CZ33799A3 - Farmaceutická kompozice ježkovitých proteinů a její použití - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Farmaceutická kompozice ježkovltého proteinu, která Je vyznačena tím, že ježkovitý protein se váže k hydrofllnímu nosiči, který je bir kompatibilní a blodegradovatelný, přičemž nosičem je polymer, který váže ježkovitý protein jako negativitě nabitý nosič jako výsledek lonických interakcí, nedenaturuje Ježkovitý protein když še váže na nosič, obsahuje alespoň 0,1 až 2 negativně nabité zbytky na monomer za neutrálních podmínek, obsahuje náboj ve formě kyselých skupin, má průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 50 000 Da a neobsahuje agarosu, revensibilně a účinně uvolňuje Ježkovitý protein in vivo z nosiče zadržovaným způsobem.

CZ 337-99 A3

φ * *·, . ** *$, φφφ · φ φ · · ♦ · φ » φ φφ φ φ φ φφφφφφ φφφ φφφ φ · • Φ φφφ' φφ ' φφφφ φφ φφ

Farmaceutická kompozice ježkovitých proteinů a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutické kompozice ježkovitých proteinů a jejího použití zejména pro lokální uvolňování to proteinů na kostech a chrupavkách.

těchDosavadní stav techniky

Jézkovité (hh) proteiny jsou míněny jako rodina vylučovaných signálních proteinů, které jsou odpovědné za tvorbu početných struktur při embryogenesi (J.C.Smitn, Cell 76 (1994) 193-195, N.Perrimon, Cell 30 (1995) 517-520, C.Chiang a j., Nátuře 83 (1996) 407, M.J.Bitgood a j., Curr.Biol. 6 (1996) 296, .A.Vortkamp-a j.., Science 273 (1996) 613, C.J.Lai a j., Develópment 121 (1995) 2349).

Během biosyntézy se získá 20 kD M-terminální doména a 25 kD C-terminální doména po štěpení signální sekvence a 4í „ autokatalyckém štěpení. N-terminální doména se modifikuje ve své přirozené formě cholesterolem (J.A.Porter a j., Science 274 (1995) 255-259). U vyšších životních forem je hh rodina tvořena z alespoň tří členů, to je sonického, indického a pouštního hh (shh, ihh, dhh; [-I.Fietz a j., Develópment (Suppl.) (1994) 43-51). Rozdíly v aktivitě ježkovitých proteinů, které byly vytvořeny rekombinantně, byly zjištěny po produkci v prokaryontech a eukaryontech (Dl.Hyneš a j., Neuron 15 (1995 ) 35 -4 a ΐ.Ι-Iakamura a j., Biochem.Biophys.Res.Comm. 237 (1977) 465-469.

Hyneš a j. srovnávají aktivitu hh v supernatantu transformovaných lidských embryonálních ledvinových 293 buněk, (eukaryotické hh) s hh vytvořenými z E.coli a zjištují 4x vyšší aktivitu hh ze supernatantů ledvinové buněčná linie.

Potenciální další přídatný faktor, který je pouze expresován v eukaryotických buňkách, posttranslační modifikace, rozdílný N-konec, protože hh izolované z S.coli obsahuje 50 % hh, které nesou dvě další N-terminální aminokyseliny (Gly-Ser) nebo jsou zkráceny o 5 až 6 aminokyselin nebo vyšší stav agregace například vazbou na niklagarosové perličky) byl diskutován jako důvod pro zvýšenou aktivitu.

Nakamura a j. srovnávají aktivitu shh v supernatantu transformovaných kuřecích embryonálních fibroplastů s shh různím proteinem izolovaným z E.coli, který má ještě N-terminální polyhistidinovou část. shh v supernatantu fibroplastů má 7 x vyšší aktivitu než vyčištěný S.coli protein pokud jde o stimulaci alkalické fosfatasy (AP) v C3K10T 1/2 buňkách.

Molekuly jako jsou kostní morfogenetické proteiny (BMP) jsou diskutovány jako příčina pro zvýšenou aktivitu, která je jedině přítomná v supernatantu eukaryotických buněk a vyvolává silnější indukci AP.

Kinto a j., FEBS Letters, 404 (1227) 319-323 popisují, že fibroplasty, které vylučují hh, indukují ektopickou tvorbu kosti při i.m. implantaci na kolagen. Ježkovité proteiny tudíž mají osteoinduktivní aktivitu.

Způsob pro vytvoření dodávacích systémů pro proteiny se zadržovaným uvolňováním za pomoci alginatu je znám z WO 90//08551. Při tomto postupu se vytvoří dvoufázový systém, ve kterém první fáze obsahuje vysokou koncentraci proteinu, (nasycený roztok) a druhá fáze obsahuje alginat. Avšak takováto fázová separace je obtížná a komplikovaná na provádění, když se produkují farmaceutické kompozice ve velkých množstvích.

Pulsatilní uvolňování dextranu z kalciumalginatových komplexů je známo z Kikuchi A. a j., J.Controlled Release 47 (1997) 21-29.

Avšak sdružování ježkovitých proteinů do takovýchto komplexů není Kikuchim popsáno.

Robinson/ C.J. a j. popisují v Trends in Biotechnology 14 (1936) 451-452 intraventrikulární implantaci alginatových mikrokuliček jako způsob pro lokální aplikaci iIGR nebo NGF vylučujících buněk. Avšak aplikace proježkovité' proteiny není popsána.

Downs, S.C. a j. popisují v J.Cell Physiol. 152 (1932) 422-429 aplikaci kalciumalginatových kuliček jako dodávací systém pro angiogenetické faktory. Avšak použití tohoto postupu nebo tento dodávací systém pro ježkovité proteiny není popsán.

Crey, C.J. a j. Dowsett popisují v Biotechnol. Bioeng. 31 (1988) 607-612 použití kalcium/zinek alginatových kuliček jako dodávací systém pro.· inzulín. Avšak použití tohoto postupu pro vytvoření áodávacích systémů pro ježovkové proteiny z toho není známo.

Z Yang a j., Development 124 (1997) 4333-4404 je známo, že vysoké lokální ježkovité koncentrace musí být udržovány po dobu alespoří 16 hodin v místě působení v těle pro farmaceuticky účinnou aktivitu in vivo. Nosný systém popsaný Yangem a j. jako ježkovité naplněné chromatografické medium Affigel CM, Ni-agarosa popsaná Marti a j. v Nátuře 375 (1995) 322-325 nebo Affigel Blue použitá Lopez-Hartinezem a j. v Curr Biol.5 (1995) 791-796 nebo heparin-agarosové částice, které tam byly použity jsou nevhodné pro farmaceutickou aplikaci, protože jsou imunogenní a mohou vyvolat sánětlivé reakce.

Vynálezci zjistili, že biokompatibilní a biodegrado vatelný nosný kolagen popsaný Kinto a j. pro hh expresující buňky je taká nevhodný pro optimální lokální farmaceutickou aplikaci ježkovitých proteinů pokud se tyto ježkovité proteiny vážou na nosič jen pomocí iontových interakcí.

* ·

Bylo zjištěno, že když se kolagenové nosiče naplní ježkovitými proteiny za fyziologických podmínek (pH asi 7) a ve slabých kyselinách (až do pH 4,5) většina aplikovaného jezkovitého proteinu se uvolní během minut z matrice. Podle zjištění vynálezců tato, nedostatečná vazba je způsobena nedostatkem dostatečných iontových interakcí mezi ježkovitým proteinem a nosičem.

V případě naplňování za kyselých podmínek (pod pH 4,5), se velké množství aplikovaného jezkovitého proteinu denaturuje a nevratně váže na nosič.

Tudíž cílem vynálezu je vytvořit farmaceutickou kompozici jezkovitého proteinu s biokompatibilním nosičem, kde nosič váže ježkovitý protein v jeho aktivní svinuté struktuře a může ho uvolnit in vivo v jeho aktivní formě zadržovaným způsobem. Takovéto formulace jsou zvlášř vhodné pro nápravu kostních a chrupavkových defektů, ale mohou být také použity pro nápravu neuronových defektů nebo pro systemické dodávání .

Podstata vynálezu

Tohoto cíle se dosáhne farmaceutickou kompozicí ježkovitého proteinu, která je vyznačená tím, že ježkovitý pro- tein se váže k hydrofilnímu nosiči, který je biokompatibilní přičemž nosič je polymer, který

- váže ježkovitý protein jako negativně nabitý nosič jako výsledek iontových interakcí,

- nedenaturuje ježkovitý protein, když ho váže na nosič,

- nosič obsahuje alespoň 0,1 až 1, výhodně 0,1 až 2 negativně nabité zbytky na monomer za neutrálních podmínek,

- náboj je zprostředkován ve formě kyselých skupin jako jsou například sulfátové, karboxylové nebo fosfátové skupiny,

- a průměrná molekulová hmotnost nosiče ja alespoň 50 000 Da.

« *

Bylo překvapivě zjištěno, že ježkovité proteiny mohou být uvolňování reversibilne z nosiče in vivo v aktivní formě a zadržovaným způsobem bez vyvolání homogenních a/nebo zánětiivých reakcí in vivo, jestliže jsou vázány na negativně nabitou rozpustnou nebo nerozpustnou polymerní matrici.

Výhodně jse použije hydrofilní nosná matrice a zvlášt výhodně rozpustná nebo nerozpustná organická hydrofilní nosná matrice. Nosná matrice je zvlášt výhodně vytvořena z aniontového polysacharidu jako je výhodně hyaluronová kyselina {stejně jako její chemicky zesítěné formy) chondroitinsulfat, polyvinylsulfat, keratinsulfat, dextransulfat, pektin, karagenany a jiné hydrokoloidy, sulfatovaný alginat, dermatansulfat, alginat výhodně kalciumalginat nebo kombinace alespoň dvou takovýchto aniontových polysacharidů nebo kombinace těchto nabitých polysacharidu s jinými polymery jako je například kolagen,· kde hmotnostní procentáž polysacharidů je 10 až 50 %.

Nerozpustná matrice ve smyslu tohoto vynálezu znamená, že tato matrice se v podstatě nerozkládá nebo se viditelně nsrozpouští v pufrcvaném roztoku in vitro během 10 až 20 hodin při teplota místnosti. V tomto spojení je zvlášě výhodné, aby nosič, použitý podle tohoto vynálezu obsahoval méně než 50 %, výhodně méně než 20 % a zvlášt výhodně v podstatě žádné množství neutrálního polysacharidu. Hyaluronová kyselina s molekulovou hmotností alespoň 10° Dalton, zejména s molekulovou hmotností 4.10 Dalton, je zvlášt vhodná jako nosná matrice.

Při dalším provedení bylo zjištěno, že hydrofilní nosiče založené na anorganickém nerozpustném fosforečnanu jako je hydroxylapatit a trikalciumfosfat jsou taká vhodné podle tohoto vynálezu jako nerozpustná nosná matrice.

Zadržovaná uvolňování podle vynálezu se rozumí jako uvolňování ježkovitého proteinu ve farmakologický účinné dávce ♦ · · » · · · · po definovanou dobu alespoň 14 hodin. Farmakologický účinek se rozumí jako neurologický účinek na nervové buňky, chondrogenesi a/nebo chondrogenesní indukci a výhodně osteogenesi a/nebo osteoindukci jak popsal Kinto a j., FSBS Letters,

404 (1937) 319-3-23 pro kostní indukci, íliao a j. v J.iíeurosci. 17 (1997) 5891-5399 pro účinek na nervové buňky a Stott a j. v J. Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701 pro buněčnou indukci chrupavky.

Enzymaticky degradovatelný nosič se výhodně použije jako nosič, který může být degradován vylučovanými enzymy (například proteasami) buněk, na kterých se provádí lokální aplikace in vivo. Avšak poločas nosiče by měl být alespoň 12 hodin, ale může být několik týdnů. Jestliže je nosič vytvořen z pólysacharidu, tento nosič se výhodně degraduje glykosidasami a hydrolasami, které jsou přítomny v buňkách a vylučovány Takováto biodegrabilita nosiče však není nutná v každém případě. Jestliže:se uvolňování provádí pro léčení osteoporosy ne-, bo neuronálních poruch, biodegrabilita není nutná. Avšak takovéto nosiče jsou výhodně špatně rozpustné za fyziologických podmínek a tudíž jsou absorbovány tělem po relativně dlouhou dobu (několik týdnů až měsíců).

Roztoky ježkovitýčh proteinů o vysokých koncentra- . cích jsou nutné, aby se vytvořily nosné matrice, které jsou pokryty ježkovitými proteiny takovým způsobem, že vykazují odpovídající farmaceutickou účinnost, když se aplikují lokálně Bylo zjištěno, že nosiče pokrytéježkovitým proteinem, které mohou být použity farmaceuticky, by měly výhodně obsahovat koncentraci ježkovitěho proteinu 1 až 5 mg/ml, výhodně 3 mg/ml nosiče nebo více. Kosice jsou zvlášt výhodná, když obsahují ježkovitě proteiny v koncentraci 10 mg/ml nebo víca. Ješkovité proteiny jsou vnitřně špatně rozpustné.

Avšak bylo překvapivě zjištěno, že rozpustnost •0 0· ► 0 0 · » «0 0

000 000

- 7 4 0

00 0 0 I ješkovitých proteinů drasticky vzrůstá v roztocích, které obsahují arginin nebo argininové ionty (výhodně argininiumsulfat). Tudíž dalším předmětem vynálezu jsou vodné roztoky ježkovitých proteinů v koncentraci 3 mg/ml a více, které obsahují arginin a argininové ionty a jsou výhodně pufrovány. Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby nosné matrice pokryté ježkovitým proteinem, která je vyznačená tím, že se nosná matrice inkubuje roztokem ježkovitého proteinu v koncentraci 3 mg/ml který obsahuje arginin nebo argininové ionty a nosná matrice pokrytá tímto způsobem se isoluje. ''

Pro vytváření nosných matric jsou vhodné takové roztoky, které obsahují ješkovité proteiny ve farmaceuticky účinných koncentracích a jsou vhodné pro farmaceutickou aplikaci. Tudíž dalším předmětem vynálezu je nosná matrice, která obsahuje 3 mg ježkovitého proteinu nebo více, výhodně 10 mg nebo vícae na ml nosná matrice a arginin nebo argininové ionty. Koncentrace argininu je výhodně mezi 10 až 500 mmol/litr, výhodně. při pH v rozmezí mezi 5 až 8.. Ά

Aktivitou ve smyslu tohoto vynálezu se rozumí aktivita alkalické fosfatasy (stimulace exprese alkalické fosfátasy), kterou polypeptid může indukovat v savčích buňkách (aktivita při alkalické fosfatasové zkoušce). Pro toto se kultivuje myší mesench.ýmální buněčná linie v mediu, které obsahuje fetální telecí sérum. Poté se.přidá sterilně zfiltrovaný vzorek, buňky se lýzují po dobu asi 5 dní a alkalická fosfstasa se určí v buněčném lyzátu pomocí štěpení chromogenního substrátu . (pMP ,' p-nitrofenol ) (J.Asahina, Exp.Cell-Pes. 222 (1996) 33-47 a T.Nakamura (1997)).

Ježkovitý protein se rozumí podle vynálezu jako vylučovaný signální protein, který je odpovědný za tvorbu početných struktur při embryogenesi. Sonický indický nebo pouštní hh se zvlašt výhodně použije (Fietz 14., a j. Development (Suppl.) ¢1934), 43-51). hh protein se sekvencí jak je popsána v EMBL ·· »· « · · • · · · • ·♦# ··* • ·

Λλ ___ databázi pod číslem L38518 se výhodně použije.

Proteiny ježkovité rodiny vykazují významnou homologii v jejich aminokyselinové sekvenci, což je také výhodné pro expresi těch nukleových kyselin, které kódují ježkovité proteiny, které jsou z 80 % nebo více homologní s výše zmíněnou sekvencí sonického ježkovitého proteinu.

Lidský sonický ježkovitý prekursorový protein je tvořen z aminokyselin 1-452 sekvence popsané v SMSL databázi pod číslem L33518. Aminokyseliny 1-23 představují signální peptid, aminokyseliny 24-197 představují zralou signální doménu, aminokyseliny 32-197 představují signální doménu zkrácenou o 8 aminokyselin a aminokyseliny 198-462 představují autoprocesní doménu po autoproteolytickám štěpení.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu výhodně obsahuje další polymer, který v podstatě působí jako podpůrná strukturální látka, která má také výhodně adhesní funkci pro buňky, ale neváže se na ježkovité proteiny na základě ionto- vých interakcí. Výhodně tato látka je biodegradovatelný protein nebo hydrolytický decradační produkt, který může být použit například ve formě intaktních proteinových vláken jako solubilizovaný protein nebo jako částečně hydrolyzovatelný protein. Takováto podpůrná strukturální látka je výhodně kolagen, gelatin, elastin nebo fibrin.

Podpůrná strukturální látka je výhodně příťomna v menším množství než je množství popsaného hydrofilního biokompatibilního nosiče podle vynálezu. Podíl podpůrné strukturální látky je výhodně 30 % nebo méně výhodně 10 % nebo méně. Avšak podpůrná strukturální látka může být také přítomna v přebytku ve vztahu k hydrofilnímu nosiči. Jenom je třeba zajistit v tomto spojení, aby množství hydrofilního nosiče ve farmaceutické kompozici podle vynálezu bylo dostatečné vysoké k zajištění toho, že terapeuticky účinné množství ježkovitého proteinu

0 > 0« 0

I 0 0 t «·V «00

G. . ...

je vázáno k hydrofilnímu nosiči. Je tudíž výhodné použít alespoň pětinásobný přebytek hydrofilního nosiče ve vztahu k ježkovitému proteinu. Navíc vázání ježkovitého proteinu k nosiči pro přípravu farmaceutické směsi by mělo být prováděno při pil 4,5 nebo vyšší. Jak je výše uvedeno, bylo zjištěno, že ježkovité proteiny při pH pod 4,5 denaturují a vážou se ireversibilně k poteinovému nosnému kolagenu. Tudíž vázání ježkovitého proteinu k nosiči by.mělo být prováděno v neutrálním rozmezí oH. . . ....

Nosiče, které obsahují kromě hydrofilního nosiče další podpůrné strukturální sloučeniny, jsou například protein/polysacharid komplexy. Výhodné komplexy jsou popsány v US patentu 4 514 794.

Farmaceutická kompozice se připraví inkubací ježkovitého proteinu s hydrofilním nosičem při pH 4,5 nebo vyšším, výhodně pH v ineutrálním rozmezí (pH 6 až 8), čímž se provádí vázání ježkovitého proteinu k nosiči. Inkubace se provádí.výhodně v pufrovaném roztoku. Když se použije jako nosič matrice, která navíc obsahuje biodegradovatelný protein jako je kolagen, inkubace při pH 4,5 nebo vyšší zajistí prevenci ireversibilního vázání ježkovitého proteinu (který je při nižších hodnotách pIí denaturován) k biodegradovatelnému proteinu. Bylo zjištěno, ze za těchto podmínek žádné vázání nebo jen zanedbatelné vázání ježkovitého proteinu k biodegradovatelnému proteinu se vyskytuje pokud ježkovitý protein neobsahuje hydrofobní modifikaci a tak biodegradovatelný protein pouze působí jako podpůrná strukturální látka.

Hydrofobně modifikované (lipofilizované) ježkovité proteiny jsou ježkovité proteiny, které vykazují ve vztahu k nemodifikovaným hh proteinům (například rekombinantně produkovaných v prokaryotech) zvýšení povrchové hydrofobicity.

·» ·

X .1.0. ____

-- -- · - _L v k

4 *

>44

4 • 4

4«4

Stupeň lipofilisaee proteinu se měří integrací v liqidové vrstvě podle Haqeue, Z., a j., J.Agric.Food Chem.30 (1982), 481. Takto lipofilizované hh proteiny se vážou podle vynálezu k hydrofilnímu nosiči stejným způsobem jako nelipofilizované h’n proteiny, ale vážou se navíc k biodegradovatelnsmu proteinu pomocí hydrofohních interakcí.

Pro produkcí farmaceutické kompozice je dále výhodné přidat pomocné látky jako jsou cukry, mannitol, saóharosš, laktosa, glukosa, trehalosa, výhodně 20 až 100 mg/ml) nebo aminokyseliny jako je glycin nebo arginin, stejně jako antioxi danty jako je EDTA, citrát, polyethylenglykol (1-10 % hmotnost nich), detergenty, výhodně neiontové detergenty (výhodně 0,005 až 1 S hmotnostní) jako jsou polysorbaty (!ween^K20 nebo Tween 80) nebo polyoxyethyleny, protizánětlivé složky, lokální anestetika, antibiotika a/nebo stabilizátory jako jsou lipidy, mastné kyseliny a glycerol.

v dalším výhodném provedení farmaceutická kompozice ježkovitého proteinu podle vynálezu společně se suraminem je výhodná a to může být výhodně využito.

Farmaceutické kompozice mohou obsahovat další farmaceutické pomocné látky.

Ve výhodném provedení farmaceutická kompozice obsahuje jeěkovitý protein v koncentraci 0,1 až 100 mg/ml.

Ve výhodném, provedení farmaceutická kompozice dále obsahuje farmaceuticky akceptovatelný pufr, který je biokompatibilní, výhodně v rozmezí mezi pH 4 až pH 10, zvláší výhodně v rozmezí mezi pH 6 až 8, zejména při pH hodnotě asi 7. pH hodnota farmaceutické směsi by měla být účelně vyšší než pH 4, aby se zabránilo denaturaci a uvolnění zinku komplexně vázaného v ježkovitém proteinu.

· · · · *

II »99

9*99

Koncentrace puřru je výhodně 1 až 500 mmol/1, zejména 5 až 150 mmol/1 a zvlášť výhodně 10 až 100 mraol/1. Při vhodném provedení se použije jako pufr 20 mmol/1 draselnořosfatověho pufru, pl-l 7,2, nebo 100 mmol/1 arginincnloridu, pil 7,2.

Následující příklady publikace a výkresy dále vysvětlují vynález, jehož ochranný rozsah vyplývá z patentových nároků. Popsané způsoby jsou míněny jako příklady, které ještě dále popisují podstatu vynálezu dokonce za modifikacemi. ...

Stručný popisů výkresů

Obr. 1 uvolňování shh z kolagenové matrice in vitro obr. 2 uvolňování shh z alginatových pouzder in vitro obr. 3 uvolňování shh z gelů hyaluronové kyseliny in vitro cbr. 4 uvolňování shh z alginat/kolagen matrice in vitro.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Produkce alginatového gelu obsahujícího hh protein

Alikvot roztoku hh proteinu (1 mg/ml shh roztoku v 50 mg/ml sacharosy, 50 mí-I fosforečnanu draselného, pH 7,2) se míchá se zásobním roztokem Na alginatu (Pronova, Biopolymer, NO) (ve vodě, více než 0,1 %) takovým způsobem, že se vytvoří želatinózní alginatproteinová směs. Tento gel může být buá použit přímo jako injektovatelná matrice nebo dále zpracován na kalciumalginatová pouzdra nebo může být uložen jako lyofilizát.

· ·

- 12 • 00 *

000 ·

0 .

Příklad 2

Produkce směsi kolagenu obsahující hh protein (srovnávací příklad)

100 mikrol hh roztoku (1 mg/ml hh) v

a) 20 mil fosforečnanu draselného, pH 7,4 nebo

b) v 50 mři octanu sodného, pH 4,5 nebo

c) v 0,l%ní trifluoroctové kyselině, pH 2, se přidá po kapkách na kolagenové tampony (I-Ielistat, Integra Life Science, USA) o rozměru 10x10x5 mm. Naplněné nosiče se pak zmrazí (-70 °C), lyofilizují a analyzují.

Pro to jsou naplněné tampony inkubovány při 37 °C ve vhodném objemu v pufru (10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 150 mmol/1 HaCl, pH 7,2). Množství uvolněného hh se určuje pomocí RP-HPLC.

Příklad 3

3.1 Produkce Ca alginatových pouzder

Alginatový gel popsaný v příkladu 1, který obsahuje hh protein se přidá po kapkách do roztoku CaCl^ (asi 1,5 %) kontinuálně za míchání. Ca alginatcve komplexy se tvoří spontánně a obsahují protein. Rozměr pouzder, která jsou vytvořena, závisí na rozměru kapiček a může být podle potřeby měněn.

Po 5 až 10 minutové inkubaci v CaC^ roztoku se pouzdra odfiltrují a promyjí v pufru (20 mmol/1 fosforečnanu draselného, pH 7,2). Tato pouzdra mohou buč být použita přímo jako implantáty nebo mohou'být dále. zpracována lyofilizací.

3.2 Lyofilizace

Ca alginatová pouzdra se zmrazí při -70 °C a následně lyofilizují. Lyofilizace umožňuje stabilní uskladnění pouzder a dále usnadňuje implantaci, protože pouzdra jsou snadněji manipulovatelná v suchém stavu.

- ,13. -..

• fc · • · · * · · · · · * fc ··* ·· fc »··· fc · « fcfc · fc · ······ fcfc · fcfc·. . » ·· ··· «fc ·*·· fcfc fcfc

Příklad 4

Uvolňování shh in vitro

Analýza uvolňovací kinetiky in vitro ukazuje, Se shh se uvolňuje zadržovaným způsobem s Ca alginatových pouzder· po dobu alespoň 70 hodin (obr. 2), zatímco shh z kolagenové matrice se uvolní během několika až asi 20 minut (obr. 1).

Lyofilizované alginatové kuličky obsahující shh byly inkubovány při 37 °C v 10 mil fosforečnanu, draselného, 150 mM NaCl, ptl 7,2 (Potatherm) . Po 5 minutách, 1 hodině, 5 hod, 10 hod, dnu, 34 hodinách, 2 dnech, 3 dnech a 5 dnech byly odebírány vzorky a analýzovány na jejich obsah shh pomocí SDS polyakrylamidové elektroforézy (obr. 2). Kumulativní množství shh uvolněného z alginatových pouzder je vyneseno oproti času.

Zkouška uvolňovací kinetiky shh z 2,5%ních gelů kyseliny hyaluronové za použití druhů hyaluronové kyseliny s nízkou molekulovou hmotností (LřiW, molekulová hmotnost asi 1/3 x 10° Da) neboo vysoké molekulové hmotnosti (HMW, molekulová hmotnost asi 4 x 10“ Da) je uvedena v obr. 3. Pro tyto gely hyaluronové kyseliny naplněné shh se provede naplnění do dialýzních trubic (separacní rozměr 300 000 Da) a trubice se inkubují v PBS při teplotě 37 °C. Ve stanovených dobách se odebírají vzorky uvolňovacího media a analýzují na obsah shh pomocí reversně fázové HPLC. Je zřejmé, že část uloženého ježkovitého proteinu se uvolňuje zadržovaným způsobem. Další část proteinu zůstává vázaná k hyaluronové kyselině a mohla by být uvolněna in.vivo degradací hyaluronové kyseliny.

Zkouška uvolňovací kinetiky shh z kolagenalginatové ϊίΊ matrice (Fibracol· \ viz US patent 4 614 794) je znázorněna v obr. 4. Pro tento účel Fibracolové tampony (1x1x0,3 cm) byly naplněny 0,2 mg shh v PBS. Naplněné tampony byly zmrazený (-70 °C), lyofilizovány a inkubovány ve vhodném objemu PBS při teplotě 37 °C. Ve stanovených časech byly odebírány vzorky

- '14' -

·· ·	« · · «	• ·
• · ·	• · · · ·	• *
• t ·	* ·. ·	•
·· ···	♦ · · ·· ·	99

β · uvolňovacího media a analyzovány na obsah shh pomocí reversně fázové HPLC. Je zřejmé, že pouze asi 10 až 20 % naplněných jež kovitých proteinů se uvolňuje do media a že hlavní část zůstává vázaná ke kolagenalginatové matrici. Tato část může být uvolněna in vivo degradací matrice.

Seznam odkazů

Hague,

Hyneš,

Asahina, J., Exp.Cell.Res. 222 (1996) 38-47 Bitgood, ki.J. a j., Curr. Biol. 6 (1995) 296 Chiang, C., a j., Hature 83 (1996) 407 Crey, C.J. a j., Eiotechnol. Bioeng. 31 (1938) 607-612 Downs, E.C. a j., J. Cellular Physiology 152 (1992) 422-429 Fietz, M. a j., Development (Suppl) (1994) 43-51 Z. a j., J.Agric.Food Chem. 30 (1982) 481 M. a j., Neuron 15 (1995) 35-44

Karablis a j., Genes and Development 3 (1994) 277-289 Kikuchi, A. a i., J. Controlled Release 47 (1997) 21-29 Kinto. a j., FEBS Letters, 404 (1997).319-323 Lai, C.J. a j., Development 121 (1995) 2349 Lopez-Martinez a j., Curr. Biol. 5 (1995) 791-796 Marti a j., Nátuře 375 (1995) 322-325 í-íiao a j., J. Keurosci. 17 (1997) 5891-5899

Nakamura, T. a j., Biocham.Biophys.Res.Comra.237(1997) 4465-469

Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517-520

Porter, J.A. a j., Science 274 (1995) 255-259

Robinson, C.J. a j. Trends in Biotechnology 14 (1996) 451-452

Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193-196

Stott a j., J.Cell Sci. 110 (.1997) 2691-2701'

U.S. patent 4 614 794

Vortkamp, A. a j., Science 273 (1996) 613

MO 90/08551

Yang a j., Development 124 (1997) 4393-4404.

-'15 • 4 * 4 4 4 4 · 444444 ♦ .. 4 · 4 4... 4 .... 4 «44 4· 4444 «I

Claims (14)

1. Farmaceutická kompozice ježkovitého proteinu vyznačená tím, že ježkovitý protein je vázán k hydrofilnimu nosiči, který je biokompatibilní, přičemž tento nosič je polymer , který váže ježkovitý protein jako negativně nabitý nosič jako výsledek iontových interakcí, nedochází k denaturaci ježkovitého proteinu, když se váže na nosič, obsahuje alespoň 0,1 až 2 negativně nabitá zbytky na monomer za neutrálních podmínek, obsahuje náboj ve formě kyselých skupin, má průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 50 000 Da a je prost agarosy.

2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 vyznačená tím, že nosič je tvořen z organické hydrofilní nosné matrice nebo z anorganického nerozpustného fosforečnanu.

3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že nosič je vytvořen z aniontového polysacharidu nebo anorganického nerozpustného fosforečnanu.

4. Farmaceutická kompozice podle nároků 1 až 3 vyznačená tím, že hydrofilním nosičem je hyaluronová-kyselina .·

5. Farmaceutická kompozice podle nároků 1 až 4 vyznačená tím, Že obsahuje ježkovitý protein v koncentraci 0,1 až 100 mg/ml.

G. Farmaceutická kompozice podle nároků 1 až 5 vyznačená tím, že je pufrována v rozmezí mezi pH 4 až 10.

7. Farmaceutická kompozice podle nároků 1 až 6 vyznačená tím, že obsahuje arginin nebo argininové ionty.

8. Způsob výroby farmaceutické kompozice vyznačený tím, že zahrnuje ješkovitý protein, který je vázán k hydrofilnímu nosiči, který je biokompatibilní, přičemž nosič je polymer, který váže ješkovitý protein jako negativně nabitý nosič jako výsledek. iontových interakcí, nedenaturuje ješkovitý protein když se váže k nosiči, obsahuje alespoň 0,1 až 2 negativně nabité zbytky na monomer za neutrálních podmínek, obsahuje náboj ve formě kyselých skupin, má průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 50 000 Da a je prost agarosy, přičemž ješkovitý protein ve farmaceuticky účinném množství se použije jako základní komponenta tohoto prostředku.

9. Způsob podle nároku 8 vyznačený tím, že ješkovitý protein se použije v koncentraci 0,1 až 100 mg/ml.

10. Způsob zadržovaného uvolňování ješkovitého proteinu v lidském těle vyznačený tím, že ješkovitý protein se aplikuje lokálně v lidském těle ve farmaceutické kompozici podle nároku 1 až 6.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačený tím, že ješkovitý protein se aplikuje v koncentraci· 0,1 až 100 mg/ml..

12. Způsob podle nároků 8 až 11 vyznačený tím, še hydrofilním nosičem je hyaluronová kyselina.·

13. Způsob podle nároků 8 až 12 vyznačený tím, že vázání ježkovitého proteinu k hydrofilnímu nosiči se provádí inkubací při pH 4,5 nebo vyšším.

14. Nerozpustná nosná matrice vyznačená tím, že obsahuje alespoň 3 mg ježkovitého proteinu a alespoň 10 mmol na 1 argininu nebo argininových iontů na ml nosné matrice.

13. Způsob výroby nerozpustné nosné matrice, která obsahuje ježkovitý protein, vyznačený tím, že nosná matrice se inkubuje roztokem obsahujícím ježkovitý protein v koncentraci alespoň 3 mg/ml a arginin nebo argininové ionty v koncentraci alespoň 10 mmol/1 a nosná matrice pokrytá tímto způsobem se izoluje.

15. Způsob podle nároku 15 vyznačený tím, že vázání ježkovitého proteinu k hydrofilnímu nosiči se provádí inkubací při pil alespoň 4,5.

Zastupuje: JUDr. Ing. Milan Hořejš _Φ_ρΗ t_t2 _B_pH 4,5 0,1% TFA

Obr. 2

1/2