DE69733651T2 - Lipid a-analoge enthaltende injektionen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Katsumi Kitagatacho ONAI
Kazuhide Tsukuba-shi ASHIZAWA
Kiyoshi Kakamigahara-shi IWAMOTO
Yasuo Gifu-shi ISHIBASHI
Sumio Niwa-gun WATANABE
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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Präparation für die Injektion, enthaltend ein Lipid A-Analog oder ein pharmakologisch akzeptables Salz davon und ein Verfahren zur Herstellung derselben.
  • Stand der Technik
  • Lipid A, wobei es sich um den Hauptbestandteil handelt, der Aktivitäten von Lipopolysaccharid (hiernach als LPS bezeichnet) auslöst, hat verschiedene biologische Aktivitäten, wie eine Makrophagenstimulierung, eine Anti-Tumor-Wirkung und Pyrogenizität (z.B. Haruhiko Takada und Shozo Kotani, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 31(4), 361(1986)).
  • Es wurden kürzlich verschiedene Lipid A-Analoge synthetisiert und im Hinblick auf ihre biologischen Aktivitäten überprüft (Yuji Ogawa et al., Metabolism 26(5), 415(1989)). Lipid A-Analoge haben ursprünglich eine Glycolipidstruktur. So sind die meisten Lipid A-Analoge nur leicht löslich oder gar unlöslich in Wasser, so dass es schwierig ist, eine Injektion mit Lipid A-Analogen herzustellen. Daher wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt, um eine hoch transparente wässrige Lösung davon zu erhalten. Im Ergebnis wurde z.B. vorgeschlagen, Triethylamin, bovines Serumalbumin, Lipide oder ähnliches als löslichmachende Mittel zuzufügen (Y.B. Kim, et al, Eur. J. Biochem. 31, 230(1972) und R. B. Ramsey, et al, Blood, 56, 307(1980), J. Dijkstra, et al, J. Immunol., 138, 2663(1987)).
  • Weiterhin offenbart die JP-A-4-198192 ein Verfahren unter Verwendung basischer Aminosäuren oder Polyamine als löslichmachende Mittel. Der pH der wässrigen Lösungen bei diesem Verfahren ist jeweils so hoch wie um den pH 10.
  • Andererseits ist als Verfahren zur Dispersion eines Lipids, wie Lecithin oder ähnliche in Wasser zur Bildung von Aggregaten von Liposomen oder ähnlichen ein Verfahren der Zugabe eines Lipids zu einem Puffer mit einem pH im Bereich des Neutralen, gefolgt von Erwärmen und Beschallen bekannt.
  • Das Verfahren zum Löslichmachen von Lipid A-Analogen unter Verwendung von löslichmachenden Mitteln ist im Hinblick auf die physikalische Stabilität in Wasser, die chemische Stabilität, die pharmakologischen Wirkungen und die Sicherheit nicht zufriedenstellend und wurde bis jetzt nicht in einer praktischen Weise durchgeführt. Weiterhin konnte auch keine transparente Lösung eines Lipid A-Analogs durch das Verfahren einer Dispersion eines Lipids in einem Puffer mit einem pH um den neutralen pH herum, gefolgt von Beschallen, erhalten werden. Daher ist es sehr wünschenswert, eine praktische Injektion, enthaltend ein Lipid A-Analog, zu entwickeln, d.h. eine Injektion, die eine hohe Transparenz in Form einer wässrigen Lösung aufweist, einen pH in geeigneten Bereichen für eine Injektion aufweist und eine ausgezeichnete Stabilität hat.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Um die obige Situation zu überwinden, haben die Erfinder der gegenwärtigen Erfindung intensiv studiert, um eine hoch transparente und stabile Präparation für die Injektion, enthaltend ein Lipid A-Analog aufzufinden sowie ein Verfahren für deren Herstellung. Im Ergebnis haben die gegenwärtigen Erfinder entdeckt, dass die gewünschten Ziele durch die folgenden Ausführungsformen erreicht werden können. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellung bewirkt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Präparation für die Injektion bereit, enthaltend Aggregate mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 30 nm oder weniger, hergestellt durch Lösung eines Lipid A-Analogs in einer alkalischen wässrigen Lösung und darauffolgende Zugabe eines Puffers und ein Verfahren für ihre Herstellung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine transparente und stabile Präparation für die Injektion mit einem Lipid A-Analog (hiernach einfach bezeichnet als Lipid A-Analog) herzustellen. Dies ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung.
  • Bevorzugte Beispiele des Lipid A-Analogs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten Tetranatrium-2-deoxy-6-O-(2-deoxy-3-O-[(R)-3-(Z)-dodec-5-enoyloxydecyl]-6-O-methyl-2-(3-oxotetradecanoylamino)-4-O-phosphonato-β-D-glucopyranosyl]-3-O-[(R)-3-hydroxydecyl]-2-(3-oxotetradecanoylamino)-α-D-glucopyranosylphosphat; α-D-Glucopyranose, 3-O-Decyl-2-deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(3-methoxydecyl)-6-O-methyl-2-[(1-oxo-11-octadecenyl)amino]-4-O-phosphono-β-D-glucopyranosyl]-2-[(1,3-dioxotetradecyl)amino]-, 1-(dihydrogenphosphat), Dinatrium[6(2Z,3R)] und α-D-Glucopyranose, 3-O-Decyl-2-deoxy-6-O-[2-deoxy-3-O-(3-methoxydecyl)-6-O- methyl-2-((1-oxo-11-octadecenyl)amino]-4-O-phosphono-β-D-glucopyranosyl]-2-((1,3-dioxotetradecyl)amino]-, 1-(dihydrogenphosphat), Tetranatrium-[6(2Z,3R)]. Diese Verbindungen werden durch die folgenden chemischen Strukturformeln (III) und (IV) dargestellt.
  • Figure 00030001
  • Figure 00040001
  • Die wässrige alkalische Lösung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid. Die Konzentration der wässrigen Lösung liegt allgemein im Bereich von 0,0001 M bis 0,1 M, vorzugsweise 0,0005 M bis 0,01 M und noch bevorzugter 0,001 M bis 0,005 M.
  • Bei der vorliegenden Erfindung kann die Temperatur der Mischung erhöht sein, nachdem eine wässrige alkalische Lösung zu einem Lipid A-Analog zugefügt wurde. Die erhöhte Temperatur muss höher sein als die Phasenübergangstemperatur des Lipid A-Analogs, hat aber keine weitere Begrenzung. Die erhöhte Temperatur liegt allgemein bei 30°C bis 60°C, vorzugsweise 45°C bis 55°C. Die Rührzeit während der Erhöhung der Temperatur liegt allgemein bei 10 Minuten bis 3 Stunden. Das Rühren kann mit einem konventionellen Apparat durchgeführt werden. Die notwendige Rührzeit zum Erhalt einer transparenten Lösung (mit einer Trübheit von 0,6 NTU oder weniger) variiert abhängig von den verwendeten Lipid A-Analogen. Für die durch die obige Formel (III) dargestellte Verbindung wird eine Rührzeit von im allgemeinen 90 Minuten oder länger bei einer erhöhten Temperatur von 40°C oder weniger benötigt oder kann innerhalb von 60 Minuten bei einer erhöhten Temperatur von 40°C oder höher liegen. Wenn ein Lipid A-Analog in einer erwärmten alkalischen wässrigen Lösung gelöst wird, kann ein Lipid A-Analog zu einer alkalischen wässrigen Lösung zugefügt werden, die im vorhinein erwärmt wurde. Alternativ kann die Mischung erwärmt werden, nachdem das Lipid A-Analog einer wässrigen alkalischen Lösung zugefügt wurde. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Zweck der Erhöhung der Temperatur die Beschleunigung der Hydratation von Lipid A-Analogen zur Verbesserung der Dispersionsfähigkeit durch Erhöhung der Temperatur auf die Phasenübergangstemperatur der Lipid A-Analoge oder höher, um dadurch eine transparente Lösung durch Rühren für eine abgekürzte Zeitspanne zu erhalten.
  • Beispiele für den Bestandteil des Puffers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten Phosphate, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Citrate und Glycin. Die Konzentration des Puffers liegt allgemein bei 1 mM bis 20 mM. Der End-pH-Wert der wässrigen Lösung des Lipid A-Analogs beträgt 4 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, besonders bevorzugt 6,8 bis 7,8. Der endgültige pH-Wert kann durch Zugabe einer Lösung von Natriumhydroxid oder Salzsäure nach Zugabe des Puffers eingestellt werden.
  • Falls notwendig, kann die Zugabe von Sacchariden und/oder Aminosäuren zum Puffer ein bevorzugteres Ergebnis ergeben. In diesem Fall können die Saccharide und/oder Aminosäuren, die zugefügt werden sollen, entweder eine Art sein oder zwei oder mehr Arten davon. Beispiele für das Saccharid beinhalten Milchzucker (Lactose), Sorbit, Glucose, Trehalose, Mannit und Dextran. Beispiele für die Aminosäure beinhalten neutrale Aminosäuren, wie z.B. Glycin, saure Aminosäuren, wie z.B. Asparaginsäure und basische Aminosäuren, wie z.B. Arginin.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die resultierende Lipid A-Analog-wässrige Lösung durch konventionelle Verfahren gefriergetrocknet werden, um eine gefriergetrocknete Präparation zu erhalten. Ein Lipid A oder ein Analog davon wird nämlich in einer wässrigen alkalischen Lösung gelöst, weiter bei erhöhter Temperatur, falls nötig, gerührt, gefolgt von Zugabe eines Puffers, um den pH der Mischung einzustellen. Nach einer Sterilisierungsfiltration wird die Mischung in ein Vial oder ähnliches gefüllt, gefolgt von einem Einfrieren und Trocknen, um eine gefriergetrocknete Präparation zu ergeben.
  • Wenn eine Präparation für die Injektion gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer wässrigen Lösung verabreicht werden soll, wird das osmotische Druckverhältnis der Präparation vorzugsweise auf einen Wert einge stellt, der für die Verabreichung für den Menschen geeignet ist, im allgemeinen um 1.
  • Bei der Präparation für die Injektion gemäß der vorliegenden Erfindung aggregieren Moleküle des Lipid A-Analogs zur Bildung von Teilchen, die grob kugelförmig in ihrer Form sind und einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von ungefähr 30 nm oder kleiner aufweisen. Die Aggregate verändern ihre Größe zwischen direkt nach der Produktion der Präparation für die Injektion und nach der Rekonstitution einer gefriergetrockneten Präparation nicht. Allgemein gesprochen zerstört ein Gefriertrocknen häufig Aggregate. In der vorliegenden Erfindung bleibt der Teilchendurchmesser der Aggregate jedoch bei 30 nm oder geringer selbst nach Rekonstitution. Dies ist eine der hervorstechenden Wirkungen der vorliegenden Erfindung. Gemäß einer detaillierten Untersuchung haben die Aggregate der vorliegenden Erfindung im Fall einer Verbindung, wie dargestellt durch die obige Formel (III), eine innere wässrige Phase von ungefähr 0,196 Liter pro Mol (bei pH 11,0). Ein kontinuierliches Rühren bei der Präparation erzeugt Aggregate mit einem fast konstanten Durchmesser von ungefähr 15 nm. Daher liegt der Teilchendurchmesser der Aggregate der vorliegenden Erfindung bei ungefähr 15 nm bis 30 nm im Fall des allgemeinen Herstellungsverfahrens.
  • Die Aggregate des Lipid A-Analogs der vorliegenden Erfindung werden kaum durch koexistierende Magnesiumionen oder Calciumionen im Teilchendurchmesser in der Trübheit oder ähnlichem beeinflusst. Andererseits beeinflussen Magnesium- oder Calciumionen die Aggregate im Hinblick auf die Membranfluidität. So erniedrigt sich die Membranfluidität der Aggregate, wenn diese Metallionen vorliegen. Die Membranfluidität beeinflusst die Pharmakokinetik nach Verabreichung der Lipid A-Analoge. Eine Abnahme der Membranfluidität beschleunigt den Verlust von Lipid A-Analogen aus lebenden Stoffen.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird unten im Detail durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt.
  • Beispiel 1
  • Zu 90 ml einer 0,003 M Lösung Natriumhydroxid mit 45°C werden 60 mg des Lipid A-Analogs, dargestellt durch die obige Formel (III) zugefügt und darin gelöst und 30 Minuten bei derselben Temperatur gerührt. Diese Mischung wurde in einer Menge von 5 ml entnommen und ihre Trübheit wurde mit einem Trübungsmesser bewertet. Die Trübheit der Lösung betrug 0,178 NTU. Zu 7,5 ml dieser wässrigen alkalischen Lösung wurden 30 ml eines 7,08 mM Phos phatpuffers, enthaltend 16,7 % Lactose, zugefügt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,39 mit einer 0,3%igen Lösung Natriumhydroxid eingestellt, gefolgt von der Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die Trübheit dieser wässrigen Lösung betrug 0,181 NTU. Zu einem Vial wurden 5,3 ml dieser wässrigen Lösung zugegeben und mit einer Vakuum-Gefriertrockenvorrichtung gefriergetrocknet (Triomaster A04, Kyowa Manufacturing Co., Ltd.).
  • Beispiel 2
  • Zu 90 ml einer 0,003 M Lösung Natriumhydroxid mit 55°C wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und 60 Minuten bei derselben Temperatur gerührt. Diese alkalische wässrige Lösung wurde in einer Menge von 5 ml entnommen und ihre Trübheit wurde mit einem Trübungsmesser bewertet. Die Trübheit der Lösung betrug 0,133 NTU. Zu 7,5 ml dieser alkalischen wässrigen Lösung wurden 30 ml eines 7,08 mM Phosphatpuffers, enthaltend 16,5 % Lactose, zugefügt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,41 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt, gefolgt von der Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die Trübheit dieser wässrigen Lösung betrug 0,212 NTU.
  • Beispiel 3
  • Zu 90 ml einer 0,001 M Lösung Natriumhydroxid mit 50°C wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und 60 Minuten bei derselben Temperatur gerührt. Diese alkalische wässrige Lösung wurde in einer Menge von 5 ml entnommen und ihre Trübheit wurde mit einem Trübungsmesser bewertet. Die Trübheit der Lösung betrug 0,142 NTU. Zu 7,5 ml dieser alkalischen wässrigen Lösung wurden 30 ml eines 7,08 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffers, enthaltend 8,35 % Mannit, zugefügt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,39 mit 1 N Salzsäure eingestellt, gefolgt von der Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die Trübheit dieser wässrigen Lösung betrug 0,133 NTU.
  • Beispiel 4
  • Zu 90 ml einer 0,005 M Lösung Natriumhydroxid mit 50°C wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und 60 Minuten bei derselben Temperatur gerührt. Diese alkalische wässrige Lösung wurde in einer Menge von 5 ml entnommen und ihre Trübheit wurde mit einem Trübungsmesser bewertet. Die Trübheit der Lösung betrug 0,150 NTU. Zu 7,5 ml dieser alkalischen wässrigen Lösung wurden 30 ml eines 7,08 mM Phos phatpuffers, enthaltend 16,5 % Lactose, zugefügt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,37 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt, gefolgt von der Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die Trübheit dieser wässrigen Lösung betrug 0,205 NTU.
  • Beispiel 5
  • Zu 90 ml einer 0,003 M Lösung Natriumhydroxid mit 35°C wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und 150 Minuten bei derselben Temperatur gerührt. Diese alkalische wässrige Lösung wurde in einer Menge von 5 ml entnommen und ihre Trübheit wurde mit einem Trübungsmesser bewertet. Die Trübheit der Lösung betrug 0,669 NTU. Zu 7,5 ml dieser alkalischen wässrigen Lösung wurden 30 ml eines 7,08 mM Phosphatpuffers, enthaltend 8,35 % Dextran 70 (durchschnittliches Molekulargewicht 70.000) zugefügt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,30 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt, gefolgt von der Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die Trübheit dieser wässrigen Lösung betrug 1,25 NTU.
  • Beispiel 6
  • Zu 9,0 ml einer 0,01 M Lösung Natriumhydroxid wurden 6,09 mg des durch die obige Formel (IV) dargestellten Lipid A-Analogs zugefügt und es wurde 60 Minuten gerührt. Diese Lösung hatte einen pH von 12,08. Zu dieser Lösung wurden 30 ml eines Phosphatpuffers, enthaltend Lactose, zugefügt. Die resultierende Lösung hatte einen pH von 7,46. Destilliertes Wasser für die Injektion wurde dieser Lösung zugefügt, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 60 ml einzustellen. Diese Lösung war eine Injektionslösung mit einem pH von 7,50, enthaltend das Lipid A-Analog in einer Konzentration von 0,1 mg/ml, 10 % Lactose und einen 4,25 mM Phosphatpuffer.
  • Beispiel 7
  • Nachdem die in Beispiel 6 erhaltene Injektionslösung einer sterilisierenden Filtration unterzogen worden war, wurde die Injektionslösung jeweils in Vials in einer Menge von je 3 ml gegossen und gefriergetrocknet, um gefriergetrocknete Präparationen, enthaltend ein Lipid A-Analog, zu ergeben. Die Bedingungen des Gefriertrocknens waren die folgenden (Gefriertrockenvorrichtung: EDWARD Modell Lyo fast S08): Gefriertemperatur: –40°C, primäre Trockentemperatur: 20°C; primärer Trockendruck: 0,075 ± 0,025 mbar; sekundäre Trockentemperatur: 27°C; sekundärer Trockendruck: (die maximale Kapazität des Apparats); sekundäre Trockenzeit: 18 Stunden.
  • Beispiel 8
  • Zu 9,0 ml einer 0,003 M Lösung Natriumhydroxid wurden 40,16 mg des in Beispiel 6 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und es wurde 60 Minuten gerührt. Diese Lösung hatte einen pH von 4,49. Zu dieser Lösung wurden 10 ml eines Phosphatpuffers, enthaltend Lactose, zugefügt. Die resultierende Lösung hatte einen pH von 8,44. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 7,4 mit 4 % Phosphorsäure eingestellt, gefolgt von einer Zugabe von destilliertem Wasser für die Injektion, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 20 ml einzustellen. Diese Lösung war eine Injektionslösung mit pH 7,51, enthaltend das Lipid A-Analog in einer Konzentration von 2,0 mg/ml, 10 % Lactose und einen 4,25 mM Phosphatpuffer.
  • Beispiel 9
  • Nachdem die in Beispiel 8 erhaltene Injektionslösung einer sterilisierenden Filtration unterzogen worden war, wurde die Injektionslösung in Vials in einer Menge von je 3 ml gegossen und gefriergetrocknet, um gefriergetrocknete Präparationen, enthaltend ein Lipid A-Analog, zu ergeben. Die Bedingungen des Gefriertrocknens waren die folgenden (Gefriertrockenvorrichtung: EDWARD Modell Lyo fast S08): Gefriertemperatur: –40°C, primäre Trockentemperatur: 20°C; primärer Trockendruck: 0,075 ± 0,025 mbar; sekundäre Trockentemperatur: 27°C; sekundärer Trockendruck: (die maximale Kapazität des Apparats); sekundäre Trockenzeit: 18 Stunden.
  • Unten werden experimentelle Beispiele angegeben, um die Wirkungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren.
  • Experimentelles Beispiel 1
  • Bewertung der Transparenz einer Präparation gemäß der vorliegenden Erfindung
  • 1. Experimentelle Verfahren
  • Die wässrigen Lösungen eines Lipid A-Analogs, hergestellt in dem folgenden Vergleichsbeispiel und dem gegenwärtigen Verfahren 1 wurden im Hinblick auf ihre Trübheit untersucht. Die Messung wurde mit einem Hach 2100AN Turbidimeter durchgeführt.
  • Vergleichsbeispiel
  • Zu einem 4,25 mM Phosphatpuffer, enthaltend 10 % Lactose mit 50°C, wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und es wurde bei derselben Temperatur gerührt. Eine 12,5 ml Probe wurde nach 30 Minuten, 60 Minuten, 120 Minuten bzw. 180 Minuten Rühren entnommen. Die Proben wurden im Hinblick auf ihre Trübheit unter Verwendung von 5 ml der jeweiligen Proben hin untersucht. Weiterhin wurde ein 4,25 mM Phosphatpuffer, enthaltend 10 % Lactose, zu 7,5 ml jeder Probenlösung zugefügt, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die resultierenden Lösungen wurden im Hinblick auf Trübheit und pH untersucht.
  • Vorliegendes Verfahren 1
  • Zu 90 ml einer 0,003 M wässrigen Lösung Natriumhydroxid bei 50°C wurden 60 mg des Lipid A-Analogs, wie verwendet in Beispiel 1, zugefügt und darin gelöst und es wurde bei derselben Temperatur gerührt. Eine 12,5 ml Probe der alkalischen wässrigen Lösung wurde nach 30 Minuten bzw. nach 60, 120 und 180 Minuten Rühren gesammelt. Die Proben wurden im Hinblick auf ihre Trübheit mit einem Trübungsmesser unter Verwendung von 5 ml der jeweiligen Proben untersucht. Weiterhin wurden 30 ml eines 7,08 mM Phosphatpuffers, enthaltend 16,5 % Lactose, zu 7,5 ml jeder Probe der alkalischen wässrigen Lösung zugefügt. Dann wurde der pH der jeweiligen Lösung auf ungefähr pH 7,4 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt. Danach wurde destilliertes Wasser für die Injektion zugefügt, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. Die resultierenden Lösungen wurden im Hinblick auf Trübheit und pH untersucht.
  • 2. Experimentelle Ergebnisse
  • Die durch die obigen experimentellen Verfahren erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00100001
  • Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass die wässrige Lösung des in dem vorliegenden Verfahren 1 gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Lipid A-Analogs eine ausgezeichnete Transparenz zeigt, die derjenigen der wässrigen Lösung des Lipid A-Analogs, hergestellt im Vergleichsbeispiel, wobei es sich um ein repräsentatives konventionelles Verfahren handelt, deutlich überlegen ist.
  • Experimentelles Beispiel 2
  • Bewertung der Rekonstitutionseigenschaften einer gefriergetrockneten Präparation eines Lipid A-Analogs
  • 1. Experimentelle Verfahren
  • Vorliegendes Verfahren 2
  • Zu 90 ml einer 0,003 M wässrigen Lösung Natriumhydroxid mit 50°C wurden 60 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und bei derselben Temperatur gerührt. Eine 12,5 ml Probe der alkalischen wässrigen Lösung wurde nach 30, 60, 120 bzw. 180 Minuten Rühren genommen. Die Proben wurden im Hinblick auf ihre Trübheit mit einem Trübungsmesser unter Verwendung von 5 ml der jeweiligen Proben überprüft. Weiterhin wurden 30 ml eines 7,08 mM Phosphatpuffers, enthaltend 16,5 % Lactose zu 7,5 ml jeder Probe der alkalischen wässrigen Lösung zugefügt. Dann wurde der pH der jeweiligen Lösungen auf ungefähr pH 7,4 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt. Danach wurde destilliertes Wasser für die Injektion zugefügt, um das Gesamtvolumen der resultierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. 5,3 ml dieser wässrigen Lösung wurden in ein Vial platziert und unter Verwendung einer Vakuum-Gefriertrockenvorrichtung gefriergetrocknet (Kyowa Manufacturing Co., Ltd., Triomaster A-04). Weiterhin wurden 5 ml destilliertes Wasser für die Injektion der resultierenden gefriergetrockneten Präparation zugefügt, um die Präparation wieder darin zu lösen. Die resultierende Lösung wurde im Hinblick auf ihre Trübheit unter Verwendung eines Hach 2100AN Turbidimeters untersucht.
  • Vorliegendes Verfahren 3
  • Zu 100 ml einer 0,003 M wässrigen Lösung Natriumhydroxid mit 50°C wurden 200 mg des in Beispiel 1 verwendeten Lipid A-Analogs zugefügt und darin gelöst und bei derselben Temperatur gerührt. Eine 7,5 ml Probe der alkalischen wässrigen Lösung wurde nach 30, 60, 120 bzw. 180 Minuten Rühren genommen. Die Proben wurden im Hinblick auf ihre Trübheit mit einem Trübungsmesser unter Verwendung von 5 ml der jeweiligen Proben untersucht. Weiterhin wurden 30 ml eines 7,08 mM Phosphatpuffers, enthaltend 16,5 % Lactose, zu 2,5 ml jeder Probe der alkalischen wässrigen Lösung zugefügt. Dann wurde der pH der jeweiligen Lösungen auf ungefähr pH 7,4 mit einer 0,3%igen wässrigen Lösung Natriumhydroxid eingestellt. Danach wurde destilliertes Wasser für die Injektion zugefügt, um das Gesamtvolumen der resul tierenden Lösung auf 50 ml einzustellen. 5,3 ml dieser wässrigen Lösung wurden in ein Vial platziert und unter Verwendung einer Vakuum-Gefriertrockenvorrichtung (Kyowa Manufacturing Co., Ltd., Triomaster A-04) gefriergetrocknet. Weiterhin wurden 5 ml destilliertes Wasser für die Injektion zu der resultierenden gefriergetrockneten Präparation zugefügt, um die Präparation wiederum darin zu lösen. Die resultierende Lösung wurde im Hinblick auf ihre Trübheit untersucht. Die Messung der Trübheit wurde unter Verwendung eines Hach 2100AN Turbidimeters durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2
    Figure 00120001
  • Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass die gefriergetrockneten Präparationen gemäß der vorliegenden Erfindung eine ausgezeichnete Transparenz selbst dann zeigen, wenn sie wiederum in Wasser gelöst werden.

Claims (11)

  1. Präparation für die Injektion, hergestellt durch Lösen eines Lipid A-Analogs in einer alkalischen wäßrigen Lösung aus Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid und darauffolgende Zugabe eines Puffers dazu, dadurch gekennzeichnet, daß der endgültige pH-Wert der Lösung 4 bis 9 beträgt, der durchschnittliche Teilchendurchmesser der durch das Lipid A-Analog gebildeten Aggregate 30 nm oder geringer ist und das Lipid A-Analog eine Verbindung ist, dargestellt durch die folgende Formel (III) oder (IV):
    Figure 00130001
    Figure 00140001
  2. Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 1, wobei die alkalische wäßrige Lösung eine temperaturerhöhte alkalische wäßrige Lösung ist.
  3. Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 2, wobei die Temperatur der temperaturerhöhten alkalischen wäßrigen Lösung auf die Phasenübergangstemperatur des Lipid A-Analogs oder höher erhöht ist.
  4. Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 2, wobei die temperaturerhöhte alkalische wäßrige Lösung eine alkalische wäßrige Lösung mit einer Temperatur von 30 bis 60°C ist.
  5. Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 1, wobei der Puffer einen pH von 4 bis 9 aufweist.
  6. Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 5, wobei der Puffer ein Saccharid enthält.
  7. Gefriergetrocknete Präparation, die durch Gefriertrocknen der Präparation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten wird.
  8. Verfahren zur Herstellung einer Präparation für die Injektion, umfassend das Lösen eines Lipid A-Analogs wie definiert in Anspruch 1 in einer wäßrigen alkalischen Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid und darauffolgende Zugabe eines Puffers dazu, wobei der endgültige pH-Wert auf 4 bis 9 eingestellt wird.
  9. Verfahren zur Herstellung einer Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 8, wobei die alkalische wäßrige Lösung eine temperaturerhöhte alkalische wäßrige Lösung ist.
  10. Verfahren zur Herstellung einer Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 8, wobei der Puffer einen pH von 4 bis 9 aufweist.
  11. Verfahren zur Herstellung einer Präparation für die Injektion gemäß Anspruch 8, wobei die Moleküle des Lipid A-Analogs zur Bildung von Teilchen mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 30 nm oder weniger aggregieren.
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