DE60002448T2

DE60002448T2 - Antibakterielle wässerige ophtalmische Formulierungen mit Ofloxacin und Chitosan

Info

Publication number: DE60002448T2
Application number: DE60002448T
Authority: DE
Inventors: Robert Gurny; Olivia Mireille Felt
Original assignee: Laboratoire Medidom SA
Current assignee: Laboratoire Medidom SA
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2020-05-27
Also published as: PL201564B1; CA2346631C; EP1157688A1; CZ299195B6; ES2195819T3; PT1157688E; US20020002148A1; CA2346631A1; US6589999B2; PL347735A1; ATE238767T1; EP1157688B1; BR0102138B1; CZ20011784A3; BR0102138A; DE60002448D1; DK1157688T3

Description

Die Erfindung betrifft eine antibakterielle wäßrige ophthalmische Formulierung, welche Ofloxacin als einen Wirkstoff enthält, und die Verwendung von Chitosan zum Solubilisieren von in einem wäßrigen Medium suspendierten Ofloxacin.
Ofloxacin [d. h. racemische (±)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure], zuerst offenbart von Daiichi Seiaku CO., LTD., in der EP-A-0 047 005, ist bekanntermaßen ein augezeichnetes antibakterielles Mittel, welches gegen ein breites Spektrum von grampositiven und gramnegativen Organismen wirksam ist.
Die hohe antibakterielle Wirkung von Ofloxacin ist durch seine potenten inhibitorischen Aktivitäten gegen DNA-Gyrase in bakteriellen Zellen erklärt worden (Sato K., Inoue Y, Fuj ii, T, Aoyama H, Mitsuhashi S, Infection 1986, 14 Suppl. 4: 5226–30).
Es ist offenbart worden, daß Ofloxacin zur Behandlung einer breiten Vielzahl von bakteriellen Augeninfektionen durch topische Verabreichung nützlich ist.
Wegen der schlechten Löslichkeit von Ofloxacin, welche nicht höher als 3,23 mg/ml bei pH 7,0 ist [Ross et al., Int. J. Pharm., 63: 237–250 (1990)], trifft die Verwendung von Ofloxacin in ophthalmischen Formulierungen jedoch auf einige Probleme.
In ophthalmischen Formulierungen wird die Löslichkeit von Ofloxacin bekanntermaßen durch Einschließen von Zusatzstoffen, insbesondere Tensiden, erhöht.
Allerdings ist es bekannt, daß Tenside Hornhautschäden verursachen, wenn sie während einer längeren Dauer verwendet werden.
Die Löslichkeit von Ofloxacin ist von Ross et al., Int. J. Pharm., 63: 237–250 (1990) als 95,4 mg/ml bei einem pH-Wert von 5,0 offenbart worden, und es ist ferner bekannt, daß die Löslichkeit von Ofloxacin durch Absenken des pH-Wertes der wäßrigen Formulierung auf einen pH nahe bei 5,0, insbesondere mit Chlorwasserstoffsäure, erhöht werden kann.
Die EP-A-O 275 515 offenbart eine wäßrige pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Infektionen in Form von Augentropfen, umfassend eine wirksame Menge von S-Ofloxacin (Levofloxacin), von welchem behauptet wird die aktive und löslichere Form von Ofloxacin zu sein, und ein wäßriges Vehikel, wie Wasser, worin Zusatzstoffe eingebracht werden können, wie Tenside, Stabilisatoren, Solubilisatoren, pH-Einstellmittel und so weiter. Das Herstellungsbeispiel von Augentropfen erwähnt insbesondere die Verwendung von Benzalkoniumchlorid als Stabilisator und Natriumchlorid, Natriumhydroxid und Chlorwasserstoffsäure als Zusatzstoffe.
Ein existierendes Collyrium, welches beispielsweise in der Schweiz unter dem Namen Floxal® vertrieben und von Chauvin, Montpellier, Frankreich, bereitgestellt wird, wird in der Form einer Lösung präsentiert, welche 0,3% Ofloxacin, Benzalkoniumchlorid und unspezifizierte Collyrium-Additive enthält.
Die EP-A-O 274 714 offenbart eine Augensalbe für die Behandlung von infektiösen Augenerkrankungen in der Form eines Hydrogels, enthaltend Ofloxacin als Wirkstoff und Carboxymethylcellulose als gelbildendes Mittel. Die Herstellung der Salbe erfordert einen Schritt der Einstellung des pH-Wertes einer Lösung, enthaltend Ofloxacin, auf einen Wert von 5,0 bis 5,5 mit wäßriger Chlorwasserstofflösung und wäßriger Natriumhydroxidlösung.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine wäßrige ophthalmische Formulierung, welche Ofloxacin enthält, zur Heilung von Infektionen, ohne Probleme der Toleranz sogar bei längerer Anwendung, bereitzustellen, welche keine Tenside enthält und welche die Schritte des Einstellens und Überprüfens des pH-Wertes während der Herstellung der Formulierung vermeidet.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung eines Chitosans mit einem Deacetylierungsgrad von 30–90% zur Solubilisierung von Ofloxacin, welches in einem wäßrigen Medium mit einem im wesentlichen neutralen pH-Wert suspendiert ist, vorzusehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind diese Ziele als ein Ergebnis der überraschenden Feststellung erreicht worden, daß die Zugabe eines Chitosans in eine Ofloxacin-enthaltende wäßrige Lösung Ofloxacin in optimaler Weise solubilisiert.
Chitosan ist als Chitinderivat bekannt, erhalten durch teilweise bis wesentliche Deacetylierung von Chitin, das auch Poly(N-acetyl-D-glucosamin) genannt wird, welches ein natürlich vorkommendes Biopolymer ist, das in Schalentieren gefunden wird.
Chitosan enthält freie Amingruppen (-NH₂) und kann als der Anteil von N-Acetyl-Dglucosamin-Einheiten und D-Glucosamin-Einheiten gekennzeichnet werden, und wird somit als der Grad an Deacetylierung des vollständig acetylierten Polymers Chitin ausgedrückt.
Die US-A-S 422 116 offenbart, daß Chitosan mit einem Deacetylierungsgrad von 60 bis 99% nützlich zur Herstellung eines flüssigen ophthalmischen wäßrigen Abgabesystems mit verzögerter Freisetzung ist, welches eine langsame und verzögerte Freisetzung der darin eingebrachten Behandlungsmittel an das Auge vorsieht.
In dem Artikel "DATABASE CHEMABS [Online] CHEMICAL ABSTRACTS SERVICE, COLUMBUS, OHIO, US; LI PING et al.: "The preparation of ofloxacin and chitosan eye drops", entnommen aus STN-Datenbank-Zugangs-Nr. 132: 98024 CA XP002150994 & ZHONGGUO SHENGHUA YAOWU ZAZHI (1999), 20(2), 68–69", wird eine Augentropfen-Formulierung, welche Ofloxacin und Chitosan umfaßt, beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung enthält eine wäßrige ophthalmische Formulierung für die Behandlung und Prävention von Infektionen Ofloxacin als aktiven Bestandteil und ein Chitosan mit einem Deacetylierungsgrad von 30–90% und einem Molekulargewicht von 500 000–5 000 000 Da als Solubilisierungsmittel von Ofloxacin.
Die vorliegende Erfindung sieht eine wäßrige ophthalmische Formulierung vor, enthaltend Ofloxacin und Chitosan ohne weiteren Zusatz von Tensiden oder anderen Solubilisierungsmitteln oder anderen Zusatzstoffen, wie pH-Einstellmitteln, welche Augeninfektionen heilen kann, welche ohne Probleme hinsichtlich der Toleranz sogar während einer längeren Behandlung verwendet werden kann, und welche gleichzeitig eine erhöhte lachrymale bzw. Tränen-Verfügbarkeit und eine erhöhte Dauer der Wirksamkeit in Bezug auf eine kommerzielle Lösung, welche Ofloxacin enthält, aufzeigt.
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung aufgeführt.
Ofloxacin, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann kommerziell erhältlich sein (zum Beispiel von Sigma, Buchs, Schweiz) oder kann gemäß verschiedenen bekannten synthetischen Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Verfahren, offenbart von Daiichi Seiaku CO., LTD., in der EP-A-O 047 005.
Das Ofloxacin kann entweder in der Racemat-Form oder in der Form seines aktiven S-Isomers [S-(-)-9-Fluor-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo-2,3-dihydro-7Hpyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazin-6-carbonsäure] vorliegen.
Die wäßrige ophthalmische Formulierung der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise 0,1 bis 0,5% w/v Ofloxacin, basierend auf der gesamten wäßrigen ophthalmischen Formulierung.
Eine wäßrige ophthalmische Formulierung mit einem Gehalt an Ofloxacin von weniger als 0,1 % w/v ist nicht vorteilhaft, weil der antibakterielle Effekt unbedeutend wird.
Eine wäßrige ophthalmische Formulierung mit einem Gehalt an Ofloxacin, der höher als 0,5 % w/v ist, ist nicht vorteilhaft, weil die Gegenwart von Ofloxacin bei diesen Konzentrationen unerwünschte Nebenwirkungen, wie Reizung und Intoleranz hervorrufen kann.
Vorzugsweise ist das Ofloxacin in einer Menge von 0,3–0,5% w/v, und weiter bevorzugt in einer Menge von 0,3%, bezogen auf die gesamte wäßrige ophthalmische Formulierung, enthalten.
Chitosane, welche in der wäßrigen ophthalmischen Formulierung der vorliegenden Erfindung enthalten sind, besitzen ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 500 000–5 000 000 Dalton und einen Deacetylierungsgrad von 30–90%.
Es ist zu beachten, daß in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen der Begriff Chitosan indifferent ein Chitosansalz oder eine Chitosanbase bedeutet.
Chitosansalz bedeutet ein Chitosan, welches Ammoniumgruppen -(NH₃ ⁺)- mit entsprechenden Gegenionen (X^–) anstelle von freien Amingruppen (-NH₂) enthält.
Ein Deacetylierungsgrad von 30–90% bedeutet, daß das Chitosan 30–90% an D-Glucosamineinheiten oder D-Glucosammonium-Salzeinheiten bzw. 70–10% N-Acetyl-D-glycosamineinheiten umfaßt.
Chitosan, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist im Handel erhältlich oder kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das auf der Deacetylierung von Chitin bis zum gewünschten Deacetylierungsgrad basiert, z. B. wie beschrieben von Roberts, G. A. F., in "Chitin chemistry", Mc Millan Press LTD., Houndmills, S. 64–82 (1992), um ein Chitosan zu erhalten, welches freie Amingruppen einschließt.
Kommerzielle Quellen von Chitosan sind beispielsweise Pronova® Biopolymer, Drammen, Norwegen; Vanson Company, Redmond, Washington, USA; Nova Chem. Limited, Armdale, Halifax, Nova Scotia, Kanada; Biosynth A. G., Staad, Schweiz; Biopolymer Engineering, Inc., St-Paul, Minnesota, USA.
Das gewichtsmittlere Molekulargewicht von in der vorliegenden Erfindung verwendetem Chitosan kann durch Größenausschlußchromatographie, wie hierin nachstehend erwähnt, bestimmt werden.
Chitosane mit einem niedrigeren gewichtsmittleren Molekulargewicht als 500 000 Dalton sind für die Verwendung in wäßrigen ophthalmischen Formulierungen nicht angemessen, weil sie zu Formulierungen mit ungenügender biologischer Verfügbarkeit und schlechter Verweildauer des Ofloxacins im Auge führen würden.
Chitosane mit gewichtsmittleren Molekulargewichten über 5 000 000 Dalton sind für die Verwendung in wäßrigen ophthalmischen Formulierungen nicht passend, weil sie hohe Herstellungskosten mit sich bringen und weil sie des weiteren sehr steife Gele bilden, welche nicht einfach und reproduzierbar topisch verwendet werden können.
Vorzugsweise besitzen die in der wäßrigen ophthalmischen Formulierung der vorliegenden Erfindung enthaltenen Chitosane ein Molekulargewicht von 1 000 000–2 000 000 Dalton.
Bei Verwendung in anderen Anwendungen zur Solubilisierung von Ofloxacin, welches in einem wäßrigen Medium mit einem im wesentlichen neutralen pH-Wert suspendiert ist, kann jedoch Chitosan mit einem beliebigen gewichtsmittleren Molekulargewicht verwendet werden, weil niedermolekulargewichtige Chitosane hinsichtlich der Solubilisierungskapazität einen identischen Effekt ausüben, wie hochmolekulargewichtige Chitosane.
Der Deacetylierungsgrad von Chitosan kann durch ein spektrophotometrisches Verfahren bestimmt werden, wie beschrieben in der Literatur von Muzarelli, R. A. und Ricchetti, R., in Carbohydr. Polym. 5, S. 461–472, 1985, oder Muzarelli, R. A. und Richetti, R., in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, S. 385–388, 1986.
Chitosane mit einem niedrigeren Deacetylierungsgrad als 30% sind in der vorliegenden Erfindung nicht geeignet, weil die Anzahl von bei physiologischem pH ionisierbaren Amingruppen ungenügend ist. Falls dies der Fall ist, wird die ionische Wechselwirkung zwischen Chitosan und dem Mucus bzw. dem Schleim einerseits und zwischen Chitosan und Ofloxacin andererseits beträchtlich verringert, wodurch die mittlere Verweilzeit der Formulierung sowie ihre pharmakokinetischen Leistungen vemindert werden.
Chitosane mit einem höheren Deacetylierungsgrad als 90% sind in der vorliegenden Erfindung nicht geeignet, weil die Löslichkeit des Polysaccharids vermindert wird, wenn der Deacetylierungsgrad erhöht wird.
Vorzugsweise besitzt in der vorliegenden Erfindung verwendetes Chitosan einen niedrigeren Deacetylierungsgrad als 60%.
Vorzugsweise umfaßt die wäßrige ophthalmische Formulierung der vorliegenden Erfindung 0,1 bis 3% w/v Chitosan.
Eine wäßrige ophthalmische Formulierung mit einem Gehalt an Chitosan, der geringer als 0,1 % w/v ist, ist nicht vorteilhaft, weil bei diesen Konzentrationen die Verweildauer nicht signifikant verlängert wird.
Eine wäßrige ophthalmische Formulierung mit einem Gehalt an Chitosan von mehr als 3% w/v ist nicht vorteilhaft, weil die Gegenwart von Chitosan bei diesen Konzentrationen Unbehagen verursachen kann. Auch kann die Viskosität der Formulierung zu hoch sein, um eine einfache und wiederholbare Verabreichung zu gestatten.
Vorzugsweise wird Chitosan in einer Menge von 0,1–1,5% w/v, und weiter bevorzugt in einer Menge von 0,5% w/v, basierend auf der gesamten wäßrigen ophthalmischen Formulierung verwendet.
Vorzugsweise sollte die wäßrige ophthalmische Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Viskosität von nicht höher als 600 mPa·s aufweisen.
Eine Formulierung mit einer höheren Viskosität als 600 mPa·s ist nicht vorteilhaft, weil sie ein steifes Gel bildet, welches nicht leicht topisch aufzutragen ist.
Für den Zweck der Erfindung wird die Konzentration an Chitosan in der wäßrigen ophthalmischen Formulierung der vorliegenden Erfindung eingestellt, um die biologische Verfügbarkeit und präcorneale Verweildauer von Ofloxacin zu optimieren.
Die wäßrige ophthalmische Formulierung der vorliegenden Erfindung kann gemäß herkömmlichen Techniken, beispielsweise wie folgend, hergestellt werden.
Chitosansalz wird in einem Phosphatpuffer (PBS), pH 7,4, gelöst. Getrennt davon, wird Ofloxacin in einem Phosphatpuffer (PBS), pH 7,4, suspendiert. Nach vollständigem Auflösen von Chitosan wird die Chitosanlösung in die Suspension, welche Ofloxacin enthält, gegeben, um die letztendliche Formulierung zu erhalten, worin Ofloxacin solubilisiert ist.
Wenn Chitosan-Base verwendet wird, sollte sie zuvor in einer kleinen Menge von 1 %iger Essigsäure gequollen werden, bevor sie in PBS, pH 7,4, gelöst wird.
Ofloxacin, welches in PBS, pH 7,4, unlöslich war, wird aufgrund des Vorhandenseins von Chitosan löslich.
Die so erhaltene wäßrige ophthalmische Formulierung besitzt einen pH-Wert von 5,5 bis 6,5 und eine Osmolalität von 240–340 mosm/kg, wodurch eine physiologische Akzeptanz vorgesehen wird.
Somit wird die Solubilisierung von Ofloxacin in einem einzelnen Schritt durchgeführt, was einen großen Vorteil bei der Herstellung der wäßrigen ophthalmischen Formulierung der vorliegenden Erfindung repräsentiert.
Die wäßrige ophthalmische Formulierung der vorliegenden Erfindung kann entweder in Einfachdosis-Einheiten oder in Mehrfachdosisbehältern abgepackt werden.
Die wäßrige ophthalmische Formulierung kann durch Eintröpfeln in das Auge in einer zweckdienlichen Tropfenform verabreicht werden.
Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich zur Behandlung oder Verhinderung von bakteriellen Infektionen des vorderen Segments des Auges und einer verwandten Struktur, wie Conjunctivitis, Blepharitis, Blepharoconjunctivitis, Keratitis und Keratoconjunctivitis.
Die nachstehenden Beispiele werden die vorliegende Erfindung veranschaulichen.
Beispiele
Um die Vorteile der wäßrigen ophthalmischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, sind verschiedene Formulierungen, enthaltend 0,3% Ofloxacin und verschiedenartige Chitosane, hinsichtlich der Verfügbarkeit von Ofloxacin in der Tränenflüssigkeit und hinsichtlich der Wirkungsdauer getestet worden.
Materialien verwendet zur Herstellung von Formulierungen, die getestet werden sollen Eine kommerzielle ophthalmische Formulierung, enthaltend 0,3% Ofloxacin, welche in den Tests als eine Vergleichsformulierung verwendet wurde, ist Floxal®, im Handel erhältlich von Chauvin (Montpellier, Frankreich).
Zur Herstellung wäßriger ophthalmischer Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung und einer Vergleichs-Formulierung verwendetes Ofloxacin ist Ofloxacin von Sigma (Buchs, Schweiz).

Zur Herstellung der Vergleichsformulierung verwendetes Chitosan ist:

UPCI 110:

Chitosanhydrochlorid von hohem Reinheitsgrad (bereitgestellt von Pronova Biopolymer (Oslo, Norwegen)) mit einem Deacetylierungsgrad von 87% und einem Molekulargewicht von 160 000 Dalton.

Zur Herstellung von Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzte Chitosane sind:

UPG 210:	Chitosanglutamat von hohem Reinheitsgrad (bereitgestellt von Pronova Biopolymer (Oslo, Norwegen)) mit einem Deacetylierungsgrad von 83% und einem Molekulargewicht von 580 000 Dalton.
CHITO-1:	Chitosanbase (bereitgestellt von Ciba Vision® (Duluth, Georgia, USA)) mit einem Deacetylierungsgrad von 53% und einem Molekulargewicht von 1 350 000 Dalton.
CHITO-2:	Chitosanbase (bereitgestellt von Ciba Vision® (Duluth, Georgia, USA)) mit einem Deacetylierungsgrad von 59% und einem Molekulargewicht von 1 930 000 Dalton.

Der Deacetylierungsgrad von jedem obenstehenden Chitosan ist vom Hersteller vorgesehen worden, und wurde durch UV-Spektrophotometrie gemäß des Verfahrens bestätigt, welches in der Literatur von Muzarelli, R. A., und Ricchetti, R., in Carbohydr. Polym. 5, S. 461–472, 1985 oder Muzarelli, R. A., und Richetti, R., in "Chitin in Nature and Technology", Plenum Press, S. 385–388, 1986, beschrieben wurde.
Das Molekulargewicht jedes Chitosans, wie obenstehend berichtet, ist durch Größenausschlußchromatographie mit einer Waters 600 E-Vorrichtung, kombiniert mit einem automatischen Probennehmer bzw. Autosampler (Waters TM17plus) und einem Waters 410 Differential-Refraktometer bestimmt worden. Die Analysebedingungen waren die folgenden:

– Säule: Serie von 4 Ultrahydrogel^®-Säulen (7,8 × 300)
– Temperatur: 30°C
– Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min
– Elutionsmittel: Acetatpuffer pH 4,2
– Standard: Pullulan

Eine 0,1%ige Lösung von Chitosan in Acetatpuffer, pH 7,4, wurde fünfmal injiziert.
Rheologische Messungen sind mit einem Bohlin-Rheometer CS vorgenommen worden, welches mit einem Temperaturregelsystem (CS ETO) ausgestattet war. Daten wurden unter den folgenden Bedingungen erhalten:

– Temperatur: 25°C
– Messsystem: Konus-Platte 4/40 LS
– Scherbelastung: 5,97E-2 Pa
– Oszillationstest

Die rheologische Auswertung, wie berichtet in der folgenden Tabelle 1, ist bei einer Konzentration von 1,5% in einem Phosphatpuffer, pH 7,4, für UPCI 110 und UPG 210, und bei einer Konzentration von 0,5% in 1%iger Essigsäure für CHITO-1 und CHITO-2 getestet worden.
Die Phosphatpufferlösung (PBS) pH 7,4, welche zur Herstellung von Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung und Vergleichsformulierungen verwendet wurde, wird wie folgend hergestellt. Natriumchlorid (8,5 g), Natriumhydrogenphosphat (280 mg) und Natriumdihydrogenphosphat (40 mg) wurden in destilliertem Wasser (1 Liter) gelöst. Die Lösung wird dann durch Autoklavieren während 15 Minuten bei 121°C gemäß den Anforderungen der Europäischen Pharmakopoe (Arzneibuch) sterilisiert.
Herstellung der zu testenden Formulierungen
Chitosan wird in einer angemessenen Menge für eine Konzentration von 1,5% w/v oder 0,5 % w/v in der Endformulierung bei Raumtemperatur unter magnetischem Rühren in isokryoskopischer steriler Phosphatpufferlösung (PBS) bei pH 7,4 gelöst.
Getrennt davon wird Ofloxacin, in einer angemessenen Menge für einer Konzentration von 0,3% in der Endformulierung, in isokryoskopischer steriler Phosphatpufferlösung (PBS) bei pH 7,4 suspendiert.
Nach der vollständigen Auflösung von Chitosan (etwa 1–2 Tage für Chitosan mit einem Molekulargewicht höher als 1 000 000 Dalton) wird die Lösung von Chitosan unter Magnetrühren in die Ofloxacin-enthaltende Suspension gegossen. Falls erforderlich wurde PBS, pH 7,4, zugesetzt, um das Volumen zu vervollständigen.
Nach wenigen Minuten wird Ofloxacin, welches in PBS, pH 7,4 nicht löslich war, aufgrund der Gegenwart von Chitosan löslich, und die zu testende Formulierung wird erhalten.
Es wird angenommen, daß dieses Solubilisierungsphänomen auf der Tatsache beruht, daß die wäßrige Lösung von Chitosan einen pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 6,5 aufweist.
Somit würde die Löslichkeit von Ofloxacin durch Verringern des pH-Wertes der Lösung von 7,4 auf 5,5–6,5 erhöht werden.
Formulierungen, welche wie obenstehend hergestellt und den nachstehenden Tests unterzogen wurden, sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt, worin es sich bei der Kontrolle um Floxal^® handelt, Comp. 1 eine Vergleichsformulierung ist und die Formulierungen 1, 2 und 3 Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
Tabelle 1
Es ist zu bemerken, daß Formulierungen mit CHITO-1 und CHITO-2 bei höheren Konzentrationen als 0,5% w/v nicht getestet wurden, da sie zur Bildung von Hydrogelen einer zu hohen Viskosität, um einfach und reproduzierbar auf das Auge angewandt zu werden, führen.
Pharmakokinetische Auswertung von Ofloxacin enthaltenden Formulierungen
Experimentelles Protokoll
Männliche New Zealand-Albinokaninchen mit einem Gewicht von ungefähr 4–5 kg und frei von jeglichem Augenschaden wurden über die gesamte Untersuchung hinweg verwendet, wie es vom örtlichen Ethik-Kommitee für Tierversuche zugelassen ist.
Ein Volumen von 25 μl der zu testenden Formulierung wurde durch Eintröpfeln auf die Hornhaut eines unbetäubten Tieres unter Verwendung einer einstellbaren Mikropipette, Assipettor-Digital® (Assistent, Deutschland) verabreicht.
Tränenproben wurden 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 45 und 60 Minuten nach der Einträufelung unter Verwendung von 2,0 μl großen kalibrierten Glaskapillaren (Microcaps Drummond®, Thomas Scientific^TM, Swedesboro, NJ, USA) entnommen. Die Proben wurden bei –25°C für die weitere Analyse von Arzneistoffkonzentrationen in den Tränen eingefroren.
Jede Formulierung wurde bei sechs Kaninchen getestet.
Bestimmung der Ofloxacinkonzentration in Tränen unter Anwendung von Kapillarelektrophorese
Die Bestimmung von Ofloxacin in Tränen wurde auf einem HP^3DCE-System (Hewlett-Packard, Wilmington, DE, USA) durchgeführt, wie früher beschrieben [V. Baeyens, E. Varesio, J. L. Veuthey et al., "Determination of dexamethassone in tears by capillary electrophoresis"; J. Chrom. B. 1997; 222–226].
Das System besteht aus einer Kapillarelektrophoreseeinheit, ausgerüstet mit einem Dioden-Array-Detektor (DAD), einem automatischen Probennehmer bzw. Autosampler und einer luftgekühlten Hochgeschwindigkeits-Kapillarkassette.
Für die Instrument-Steuerung, Datenerfassung und Datenanalyse wurde die HP3D-Chemstation-Software eingesetzt.
Hewlett-Packard-Kapillaren mit 50 μm Innendurchmesser (I. D.) (375 μm O. D.), 64,5 cm Gesamtlänge (56 cm vom Einlaß zum Detektorfenster) wurden für alle Experimente verwendet. Diese Kapillaren waren aus Quarzglas hergestellt und mit einem Detektionsfenster von vergrößerter Pfadlänge von 150 μm I. D. ("Blasenzelle") ausgestattet. Neue Kapillaren wurden 3 Minuten lang mit 1 M NaOH, gefolgt von 5 Minuten mit 0,1 M NaOH und schließlich 10 Minuten mit Wasser gespült. Nach jedem Durchlauf wurden die Kapillaren mit Wasser, 2 Minuten mit 0,1 M Natriumdodecylsulfat, dann 2 Minuten mit Wasser und schließlich 4 Minuten mit der Trennungspufferlösung gespült. Die für die Auftrennung verwendete 100 mM Phosphatpufferlösung wurde hergestellt, wie in Ph. Helv. VII beschrieben, durch Lösen von 6,75 g KH₂PO₄ in 500 ml Wasser unter Erhalt eines pH-Wertes von 4,5.
Die Herstellung von Tränenproben wurde wie folgend ausgeführt.
Ein Mikrogefäß (Hewlett-Packard, Waldbronn, Germany) wurde mit 18 μl Wasser, enthaltend lediglich 10% (v/v) Trennungspuffer, gefüllt, um die Empfindlichkeit durch ein "Stacking"-Verfahren zu verstärken, und 10 μg·ml^–1 Imipramin-HCl wurde als interner Standard verwendet. Dann wurde eine Tränenprobe von 2 μl, entnommen mit der Glaskapillare, unter einem sanften Stickstoffstrom in das Mikrogefäß eingeblasen. Das Gefäß wurde schließlich 5 Minuten lang bei 10 000 U/min (Avanti^TM 30 Zentrifuge, Beckman) vor der Injektion zentrifugiert.
Proben (24 nl) wurden unter Druck (5kPa während 20 s) injiziert, und die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 20 kV (310 V cm^–1) nach einem 1 min. Rampenschritt zur Vermeidung von Probenverlust bei der Injektion durchgeführt [K. D. Altria; "Main component assay of pharmaceutical by capillary electrophoresis: Considerations regarding precision, accuracy, and linearity data"; J. Capill. Electrophor. 1996; 3; 13]. Die Kapillare wurde thermostatisch bei 25°C gehalten, und der Nachweis erfolgte unter Verwendung des DAD (Abtastung von 190 nm bis 600 nm).
Elektropherogramme wurden bei 290 nm mit einer Bandbreite von 3 nm sowohl für Ofloxacin als auch Imipramin überwacht. Um das Detektor-Rauschen abzuziehen wurde das Referenzsignal bei 450 nm (Bandbreite = 80 nm) fixiert. In allen Experimenten wurden die Flächen hinsichtlich ihrer jeweiligen Wanderungszeiten korrigiert.
Datenanalyse
Die drei folgenden Parameter sind aus den verschiedenen Zeit-Konzentrations-Kurven, erhalten nach Messen der Menge von Ofloxacin in Tränen, berechnet worden:

– Fläche-unter-der-Kurve-Werte (AUC_eff) was die Verfügbarkeit von Ofloxacin in der Tränenflüssigkeit repräsentiert, berechnet unter Verwendung der Trapezoid-Regel.
– AUC_eff-Chitosanformulierung/AUC_eff-Kontrolle, was das Leistungsvermögen der Formulierung repräsentiert.
– Zeit der Wirkung (t_eff), was die Zeit ist, während welcher die Konzentration von Ofloxacin überhalb ihres MIC⁸⁰(minimale inhibitorische Konzentration)-Wertes, d. h. über 4 μg/ml bleibt.

Der Vergleich dieser pharmakokinetischen Parameter zwischen den verschiedenen getesteten Formulierungen und der Kontrolle erfolgte unter Anwendung eines t-Tests nach Student (ungepaarte Proben), nachdem sichergestellt wurde, daß die Datenpunkte einer Normalverteilung folgten.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Chitosan mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht höher als 500 000 die Ofloxacin-Verfügbarkeit in Tränen signifikant verbessert, wobei das AUC_eff-Verhältnis eine etwa 1,5- bis 3,2fache Verbesserung zeigt.
Der ausgesprochenste Effekt wird mit der CHITO-2 enthaltenden Formulierung 3 beobachtet, welche ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1 930 000 Dalton und einen Deacetylierungsgrad von 59% aufweist.
Diese Ergebnisse zeigen auch, daß Chitosan mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von mehr als 500 000 die Wirkungszeit von Ofloxacin verbessert, wobei der ausgesprochenste Effekt ebenfalls mit der Formulierung 3 beobachtet wird, welche eine etwa 1,8fache Verbesserung zeigt. Ein Vorteil für den Patienten besteht darin, daß nur 2 tägliche Einträufelungen anstatt von 4 für Floxal® erforderlich sind.
Beispiel einer wäßrigen ophthalmischen Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung
0,025 g Chitosan CHITO-1, wie obenstehend angegeben, mit einem Molekulargewicht von 1 350 000 und einem Deacetylierungsgrad von 53% wurden in 0,25 ml 1%iger Essigsäure gequollen, und dann bei Raumtemperatur unter magnetischem Rühren in etwa 2 ml einer isokryoskopischen sterilen Phosphatpufferlösung (PBS), pH 7,4, wie obenstehend angegeben, aufgelöst.
Getrennt davon wurde 0,015 g Ofloxacin, wie obenstehend angegeben, in etwa 1 ml einer isokryoskopischen sterilen Phosphatpufferlösung (PBS), pH 7,4, wie obenstehend angegeben, suspendiert.
Nach vollständiger Auflösung des Chitosans wurde die Chitosan-enthaltende Lösung unter magnetischem Rühren in die Ofloxacin-enthaltende Suspension gegossen, und das Volumen wurde mit isokryoskopischer steriler Phosphatpufferlösung (PBS) pH 7,4, wie obenstehend angegeben, auf 5 ml ergänzt.
Nach einigen Minuten wurde das Ofloxacin löslich.
Fünf ml einer Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung, enthaltend 0,5% w/v und 0,3 % w/v Ofloxacin wurden so erhalten.
Die Formulierung war geruchslos, klar und von leicht gelber Färbung.
Die Osmolalität der Formulierung belief sich auf 290 mosm/kg.
Der pH-Wert der Formulierung war 6,25.
Die so erhaltene Formulierung kann entweder in Einzeldosierungseinheiten oder in Mehrfachdosierungs-Behälter verpackt werden.
Die Formulierung kann durch Einträufeln in das Auge in zweckmäßiger Tropfenform topisch verabreicht werden.
Somit erlaubt die Gegenwart von Chitosan in einer wäßrigen ophthalmischen Formulierung, welche Ofloxacin enthält, gleichzeitig die Solubilisierung von Ofloxacin und die Steigerung der pharmakokinetischen Parameter von Ofloxacin.
Es wird kein Zusatz eines Tensids erfordert, und die Formulierung ist sehr einfach herzustellen, da der pH-Wert nicht mit pH-einstellenden Mitteln eingestellt werden muß.
Das Vorhandensein von Chitosan gestattet die Einbringung von Ofloxacin bei höheren Mengen als denjenigen, welche in handelsüblichen Formulierungen gefunden werden, während die pH-Werte kompatibel mit einer okularen Verabreichung gehalten werden, und unter den Vorteilen von erhöhten pharmakokinetischen Parametern und einer gesteigerten klinischen Wirksamkeit aufgrund der höheren Ofloxacin-Konzentration.
Nach der vorliegenden Erfindung kann Chitosan nicht nur als Solubilisierungsmittel von Ofloxacin für die Herstellung einer wäßrigen ophthalmischen Formulierung, enthaltend Ofloxacin zur Behandlung bakterieller Infektionen, verwendet werden, sondern auch zur Solubilisierung von Ofloxacin, suspendiert in einem beliebigen wäßrigen Medium mit einem im wesentlichen neutralen pH-Wert, in anderen Anwendungen, welche die Solubilisierung von Ofloxacin erfordern.
In diesem letztgenannten Fall ist lediglich der Deacetylierungsgrad von Chitosan kritisch, da niedermolekulargewichtige Chitosane hinsichtlich der Solubilisierungskapazität eine identische Wirkung wie hochmolekulargewichtige Chitosane ausüben.

Claims

Wäßrige ophthalmische Formulierung für die Behandlung und Prävention von Infektionen, enthaltend Ofloxacin als aktiven Bestandteil und ein Chitosan mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 500000–5000000 Dalton und einem Deacetylierungsgrad von 30–90 % als Solubilisierungsmittel für Ofloxacin.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 0,5% w/v Ofloxacin enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige Formulierung.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,3 bis 0,5% w/v Ofloxacin enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige Formulierung.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,3% w/v Ofloxacin enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige Formulierung.
Die wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Chitosan ein Molekulargewicht von 1 000 000–2 000 000 Dalton aufweist.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Chitosan einen geringeren Deacetylierungsgrad als 60% aufweist.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 3,0% w/v Chitosan enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige ophthalmische Formulierung.
Wäßrige oplithalmische Formulierung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 1,5% w/v Chitosan enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige ophthalmische Formulierung.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,5% w/v Chitosan enthält, bezogen auf die gesamte wäßrige ophthalmische Formulierung.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Viskosität von nicht mehr als 600 mPa·s bei 25°C aufweist.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, welche in Einzeldosiseinheiten abgepackt ist.
Wäßrige ophthalmische Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, welche in Mehrfachdosis-Behältern abgepackt ist.
Verwendung eines Chitosans mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 500000–5000000 Dalton und einem Deacetylierungsgrad von 30–90% als Solubilisierungsmittel für Ofloxacin bei der Herstellung einer wäßrigen ophthalmischen Formulierung zur Behandlung bakterieller Infektionen, enthaltend Ofloxacin als den aktiven Bestandteil.
Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der bakteriellen Infektion um Conjunctivitis, Blepharitis, Blepharoconjunctivitis, Keratitis und Keratoconjunctivitis handelt.
Verwendung eines Chitosans mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von 500000–5000000 Dalton und einem Deacetylierungsgrad von 30–90% zur Solubilisierung von Ofloxacin, welches in einem wäßrigen Medium mit einem im wesentlichen neutralen pH-Wert suspendiert ist.