胶原分子中。

图5为本发明实施再生膜在复水后湿态时的致密层的250倍放大的扫描电镜图，由图可看出，吸水后的胶原膜中胶原纤维分子依然按一定方向整齐排列，胶原纤维分子是取向性排列的；图6、图7分别为本发明实施再生膜在复水后湿态时的疏松层的250倍和5000倍放大的扫描电镜图，由图可看出，疏松层表面凹凸不平，胶原分子无规则排列，钙盐颗粒均匀夹杂在胶原分子中。

实施例1：高强度组织再生膜的制备，致密层和疏松层均为I型胶原蛋白。图1所示为本发明高强度组织再生膜的制备方法流程图。图2为本发明实施再生膜在干态时的致密层的扫描电镜图，图3、图4为本发明实施再生膜在干态时的疏松层的扫描电镜图。

根据图1所示的步骤，高强度的I型胶原蛋白双层组织再生膜的制备方法为：

步骤S1-1、将1gI型胶原蛋白，溶解在2L浓度为0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成胶原的酸溶液；

步骤S1-2、选择透析袋，将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-3、第一梯度透析，参数为：pH＝2醋酸溶液透析7天，温度为4℃，每天更换透析液2次；

步骤S1-4、第二梯度透析，参数为：pH＝4.5的醋酸溶液透析3天，温度为4℃，每天更换透析液2次；

步骤S1-5、第三梯度透析，参数为：使用中性的纯化水透析2天，温度为4℃，每天更换透析液2次。

步骤S2、高强度双层组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、取1L步骤S1所得的胶原溶液注入20X10X1cm尺寸的矩形槽模具中，在50℃通风条件下自然干燥，制备致密层备用；

步骤S2-2、取1L将步骤S1所得胶原溶液，置入容器中，使用搅拌桨以200r/min的转速旋转搅拌，混入大量气泡，制备得含有大量气泡的泡沫状胶原溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-1制备的致密层未完全干燥前，将步骤S2-2所得胶原溶液，注入到步骤2-1所得的致密层上，并使其在致密层上均匀分布；

步骤S2-4、将模具在通风条件下，50℃自然干燥成膜；

步骤S2-5、材料通过Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌后使用。

该再生膜具有双层结构，致密层提供了主要的力学强度，疏松层为含有气孔的多孔材料，经测试吸水后的湿态抗张强度为49.2Mpa。

实施例2：高强度组织再生膜的制备，致密层为I型胶原蛋白，疏松层为I型胶原蛋白复合羟基磷灰石。图1所示为本发明高强度组织再生膜的制备方法流程图。图5为本发明实施再生膜在干态时的致密层的扫描电镜图，图6、图7为本发明实施再生膜在干态时的疏松层的扫描电镜图。

根据图1所示的步骤，含羟基磷灰石的高强度的I型胶原蛋白双层组织再生膜的制备方法为：

步骤S1-1、将1gI型胶原蛋白，溶解在2L浓度为0.1mol/L的醋酸溶液中，配置成胶原的酸溶液；

步骤S1-2、选择透析袋，将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-3、第一梯度透析，参数为：pH＝1醋酸溶液透析3天，温度为4℃，每天更换透析液3次；

步骤S1-4、第二梯度透析，参数为：pH＝4的醋酸溶液透析5天，温度为4℃，每天更换透析液3次；

步骤S1-5、第三梯度透析，参数为：使用中性的纯化水透析1天，温度为4℃，每天更换透析液3次。

步骤S2、高强度双层组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、取1.5L步骤S1所得的胶原溶液注入30X5X1.3cm尺寸的矩形槽模具中，在50℃通风条件下自然干燥，制备致密层备用；

步骤S2-2、取0.5L将步骤S1所得胶原溶液，加入0.2g的羟基磷灰石，使用搅拌桨以300r/min的转速旋转搅拌，制备得胶原与羟基磷灰石的混合溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-1制备的致密层未完全干燥前，将步骤S2-2所得胶原与羟基磷灰石的混合溶液，注入到步骤2-1所得的致密层上，并使其在致密层上均匀分布；

步骤S2-4、将模具在通风条件下，35℃自然干燥成膜；

步骤S2-5、材料通过Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌后使用。

该再生膜具有双层结构，致密层提供了主要的力学强度，疏松层为含有气孔和羟基磷灰石的多孔材料，经测试吸水后的湿态抗张强度为58.6Mpa。

实施例3：高强度组织再生膜的制备，致密层为I型和III型胶原蛋白混合材料，疏松层为I型胶原蛋白

根据图1所示的步骤，高强度的胶原蛋白双层组织再生膜的制备方法为：

步骤S1-1、取0.3gI型和0.4gIII胶原蛋白，溶解在1.1L浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，配置成I型和III型混合胶原溶液；取0.5gI型胶原蛋白，溶解在0.9L的浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，配置成I型胶原溶液

步骤S1-2、选择透析袋，将步骤S1-1中所得胶原酸溶液分别装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-3、第一梯度透析，参数为：pH＝1醋酸溶液透析2天，温度为8℃，每天更换透析液1次；

步骤S1-4、第二梯度透析，参数为：pH＝4的醋酸溶液透析3天，温度为8℃，每天更换透析液4次；

步骤S1-5、第三梯度透析，参数为：使用中性的纯化水透析1天，温度为8℃，每天更换透析液2次。

步骤S2、高强度双层组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、取1.1L步骤S1所得的I型和III型混合胶原溶液注入20X10X1cm尺寸的矩形槽模具中，在50℃通风条件下自然干燥，制备致密层备用；

步骤S2-2、取0.9L将步骤S1所得I型胶原溶液，置入容器中，使用搅拌桨以200r/min的转速旋转搅拌，混入大量气泡，制备得含有大量气泡的泡沫状胶原溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-1制备的致密层未完全干燥前，将步骤S2-2所得胶原溶液，注入到步骤2-1所得的致密层上，并使其在致密层上均匀分布；

步骤S2-4、将模具在通风条件下，30℃自然干燥成膜；

步骤S2-5、材料通过Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌后使用。

经测试吸水后的湿态抗张强度为63.5Mpa。

实施例4：高强度组织再生膜的制备，致密层为I型和III型胶原蛋白混合材料，疏松层为I型胶原蛋白和β-磷酸三钙的复合材料

根据图1所示的步骤，含β-磷酸三钙的高强度的胶原蛋白双层组织再生膜的制备方法为：

步骤S1-1、取0.2gI型和0.9gIII胶原蛋白，溶解在1.1L浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，配置成I型和III型混合胶原溶液；取0.8gI型胶原蛋白，溶解在0.9L的浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，配置成I型胶原溶液

步骤S1-2、选择透析袋，将步骤S1-1中所得胶原酸溶液分别装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

步骤S1-3、第一梯度透析，参数为：pH＝1醋酸溶液透析2天，温度为8℃，每天更换透析液1次；

步骤S1-4、第二梯度透析，参数为：pH＝4的醋酸溶液透析3天，温度为8℃，每天更换透析液4次；

步骤S1-5、第三梯度透析，参数为：使用中性的纯化水透析1天，温度为8℃，每天更换透析液2次。

步骤S2、高强度双层组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、取1.1L步骤S1所得的I型和III型混合胶原溶液注入15X15X0.8cm尺寸的矩形槽模具中，在37℃通风条件下自然干燥，制备致密层备用；

步骤S2-2、取0.9L将步骤S1所得I型胶原溶液，加入0.4g的β-磷酸三钙，使用搅拌桨以100r/min的转速旋转搅拌，制备得胶原与β-磷酸三钙的混合溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-2所得含羟基磷灰石的I型胶原溶液，注入15X15X0.8cm尺寸的矩形槽模具中，然后将S2-1制备的致密层取出，平铺覆盖在含β-磷酸三钙的I型胶原溶液上，使其均匀铺展；

步骤S2-4、将模具在通风条件下，37℃自然干燥成膜；

步骤S2-5、材料通过Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌后使用。

经测试吸水后的湿态抗张强度为53.5Mpa。

实施例5

按照实施例1所述的步骤制备高强度组织再生膜，其中，步骤S2-4之后，将成型模置入真空干燥箱中进行高温真空交联，参数为：时间3天，温度120℃，真空度0.1MPa，其余工艺参数保持不变。交联完成后，在进行灭菌。经测试吸水后的湿态抗张强度为109.5Mpa。

实施例6

按照实施例1所述的步骤制备高强度组织再生膜，其中，步骤S2-4之后，将成型模使用化学交联的方法进行交联，交联剂及交联参数：0.05％戊二醛的乙醇溶液，以膜和溶液质量比为1:100的比例，将膜浸泡在乙醇溶液中，交联时间48h。交联完成后，使用乙醇流动清洗，以去除交联剂的残留，然后自然干燥。经测试吸水后的湿态抗张强度为213.3Mpa。

对比例1：

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中去掉步骤S1-2～S1-5，无酸透析，其余参数保持不变。

对比例2：

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中去掉步骤S1-5，无水透析，其余参数保持不变。

对比例3

按照实施例2所述的步骤制备组织再生膜，其中在步骤S1-3～5中，透析温度为30℃，其余参数保持不变。

对比例4

按照实施例2所述的步骤制备组织再生膜，其中在步骤S2-2中，加入羟基磷灰石5g，其余参数保持不变。

对比例5

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中步骤S2-4，产品通风干燥温度80℃，其余参数保持不变。

对比例6

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中步骤S1-1，所加入的胶原为市售的胶原蛋白海绵，经过一定的交联反应，其余参数保持不变。

对比例7

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中步骤S1-1，所加入的胶原经过60℃度加热，其余参数保持不变。

对比例8

按照实施例1所述的步骤制备组织再生膜，其中去掉步骤S1-2～S1-5，无酸透析，其余参数保持不变，制成胶原膜后，再经戊二醛交联反应。

对比例9

按照国内专利公开号CN102716517A号实施例1所述步骤，对比制作引导组织再生膜。

对上述对比例获得的材料进行力学性能测试，测试结果如下表：

经检测，按照上述对比例的工艺所制备的样品中，无梯度的透析过程的方法，制备出的膜，抗张强度很低，即使经过交联反应力学性能提高的程度非常有限。因此，在制备高强度组织再生膜的过程中，步骤S1中，所述的酸透析和水透析结合的梯度透析过程是必不可少的。

本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化或等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入权利要求保护范围的实施例。

本发明的疏松层非蜂窝状结构，疏松层呈白色或微黄色纤维状，含有气泡造成的空隙，与致密层紧密结合。

Claims (8)

1.一种组织再生膜的制备方法，其特征在于所述的组织再生膜包括致密层和疏松层，所述的致密层包括I型胶原或I型胶原蛋白复合III型胶原蛋白，组成该致密层的胶原分子具有一致的有序排列的胶原纤维取向，能够使用缝合线进行缝合操作，厚度为0.02-0.3mm；

所述的疏松层是包括I型胶原复合III型胶原，或包括I型胶原蛋白复合一定量的钙盐，或包括I型胶原复合III胶原同时复合一定量的钙盐，厚度为0.01-1mm；疏松层和致密层在成型的过程中紧密的结合在一起；

所述的制备方法包含以下步骤：

步骤S1、I型胶原蛋白凝胶或I型和III型胶原蛋白混合凝胶的制备，具体包括：步骤S1-1、将一定量的I型胶原蛋白，或者I型和III型胶原混合，溶解在醋酸、盐酸、硝酸或柠檬酸中的一种，制备成胶原的酸溶液，胶原质量分数为0.1-2％；其中若为I型胶原与III胶原的混合溶液，则I型胶原与III型胶原的重量比例范围为9:1～1:9；

步骤S1-2、将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析：

第一梯度透析所使用的参数为：pH＝1-3.5酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

第二梯度透析所使用的参数为：pH＝3.5～6的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

第三梯度透析所使用的参数为：使用中性的纯化水透析1～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次，梯度透析完成后，得均一稳定的胶原蛋白凝胶；

步骤S2、高强度双层引导组织再生膜的制备，具体包括：

步骤S2-1、步骤S1所得的胶原溶液注入一定深度的矩形模具中，在通风条件下自然干燥，制备致密层；

步骤S2-2、将步骤S1所得胶原溶液，置入容器中，使用搅拌桨或搅拌子旋转搅拌的方法，混入大量气泡，制备得含有大量气泡的泡沫状胶原溶液；或者在胶原溶液中加入钙盐后，快速搅拌混入大量气泡，制备得胶原与钙盐的混合溶液；

步骤S2-3、待步骤S2-1制备的致密层未完全干燥前，将步骤S2-2所得的含大量气泡的胶原溶液，或胶原与钙盐的混合溶液，注入到步骤S2-1所得的致密层上，并使其在致密层上均匀分布；

步骤S2-4、将模具在通风条件下自然干燥，从而制备得到由致密层和疏松层构成引导再生膜；

步骤S2-5、材料通过无菌包装，经灭菌后使用。

2.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：步骤S-1所述的I型和III型胶原蛋白混合凝胶是经过酶解、透析、冻干后形成的干态胶原蛋白，然后单独或混合后通过酸溶所形成的胶原蛋白凝胶，或是直接经过酶解、透析后形成胶原蛋白凝胶，其中的胶原蛋白未经过高温、辐照、化学交联反应。

3.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：将步骤S1-1～S1-2采用下述步骤替换：

步骤S1-1、将一定量的I型和III型混合胶原，溶解在醋酸、盐酸、硝酸或柠檬酸中的一种，制备成胶原的酸溶液，其中I型胶原与III型胶原的质量分数分别为0.1-2％以及0.05-2％；

步骤S1-2、将步骤S1-1中所得胶原酸溶液装入透析袋中，将透析袋端口密封，采用梯度透析的方法进行透析；

第一梯度透析所使用的参数为：pH＝1-2的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

第二梯度透析所使用的参数为：pH＝2～4的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

第三梯度透析所使用的参数为：pH＝4～6的酸溶液透析2～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次；

第四梯度透析所使用的参数为：使用中性的纯化水透析1～7天，温度为1～25℃，每天更换透析液1～10次，梯度透析完成后，得均一稳定的胶原蛋白凝胶。

4.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：步骤S2-2中，所述胶原与钙盐的混合溶液中，胶原与钙盐的重量比例范围10:1～1:2，钙盐为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸四钙、羟基磷酸钙、碳酸钙中的一种或多种，颗粒度为纳米或微米级。

5.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：步骤S2-1和步骤S2-4中，所述的通风干燥时间为8-96小时，所使用的温度为0～65℃。

6.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：在完成步骤S2-4后，使用物理方法、化学方法或两者结合的方法进行进一步交联，以进一步增强材料的性能，物理方法有紫外辐照、热脱氢法、辐照灭菌法，化学交联方法有使用碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐、戊二醛、甲醛、乙醛酸、京尼平进行交联，使用化学交联剂后，需要经过洗脱程序去除交联剂的残留。

7.如权利要求1所述的再生膜的制备方法，其特征在于：步骤S2-5中，所述的灭菌方法为Co60灭菌、电子束灭菌或环氧乙烷灭菌中的一种。

8.如权利要求1～7任一项所述的方法制备的组织再生膜。