DE60116338T2

DE60116338T2 - Eine mischung von nicht-sulfatierten oligosacchariden auf der basis von fukose, eine diese mischung enthaltende, kosmetische oder pharmazeutische zusammensetzung und deren verwendungen in der kosmetik und pharmazie

Info

Publication number: DE60116338T2
Application number: DE60116338T
Authority: DE
Inventors: Ladislas Robert; Alexandre Michel Robert; Catherine Sylvie Robert; Jean-Luc Gesztesi
Original assignee: Industria e Comercio de Cosmeticos Natura Ltda
Current assignee: Industria e Comercio de Cosmeticos Natura Ltda
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: DE60116338D1; EP1317489A1; ATE314397T1; JP5374675B2; US20040097464A1; WO2002020622A1; JP2004507613A; EP1317489B1

Description

Vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Mischung von nicht-sulfatierten Oligosacchariden auf der Basis von Fukose und deren Verwendung, hauptsächlich in Produkten zur topischen Applikation, bei der eine Aktivität des Epithel- oder Konjunktivgewebes erwünscht ist, im Speziellen in anti-aging-Produkten, wie z.B. pharmazeutische oder vetrinäre Produkte und, ganz besonders, in kosmetischen Erzeugnissen.
Während des Alterungsprozesses wird die Haut durchschnittlich alle 10 Jahren um 6% dünner (Skin thickness changes in normal aging skin, Branchet et al., Gerontolgy 1990, 36, 28–35). Die zugrunde liegenden Mechanismen des Alterungsprozesses sind sowohl intrinsisch als auch extrinsisch. Die intrinsischen Mechanismen umfassen eine Abnahme der Zellproliferation sowie eine bedeutende Minderung der cutanen extramolekularen Matrix (cutaneous extramolecular matrix, CEM). Diese Minderung ist mit zunehmendem Alter hauptsächlich auf die Abnahme der Synthese der CEM und der zunehmenden Synthese von Abbauenzymen, die die Hautmatrix angreifen können, zurückzuführen (D. L. Robert, Aging, CNRS, Belin, 1994; Docteur L. Robert, Aging, Facts and Theories, DOMINOS, Flammarion, 1995). Die verantwortlichen Proteasen sind im Wesentlichen die Matrix-Metalloproteasen (MMP), von denen viele (so z.B. Serin-Proteasen) die meisten Bestandteile der Hautmatrix und im Speziellen, die elastischen Fasern abbauen können.
In letzter Zeit wurden zahlreiche Studien unternommen mit der Zielsetzung, gegen bestimmte Hautalterungseffekte aktive Verbindungen zu erhalten. Das erste Ziel dabei ist es, diesen Prozess zu verlangsamen. Eine weitere Zielsetzung ist, eine Hautverdickung zu bewerkstelligen, hauptsächlich der Dermis.
Saccharide und Polysaccharide sind in der Kosmetik wohl bekannte Substanzen, vor allem wegen ihrer feuchtigkeitsspendenden Eigenschaften. Dies ist z.B. für das Monosaccharide Fukose sowie Fukose enthaltende Polysaccharide der Fall.
Fukose ist eine der Galaktose ähnliche Deoxy-Hexose, mit gleicher sterischer Konformation. Allerdings unterscheidet sich die Struktur von der der Galaktose wesentlich, dadurch dass das C6-Atom eine Methyl (-CH₃) und keine primäre Alkoholgruppe (-CH₂OH) trägt. Diese Methylgruppe verleiht der Fukose tatsächlich eine interessante teilhydrophobe Natur, die durch die Hydroxylgruppen der anderen, Fremdatome tragenden vier Kohlenstoffatome kompensiert wird.
Fukose tritt früh während der Phlyogenese auf; Polysaccharide verschiedener Algen und Pilze enthalten sie in relativ bedeutenden Quantitäten, entweder einzeln oder in Kombination mit anderen chemischen Verbindungen. Dabei kann sie auch in sulfatierter Form, wie in den Fukanen, vorliegen. Andererseits findet Fukose weite Verbreitung im Tierreich und wird auch von bestimmten Bakterien synthetisiert.
Allerdings gibt es bislang, trotz der zahlreichen Veröffentlichungen, die Fukose und Fukose enthaltende Polysaccharide behandeln, fast keine zufrieden stellenden erreichten Ergebnisse, für eine Anwendung in industriellem Maßstab, v.a. für kosmetische Produkte.
Hinzu kommt, dass zusätzlich zum schlechten Kosten/Effektivitäts-Verhältnis des Monosaccharids Fukose die bekannten Fukose enthaltenden Polysaccharide keine signifikante Aktivität, die eine wirksame Bekämpfung der Hautalterung ermöglicht, aufzeigen.
Fukane etwa sind sulfatierte Polymere mit hohem Molekulargewicht (> 20 kD). WO 99/32099 (IFREMER) beschreibt neue Anwendungsmöglichkeiten von Fukanen im Rahmen des Heilungsprozesses von Verletzungen des Bindegewebes. Fukane können jedoch wegen ihrer Größe und ihres Gewichts nicht effektiv mit allen Zellschichten der Haut wechselwirken. Im Gegensatz dazu können Fukane zusätzlich MMP-2 aktivieren, eine redhibitorische Eigenschaft zur kosmetischen Behandlung der normalen Hautalterung.
FR 2 750 863 (L'ORÉAL) beschreibt die Verwendung ei nes Polyholosides, hauptsächlich eines Fukose enthaltenden Polysaccharids um die Hautschuppung zu begünstigen, d.h. um die Eliminierung der „losen" Zellen, die auf der Oberfläche der Horn-Schicht der Epidermis liegen, zu begünstigen (Seite 3, Zeilen 6 und 7) und/oder die Erneuerung der Epidermis zu stimulieren, d.h. verstärkte Eliminierung der Horn-Schicht, die die Erneuerung beschleunigt, zu bewirken (Seite 1, Zeilen 13–23), wobei diese Effekte gemäß FR 2 750 863 ein angeglichenes Ergebnis gegenüber einem Ergebnis gegen Hautalterung einbringen. Das in FR 2 750 863 beschriebene Polysaccharid erlaubt es jedoch, aufgrund seiner Masse und Struktur, nicht eine zufrieden stellende Einbindung der verschiedenen Bestandteile der Haut zu schaffen.
Überraschenderweise stellte sich nun jedoch heraus, dass durch eine neue Mischung von Fukose enthaltenden Oligosacchariden, die durch spezielle Behandlung ausgewählter Mikroorganismen erhalten werden kann, eine signifikante Wirkung auf verschiedene Hautbestandteile erzielt werden kann, wobei ein reelles, klar ersichtliches anti-aging-Resultat, hauptsächlich durch ausgezeichnete Verdickung der Haut, erhalten wird.
Daher war es Aufgaben vorliegender Erfindung, eine Mischung von nicht-sulfatierten auf Fukose basierenden Oligosacchariden bereitzustellen, dadurch gekennzeichnet, dass Oligosaccharide mit weniger als 13 Saccharid-Einheiten und zumindest eine Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endstellung enthalten sind und dass sie durch ein Verfahren hergestellt werden kann, bei dem mindestens ein Schritt enthalten ist, bei dem ein Abbau eines Polysaccharids durch einen Mikroorganismus der Art Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae erfolgt.
Unter einem erfindungsgemäßen „nicht-sulfatierten auf Fukose basierenden Oligosaccharid" ist in Übereinstimmung mit dem Wissen eines Fachmannes ein Oligosaccharid zu verstehen, das zumindest eine Fukose-Einheit und keine Sulfatgruppe -O(SO₃ ^–) aufweist. Fukane sind im Besonderen von dieser Definition ausgeschlossen.
Unter einem erfindungsgemäßen „Oligosaccharid, das zumindest eine Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endstellung enthält" ist in Übereinstimmung mit dem Wissen eines Fachmannes ein Oligosaccharid zu verstehen, das zumindest eine Fukose-Einheit in einer Endstellung der Oligosaccharid-Kette enthält, wobei diese Fukose-Einheit mit der nächsten Saccharid-Einheit des Restes des Oligosaccharids über eine Acetalbindung verbunden ist.
Die Anzahl der Saccharid-Einheiten kann mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Techniken, im Speziellen der HPLC-Chromatographie, bestimmt werden, wie in den folgenden Beispielen dargestellt wird.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Mischung von Oligosacchariden bezüglich des Gesamtgewichts der Mischung mindestens 15 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 20 und 50 Gew.-% an Oligosacchariden mit weniger als 13 Saccharid-Einheiten, die zumindest eine Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endstellung enthalten.
Insbesondere ist die erfindungsgemäße Mischung von Oligosacchariden dadurch gekennzeichnet, dass bezüglich des Gesamtgewichts der Mischung zwischen 25 und 45 Gew.-% Oligosaccharide enthalten sind, die zwischen 13 und 24 Saccharid-Einheiten und zumindest ei ne Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition.
In einer besonderen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Mischung an Oligosacchariden bezüglich des Gesamtgewichts der Mischung zwischen 15 und 35 Gew.-% an Oligosacchariden mit mehr als 54 Saccharid-Einheiten, die zumindest eine Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition beinhalten.
Die Mischung der Oligosaccharide kann durch ein Verfahren hergestellt werden, bei dem mindestens ein Schritt enthalten ist, bei dem ein Abbau eines Polysaccharids durch einen Mikroorganismus der Art Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae erfolgt, wobei die Oligosaccharide vorzugsweise, zumindest teilweise das Motiv von Fukose-Galaktose-Galakturonsäure enthalten.
Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Mischung von Oligosacchariden durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte enthält:

a) Kultivierung des Mikroorganismus der Art Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae in einem wässrigen Nährmedium durch aerobe Fermentation einer vergleichbaren Glycidquelle;
b) Rückgewinnung des Polysaccharids, das in dem Fermentationsmost gebildet wurde;
c) eine moderate Hydrolyse des gebildeten Polysaccharids;
d) eine enzymatische Hydrolyse des Hydrolyseprodukts des Schrittes c) und
e) die Deaktivierung des Enzyms nach Rückgewinnung der auf diese Weise gebildeten Mischung von Oligosacchariden.

Die Schritte a) bis e) werden im Folgenden eingehender beschrieben:
Schritt a)
Vorzugsweise wird der Mikroorganismus Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae verwendet, der in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes unter der Nummer I-1507 hinterlegt ist, oder ein davon abgeleiteter Mutant. Weiterhin wird dieser Mikroorganismus detailliert in der Patentanmeldung WO 96/23057 beschrieben.
Das wässrige Nährmedium ist beispielsweise ein dem Fachmann bekanntes wässriges Medium, das Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff sowie Mineralsalze enthält, wie es auch in der Patentanmeldung WO 96/23057 beschrieben wird.
Die Fermentation kann bei Temperaturen in der Größenordnung von 25 bis 35°C, bei einem pH-Wert von ca. 6,0 bis 7,5, unter Belüftung und Rühren und über einen Zeitraum von 2 bis 4 Tagen durchgeführt werden.
Die Fermentation kann in einem klassischen Fermentationskessel durchgeführt werden, wobei das zuvor sterilisierte Nährmedium, das z.B. durch Erhitzen auf eine Temperatur von ca. 120°C oder durch sterile Filtration sterilisiert wurde, eingeimpft wird.
Schritt b)
Am Ende der Fermentationsperiode wird der Fermentationsmost zurückgewonnen und ein fukosereiches Polysaccharid auf folgende Art und Weise daraus isoliert:
Der Fermentationsmost wird einer Hitzebehandlung bei Temperaturen, die im Speziellen zwischen ca. 100 und 130°C, bevorzugt zwischen ca. 115 und 125°C, liegen, für ca. 30 min bis ca. 2 Stunden, bevorzugt für ca. 40 Minuten bis 1 Stunde und bei einem pH-Wert, der zwischen ca. 2 und ca. 5,5 und bevorzugt zwischen 3 und 5,5 liegt, unterworfen.
Das Produkt der Wärmebehandlung wird mittels klassischer Methoden filtriert, wie z.B. durch eine mit Platten ausgestattete Filterpresse.
Auf diese Weise kann ein zellfreies, klares, viskoses Polysaccharid erhalten werden.
Im Anschluss daran wird eine Fällung in einem alkoholischen Lösungsmittel ausgeführt, bevorzugt in einem Alkohol, ausgewählt aus Ethanol und Isopropanol sowie Mischungen daraus. Bevorzugt werden dabei 1 bis 3.0 Volumenanteile Lösungsmittel bezüglich 1 Volumenanteil des Polysaccharids und, besonders bevorzugt zwischen 1,3 und 2,0 Volumenanteile des Lösungsmittel bezüglich 1 Volumenanteil des Polysaccharids verwendet.
Weiterhin wird eine Vakuumtrocknung durchgeführt, bei einer Temperatur, die vorzugsweise zwischen 20 und 60°C, besonders bevorzugt zwischen 30 und 50°C liegt, bis ein weißes Pulver erhalten wird.
Schritte c) und d): Hydrolyse des Polysaccharids
Hier liegt eine unumgängliche Kombination von Schritten vor. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Kombination eines moderaten Hydrolyseschrittes, vorzugsweise durch Bestrahlung mit Gammastrahlen und/oder durch Protolyse mit einem enzymatischen Hydrolyseschritt, vorteilhafterweise einen ausreichenden globalen Ertrag der Hydrolyse gewährleistet, der nahe an den einer klassischen Hydrolyse, wie z.B. einer acidischen Hydrolyse herankommt, aber mit dem Vorteil spezifischer Schnitte einer enzymatischen Hydrolyse. Insbesondere ist es durch acidische, klassische Hydrolyse nicht möglich, eine erfindungsgemäße Mischung von spezifischen Oligosacchariden zu erhalten, da sie zum Erhalt von statistischen, redhibitorischen Schnitten von zufälliger Art führt. Hinzu kommt, dass Verbindungen, die aus einer klassischen acidischen Hydrolyse resultieren, sich als biologisch inaktiv erweisen.
Schritt c): Moderate Hydrolyse des Polysaccharids
Die moderate Hydrolyse wird durch Behandlung mit Gammastrahlen, Behandlung durch Protolyse oder durch diese beiden Behandlungen sukzessive durchgeführt. Vorzugsweise wird zunächst eine Behandlung mit Gammastrahlen und danach eine Protolyse-Behandlung sukzessive durchgeführt.
Die Behandlung mit Gammastrahlen bedingt hier eine merkliche Abnahme der Viskosität durch begrenzten Abbau, der auf die Aktivität von freien Radikalen zurückzuführen ist. Dieser Schritt kann durch gängige Bestrahlungsvorrichtungen, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden.
Diese Behandlung mit Gammastrahlen, die eine sehr durchdringende Strahlungsart ist, birgt zusätzlich den Vorteil, dass die Polysaccharide sterilisiert werden, wobei vorhandene Keime abgetötet werden, die Entzündungen oder sogar Granuloma hervorrufen könn ten. Auf diese Art und Weise kann einer bakteriellen Attacke vorgebeugt werden, ohne dass zu dem Medium irgendwelche antiseptischen Produkte zugegeben werden müssten, die auf unerwünschte Weise die biologischen Aktivitäten des Endproduktes beeinflussen könnten.
Das Polysaccharid-Pulver, das in Schritt b) erhalten wurde und das gegebenenfalls mit Gammastrahlen bestrahlt wurde, kann ebenso einer Protolyse-Behandlung unterzogen werden. Zu diesem Zweck wird es in eine wässrige Lösung eingebracht, mit einem Gewichtsverhältnis, das zwischen 1 und 20% vorzugsweise zwischen 2 und 10%, bezüglich des Gesamtgewichts der wässrigen Lösung liegt.
Die wässrige Lösung wird einer Hitzebehandlung unterzogen, d.h. es erfolgt ein Erhitzen auf eine Temperatur bevorzugt im Bereich von ca. 75 bis 120°C und besonders bevorzugt von ca. 90 bis 100°C über einen Zeitraum von 1 bis 6 Stunden, in der Gegenwart eines kommerziell erhältlichen und dem Fachmann bekannten Protonen-freisetzenden Harzes, d.h. ein Harz, das Protonen freisetzt und das einen Schnitt der glykosidischen Bindungen unter Bindung eines Wassermoleküls bewerkstelligt.
Schritt d): Enzymatische Hydrolyse
Ein sauerer Puffer, wie z.B. ein Citratpuffer (4,15 g/kg) – Dinatriumhydrogenphosphat (ca. 10,75 g/kg) wird zu dem aus Schritt b) erhaltenen Hydrolysat zugegeben. Dabei wird eine Temperatur der Lösung in einem Bereich zwischen ca. 25 bis 45°C, bevorzugt zwischen 30 und 40°C, eingestellt.
Ein enzymatisches Präparat, das zumindest eine Endo fukosidase, bevorzugt Fermizyme HCP, wie es von Gist Brocades kommerziell erhältlich ist, wird bezüglich des ursprünglich eingesetzten Gewichts des verwendeten Polysaccharidpulvers in einer Menge die von 2 bis 20 Gew.-%, bevorzugt von 5 bis 15 Gew.-%, eingesetzt.
Das so erhaltene Gemisch wird für eine Dauer von 8 bis 24 Stunden, bevorzugt von 10 bis 20 Stunden, bei einer Temperatur von 25 bis 45°C, bevorzugt von 30 bis 40°C gerührt, wobei der pH-Wert mittels eines Puffergemisches auf 6 eingestellt wird.
Schritt e)
Das aus Schritt d) erhaltene Hydrolyseprodukt wird mit Hilfe klassischer Filtriermethoden, wie z.B. einer mit Platten ausgestatteten Filterpresse, filtriert.
Um das Enzym und im Speziellen die Fukosidase-Aktivität dieses speziellen Enzyms zu deaktivieren, wird die gesammelte Lösung anschließend einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur im Bereich von 75 bis 120°C, bevorzugt von 90 bis 105°C, über einen Zeitraum von ca. 10 bis 45 Minuten, bevorzugt zwischen 20 und 35 Minuten, unterzogen.
Anschließend wird die Lösung auf eine Temperatur zwischen ca. 20 und 40°C abgekühlt.
Während des Abkühlens können gegebenenfalls Konservierungsstoffe zu der Lösung gegeben werden.
Das Mischung wird im Anschluss unter sterilen Bedingungen filtriert, dann erfolgt die Abpackung.
Die so erhaltene erfindungsgemäße Mischung von Oligosacchariden kann mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, im Speziellen HPLC, Dünnschicht-Chromatographie und anderen Methoden und chemischen Dosierungen, charakterisiert werden.
Auf diese Art und Weise kann festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Oligosaccharide so beschaffen sind, dass Fukose zumeist am Kettenende in einer nicht-reduzierenden Endposition lokalisiert ist.
Die Oligosaccharid-Mischung ist besonders geeignet als Aktivmischung in einer kosmetischen Zusammensetzung, im Speziellen zu Zwecken wie anti-aging oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, im Speziellen zu dermatologischen Zwecken (topische Applikation). Besonders hervorzuheben ist, dass die biologischen Effekte, die bei dieser Oligosaccharid-Mischung festgestellt wurden, gut vergleichbar mit denen des Monosaccharids Fukose und diesen sogar überlegen sind.
Vorliegende Erfindung hat ebenso die Zielsetzung, eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die dadurch charakterisiert werden kann, dass sie als kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Bestandteil mindestens eine Oligosaccharid-Mischung, wie vorangehend beschrieben, und zumindest ein kosmetisch oder pharmazeutisch akzeptables Vehikel enthält.
Für den Fall einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist dies bevorzugt eine dermatologische Zusammensetzung zur topischen Anwendung, daher ist zumindest ein pharmazeutisches Vehikel, das für diese dermatologische Applikation geeignet ist, vorhanden.
Das kosmetisch oder pharmazeutisch geeignete Vehikel kann ein jedes dem Fachmann bekanntes Vehikel sein, das den Zweck erfüllt, eine erfindungsgemäße Zusammensetzung bereitzustellen, z.B. in Form einer Creme, einer Lotion, eines Gels, einer Salbe etc., möglicherweise in Form einer Emulsion, die zusätzlich auch andere dem Fachmann bekannte Verbindungen enthalten können, die die Zusammensetzung aus kosmetischer oder pharmazeutischer Sicht verbessern, modifizieren oder stabilisieren.
Der Ausdruck „pharmazeutisch geeignetes Vehikel" umfasst ebenso Hilfsstoffe, die einem veterinären Verwendungszweck der erfindungsgemäßen Zusammensetzung angepasst sind.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann insbesondere weitere Additive enthalten, die zugunsten der Formulierung wirken, z.B. Antioxidantien zur Bekämpfung freier Radikale. Besondere Erwähnung verdienen Vitamin E oder Di-alpha-tocopherol und dessen Derivate, und 2,6-Di-tert-butyl-p-cresol (BHT).
Vorzugsweise kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung im Speziellen zumindest ein weiteres Additiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hautaufbauenden Wirkstoffen (wie z.B. Squalan und Sphingo-Lipide), feuchtespendenden Wirkstoffen (wie z.B. Glycerin und Hydroxyprosilan C), Weichmachern (wie z.B. Butylenglykol und Cetyllactat), Siliconen (wie z.B. Cyclomethicon), Sonnenschutzmitteln (wie z.B. Parsol 1789 und Eusolex 6300), Emulgatoren (besonders Carbopol 1342 in Verbindung mit Triethanolamin und Lecithin aus Sojabohnen), Verdickungsmitteln (insbesondere Xanthangummi), Radikalfängern (besonders EDTA), Antioxidantien (z.B. BHT wie oben beschrieben), Duftstoffen, Konservierungsmitteln, Wasser und Mischungen davon.
Selbstverständlich sind die Bedingungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung Teil des dem Fachmann zur Verfügung stehenden Fachwissens.
Vorzugsweise ist die Oligosaccharid-Mischung in einem Verhältnis von 0,001 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,1 bis 10 Gew.-% bezüglich des Gesamtgewichts der kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden.
Ohne durch irgendeine Theorie eingeschränkt werden zu wollen, ist die vorteilhafte Aktivität der erfindungsgemäßen Oligosaccharid-Mischung, wie in den folgenden Beispielen dargestellt, insbesondere auf ihr hohes Vermögen zur Interaktion mit den Zellmembranen über die hydrophoben Funktionen der hoch verfügbaren Methylgruppen der Fukose und auf ihre Interaktion mit dem Mannose-Fukose-Rezeptor der Hautzellen, Makrophagen oder Langerhans-Zellen (Condaminet et al.: Human epidermal Langerhans cells express the mannose-fucose binding receptor, Eur. J. Immuno. 1998, 28; 3541–3551) zurückzuführen. Die Gesamtheit dieser Effekte kann als Effekt zur Stimulation zellularer Kommunikationen charakterisiert werden.
Daher hat vorliegende Erfindung auch die Aufgabe, die voran beschriebene Oligosaccharid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulation zellulärer Kommunikationen zwischen den Hautzellen zu verwenden.
Andererseits liegt vorliegender Erfindung auch die Aufgabe zugrunde, die im vorangegangenen beschriebene Oligosaccharid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulation der zellularen Proliferation der Keratinozyten der Haut zu verwenden.
Weiterhin liegt vorliegender Erfindung die Aufgabe zugrunde, die im vorangegangenen beschriebene Oligosaccharid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulation der zellularen Proliferation der Fibroblasten der Haut zu verwenden.
Letztlich liegt vorliegender Erfindung die Aufgabe zugrunde, die im vorangegangenen beschriebene Oligosaccharid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zu verwenden, die die Synthese von Elastase-ähnlichen Proteasen durch die Fibroblasten der Haut unterbinden.
Die Fibroblasten der menschlichen Haut synthetisieren verschiedene Proteasen, von denen einige Elastase-ähnliche Aktivität zeigen. Dies gilt im Speziellen für MMP-2 und MMP-9 und für Membran-MMP.
In geringer Konzentration (1 bis 2 mg/ml) zu den Fibroblasten zugegebenes Hyaluronan erhöht die Elastase-ähnliche Aktivität signifikant. Überraschenderweise zeigte sich, dass die erfindungsgemäße Oligosaccharid-Mischung diesen Stimulus blockiert. Da Hyaluronan konstant in der perizellulären Umgebung zugegen ist, kann diese Blockierungsaktivität als Möglichkeit angesehen werden, den alterungsbedingten Abbau der Hautmatrix zu reduzieren.
Daher liegt vorliegender Erfindung ebenso die Aufgabe zugrunde, die im Vorangehenden beschriebene Oligosac charid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zu verwenden, die beabsichtigt, die Superexpression der Proteasen MMP-2 und MMP-9, induziert durch Hyaluronan, zu unterbinden.
Im Speziellen liegt vorliegender Erfindung auch die Aufgabe zugrunde, die im vorangegangen beschriebenen Oligosaccharid-Mischungen zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Inhibition der Synthese der Proteasen MMP-2 und MMP-9 durch die Fibroblasten der Haut bestimmt ist, zu verwenden.
Andererseits konnte kürzlich gezeigt werden, dass die Aktivität der MMP im Fall der Sensibilisierung durch Kontakt entscheidend ist (M. C. Lebre et al., Arcg. Dermatol. Res. 1999, 291, 447–452). In der Gegenwart von MMP-Inhibitoren können die Langerhans-Zellen der Epidermis nicht durch die Dermis migrieren, wie es zum Zeitpunkt der Sensibilisierung durch Kontakt der Fall ist. Auf diese Weise besitzt die Inhibition der Aktivität der MMP durch die erfindungsgemäße Oligosaccharid-Mischung einen realen Effekt, nämlich der Abnahme der Sensibilität der Haut gegenüber Irritationen.
Daher stellt sich vorliegende Erfindung ebenso die Aufgabe, die vorangegangene beschriebene Oligosaccharid-Mischung zur Herstellung einer Zusammensetzung zu verwenden, die eine Abnahme der Sensibilität der Haut gegenüber Irritationen beabsichtigt.
Die erfindungsgemäße Oligosaccharid-Mischung ermöglicht es, eine Zunahme der Dicke der Epidermis und der Dermis zu erreichen. Statistisch sind diese beiden Effekte von hoher Signifikanz. Bei der Abnahme der Hautdicke mit zunehmendem Alter ist dieser trophische Effekt der erfindungsgemäßen Oligosaccharid-Mischung sehr wichtig bei der Vorbeugung von Hautalterung.
Besonders kann eine Wiederverstärkung der Collagen-Bündel der Dermis einer Haut, die mit einer erfindungsgemäßen Oligosaccharid-Mischung behandelt wurde, festgestellt werden. Angesichts der großen Bedeutung der Rolle dieser Collagen-Bündel bezüglich der Festigkeit der Haut stellt dies ein gewichtiges Ergebnis gegen die Hautalterung dar.
Als Konsequenz ist es ebenso Aufgabe der im Vorangehenden beschriebenen Oligosaccharid-Mischung eine Zusammenstellung bereitzustellen, die dazu gedacht ist, die Ablagerung von Collagenfasern in der Dermis zu stimulieren.
Die Oligosaccharid-Mischung wird, wie oben beschrieben, verwendet, vorzugsweise in einem Verhältnis von 0,001 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 0,1 bis 10 Gew.-% bezüglich des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Die so hergestellte Zusammensetzung beinhaltet weiterhin ein kosmetisch oder pharmazeutisch (speziell dermatologisch geeignetes) Vehikel, wie sie dem Fachmann bekannt sind.
Letztlich liegt vorliegender Erfindung auch die Aufgabe zugrunde, eine Methode zur kosmetischen Behandlung der Haut bereitzustellen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass eine kosmetische Zusammensetzung, die zumindest ein weiter oben beschriebenes Oligosaccharid-Gemisch beinhaltet, auf die Haut aufgebracht wird. Die kosmetische Zusammensetzung beinhaltet weiterhin ein kosmetisch geeignetes Vehikel, wie es dem Fachmann bekannt sind.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, sie sind jedoch nicht so zu verstehen, dass der erfindungsgemäße Sachverhalt auf diese Ausführungsformen eingeschränkt wird.
1 zeigt ein Histogramm, das die Ergebnisse des Beispiels 3.b.1 darstellt, in Form des Prozentsatzes der Effektivität der Reduktion des Verhältnisses von aktiver zu inaktiver Form der MMP-2 und MMP-9, die von den Explantaten der Haut abgegeben wurden.
2 zeigt ein Histogramm, das die Ergebnisse des Beispiels 3.b.1 darstellt, in Form des Prozentsatzes der Effektivität der Reduktion des Verhältnisses von aktiver zu inaktiver Form der MMP-2 und MMP-9, die von den Explantaten der Haut, stimuliert durch Hyaluronan, abgegeben wurden.
3 zeigt ein Histogramm, das die Ergebnisse des Beispiels 3.b.2 darstellt, in Form des Prozentsatzes der Effektivität der Reduktion der Expression von MMP-2 von Explantaten der Haut.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung einer erfindungsgemäßen Oligosaccharid-Mischung
a) Fermentation
Es wird der Mikroorganismus Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae verwendet, der unter der Nummer I-1507 in der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes hinterlegt ist. Das Nährmedium und die weiteren Fermentationspara meter werden im Folgenden erläutert:
Herstellung der Inoculums:

Kulturmedium:
Neosorb^® 70-07 (Sorbitol-Gehalt: 70 Gew.-%, von ROQUETTE FRERES, Lille/France): 17,90 g/l (d.h. 12,5 g/l Sorbitol)
Peptona Biokar 104003 (Protein-Hydrolysat, von SOLABIA-BIOKAR, Pantin, France): –4,50 g/l
Hefeextrakt: 0,05 g/l
KH₂PO₄: 1,50 g/l
K₂HPO₄: 4,50 g/l
MgSO₄, 7H₂O: 0,20 g/l
Pluronic^® PE 6100 (Entschäumungs-Mittel), von BASF, D-6700, Ludwigshafen, Germany: 0,50 g/l

Herstellen einer wässrigen Lösung:

Kultur-Bedingungen:
Sterilisation bei 121°C für 30 Minuten,
Kultur-Temperatur: 30°C,
Impfrate: 5 bis 10%,
Belüftung: 1 VVM,
nicht-regulierter pH-Wert (pH ungefähr 7,00),
Kulturdauer: 24 Stunden,
Produktionsmedium:
Kulturmedium,
Neosorb^® 70-07: 54,00 g/l (d.h. 38 g/l Sorbitol),
Peptona Biokar^®b 104003: 4,50 g/l,
Hefeextrakt: 0,05 g/l,
KH₂PO₄: 1,50 g/l,
MgSO₄, 7H₂O: 0,20 g/l,
Pluronic^® PE 61000: 0,50 g/l,
Herstellen einer wässrigen Lösung,
Kultur-Bedingungen (Chemap Fermentationskessel mit einem Nutzungsvolumen von 350 l),
Sterilisation bei 120°C für 45 Minuten,
Kultur-Temperatur: 30°C,
Impfrate: ungefähr 5%,
Rühren: 300 rpm (Rushton-type-Rührer),
Belüftung: 1 VVM,
pH-Wert reguliert auf 7,0 durch NaOH7N,
Druck: 100 bis 200 mbars,
Kulturdauer: 60 bis 65 Stunden,

Bei der Produktion erreichter Durchschnittswert:

Viskosität am Ende des Zyklus: 40000 MPas (Viskosimeter: Brookfield DV-II+model LV, movable SP 31, Kammer SC4-34/13R, 30°C),
Konzentration der im Medium produzierten Polysaccharide, berechnet in L-Fukose, 2 g/l (Dische and Shettles-Verfahren),
verbrauchtes Sorbitol: > 35 g/l (in Sorbitol),
verbrauchtes NaOH (20 Gew.-%): 15 l/m³,
Start der pH-Wert-Regulierung: 16–17 Stunden nach Einimpfen in den Fermentationskessel,
endgültiger Trockenextrakt des Fermentationsmediums: ≈ 20 g/l.

b) Gewinnung des gebildeten Polysaccharids
Der Fermentationsmost wird einer Behandlung bei einer Temperatur von 120°C für 45 Minuten und bei einem pH-Wert von 5,5 unterzogen. Das Produkt der Hitzebehandlung wird mit Hilfe einer mit Platten vom Seitz-Typ ausgestatteten Filterpresse filtriert. Auf diese Weise wird ein klares, viskoses, zellfreies Polysaccharid erhalten. Anschließend wird das Polysaccharid in Ethanol gefällt, wobei 1,5 Volumenanteile Ethanol zu einem 1 Volumenanteil Polysaccharid ver wendet werden. Anschließend wird eine Trocknung unter Vakuum bei einer Temperatur von 25°C durchgeführt, bis ein Pulver erhalten wird. Angesichts des verwendeten Mikroorganismus besteht dieses Polysaccharid aus sich wiederholenden Einheiten des Trisaccharids Fukose-Galaktose-Galakturonsäure und wird durch folgende Strukturformel wiedergegeben:
c) Moderate Hydrolyse des Polysaccharids
Basierend auf dem Gesamtgewicht der Lösung wird eine 5 Gew.-%-ige wässrige Lösung des Polysaccharid-Pulvers hergestellt. Die wässrige Lösung wird einer Hitzebehandlung unterzogen, d.h. Erhitzen auf 100°C für 3 Stunden in der Gegenwart eines Protonen-freisetzenden Harzes.
d) Enzymatische Hydrolyse
Das Pulvergemisch aus Zitronensäure (4,15 g/kg) und Dinatriumhydrogenphosphat (ca. 10,75 g/kg) wird in das Hydrolysat eingebracht. Die Temperatur der Lösung wird auf 37°C eingestellt. Das enzymatische Präparat Fermizyme HCP, erhältlich von Gist Brocades, wird zur moderaten Hydrolyse durch Protolyse in einer Menge von 20 Gew.-% bezüglich des ursprünglich eingebrachten Gewichts des Polysaccharids, d.h. 0,05 Gew.-% bezüglich der Gesamtmasse der wässrigen Lösung, nach Lösen des Pulvers im Wasser wie oben beschrieben, zugegeben.
Die so erhaltene Mischung wird 15 Stunden lang bei einer Temperatur von 37°C gerührt, dabei wird der pH-Wert durch das Puffergemisch auf 6 eingestellt.
e) Deaktivierung des Enzyms und Gewinnung der Oligosaccharid-Mischung
Das Hydrolyse-Produkt wird mit einer mit Platten vom Seitz-Typ ausgestatteten Filterpresse filtriert. Die gesammelte Lösung wird dann einer Hitzebehandlung bei 10°C für eine Dauer von 30 Minuten unterzogen, um das Enzym zu deaktivieren. Anschließend lässt man die Lösung auf eine Temperatur von 25°C abkühlen. Während des Abkühlprozesses werden die Konservierungsmittel Phenoxyethanol (1 Gew.-%) und Phenonipe (0,3 Gew.-%) zur Lösung gegeben. Anschließend wird das Gesamtgemisch einer sterilen Filtration unterzogen.
Die auf diese Weise erhaltene Oligosaccharid-Mischung wird im Folgenden „Gemisch 1" genannt.
Beispiel 2: Charakterisierung des Gemisches 1 durch HPLC
Die Fraktionierung des Gemisches 1 aus Beispiel 1 wurde zu dem Zweck ausgeführt, das Verhältnis von Oligosacchariden und Polysacchariden in der Zusammensetzung festzustellen.
a) Fraktionierung durch „Preparative Exclusion Chromatography" auf Trennsäule „XK 50/60 Superdex 75 prepgrade"
50 ml des Gemisches 1, aufkonzentriert auf 50 mg/ml, werden auf eine präparative Trennsäule „XK 50/60 Superdex 75 prepgrade" (Ausschluss-Chromatographie) gegeben und 95 Fraktionen gesammelt, die anschließend in HPLC aufgegeben werden.
Tabelle 1: Technische Informationen bezüglich der präparativen Trennsäule XK 50/60 Superdex 75 prepgrade
Nach Auftrennung des Gemisches 1 auf der Trennsäule „XK 50/60 Superdex 75 prepgrade" wurden 95 Fraktionen gesammelt, von denen 45 Oside enthalten.
b) Charakterisierung der Fraktionen durch HPLC (Ausschluss-Chromatographie) Ultrahydrogel 120- und Ultrahydrogel 250-Trennsäulen
Ziel dieses zweiten Teils der Studie war es, alle 95 Fraktionen des Gemisches 1 auf eine HPLC-Ausschluss-Trennsäule (Ultrahydrogel 120- und 250-Trennsäulen) aufzugeben, um die molekularen Gewichte und die Konzentrationen der Verbindungen dieser Fraktionen zu analysieren.
Zu diesem Zweck wurde mit einem Waters HPLC-System gearbeitet, dessen Beschreibung im Folgenden wiedergegeben ist.
Tabelle 2: Technische Charakteristika des verwendeten HPLC-Chromatographiesystems
Tabelle 3: Molekulare Gewichtsstandards von Polyethylenglykol (Fluka), die bei der HPLC-Ausschluss-Chromatographie verwendet wurden.
c) Ergebnisse
Die Molekulargewichte der Verbindungen der untersuchten Fraktionen wurden unter Verwendung folgender Gleichung berechnet und mit den molekularen Gewichtsstandards von Fluka (beschrieben in Tabelle 3) erhalten: Molekulargewicht der Komponenten = 55290000·10^(–0,13942·X)

R²: = 0.982
X: = Elutionszeit (min)

Die erste Fraktion des Gemisches 1, die Verbindungen enthält, ist Nr. 44, die letzte Fraktion Nr. 89, was bedeutet, dass die gleiche Verbindung mit weniger erhöhtem Molekulargewicht nach 89 gesammelten Fraktionen erhalten werden (nach Elution von 89 × 12,5 ml = 1112,5 ml). Die auf gefangenen Fraktionen beinhalten Mono-, Oligo- und Polysaccharide von 184 Da (Mischung von Monosacchariden) bis zu 21 kDa. Daher beinhaltet diese Fraktion Polysaccharide, die aus durchschnittlich 117 Monosaccharid-Einheiten oder aus 39 Trisaccharid-Einheiten bestehen.
Die meisten der Fraktionen mit Ausnahme der Fraktionen Nr. 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85 und 86 beinhalten einen einzelnen Saccharid-Peak (die Trennung wird durch die Sensitivität der verwendeten Separationsmethode limitiert).
Die ungefähre Konstellation der verschiedenen Fraktionen kann durch Verwendung eines abgeschätzten Bereiches von Fukose-Standards mit wachsender Konzentration bestimmt werden. Diese Art eines „Einkomponenten-Abschätzungsbereich" konnte aufgrund des Detektionssystems (Messung des Refraktionsindex mit einem Refraktometer) verwendet werden. Diesen Ergebnissen zufolge ergibt eine Lösung mit 1 μg/ml Fukose im Durchschnitt einen Flächen-Peak von 29409 (willkürliche Einheiten des Systems). Mit den einmal bekannten Flächen der analysierten Peaks war es möglich, die zugehörigen Konzentrationen zu berechnen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das Gemisch 1 ungefähr 26% kleiner Oside (bis 2 kDa, ungefähr 4 Trisaccharid-Einheiten), ungefähr 36% an Oligosacchariden (bis 4 kDa, 8 Trisaccharid-Einheiten) und ungefähr 23% Polysaccharide mit einem Molekulargewicht höher als 10 kDa (18 Trisaccharid-Einheiten) enthält.
Hinsichtlich des Mikroorganismus und des spezifischen Enzyms (Endofukosidase), die zur Darstellung des Gemisches 1 verwendet wurde, hat es den Anschein, dass die Oligosaccharide des Gemisches eine Fukose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition besitzen.
Beispiel 3: Aktivität von Fukose und des Gemisches 1 auf die Aktivität von Matrixmetalloproteasen humaner Haut
Es wird vorgeschlagen, den Einfluss der Monosaccharid-Fukose und des Gemisches der Oligosaccharide (Gemisch 1) wie in Beispiel 1 dargestellt, auf die Aktivität der Matrixmetalloproteasen (MMP) der Fibroblasten in ruhendem Zustand oder stimuliert durch Hyaluronan zu untersuchen. Die Untersuchungen wurden an Zellkulturen von Fibroblasten von humaner Haut, die in Monolayern kultiviert wurden, aber auch an Kulturen von Explantaten zur Untersuchung des Effekts unterschiedlicher Behandlungsmethoden auf eine Zellumgebung, die der der Haut am nähesten kommt, durchgeführt. Die dermalen Fibroblasten werden in der Tat von einer extrazellulären Matrix, die in vivo im Überfluss vorhanden ist, eingeschlossen. Daher ist eine Kultur von Explantaten ein Typ von Kultur, der die natürliche Umgebung der Zellen wiederherstellt, um daher Untersuchungen des Effekts von Behandlungen auf die Aktivität von MMP der Fibroblasten unter Bedingungen, die den physiologischen Bedingungen nahe kommen, zu unternehmen.
a) Methode
a.1) Kultur eines Hautexplantats
a.1.1) MMP-Aktivität von nicht stimulierten Hautexplantaten
Hautexplantate von der Haut vom Bauch einer 54 Jahre alten Frau wurden in einem DMEM Medium ohne Phenolrot (GIBCO) unter Rühren bei 37°C 48 Stunden lang bei unterschiedlichen Behandlungen kultiviert. Die Proben wurden mit einer Konzentration von 10 μg/ml behandelt.
Gewinnung der Proben:

Extrazelluläres Medium – 1 ml Medium
Intrazelluläres Medium – Explantatgrund mit Ultraturax in 1 ml MMP-Puffer

Zusammensetzung des MMP-Puffers:

0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 10 mmol CaCl₂, 1 mol Zinkacetat, 0,01% Brij 35, 0,01% NaN₃.

Zymographie:
Gelatine, das Substrat der MMP-s wurde mit 1 mg/ml mit einem 10%-igen Gel von Polyacrylamid copolymerisiert. Die extrazellulären Medien von den Kulturen des Hautexplantats wurden auf die Oberfläche des Gels aufgebracht, die Elektrophorese wurde bei 150 Volt durchgeführt. Die Gele wurden anschließend in MMP-Puffer 24 Stunden lang unter Rühren bei 37°C inkubiert. Die Gele wurden anschließend mit Coomassie-Blau angefärbt, dann mit destilliertem Wasser wieder entfärbt. Die Lysebereiche, die auf eine MMP-Aktivität zurückzuführen waren, erschienen weiß, während der Hintergrund des Gels blau war. Das Molekulargewicht der Enzyme, die die Gelatine abgebaut haben, konnte in Abhängigkeit von der Wanderungsstrecke der Proteine bestimmt werden. Die MMP-Aktivität wurde durch morphometrische Analyse mit Hilfe eines Visiolab-Computers quantifiziert.
a.1.2) MMP-Aktivität der Hautexplantate angeregt mit 12 mg/ml Hyaluronan
Die Protokollierung des Experiments erfolgte auf gleiche Weise wie bei der Studie der MMP-Aktivität der Hautexplantate, die nicht angeregt wurden, jedoch unter Zugabe von Hyaluronan mit einer Konzentration von mg/ml zum Zellkulturmedium und einer Oligosaccharid-Konzentration der Proben von 10 μg/ml.
a.2) Zellkultur der Hautfibroblasten
a.2.1) MMP-Aktivität von Hautfibroblasten ohne Anregung
Hautfibroblasten der Haut vom Bauch einer 45 Jahre alten Frau wurden bis zum 7. Zelldurchgang in einem DMEM-Glutamax (GIBCO) Medium, das 1% Antibiotika und Fungizide und 10% eines fötalen Kalbserums enthielt, kultiviert und für das Experiment verwendet. Die Fibroblasten wurden mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Napf auf Mikrotiterplatten (6 Reihen) aufgetragen. Beim Zusammenfluss wurde das Kulturmedium durch ein DMEM Medium ersetzt, das 0,1% BSA und verschiedene zu untersuchende Substanzen mit einer Konzentration von 10 μg/ml, jedoch kein Phenolrot enthielt. Nach 24 Stunden Kultivierung bei 37°C (5 Vol-% CO₂, 95 Vol-% Luft) wurden die Proben aufgearbeitet.
Extrazelluläres Medium – 1 ml des Mediums + 2 Spülungen mit 0,25 ml PBS
Intrazelluläres Medium – geschalter Zellteppich mit 1 ml MMP-Puffer
Zusammensetzung des MMP-Puffers:

0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 10 mmol CaCl₂, 1 mmol Zinkacetat, 0,01% Brij 35, 0,01% NaN₃.

Wie im Fall der Kultur der Hautexplantate wurde das Kulturmedium der Fibroblasten mit Hilfe der Zymographie untersucht.
a.2.2) MMP-Aktivität der Hautfibroblasten, stimuliert mit 1 mg/ml Hyaluronan
Die Protokollierung der Experimente erfolgte auf gleiche Weise wie bei der Studie der MMP-Aktivität der Hautfibroblasten, die nicht angeregt wurden, jedoch unter Zugabe von Hyaluronan mit einer Konzentration von 1 mg/ml zum Kulturmedium und einer Oligosaccharid-Konzentration der Proben von 10 μg/ml.
b) Ergebnisse
b.1) MMP-Aktivität der Hautexplantate
Die MMP-Enzyme, die in der Form von Zymogenen abgeschieden werden, sind inaktiv. Ihre Aktivierung erfolgt durch proteolytische Spaltung, die aktive Form des Enzyms kann dann die Verbindungen der extrazellulären Matrix abbauen. Daher ist es von großem Interesse, nicht nur den Expressionslevel der MMP-s, sondern auch das Verhältnis von MMP, das in aktiver Form vorhanden ist, zu kennen, welche nur in vivo im Stande ist, die extrazelluläre Matrix abzubauen, genauso wie die Enzyme im Stande sind, die latenten Formen zu aktivieren. Die Ergebnisse wurden daher als Verhältnis der aktiven Form/inaktiven Form des Enzyms dargestellt und der Prozentsatz errechnet, um die Effektivität von Fukose und des Gemisches 1 der Fähigkeit des Abbaus des aktiven Anteils von MMP und der möglichen Inhibition der Aktivität der inaktiven Form zu beweisen.
Tabelle 4: MMP-Aktivität von nicht-stimulierten Hautexplantaten: Verhältnis von aktiver Form/inaktiver Form des Enzyms Prozentsatz der Effektivität der Behandlung: Reduktion dieses Verhältnisses
Diese Ergebnisse sind auch gleichwertig in Form eines Histogramms in 1 dargestellt.
Fukose und Gemisch 1 sind im Stande, das Verhältnis von aktiver Form/inaktiver Form des Enzyms zu erniedrigen. Dieses Phänomen ist für MMP-9 von größerer Bedeutung als für MMP-2. Die Abnahme dieses Verhältnisses impliziert, dass die Menge an aktiven Enzymen, die ja im Stande sind, in vivo die extrazelluläre Matrix abzubauen, weniger Bedeutung besitzt, wenn die Hautexplantate in der Gegenwart von Fukose oder des Gemisches 1 kultiviert werden.
Tabelle 5: MMP-Aktivität von Hautexplantaten, angeregt mit 1 mg/ml Hyaluronan Verhältnis der aktiven Form/inaktiven Form des Enzyms Prozentsatz der Effektivität der Behandlung: Reduktion dieses Verhältnisses
Diese Ergebnisse sind auch gleichwertig in Form eines Histogramms in 2 dargestellt.
Die Anwesenheit von Hyaluronan im Kulturmedium der Hautexplantate verursacht einen Anstieg der aktiven Form der MMP-s. Fukose und das Gemisch 1 reduzieren diesen Anstieg und sind daher geeignet, diese Anregung der Freisetzung von aktiven Enzymen zu verändern.
b.2) MMP-Aktivität der Fibroblasten
Bei der Kultivierung der Fibroblasten als Monolayer ist nur das verbreitet abgeschiedene MMP-2 sichtbar, mit einem sehr geringen Anteil von MMP-9, das aber trotzdem vorhanden ist. Nur die inaktive Form des MMP-2-Enzyms wird freigesetzt.
Tabelle 6: MMP-Aktivität von nicht stimulierten Hautexplantaten Prozentsatz der Effektivität der Behandlung: Reduktion der Expression von MMP-2
Diese Ergebnisse sind auch gleichwertig in Form eines Histogramms in 3 dargestellt.
Es kann beobachtet werden, dass Fukose und das Gemisch 1 die Expression von MMP-2 mindern. Zur Abnahme dieser Expression scheint das Gemisch 1 effektiver zu sein als Fukose.
Tabelle 7: MMP-Aktivität von Hautexplantaten, die nicht mit 1 mg/ml Hyaluronan stimuliert wurden. Prozentsatz der Effektivität der Behandlung: Reduktion der Expression von MMP-2 bezüglich der Kontrolle
c) Schlussfolgerung
Aus diesen Experimenten kann schlussgefolgert werden, dass Fukose und das Gemisch 1 im Stande sind, die Synthese und auch die Aktivität von MMP-2 und MMP-9 durch die Fibroblasten von humaner Haut herabzusetzen. Auf gleiche Weise verhindern Fokuse und das Gemisch 1 auf hocheffiziente Weise die Superexpression der Metalloproteasen in Gegenwart von Hyaluronan. Angesichts der wichtigen Rolle dieser Metallo-Endopeptidasen beim Abbau der kutanen extrazellulären Matrix während des Alterungsprozesses ist dies als wichtiges Ergebnis bei der Bekämpfung der Hautalterung anzusehen.
Beispiel 4: Beeinflussung der Fibroblasten humaner Haut durch Fukose und Gemisch 1
Ziel dieser Studie war es, den Einfluss des Gemisches 1 aus Beispiel 1 auf einen charakteristischen Parameter der zellulären Kommunikation sowie den Einfluss auf die Vorbeugung der Alterung der Fibroblasten humaner Haut, nämlich den Stimulus der zellulären Proliferation der Fibroblasten von humaner Haut, zu untersuchen.
a) Methodologie:
Untersuchung der zellulären Proliferation
Die Fibroblasten der in dieser Studie verwendeten humanen Haut wurden der Haut einer 20 Jahre alten Frau entnommen (26 Durchgänge). Die Zellen wurden auf Mikrotiterplatten (12 Reihen) in einem DMEM-Kulturmedium mit 10% eines fötalen Kalbserum (SVF), 1% Antibiotika und Fungiziden (PSF) und 1 μCi/ml von [³H]-Timidin (ICN) 72 Stunden lang in der Gegenwart der zu untersuchenden Produkte mit 2 Endkonzentrationen für jede Probe (1 μg/ml und 10 μg/ml) kultiviert.
Nach 72 Stunden Kultivierung im Ofen (5 Vol-% CO₂, 95 Vol-% Luft) bei 37°C in Gegenwart der Proben, wurden die Zellen vier Mal mit PBS gewaschen, dann wurde der Zellteppich mit 0,05% Trypsin abgelöst. 3 ml einer Szintillations-Flüssigkeit wurden pro Probe zugegeben, dann wurde die von den Zellen aufgenommene Radioaktivität über die Szintillation in einen Computer eingelesen.
b) Einfluss auf die zelluläre Proliferation
Die 72-stündige Inkubation der Fibroblasten mit den 2 untersuchten Proben (Konzentrationen von 1 μg/ml und 10 μg/ml) bewirkt eine signifikante Stimulation der zellulären Proliferation im Vergleich mit nicht behandelten Zellen (siehe Tabelle 8 unten).
Tabelle 8: Einfluss von verschiedenen Konzentrationen des Gemisches 1 auf die Zellproliferation der Fibroblasten von humaner Haut (Proliferation in Bezug auf die Kontrolle)
Beispiel 5: anti-aging-Creme
Beispiel 6: anti-aging-Creme

Claims

Mischung von unsulfatierten, auf Fucose basierenden Oligosacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass sie Oligosaccharide von weniger als 13 Saccharid-Einheiten und mindestens eine Fucose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition enthält und dass sie durch ein Verfahren herstellbar ist, das mindestens einen Schritt des Abbaus eines Polysaccharid aus einem Mikroorganismus des Geschlechts Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae umfasst.
Mischung von Oligosacchariden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 15 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, Oligosaccharide mit weniger als 13 Saccharid-Einheiten und mindestens eine Fucose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition enthalten sind.
Mischung von Oligosacchariden nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass von 20 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, Oligosaccharide mit weniger als 13 Saccharid-Einheiten und mindestens eine Fucose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition enthalten sind.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich von 25 bis 45 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, Oligosaccharide mit 13 bis 24 Saccharid-Einheiten und mindestens eine Fucose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition enthalten sind.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich 15 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, Oligosaccharide mit mehr als 54 Saccharid-Einheiten und mindestens eine Fucose-Einheit in einer nicht-reduzierenden Endposition enthalten sind.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligosaccharide zumindest teilweise das Motiv der Wiederholung von Fucose-Galactose-Glacturonsäure enthält.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch das Verfahren mit den folgenden Schritten herstellbar ist: a) der Mikroorganismus des Geschlechts Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae wird in einem wässrigen Nährmedium durch aerobe Fermentation einer vergleichbaren Glucid-Quelle aufgezüchtet, b) die aus dem Fermentations-Most gebildeten Polysaccharide werden wieder hergestellt, c) die gebildeten Polysaccharide werden einer moderaten Hydrolyse unterworfen, d) das Hydrolyseprodukt aus Schritt c) wird einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen und e) nach Wiederherstellung der Mischung der so gebildeten Oligosaccharide wird das Enzym deaktiviert.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae der Mikroorganismus ist, der in der nationalen Sammlung der Mikroorganismuskulturen unter Nr. I-1507 oder einer Mutation hiervon abgelegt ist.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die moderate Hydrolyse durch eine Behandlung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Behandlungen mit Gamma-Strahlen, Protolyse-Behandlungen und deren Kombinationen durchgeführt wird.
Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Hydrolyse mit mindestens einer Endofucosidase durchgeführt wird.
Mischung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Endofucosidase Fermizym HCP ist.
Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein kosmetisch oder pharmazeutisch wirksames Mittel, mindestens eine Mischung von Oligosacchariden nach einem der vorhergehenden Ansprüche und mindestens einen kosmetisch oder pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eine dermatologische Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung der Oligosaccharide in einem Anteil im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, anwesend ist.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die die Stimulation der zellularen Kommunikation zwischen den Hautzellen beabsichtigt.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Stimulation der zellularen Poliferation der Keratinozyten der Haut beabsichtigt ist.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Stimulation der zellularen Proliferation der Fibroblasten der Haut beabsichtigt ist.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Inhibierung der Synthese von Proteasen vom Elastase-Typ durch die Fibroblasten der Haut beabsichtigt ist.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Her stellung einer Zusammensetzung, die für die Inhibierung der Superexpression der Proteasen MMP-2 und MMP-9, ausgelöst durch Hyaluronan, beabsichtigt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die Inhibierung der Synthese der Proteasen MMP-2 und MMP-9 durch die Fibroblasten der Haut beabsichtigt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die Verringerung der Empfindlichkeit der Haut gegenüber Irritationen beabsichtigt ist.
Verwendung der Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Stimulierung der Ablagerung von Collagen-Fasern auf der Dermis beabsichtigt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung von Oligosacchariden in einem Anteil im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellte Zusammensetzung zusätzlich einen kosmetisch oder pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff enthält.
Verfahren zur kosmetischen Behandlung der Haut, dadurch gekennzeichnet, dass man eine kosmetische Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Mischung von Oligosacchariden nach einem der Ansprüche 1 bis 11 auf der Haut aufbringt.
Verfahren zur kosmetischen Behandlung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die kosmetische Zusammensetzung zusätzlich einen kosmetisch verträglichen Hilfsstoff enthält.