DE60307603T2 - Zellwandderivate aus biomasse und herstellung davon - Google Patents

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    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus der Biomasse von Pilzen oder Hefen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin. Die Erfindung betrifft weiterhin Chitinpolymere, Chitin-Glucan-Copolymere und Chitosanpolymere, die mit Hilfe der Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden können. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung von Chitinpolymeren, Chitin-Glucan-Copolymeren oder Chitosanpolymere, die mit Hilfe der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, in pharmazeutischen, medizinischen, landwirtschaftlichen, textilen, kosmetischen und/oder industriellen Anwendungen sowie deren Verwendung im Umweltsektor, in Lebensmitteln und in funktionellen Lebensmitteln.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Natürliche Polysaccharide wie etwa Stärke, Zellulose oder Chitin haben eine große technologische Bedeutung, da sie in großen Mengen leicht verfügbar sind und einzigartige Eigenschaften aufweisen, die bei synthetischen Polymeren oft nicht vorkommen. Die Zellwände von Pilzen zum Beispiel bestehen aus einem Netzwerk von Polysacchariden, Proteinen und Lipiden, wobei es sich bei den Polysaccharidketten größtenteils um β-Glucane und Chitin handelt.
  • Chitin ist ein natürliches Polymer mit hohem Molekulargewicht, das in der Natur weitverbreitet vorkommt und, nach Zellulose, das zweite Hauptbiopolymer darstellt. Chitin ist ein Polysaccharid, dessen Bauweise derjenigen von Zellulose nahekommt. Es ist der Hauptbestandteil der Oberhaut von Insekten und Krustentieren und bildet auch einen Teil der Zellwände einer Pilze und anderer Organismen. Chitosan wird in industriellem Maßstab durch chemische Modifizierung von Chitin hergestellt und kommt natürlicherweise in einigen Organismen vor. Bei Chitin handelt es sich um ein geradkettiges Polymer aus N-Acetyl-(D)-glucosamin, das β-(1,4)-Glycosidbindungen aufweist und in Formel I dargestellt ist. Bei Chitosan handelt es sich um ein zufällig strukturiertes Copolymer aus N-Acetyl-(D)-glucosamin und (D)-Glucosamin, das in Formel II dargestellt ist. Chitin und Chitosan gehören zu der Familie der Glycosaminglycan-Polymere.
  • Ähnlich wie Zellulose ist Chitin ein faseriges Polysaccharid, das zusätzliche chemische und biologische Eigenschaften aufweist, die in vielen industriellen und medizinischen Anwendungen von Nutzen sind. Chitin ist indes schwieriger zu extrahieren, da es üblicherweise in seiner natürlichen Struktur vorkommt, in welcher es mit anderen Substanzen eng verknüpft ist.
  • Chitosan kann durch teilweise Hydrolyse der Acetylgruppen der N-Acetyl-glucosamin-Einheiten hergestellt werden, wodurch das Polymer in einer verdünnten Lösung der meisten Säuren löslich wird. Chitosan kann auf der Grundlage eines Polymers, das aus Biomasse extrahiert wird, hergestellt werden, nämlich aus Chitin. Es wird durch zwei molekulare Eigenschaften definiert, nämlich durch das durchschnittliche Molekulargewicht und des Acetylierungsgrad, d.h. das den Anteil der acetylierten Glucosamineinheiten entlang der Polymerhauptkette.
  • Formel I: Chitin
    Figure 00030001
  • Formel II: Chitosan
    Figure 00030002
  • Zur industriellen Herstellung von Chitin und Chitosan werden im Allgemeinen Krustentierabfälle, beispielsweise die Panzer von Krabben oder Garnelen verwendet. Nach zwei Schritten, nämlich der Entkalkung mittels Säurebehandlung und die Proteinentfernung mittels Alkalibehandlung, kann das Chitin isoliert werden, woraufhin es einem Deacetylierungsschritt unterzogen wird, wozu eine heiße konzentrierte Alkalilösung verwendet wird. Aus Biomasse gewonnenes Chitin weist indes oftmals einen hohen Gehalt an Mineralien auf, hauptsächlich an Calciumcarbonat, wobei deren Menge bis zu 90 % der Chitintrockenmasse betragen kann. Die Qualität des Chitins und Chitosan ist daher nicht reproduzierbar und hängt von jahreszeitlichen Schwankungen und von der Krustentierart ab. Das Deacetylierungsverfahren führt zu einem Abbau, und Chitosan weist oftmals große Schwankungen hinsichtlich des Molekulargewichts und des Acetylierungsgrades auf, wodurch die Produktentwicklung durch den Anwender erschwert wird. Darüber hinaus führen der hohe Bedarf an Wärmeenergie, die großen Mengen an Natriumhydroxid ebenso so wie die ausgiebige Säurebehandlung, die zur Abtrennung des Chitins vom Calciumcarbonat, dessen Menge bis zu 90 % des Chitintrockengewichts betragen kann, erforderlich ist, zu hohen Produktionskosten.
  • Es gibt indes alternative Quellen für Chitin und Chitosan, wie beispielsweise Pilze, deren Zellwände davon bis zu 40 % enthalten können, bezogen auf das Trockengewicht der Wände. Das Pilzmyzel ist ein komplexes Netzwerk von Fäden, die aus Zellen bestehen. Die Zellwände des Myzels bestehen aus Hemicellulose, Chitin und beta-Glucanen. Pilze, die ausreichende Mengen an Chitin enthalten, können ausgewählt und spezifisch für die Extraktion von Chitin gezüchtet werden. Darüber hinaus enthalten auch Nebenprodukte industrieller Fermentationsverfahren, wie etwa die Biomasse, die nach der Fermentation durch Pilze oder Hefen anfällt, Chitin in Verbindung mit anderen Biopolymeren, hauptsächlich Glucanen, Mannanen, Proteinen und Lipiden. Diese Nebenprodukte der Fermentation werden im Allgemeinen unmittelbar nach ihrer Abtrennung vom Kulturmedium verbrannt, da ihre Aufbewahrung wirtschaftlich uninteressant ist.
  • Damit Chitin und Chitosan sich für möglichst viele Anwendungen eignen, sollten sie von gleichmäßiger und reiner Qualität sein. Die Herstellung von Chitosan aus reinem Chitin, wenn dieses reproduzierbar in großen Mengen und mit geringen Gehalten an anorganischen und proteinischen Verunreinigungen erhältlich wäre, würde daher einen bedeutenden Fortschritt auf diesem Gebiet darstellen.
  • Nach dem Stand der Technik gibt es nicht sehr viele Informationen über andere Quellen als Krustentiere zur Gewinnung von Chitin und Chitosan. Einige Patentschriften und Patentanmeldungen beziehen sich auf Pilzmyzel als mögliche industrielle Chitinquelle, zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 4,960,413, Nr. 6,255,085, Nr. 4,195,175, Nr. 4,368,322, Nr. 4,806,474, Nr. 5,232,842, Nr. 6,333,399 sowie die Patentanmeldungen WO 01/68714, GB-A-458,839, GB-A-2,026,516, GB-A-2,259,709, DE-A-2,923,802 und RU-C2,043,995. Die meisten dieser Schriftstücke offenbaren Verfahren zur Herstellung von Chitosan oder Chitosan-Glucan aus Pilzmy zel. Weiterhin beschreiben die Verfahren die direkte Umwandlung des Chitins, das in den Zellwänden der Pilze enthalten ist, ohne jegliche Zwischenschritte zur Isolierung und Aufreinigung des Chitins. Die Verfahren, die in diesen Patentschriften und Patentanmeldungen beschrieben sind, ermöglichen es daher nicht, reines Chitin als Quelle für reines Chitosan zu gewinnen. In diesen Verfahren kommen hochkonzentrierte Alkalilösungen, extreme Temperaturen und lange Einwirkungszeiten zur Anwendung, was wiederum ein hohes Umweltrisiko nach sich zieht. Darüber hinaus führen diese aggressiven Verfahren wahrscheinlich zur Bildung von Chitinderivaten und Chitosan mit sehr niedrigem Molekulargewicht und eignen sich nicht zur Herstellung von Chitosan mit höherem Molekulargewicht.
  • Weitere Artikel beschreiben Grundlagenstudien der Zellwandstruktur einiger Pilzarten, zum Beispiel Hartland et al. (1994) Yeast 10, 1591-1599; Hong et al. (1994) Yeast, 10, 1083-1092; Heam et al. (1994) Microbiology 140, 789-795; Fontaine et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275, 27594-27607. Diese Studien führen übereinstimmend zu dem Ergebnis, dass die Zellwände hauptsächlich aus Chitin und beta-Glucanen bestehen und dass zwei Arten von Polymerketten eng miteinander verbunden sind, bei den meisten Pilzen wahrscheinlich über kovalente Bindungen. Einige dieser Studien erwähnen die Verwendung spezifischer Enzyme, um die Bestandteile der Zellwände auf selektive Weise abzubauen, etwa mit Hilfe von Glucanasen und Chitinasen, und zwar mit dem Ziel, die verbleibenden Zuckerstoffe weiter zu identifizieren, um so die ursprüngliche Polysaccharidzusammensetzung abschätzen zu können. Im Allgemeinen besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein verbessertes Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus der Biomasse von Pilzen oder Hefen bereitzustellen. Insbesondere besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Isolierung von Chitinpolymeren oder Chitin-Glucan- Polymeren bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Chitinpolymere zu isolieren und gemäß einem schnellen Verfahren, welches weder eine hohen Energiemenge noch den Einsatz umweltschädigender Chemikalien erfordert, Chitosan herzustellen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Isolierung reiner Chitinpolymere bereitzustellen und Chitosanpolymere nicht-tierischer Herkunft herzustellen, die für Anwendungen auf verschiedenartigen Gebieten geeignet sind.
  • Die vorliegende Erfindung hat weiterhin zur Aufgabe, Polymere aus Chitin mit einem hohen Reinheitsgrad bereitzustellen. Darüber hinaus besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Chitin-Glucan-Copolymere bereitzustellen, wobei die Mengen an Chitin und beta-Glucan angepasst werden können. Die vorliegende Erfindung hat weiterhin zur Aufgabe, Chitosan mit einem hohen Reinheitsgrad sowie einem regelbaren Acetylierungsgrad und Molekulargewicht bereitzustellen.
  • Kurzdarstellung
  • In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung darin, ein Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus der Biomasse von Pilzen oder Hefen, welches die folgenden, nacheinander durchzuführenden Schritte umfasst:
    • a) Inkontaktbringen der Biomasse mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilösliche Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion, welche die Zellwandderi vate enthält, weiterverwendet wird,
    • b) Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine Suspension der angesäuerten alkaliunlöslichen Fraktion, welche die Zellwandderivate umfasst, zu erhalten, und
    • c) Inkontaktbringen der angesäuerten Suspension der alkaliunlöslichen Fraktion mit β-Glucanase-Enzymen, wobei die Zellwandderivate erhalten werden.
  • Die Biomasse aus Pilzen oder Hefen, die in dem vorliegenden Verfahren gemäß der Erfindung behandelt wird, besteht aus Pilz- oder Hefezellen, deren Zellwände Chitin enthalten. Alternativ dazu kann es sich bei der Biomasse ebenfalls um ein Nebenprodukt eines industriellen Kulturverfahrens handelt, bei welchem Pilz- oder Hefekulturen verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Hauptnachteile der bestehenden Verfahren umgeht. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Chitin bereit, das gegenüber bestehenden Verfahren und Quellen wirtschaftliche und ökologische Vorteile aufweist. Insbesondere offenbart die Erfindung ein Verfahren, das es ermöglicht, Chitin von β-Glucanen auf kontrollierbare Weise zu abzutrennen, ohne Abbau oder Umwandlung der Chitinketten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, in welchem es sich bei den Zellwandderivaten, die in Schritt c) erhalten werden, um Chitinpolymere oder chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere handelt. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Chitin aus Biomasse aus Pilzen oder Hefen, mit dem Ziel, Chitinpolymere zu erhalten, die im Wesentlichen frei von anderen Polysacchariden wie β-Glucanen sind.
  • Der Begriff "Chitinpolymere" bezieht sich auf Chitinpolymere die mehr als 80 % Chitin und weniger als 20 % beta-Glucan enthalten, wobei sie vorzugsweise mehr als 90 % Chitin und insbesondere mehr als 95 % Chitin enthalten. In einer Ausführungsform handelt es sich bei den bereitgestellten Chitinpolymeren um solche, die mehr als 80 % Chitin umfassen.
  • Der Begriff "chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere" bezieht sich auf Polymere, die sowohl Chitinpolymere als auch Glucanpolymer in bestimmten relativen Anteilen umfassen, wobei der relative Anteil an Chitin aber höher ist als der an Glucan. Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht es, die Anteile an Chitin und Glucan in diesen Chitin-Glucan-Copolymeren spezifisch einzustellen. Der Anteil an Chitin in den Copolymeren kann eingestellt werden, indem die Bedingungen des enzymatischen Hydrolyseschrittes im vorliegenden Verfahren gesteuert werden. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren bereit, mit dem Copolymere erhalten werden können, die Chitin mit einer regelbaren Reinheit umfassen. Der Begriff "Polymere, die Chitin mit einer regelbaren Reinheit umfassen" bezieht sich auf ein Polymerprodukt, bei welchem der Anteil an Chitin mit Hilfe von Glucanase-Enzymen auf kontrollierbare Weise eingestellt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Anteil an Chitin in den chitinreichen Chitin-Glucan-Copolymeren einstellbar und liegt vorzugsweise bei über 75 % und insbesondere bei über 80 %.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, in welchem es sich bei den Zellwandderivaten, die in Schritt a) oder b) erhalten werden, um Chitin-Glucan-Copolymere handelt, bei denen der relative Anteil an Chitin gegenüber Glucan von der verwendeten Biomasse abhängt. Der Begriff "Chitin-Glucan-Copolymere" bezieht sich auf im vorliegenden Schriftstück auf Copolymere nach deren Extraktion aus Biomasse aus Pilzen oder Hefen, jedoch vor einer enzymatischen Reaktion mit Hilfe von Glucanase-Enzymen. Der Anteil an Chitin in den Chitin-Glucan-Copolymeren wird durch die Art von Organismen, aus denen die extrahiert wurden, bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Verfahren gemäß der Erfindung das Myzel von Aspergillus niger verwendet, und die Chitin-Glucan-Copolymere, die aus dem Myzel von Aspergillus niger extrahiert werden, umfassen zwischen 30 und 50 % (w/w) an Chitin und zwischen 50 und 70 % an beta-Glucan.
  • Die Begriffe "Chitin" und "Chitinpolymere" werden im vorliegenden Schriftstücke synonym verwendet. Ebenfalls werden die Begriffe "Chitosan" und "Chitosanpolymere" im vorliegenden Schriftstücke synonym verwendet.
  • In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin, welches die folgenden, nacheinander auszuführenden Schritte umfasst
    • a) Inkontaktbringen des Chitins mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilösliche Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion, welche das teilweise deacetylierte Chitin enthält, weiterverwendet wird,
    • b) Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine angesäuerte alkaliunlöslichen Fraktion, welche das teilweise deacetylierte Chitin umfasst, zu erhalten, und
    • c) Inkontaktbringen der angesäuerten Fraktion mit Chitin-Deacetylase, wobei Chitosan erhalten wird.
  • In diesem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan bereit, wobei Chitosan mit hohem Molekulargewicht und mit einem einstellbaren Acetylierungsgrad, indem Chitin einer enzymatischen Deacetylierungsreaktion mit Hilfe eines Chitin-Deacetylase-Enzyms unterzogen wird. In diesem Aspekt stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan bereit, wobei Chitosan mit niedrigem und mittlerem Molekulargewicht und mit einem einstellbaren Acetylierungsgrad erhalten werden kann.
  • Der Begriff "niedriges und mittleres Molekulargewicht" bezieht sich auf ein durchschnittliches Molekulargewicht von weniger als 100 kDa, gemäß einer Messung mit einem Ubbleohde Kapillarviskosimeter. Der Begriff "hohes Molekulargewicht" bezieht sich auf ein durchschnittliches Molekulargewicht von mehr als 100 kDa, gemäß einer Messung mit einem Ubbleohde Kapillarviskosimeter.
  • Der Begriff "Chitosan mit einem einstellbaren Acetylierungsgrad" bezieht sich auf ein Produkt, bei welchem das Ausmaß der Acetylierung, d.h. der Anteil der N-Acetyl-glucosamin-Einheiten auf kontrollierbare Weise eingestellt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, in welchem es sich bei dem Chitin um Chitin aus Pilzen oder Hefen handelt, welches mit Hilfe des Verfahrens zur Isolierung von Zellwandderivaten aus Biomasse aus Pilzen oder Hefen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann. Da diese Chitinquelle einen sehr hohen Reinheitsgrad aufweist, ermöglicht es die Erfindung, ein Chitosan herzustellen, das ebenfalls einen hohen Reinheitsgrad aufweist. Zusätzlich dazu stellt die Methode ein Chitosan mit einstellbarem Acetylierungsgrad bereit, da dieser eingestellt werden kann, indem die Bedingungen des enzymatischen Hydrolyseschrittes im vorliegenden Verfahren gesteuert werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin aus Pilzen oder Hefen, welches die folgenden, nacheinander auszuführenden Schritte umfasst:
    • a) Inkontaktbringen des Chitins mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilösliche Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion weiterverwendet wird,
    • b) Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, wobei eine säureunlösliche Fraktion und eine säurelösliche Fraktion erhalten werden und wobei die säureunlösliche Fraktion verworfen wird und die säurelösliche Fraktion, welche Chitosan umfasst, weiterverwendet wird.
  • In diesem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan, welches ein niedriges und mittleres Molekulargewicht aufweist, bereit. Dieses Verfahren umfasst eine alkalische Hydrolysereaktion von Chitin, welches aus Biomasse aus Pilzen oder Hefen erhalten wurde. Der Begriff "niedriges und mittleres Molekulargewicht" bezieht sich auf ein durchschnittliches Molekulargewicht von weniger als 100 kDa, wie oben definiert.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Chitinpolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können.
  • Zusätzlich dazu betrifft die Erfindung chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung Chitosanpolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verbundmaterial, das Chitinpolymere, chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, welche mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von Chitinpolymeren, chitinreichen Chitin-Glucan-Copolymeren oder Chitosanpolymeren, welche mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, in pharmazeutischen, medizinischen, landwirtschaftlichen, textilen, kosmetischen und/oder industriellen Anwendungen sowie deren Verwendung im Umweltsektor, in Lebensmitteln und in funktionellen Lebensmitteln.
  • Der Fachmann wird sofort viele weitere Nutzeffekte und Vorteile der vorliegenden Verfahren erkennen sowie die zahlreiche Möglichkeiten zur Nutzung der vorliegenden Erfindung, die sich aus der ausführlichen Beschreibung und aus den untenstehend aufgeführten Beispielen ergeben.
  • Ausführliche Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt das Festphasen-13C-NMR-Spektrum der alkaliunlöslichen Fraktion, die ein aufgereinigtes Chitin-Glucan-Polymer umfasst und die nach alkalischer Verdauung von Pilzbiomasse gemäß dem ersten Schritt im Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Isolierung von Zellwandderivaten erhalten wurde. Das berechnete Chitin-Glucan-Verhältnis beträgt 41:59 (w/w).
  • 2 zeigt eine Röntgenstreuuntersuchung der alkaliunlöslichen Fraktion, die nach alkalischer Verdauung von Pilzbiomasse gemäß dem ersten Schritt im Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Isolierung von Zellwandderivaten erhalten wurde, wobei das Chitin:Glucan-Verhältnis bei 38:62 ± 3 (w/w) lag.
  • 3 zeigt eine Röntgenstreuuntersuchung der alkaliunlöslichen Fraktion, die nach alkalischer Verdauung von Pilzbiomasse gemäß dem ersten Schritt im Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Isolierung von Zellwandderivaten erhalten wurde, wobei das Chitin:Glucan-Verhältnis bei 85:15 ± 8 (w/w) lag.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten
  • In einem ersten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus der Biomasse von Pilzen oder Hefen, welches die oben beschriebenen Schritte umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich bei den Zellwandderivaten um Chitinpolymere handelt. Der Begriff "Polymer" bezieht sich im vorliegenden Schriftstück auf Substanzen mit hohem Molekulargewicht, die Mischungen aus Ketten darstellen, welche durch Wiederholung einer oder mehrerer Arten von monomeren Einheiten entstanden sind. Im Allgemeinen bestehen Polymere aus mindestens drei monomeren Einheiten. Die monomere Einheit ist eine sich wiederholende Einheit, aus welcher die Polymerketten aufgebaut sind. Der Begriff "Chitinpolymere" bezieht sich auf ein Polymer, das aus mindestens 3 monomeren, sich wiederholenden Einheiten von β-(1,4)-N-Acetyl-(D)-glucosamin besteht und vorzugsweise mehr als 10 sowie insbesondere mehr als 20 monomere Einheiten aufweist. Chitinpolymere sind Ketten aus monomeren Einheiten von β(1,4)-N-Acetyl-(D)- glucosamin, die über eine kovalente β-(1,4)-Glycosidbindung verknüpft sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, welches es ermöglicht, das Chitin, das im Myzel von Pilzen und Hefen enthalten ist, zu extrahieren. Im Stand der Technik wurde wiederholt aufgezeigt, dass das Chitin in den Zellwänden der meisten Hefen und Pilze mit weiteren Polymeren über kovalente Bindungen verknüpft ist, zum Beispiel mit Polysacchariden des Typs β-Glucane, wobei eine typische Faserstruktur gebildet wird. Aus diesem Grunde ist das Chitin schwierig aus der Biomasse von Pilzen und Hefen zu extrahieren und in reiner Form zu gewinnen. Um die Chitinketten zu erlangen, müssen die Chitinketten von den anderen Polymerketten abgetrennt werden, vorzugsweise mittels eines nicht abbauenden Verfahrens. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren, das es ermöglicht, Chitin von anderen Polymeren, die hauptsächlich β-Glucane umfassen, abzutrennen, und zwar ohne Abbau der Chitinketten.
  • Chitin kann aus nicht-tierischer Biomasse gewonnen werden, insbesondere aus den Zellwänden von Pilzmyzel oder Hefen aus verschiedenen Gruppen, wozu Zygomycetes, Basidiomycetes, Ascomycetes und Deuteromycetes und/oder Mischungen daraus gehören, wobei Ascomycetes bevorzugt werden. Aspergillus und Hefen wie Saccharomyces gehören zu der letzteren Gruppe. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass die Biomasse aus einer Gruppe gewählt wird, die Schlauchpilze oder Hefen wie etwa Arten von Aspergillium, Penicillium, Trichoderma, Saccharomyces und Schizosaccharomyces sowie essbare Pilze wie etwa Arten von Agaricus, Pleurotus, Boletus und Lentinula und/oder Mischungen daraus umfasst, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Gattungen beschränkt ist. Ein gemeinsames Merkmal dieser Pilze und Hefen ist das Vorhandensein von Chitin in den Zellwänden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Biomasse aus Aspergillus niger gewonnen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Biomasse um ein Nebenprodukt eines Kulturverfahrens handelt, bei welchem Pilz- oder Hefekulturen verwendet werden. Pilzmyzel kann aus Pilzkulturen gewonnen werden, die zur industriellen Herstellung von Verbindungen wie zum Beispiel Zitronensäure, Enzymen und Antibiotika angelegt wurden. Chitin kann aus den Zellwänden dieser Kulturnebenprodukte extrahiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Biomasse um ein Nebenprodukt eines Kulturverfahrens handelt, bei welchem eine Aspergillus niger Kultur verwendet wird, um Zitronensäure zu herstellen.
  • Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst das Inkontaktbringen der Biomasse mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilösliche Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion, welche die Zellwandderivate umfasst, weiterverwendet wird. Bei der Alkalilösung, die verwendet wird, um die Biomasse aus Pilzen oder Hefen zu verdauen, handelt es sich um eine wässrige Lösung von alkalischer Substanzen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid und vorzugsweise um Natrium- oder Kaliumhydroxid. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die basische Lösung eine Konzentration von weniger als 10 % (w/v) auf. Die Alkalikonzentration beträgt vorzugsweise zwischen 0,1 und 15 % (w/v) und insbesondere weniger als 10 %. Die Reaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die vorzugsweise zwischen 5 und 120 °C und insbesondere weniger als 60 °C beträgt. Die Biomasse wird in der Alkalilösung in Suspension gebracht, wobei die Konzentration vorzugsweise zwischen 1 und 15 % (Trockenmasse, w/v) und insbesondere zwischen 3 und 12 % beträgt. Die Reaktion wird vorzugsweise 4 bis 48 Stunden lang durchgeführt und insbesondere weniger als 30 Stunden lang. Dieser erste Extraktionsschritt ermöglicht es, alkalilösliche Verbindungen einschließlich Pigmente Proteine, einiger Lipide und einiger Polysaccharide zu entfernen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Biomasse mit einer ersten Alkalilösung behandelt, filtriert und erneut mit einer zweiten Alkalilösung behandelt werden. In der alkalischen Suspension können Zusatzstoffe verwendet werden, um die Extraktion der alkaliunlöslichen Produkte zu verbessern. Solche Zusatzstoffe können organische Lösungsmittel wie etwa Cyclohexan, Ethylacetat, Methanol oder Ethanol; Schaumverhüter wie etwa Structol; Tenside wie etwa Natriumdodecylsulfat, Poly(vinylalkohol), Tween oder Poloxamere; oder Enzymzubereitungen, die Carboxylesterase, Carboxylesterhydrolase oder Triacylglycerinlipase (sämtlich Synonyme für EC 3.1.1.3) enthalten, umfassen, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Verbindungen beschränkt ist.
  • Um das alkaliunlösliche Produkt der Zellwände der Biomasse, wobei es sich bei vielen Pilz- und Hefebiomassen um ein Chitin-Glucan-Copolymer handelt, zu isolieren, folgen dem ersten Schritt wiederholte Waschschritte in Wasser, woraufhin filtriert und getrocknet wird. Für die Isolierung von Chitinpolymeren folgt diesem ersten Schritt wiederholtes Waschen in Wasser und anschließend weitere Schritte im Rahmen des unten beschriebenen Verfahrens.
  • Ein zweiter Schritt in dem Verfahren gemäß der Erfindung umfasst das Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine Suspension der angesäuerten alkaliunlöslichen Fraktion, welche die Zellwandderivate umfasst, zu erhalten.
  • Nach dem letzten Filtrationsschritt gemäß den obigen Ausführungen wird das alkaliunlösliche Produkt in Wasser in Suspension gebracht, und zwar derart, dass dessen Konzentration vorzugsweise zwischen 1 und 8 (w/v) und insbesondere zwischen 1 und 5 % liegt. Anschließend wird der pH-Wert der wässrigen Suspension des alkaliunlöslichen Produktes durch Zugabe einer sauren Lösung auf unter 7,0 eingestellt. Bei der sauren Lösung handelt es sich vorzugsweise um eine wässrige Lösung einer Säure, beispielsweise Salzsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Milchsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Glykolsäure, und vorzugsweise wird Essigsäure verwendet. Dieser Schritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 5 und 60 °C durchgeführt und insbesondere bei weniger als 30 °C.
  • Ein dritter Schritt im Verfahren gemäß der Erfindung umfasst das Inkontaktbringen der angesäuerten alkaliunlöslichen Fraktion mit β-Glucanase-Enzymen, wobei die Zellwandderivate erhalten werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die β-Glucanase-Enzyme aus der Gruppe gewählt werden, welche die Enzyme endo-β-(1,3)-Glucanase, exo-β(1,3)-Glucanase, β-(1,3)(1,4)-Glucanase sowie β-(1,6)-Glucanase oder eine beliebige Mischung daraus umfasst. Mit noch stärkerem Vorzug wird der Suspension der angesäuerten alkaliunlöslichen Fraktion eine Mischung von Enzyme zugesetzt, um die β-Glucanketten, die mit dem Chitin verknüpft sind, zu hydrolysieren. β-Glucanase-Aktivitäten sind ohne Schwierigkeiten in gewerblichen Zubereitungen von β-Glucanase bei verschiedenen Firmen erhältlich. Die Hydrolysereaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 5 und 60 °C durchgeführt und insbesondere bei weniger als 40 °C. Die Reaktionsdauer beträgt vorzugsweise weniger als 5 Tage.
  • Bevorzugte Zubereitungen enthalten hauptsächlich β-Glucanase Aktivitäten und vorzugsweise niedrige oder keine Chitinase-Aktivität. Es können im Handel erhältlich Enzymzubereitungen verwendet werden, die aus Organismen wie beispielsweise Bacillus subtillis, Arthrobacter luteus, Penicillium emersonii, Penicillium funicolosum, Humicola insolens, Aspergillus niger, Trichoderma harzanium, Trichoderma longibrachiatum extrahiert wurden. Die Zubereitungen sind bei Firmen wie NovoZymes, Erbsloh, Roche oder Lyven erhältlich. Um die β-Glucanketten der Polysaccharide, die aus den Zellwänden des Pilzmyzels extrahiert wurden, zu hydrolysieren, werden enzymatische Zubereitungen bevorzugt, welche die folgenden β-Glucanase-Aktivitäten enthielten: endo-β-(1.3-1.4)-Glucanase (EC 3.2.1.6); endo-β-(1.3)-Glucarlase (EC 3.2.1.39); exo-β-(1.3)-Glucarlase (EC 3.2.1.58); endo-β-(1.6)-Glucanase (EC 3.2.1.75); und/oder β-Glucosidase (EC 3.2.1.21, β-D-Glucosid-Glucohydrolase). In Beispiel 3, welches unten aufgeführt ist, werden verschiedene gewerbliche enzymatische Zubereitungen, die im Verfahren gemäß der Erfindung Verwendung finden können, erläutert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich bei den Zellwandderivaten um chitinreiche Polymere (d.h. Chitinpolymere oder chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere) handelt. Die unlösliche Fraktion, die in dem Verfahren erhalten wird, enthält hauptsächlich makromolekulare Chitinketten, die mit einer gewissen Menge an verbleibenden oligomeren oder makromolekularen β-Glucanketten verknüpft sind. Das Mengenverhältnis von Chitin zu Glucan kann ohne Schwierigkeiten eingestellt werden, indem die Reaktionsbedingungen gesteuert werden, und zwar hauptsächlich mittels der verwendeten β-Glucanase-Zubereitung und mittels der Reaktionsdauer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet, dass der relative Anteil des Chitins einstellbar ist und vorzugsweise bei über 80% %, insbesondere bei über 90 % und mit besonderem Vorzug bei über 95 % liegt. Der relative Anteil des Chitins kann mittels Festphasen-13C-NMR gemessen werden. Die chitinreiche unlösliche Fraktion kann darüber hinaus verbleibende Proteine enthalten.
  • Wahlweise wird in einem weiteren Schritt des vorliegenden Verfahrens eine zweite Alkalilösung gegen Ende der Hydrolysereaktion zugegeben, zum Beispiel eine Natriumhydroxid-, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxidlösung, vorzugsweise enthält sie Natrium- oder Kaliumhydroxid. Dieser weitere Schritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20 und 80 °C, insbesondere bei weniger als 70 °C durchgeführt, und zwar vorzugsweise während einer Dauer von 30 Minuten bis 3 Stunden, insbesondere von weniger als 2 Stunden. Diese zweite Alkalibehandlung ermöglicht es, die Trennung von Chitin und β-Glucan abzuschließen und somit Chitin zu isolieren.
  • Zur Herstellung von Chitinpolymeren wird das Verfahren vorzugsweise fortgesetzt, indem wiederholte Waschschritte und anschließend ein Trocknungsschritt folgen.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Chitinpolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Das Verfahren, das in der Erfindung offenbart wird, weist mehrere Vorteile auf. Das Verfahren ermöglicht es, reines Chitin zu extrahieren, indem es teilweise oder vollständig von den β-Glucanketten getrennt wird. In anderen Verfahren hingegen werden direkt Chitosan-, Chitin-Glucan- oder Chitosan-Glucan-Produkte erhalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Chitinpolymere mehr als 80 % Chitin, vorzugsweise mehr als 90 % Chitin sowie mit besonderem Vorzug mehr als 95 % Chitin.
  • Darüber hinaus weist das Chitin, welches gemäß der vorliegenden Erfindung aus Biomasse von Pilzen oder Hefen hergestellt wird, einen niedrigeren Kristallinitätsindex als Chitinpolymere, die aus Krustentierpanzern hergestellt werden, auf. In einer bevorzugten Ausführungsform in der Kristallinitätsindex des Chitinpolymers niedriger als 80 % und insbesondere niedriger als 70 % sowie mit besonderem Vorzug niedriger als 65 %, wobei das Chitin aus Aspergillus niger Biomasse hergestellt wird. Der Kristallinintätsindex kann mit Hilfe des Verfahrens von Struszczyk et al. (J. Appl. Polym. Sci., 1987, 33: 177-189) berechnet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die chitinreichen Chitin-Glucan-Copolymere einen einstellbaren Anteil an Chitin auf, der vorzugsweise mehr als 80 % beträgt.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Chitin-Glucan-Copolymere, die gemäß dem vorliegenden Verfahren erhalten werden können, insbesondere vor dem enzymatischen Hydrolyseschritt. In einer bevorzugten Ausführungsform, in welcher das Chitin aus Aspergillus niger Biomasse hergestellt wird, enthalten die Chitin-Glucan-Copolymere, die vor dem enzymatischen Hydrolyseschritt erhalten werden, einen Anteil an Chitin, der vorzugsweise zwischen 30 und 50 % liegt.
  • Darüber hinaus führt das vorliegende Verfahren nicht zum Abbau der Chitinketten, im Gegensatz zu anderen Verfahren, bei denen konzentrierte Alkalilösungen zum Einsatz kommen. Das vorliegende Extraktionsver fahren kommt ohne den Einsatz aggressiver Tenside oder saurer Verbindungen aus. Das Verfahren gewinnt Chitin aus einer erneuerbaren Quelle, zum Beispiel aus Pilz- oder Hefebiomasse, was eine wertvolle Alternativquelle für Krustentierpanzer darstellt. Darüber hinaus können die Alkalilösungen, die in dem Verfahren zum Einsatz kommen, im Laufe des Extraktionsverfahrens wiederverwendet werden.
  • Verfahren zur Herstellung von Chitosan
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Chitosan. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan mit einem höheren Molekulargewicht mittels einer ersten Verfahrensvariante und von Chitosan mit niedrigerem Molekulargewicht mittels einer zweiten Verfahrensvariante.
  • In der einen Verfahrensvariante betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin, welches die folgenden, nacheinander auszuführenden Schritte umfasst:
    • a) Inkontaktbringen des Chitins mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilöslich Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion, welche das teilweise deacetylierte Chitin enthält, weiterverwendet wird,
    • b) Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine Suspension der angesäuerten alkaliunlöslichen Fraktion, welche das teilweise deacetylierte Chitin umfasst, zu erhalten, und
    • c) Inkontaktbringen der angesäuerten Suspension der alkaliunlöslichen Fraktion mit einem Deacetylase- Enzym, wobei Chitosan erhalten wird.
  • In diesem Verfahren kann die Chitinquelle zum Herstellen von Chitosan Chitin, das von Krustentieren stammt, oder Chitin, das von Pilzen oder Hefen stammt, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der verwendeten Chitinquelle um Pilzchitin oder Hefechitin, welches mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens gemäß dieser Erfindung erhalten werden kann.
  • Gemäß diesem Verfahren zur Herstellung von Chitosan wird das Chitin mit einer konzentrierten Alkalilösung behandelt, sodass die Chitinketten aufquellen können und der Chitin-Deacetylase der Zugang zum Chitinsubstrat erleichtert wird. Bevorzugte Alkalilösungen sind Natrium- oder Kaliumhydroxidlösungen, welche in solchen Mengen eingesetzt werden, dass das Gewichtsverhältnis von Alkali zu Chitin zwischen 5 und 25 beträgt, vorzugsweise zwischen 10 und 25. Um einen Abbau der Chitinketten zu vermeiden und um die Bildung eines gequollenen Chitinhydrogels zu fördern, ist die Alkalikonzentration vorzugsweise so hohe wie möglich. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkalilösung eine Konzentration von mehr als 40 % (w/v) auf. Die Reaktion findet bei Temperatur zwischen 50 und 120 °C statt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt a) bei einer Temperatur zwischen 50 und 120 °C, insbesondere zwischen 80 °C und 120 °C durchgeführt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Schritt a) während einer Zeitdauer durchgeführt, die zwischen 30 und 180 Minuten, vorzugsweise zwischen 30 und 120 Minuten beträgt. Die in Schritt a) erhaltene alkaliunlösliche Fraktion wird in Suspension gebracht und anschließend verdünnt, filtriert und ausgiebig mit Wasser gewaschen.
  • Vorzugsweise wird die verwendete Alkalilösung nach dem ersten Schritt aufgefangen, konzentriert und der Wiederverwendung im oben beschriebenen Chitiniso lierungsverfahren der vorliegenden Erfindung zugeführt.
  • Anschließend wird die erhaltene, in Suspension befindliche alkaliunlösliche Fraktion mit einer Säurelösung in Kontakt gebracht, wobei eine angesäuerte Fraktion erhalten wird, die teilweise deacetyliertes Chitin umfasst. Der pH-Wert der Suspension wird auf einen Wert eingestellt, der vorzugsweise unter 7,0 und insbesondere unter 4,8 liegt, und zwar durch Zugabe einer Säure, zum Beispiel Salzsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Glutaminsäure, Phthalsäure, wobei vorzugsweise Ameisensäure verwendet wird. Dieser Schritt findet bei Raumtemperatur statt.
  • Anschließend wird die erhaltene angesäuerte Fraktion mit einer Chitin-Deacetylase in Kontakt gebracht. Vorzugsweise wird eine rekombinante Chitin-Deacetylase verwendet, die von einer Pichia pastoris Hefe produziert wird, die mit einem Expressionsvektor verändert wurde, der eine DNA-Sequenz trug, welche die Chitin-Deacetylase von Mucor rouxii codiert. Das Mengenverhältnis der rekombinanten Chitin-Deacetylase (rCDA) zum Chitin beträgt vorzugsweise zwischen 0,5 und 10 mg/g Chitin und insbesondere zwischen 0,5 und 5 mg/g. Die Hydrolysereaktion mit der Deacetylase wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 50 °C, insbesondere zwischen 20 und 40 °C durchgeführt, und zwar für eine Zeitdauer von weniger als 120 Stunden, bis der gewünschte Anteil an verbleibenden acetylierten Glucosamin-Einheiten erreicht ist.
  • Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass dieser enzymatische Schritt unter sauren Bedingungen durchgeführt wird. Vorzugsweise liegt der pH-Wert während des enzymatischen Schrittes bei weniger als 5,0 und insbesondere zwischen 3,5 und 4,5. Unerwarteterweise wird bei diesem niedrigen pH-Werten eine gute enzymatische Deacetylierung erzielt, obgleich der optimale pH-Wert des rekombinanten Deacetylase-Enzyms zwischen 5,0 und 5,5 liegt. Bei den niedrigen pH-Werten bleibt das Enzym aktiv und die enzymatische Deacetylierungsreaktion kann vorteilhafterweise innerhalb kürzerer Zeiträume durchgeführt werden. Somit wird das CDA-Enzym unter Reaktionsbedingungen verwendet, die nicht den optimalen Bedingungen hinsichtlich der Stabilität und Aktivität des rekombinanten CDA-Enzyms entsprechen. Während das CDA-Enzym nämlich seine optimale Aktivität bei Bedingungen von 60 °C und einem pH-Wert von vorzugsweise unter 5,0, insbesondere zwischen 4,0 und 5,0 hat, wird der vorliegende Schritt bei anderen Bedingungen durchgeführt, ohne dass dies die Aktivität des Enzyms beeinträchtigt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung einen weiteren Schritt, im welchem das erhaltene Chitosan ausgefällt wird. Zu diesem Zweck wird die Suspension filtriert, um nicht-deacetylierte Chitinketten zu entfernen, und der pH-Wert wird durch Zugabe einer alkalischen Verbindung wie Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid auf einen Wert oberhalb von 7,0 eingestellt. Die ausgefällte Verbindung wird anschließend filtriert, gewaschen und entweder getrocknet, um Chitosan in der Aminoform zu gewinnen, oder erneut in einer sauren Lösung solubilisiert und dann gefriergetrocknet. Die ausgefällte Verbindung kann zum Beispiel in Salzsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Milchsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glykolsäure, Benzoesäure, Sorbinsäure (2,4-Hexadiensäure), Oxalsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Laurinsäure oder Palmitinsäure oder einer beliebigen anderen mineralischen oder organischen Säure oder einer beliebigen anderen Polysäure wie zum Beispiel Hyaluronsäure oder Poly(acrylsäure) solubilisiert werden.
  • Dieses enzymatische Verfahren ermöglicht es, aus einem Chitin, das aus Pilzen oder Krustentieren stammt, ein Chitosan mit höherem Molekulargewicht zu gewinnen, und ermöglicht es weiterhin, den Acetylierungsgrad im Endprodukt auf den gewünschten Wert einzustellen, indem die Bedingungen der Chitin-Deacetylasereaktion sorgfältig gewählt werden, wie zum Beispiel der pH-Wert oder die Dauer der Reaktion.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann auch die rekombinante Chitin-Deacetylase aus Mucor rouxii, die in Pichia pastoris exprimiert wird (rCDA), dazu verwendet werden, die Deacetylierung von Chitosan, welches entweder von Pilzen oder von Krustentieren stammt, ohne Verlust an Molekulargewicht voranzutreiben.
  • Beispielsweise kann ein Chitosan, dessen viskosimetrisch bestimmtes Molekulargewicht 500.000 Da beträgt und dessen Acetylierungsgrad bei 19 mol% liegt, in einer Ameisensäurelösung (1 N) bei einer Polymerkonzentration von 0,5 g/l bei Raumtemperatur mit rCDA umgesetzt werden, und zwar 6 Stunden lang bei einem pH-Wert von 3,8. Der pH-Wert der Lösung wird anschließend vorzugsweise auf mehr als 7,0 angehoben, indem eine alkalische Substanz wie Natrium- Kalium- oder Ammoniumhydroxid hinzugegeben wird, um die Fällung des Chitosan zu fördern, welches vorzugsweise durch Filtration entnommen und anschließend gewaschen und getrocknet wird. In diesem Beispiel wies das Endprodukt einen Acetylierungsgrad von 10 mol% auf und das Molekulargewicht wurde nicht verändert.
  • Das enzymatische Deacetylierungsverfahren zur Herstellung von Chitosan gemäß der Erfindung ermöglicht es vorteilhafterweise, hochgradig deacetyliertes Chitosan herzustellen, und zwar ohne Molekulargewichtsverlust, ohne Materialverlust und ohne dass er erforderlich wäre, die Polymerketten zu spalten. Da das Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Chitin-Deacetylase für Chargen zur Fermentierung großer Volumina bestimmt ist, eignen sich die Mengen an Chitin und Chitosan, die enzymatisch umgewandelt werden können, für eine Produktion und Verwendung des erhaltenen hochgradig deacetylierten Chitosans in industriellem Maßstab, und zwar auf sehr kostengünstige und umweltfreundliche Weise.
  • In einer zweiten Verfahrensvariante betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin aus Pilzen oder Hefen, welches die folgenden, nacheinander auszuführenden Schritte umfasst:
    • a) Inkontaktbringen des Chitins mit einer basischen Lösung, wobei eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten werden und wobei die alkalilösliche Fraktion verworfen wird die alkaliunlösliche Fraktion weiterverwendet wird,
    • b) Inkontaktbringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion in Suspension gebracht und diese Suspension mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, wobei eine säureunlösliche Fraktion und eine säurelösliche Fraktion erhalten werden und wobei die säureunlösliche Fraktion verworfen wird und die säurelösliche Fraktion, welche Chitosan umfasst, weiterverwendet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der verwendeten Chitinquelle um Pilzchitin oder Hefechitin, welches mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens gemäß dieser Erfindung erhalten werden kann.
  • Das Verfahren zur Herstellung von Chitosan mit Molekulargewicht besteht darin, eine starke alkalische Reaktion bei hoher Temperatur durchzuführen. Eine alkalische Substanz wie Natrium-, Kalium-, Lithium oder Ammoniumhydroxid wobei Natrium- oder Kaliumhydroxid bevorzugt sind, wird in solchen Mengen der Chitinsuspension zugesetzt, dass das Gewichtsverhältnis von Alkali zu Chitintrockenmasse vorzugsweise zwischen 1 und 20 (w/w) und insbesondere zwischen 1 und 15 (w/w) beträgt. Um den Abbau der Chitinketten so gering wie möglich zu halten, können Zusatzstoffe verwendet werden, zum Beispiel Natriumborhydrid oder Thiophenol, und organische Lösemittel wie etwa Methanol oder Ethanol können ebenfalls hinzugefügt werden.
  • Vorzugsweise wird die verwendete Alkalilösung nach dem ersten Schritt aufgefangen, konzentriert und der Wiederverwendung im oben beschriebenen Chitinisolierungsverfahren der vorliegenden Erfindung zugeführt.
  • Anschließend wird die erhaltene alkaliunlösliche Fraktion abgetrennt und in Suspension gebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Schritt bei einer Temperatur von mehr als 80 °C durchgeführt. Vorzugsweise wird die Suspension auf eine Temperatur zwischen 80 und 140 °C, insbesondere zwischen 100 und 120 °C, erwärmt, wobei die Reaktion vorzugsweise während eines Zeitraums von 30 bis 300 Minuten, insbesondere weniger als 240 min. lang stattfindet.
  • Die alkaliunlösliche Fraktion wird durch Filtration entnommen und mit Wasser gewaschen. Anschließend wird sie in einer verdünnten sauren Lösung solubilisiert, beispielsweise in Salzsäure, Essigsäure, Ameisensäure und vorzugsweise in Essigsäure mit einer Konzentration von 0,1 bis 1 N. Die säureunlösliche Fraktion wird durch Filtration entfernt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt, in welchem das Chitosan aus der säurelöslichen Fraktion ausgefällt wird, indem die Fraktion mit einer basischen Lösung in Kontakt gebracht wird. Der pH-Wert der säurelöslichen Fraktion wird vorzugsweise mit einer alkalischen Lösung wie etwa einer konzentrierten Lösung von Natrium- oder Ammoniumhydroxid auf einen Wert von mehr als 8,0 angehoben. Die ausgefällte Verbindung wird filtriert, wieder holt mit Wasser gewaschen und getrocknet. Bei der erhaltenen Verbindung handelt es sich um Chitosan in Aminoform. In einem Beispiel kann ein Chitosan mit einem Acetylierungsgrad von 14 mol% und einem viskosimetrischen Molekulargewicht von 20 kDa (Bestimmung mittels Kapillarviskosimetrie) erhalten werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform können aus der säurelöslichen Fraktion auch Chitosansalze erhalten werden. Zum diesem Zwecke wird die säurelösliche Fraktion durch Zugabe einer alkalischen Lösung wie Natrium- oder Ammoniumhydroxid einer Fällung unterzogen. Die ausgefällte Verbindung wird filtriert, wiederholt mit Wasser gewaschen und anschließend in einer sauren Lösung solubilisiert und dann aus dieser sauren Lösung gefriergetrocknet. Die ausgefällte Verbindung kann in Salzsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Milchsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glykolsäure, Benzoesäure, Sorbinsäure (2,4-Hexadiensäure), Oxalsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Laurinsäure oder Palmitinsäure oder einer beliebigen anderen mineralischen oder organischen Säure oder einer beliebigen anderen Polysäure wie zum Beispiel Hyaluronsäure oder Poly(acrylsäure) solubilisiert werden.
  • In einer weitere Ausführungsform betrifft die Erfindung Chitosanpolymere, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Chitosanpolymere mit einstellbarem Molekulargewicht. In Abhängigkeit von der Verfahrensvariante und den Bedingungen der Deacetylierungsreaktion kann ein Chitosan mit niedrigem, mittlerem oder hohem Molekulargewicht erhalten werden. Vorzugsweise weist das Chitosan ein Molekulargewicht zwischen 10 und 1000 kDa auf, wobei die Bestimmung mittels Ubbelohde Kapillarviskosimetrie erfolgt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Chitosanpolymere mit einstellbarem Deacetylierungsgrad. In Abhängigkeit von der Verfahrensvariante und den Bedingungen der Deacetylierungsreaktion kann der Acetylierungsgrad eingestellt werden, und zwar vorzugsweise im Bereich zwischen 0 und 40 mol%.
  • Industrielle Anwendungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Chitinpolymere und chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere nicht-tierischer Herkunft bereit, die mit Hilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.
  • Chitin-Glucan-Copolymere der vorliegenden Erfindung, d.h. solche, die vor dem enzymatischen Hydrolyseschritt gemäß dem vorliegendem Verfahren erhalten werden, umfassen einen Anteil an beta-Glucan-Ketten, wobei die Struktur und Zusammensetzung der Copolymere von dem Organismus, aus dem sie extrahiert wurden, bestimmt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Chitin-Glucan-Copolymere aus dem Myzel von Aspergillus niger extrahiert und umfassen hauptsächlich Chitin und beta-(1,3)(1,4) sowie beta-(1,3)-Glucanketten. Gemäß der Erfindung ist der Anteil an Chitin und Glucan in solchen Polymeren darüber hinaus einstellbar, und zwar in Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen, die während der enzymatischen Hydrolyse angewendet werden, um chitinreiche Chitin-Glucan-Copolymere zu erhalten.
  • Chitinpolymere und (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere, die mit Hilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, verfügen über interessante Eigenschaften, aufgrund derer sie für sehr verschiedenartige Anwendungen geeignet sind. Zu den hauptsächlichen vorteilhaften Eigenschaften dieser Produkte gehören ihre Wundheilungseigenschaften und ihre Chelatbildungsaktivität.
  • Weiterhin kann nicht-tierisches Chitosan mit Hilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Ausgehend von sehr reinem Chitin, kann vorteilhafterweise ein sehr reines Chitosan hergestellt werden. Zusätzlich dazu ermöglicht es ein steuerbares enzymatisches Deacetylierungsverfahren, ein Chitosan mit einem hohen Molekulargewicht herzustellen, welches gleichzeitig einen einstellbaren (niedrigen) Deacetylierungsgrad aufweist. Weiterhin können aufgrund der vergleichsweise unbegrenzten Verfügbarkeit von Biomasse aus Pilzen oder Hefen grobe Volumina an Chitosan hergestellt werden, und zwar auf eine reproduzierbare und flexible Weise. Vorteilhafterweise unterliegt eine solche Herstellung keinerlei jahreszeitlichen Schwankungen, während dies bei Verwendung einer Chitosanquelle aus Krustentieren der Fall ist.
  • Bei Verwendung von Chitosan aus tierischen Quellen treten in verschiedenen Anwendungsbereichen vielerlei Probleme auf. Bei Anwendungen im Ernährungsbereich beispielsweise ist ein solches Chitosan für Vegetarier ungeeignet, es kann Allergien gegen Krustentierprodukte hervorrufen und macht es erforderlich, dass die Lebensmittelerzeugnisse entsprechend gekennzeichnet werden. Bei kosmetischen Anwendungen kann ein solches Chitosan eine Allergie hervorrufen, und es besteht hier eine Neigung zu nicht-tierischen Produkten. Daher kann stellt das nicht-tierische Chitosan, das mit Hilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, in diesen Problembereich eine Lösung dar.
  • Zu den interessanten Eigenschaften des Chitosans, das mit Hilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, gehören, unter anderem, die kationische Ladung, die biologische Abbau barkeit, die Ungiftigkeit, die Chelatbildungsfähigkeit, die Wundheilung und die Feuchthaltewirkung. Darüber hinaus führt das Chitosan der vorliegenden Erfindung nicht zu allergischen Reaktionen und kann gegen Pilze und Mikroorganismen wirken.
  • Chitin und Chitosanprodukte die gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können in verschiedenen Formen verwendet werden, in Abhängigkeit von ihrer Anwendung in verschiedenartigen Systemen. Chitosanpolymere beispielsweise können in Form eines Ammoniumsalzes als verdünnte Lösung in verschiedenen mineralischen und organischen Säuren wie etwa Salzsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Ameisensäure, Milchsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glykolsäure, Benzoesäure, Sorbinsäure (2,4-Hexadiensäure), Oxalsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Laurinsäure oder Palmitinsäure oder einer beliebigen anderen mineralischen oder organischen Säure oder einer beliebigen anderen Polysäure wie zum Beispiel Hyaluronsäure oder Poly(acrylsäure) verwendet werden, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Säuren beschränkt ist. Die Konzentration an Chitosan in einer solchen Lösung wird vorzugsweise in Abhängigkeit von der geforderten Viskosität gewählt. Daher können gemäß der Erfindung auch Lösungen mit verschiedenen Viskositätsgraden, die Chitin oder Chitosanprodukte gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, hergestellt werden.
  • Chitosanprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können auch in Form eines Hydrogels verwendet werden. Ein solches Hydrogel kann unter Anwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, beispielsweise durch Herstellung einer konzentrierten Lösung, durch Komplexbildung mit anionischen (Makro)molekülen wie etwa Alginaten, Heparin, Xanthan oder Pektin, durch chemisches vernetzen oder durch Bildung kovalenter Bindungen zwischen den Aminogruppen des Chitosans und anderen (Makro)molekülen, wobei die Auswahl nicht auf die genannten Verfahren beschränkt ist. Die Produkte können ebenfalls in Form eines thermoreversiblen Hydrogels verwendet werden.
  • Chitin und Chitosanprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können darüber hinaus auch in Form eines Films verwendet werden. Beispielsweise weist Chitosan mit hohem Molekulargewicht, wenn es gemäß einem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, verbesserte Filmbildungseigenschaften auf und kann daher zur Herstellung stabilerer Film dienen. Weiterhin können mehrlagige Membranen oder Substrate hergestellt werden, die Chitosan in Verbindung mit weiteren Polymeren umfassen.
  • Darüber hinaus können Chitin und Chitosanprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, dazu verwendet werden, poröse Filme oder poröse Gegenstände herzustellen, deren Porengrößen eingestellt werden können, indem Verfahren zur Anwendung kommen, die dem Fachmann bekannt sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Chitin und die Chitosanprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, in Form von Mikro-, Milli- oder Nanopartikeln bereitgestellt werden, welche mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden können (siehe z.B. Polymeric Biomaterials, S Dimitriu ED, Marcel Dekker, 2002, Kap. 1). Chitosanprodukte, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können und in Form von Partikeln bereitgestellt werden, weisen vielfältige Anwendungsmöglichkeiten auf, einschließlich der Verkapselung von Substanzen, Organismen oder wirkstoffmolekülen wie etwa Samen, Zellen, Pigmente, Aromen, Duftstoffe, Medikamente, Impfstoffe, Biowirksame (antibakterielle oder gegen Pilze gerichtete) Mittel, Enzyme. Die Verkapselung in Chitosanpartikeln ermöglicht es, die Wirksubstanzen auf kontrollierte Weise festzuhalten, zu schützen, zu transportieren oder freizusetzen.
  • Obgleich die Chitin-Glucan-Copolymere der vorliegenden Erfindung einen hydrophilen Charakter aufweisen, sind sie im Wesentlichen in jeglichen Lösemitteln unlöslich und daher geeignet, in Form von Pulvern, Fasern oder gefriergetrocknet verwendet zu werden.
  • In einer weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verbundmaterial bereitgestellt, welches Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere umfasst, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Chitinpolymere oder Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung, welche aus Pilzen stammen, können in Mischung mit einer oder mehreren anderen Substanzen verwendet werden. Sie können zum Beispiel mit anderen Polymeren gemischt werden, wobei die Mischung in einer der oben erwähnten Formen verwendet werden kann, um neue Eigenschaften oder synergetische Eigenschaften zu verleihen.
  • Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, können mit Molekülen gemischt werden, die eine niedriges Molekulargewicht aufweisen. In Kombination mit anderen Substanzen eignen sich Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, weiterhin as Komplexierungsmittel, wenn die Substanz eine negative Ladung aufweist, oder sie eignen sich als Matrix zur kontrollierten Freisetzung eines Medikaments oder eines Wirkstoffs, oder sie eignen sich als Matrix für einen kosmetischen Inhaltsstoff wie etwa ein Pigment, ein Aroma oder einen Duftstoff.
  • Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können weiterhin mit einem Impfstoff gemischt werden, wobei sie sich als Hilfsstoff eignen. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere können weiterhin mit anorganischen Substanzen gemischt werden, beispielsweise mit keramischen Stoffen, vorzugsweise mit Calciumphosphaten, wobei ein Matrix geschaffen werden kann, die sich dafür eignet, die Regenerierung von Geweben wie etwa Knorpel oder Knochen zu unterstützen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Derivate von Chitinpolymeren, (chitinreichen) Chitin-Glucan-Copolymeren oder Chitosanpolymeren, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere sind Polymere, die chemisch modifiziert werden können, um Derivate zu erhalten, und zwar mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Die chemisch Modifizierung kann beispielsweise an einer oder an mehreren funktionellen Gruppen der D-Glucose-, N-Acetyl-D-glucosamin- oder D-Glucosamin-Einheiten durchgeführt werden, zum Beispiel am Sauerstoffatom in Position 6 oder am Stickstoffatom in alpha-Stellung zum Kohlenstoff, der sich in Position 1 im N-Acetyl-D-glucosamin und D-Glucosamin befindet.
  • Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, können ein verschiedenartigen Produkten und Systemen zur Anwendung kommen, vorzugsweise in pharmazeutischen, medizinischen, landwirtschaftlichen, textilen, kosmetischen und/oder industriellen Anwendungen sowie im Umweltsektor, in Lebensmitteln und in funktionellen Lebensmitteln.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung als Trägerstoff bei der Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Sie können in tierärztlichen ebenso wie in humanmedizinischen Anwendungen verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Um die Verwendung von Chitosan in pharmazeutischen Formen zu ermöglichen, ist es erforderlich, dass die Molekulargewichtsverteilung und der Acetylierungsgrad gesteuert und reproduzierbar sind, und die Verbindungen müssen reproduzierbar geringe Gehalte an Verunreinigungen aufweisen. Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung können Verbindungen mit solchen Eigenschaften erhalten werden.
  • Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere üben keine Antigenwirkung aus und sind vollkommen bioverträglich. Darüber hinaus sind sie durch enzymatische Hydrolyse, zum Beispiel in Gegenwart von Lysozymen, biologisch abbaubar. Aufgrund ihres antithrombogenen und hämostatischen Charakters können sie auf sämtlichen Gebieten der Medizin verwendet werden. Daher können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, in Wundheilungssystem zur Anwendung kommen. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, können weiterhin dazu verwendet werden, die Bildung von Fibrinspitzen in Wunden zu verhindern, der Bildung von Narben vorzubeugen und zu Zellregeneration zu unterstützen. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere können in Systemen zum Gewebeaufbau zur Zelltransplantation und zur Zellverkapselung verwendet werden. Da die Produkte luftdurchlässige Filme bilden können, sind sie dazu befähigt, die Zellregeneration zu unterstützen, wobei sie das Gewebe vor mikrobiellen Angriffen schützen. Sie können weiterhin dazu verwendet werden, Naht- und Verbandmaterial zu bilden, vorzugsweise bilden sie abbaubares Naht- und Verbandmaterial. Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, sind weiterhin dazu geeignet, künstliche Haut herzustellen, und sie eignen sich für Systeme zur Wiederherstellung von Gewebe und Organen und/oder für die Transplantation von Zellen. Zum Beispiel können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere in Systemen zur Knochenwiederherstellung in der Orthopädie oder Kieferorthopädie verwendet werden, sowie zur Wiederherstellung der Haut, der Hornhaut, der Netzhaut und des Knorpels und zum Wiederaufbau von Organen wie der Bauchspeicheldrüse, des Magens und des Nervensystems.
  • Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich weiterhin dazu, in Kontaktlinsen, in Zusammensetzungen zur Vorbeugung gegen trockene Augen, als Tränenersatzmittel in Form eines topischen Hydrogels, als topischer Trägerstoff für Augenmedikamente, als Partikel- oder Hydrogelsystem zur lokalen Anwendung im Auge, in Vorrichtungen zur Reparatur von Netzhautablösung und Makula-Degeneration sowie in chirurgischen Hilfsmitteln verwendet zu werden.
  • Aufgrund ihrer guten Bio-Klebeeigenschaften können Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung als chirurgisches Hilfsmittel gegen Verkleben zur Anwendung kommen, beispielsweise um während der Operation das Zusammenkleben von Geweben zu verhindern. Dank ihres guten Klebeverhaltens auf Schleimhäuten können sie weiterhin als Hilfsstoff für Impfstoffe Anwendung finden.
  • Chitosanpolymere, die gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können weiterhin als Träger material zum Transport und zur langsamen Freisetzung von Wirkstoffen in Pflanzen, Tieren und Menschen angewendet werden. Im Hinblick auf die orale Verabreichungsform von Arzneimitteln, ist es besonders zweckmäßig, Chitosanpolymer zu verwenden, wenn verkapselte Produkte unverändert den Darm erreichen müssen, da die Produkte im Magen sind verdaut werden. Chitosan kann in Form von Partikeln formuliert werden, wodurch sich noch mehr Möglichkeiten für orale und parenterale Anwendungen mit kontrollierter Freisetzung ergeben. Chitosan kann die Wirksamkeit oraler Trägerstoffe erhöhen, und zwar durch chemische Modifizierung und Bindung von Medikamenten oder anderen biowirksamen Molekülen. Da Chitosanpolymere gute Film- und Gelbildungseigenschaften besitzen, können sie dazu dienen, transdermale Membranen herzustellen. Ihre Klebeeigenschaften auf Schleimhäuten sind erwünscht, um einen guten Kontakt mit der äußeren Hautschicht herzustellen. Chitosan kann auch von Nutzen sein, um neuartige Medikamentenanwendungssysteme über lokale und systemische Verabreichungswege herzustellen, wie etwa vaginale, bukkale und parenterale Wege.
  • Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, können als Trägerstoff bei der Herstellung von Tabletten, bei der Granulierung von Pulvern, bei der Herstellung von Gelen und Filmen, bei der Herstellung von Emulsionen verwendet werden und auch als Benetzungs- und Beschichtungsmittel dienen. Einige der außergewöhnlicheren Eigenschaften von Chitosanen können ebenfalls in oralen Medikamentenanwendungssystemen genutzt werden, wie ihre Fähigkeit, bei der kontrollierten Medikamentenfreisetzung als Matrix zu dienen, ihr Bioklebeverhalten, seine Filmbildungseigenschaften und ihre Fähigkeit, mit anionischen Medikamenten und anionischen Polymeren Komplexe zu bilden. Daher können sie in Medikamentensystemen verwendet werden, um die Löslichkeit von schlecht wasserlöslichen Medikamenten zu verbessern, um durch Bildung con Hydrogelen die Aufnahme von Medikamenten über Schleimhautgewebe zu fördern und um die Immunantwort auf Impfstoffe zu verstärken.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, darüber hinaus in landwirtschaftlichen und agrochemischen Systemen zur Anwendung kommen. Sie können als Schutzbeschichtung und Biofungizid dienen, wenn sie auf frisches Obst, Gemüse und Feldfrüchte aufgebracht werden, oder aber als Düngemittel, indem es die Anzahl nützlicher Bodenmikroorganismen erhöht und die der schädlichen verringert. Pflanzliches Saatgut kann in wässrige Lösungen von Chitosan getaucht werden, um mikrobiellen Infektionen vorzubeugen und die Pflanzenproduktion zu steigern. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, können mit Molekülen gemischt werden, können weiterhin in Lösung, als Pulver oder zur Beschichtung von Saatgut verwendet werden. In geringen Mengen von ungefähr einigen Milligramm pro Kubikmeter Wasser können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere verwendet werden, um die Verteidigungsmechanismen der Pflanzen gegen parasitische Infektionen und Angriffe auszulösen. Zusätzlich zu den gegen Pilze gerichteten Eigenschaften können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere dazu verwendet werden, die Wurzeln der Pflanzen zu verstärken und für eine kräftigere Stammentwicklung zu sorgen. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die mittels eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung herstellbar sind, können weiterhin dazu verwendet werden, die Synthese von Schutzstoffen durch eine Pflanze anzuregen. Darüber hinaus können sie dazu verwendet werden, die Keimung und das Wachstum der Pflanzen zu beschleunigen. Auf dem Gebiet der Landwirtschaft und Ernährungswirtschaft können sie dazu verwendet werden, Saatgut, Dung oder Pestizide zu beschichten.
  • Aufgrund ihrer Filmbildungseigenschaften können die Chitosanpolymere der Erfindung als Zusatzstoffe in Pestizide verwendet werden, um einen besser Kontakt herzustellen und für ein besseres Eindringen der Pestizide zu sorgen. Darüber hinaus kann das Mischen des Pestizids mit einer kleinen Menge an Chitin oder Chitosan der vorliegenden Erfindung dazu geeignet sein, die verwendete Pestizidmenge zu verringern.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, darüber hinaus insbesondere zur Verwendung in Lebensmittelanwendungen und in funktionellen Lebensmitteln geeignet. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere können als Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Insbesondere Chitosanpolymere können als Lebensmittelinhaltsstoff im Diätbereich Anwendung finden. Da Chitosanpolymere vom menschlichen Körper nicht verdaut werden, eignen sie sich dafür, sich wie Nahrungsfasern zu verhalten, was im Diätbereich von Bedeutung ist. Da Chitosanpolymer kationische Ladungen aufweisen, sind sie dazu befähigt, negativ geladene Lipide zu komplexieren, und sie sind dazu geeignet, Lipide im Verdauungstrakt abzufangen. Zusätzlich können Chitosanpolymer in funktionellen Lebensmittelprodukten eingesetzt werden, um cholesterinsenkende Wirkungen zu erzielen.
  • Darüber hinaus können Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung als natürliche Lebensmittelzusätze verwendet werden, um eine antimikrobielle und gegen Pilze gerichtete Wirkung gegen ein breites Spektrum an Pilzen, Hefen und Bakterien, die in Lebensmitteln auftreten, zu erzielen. Zusätzlich dazu können sie als Hilfsstoffe für herkömmliche Lebensmittelkonservierungsstoffe sowie als Antibräunungsmittel, als Bestandteile gasdurchlässiger essbarer Filme für die Lagerung von Obst/Gemüse, als Verdickungsmittel, Stabilisatoren oder Emulgatoren, als thixotrope Mittel oder als natürliche Aromaverstärker verwendet werden. Zusätzlich dazu können Chitosanpolymer gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lebensmittelverarbeitung verwendet werden, wo sie beispielsweise as Schaumbilder, Verdickungsmittel oder Stabilisatoren Anwendung finden können. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Koagulierung und Ausflockung können Chitosanpolymer weiterhin bei der Klärung von Getränken wie Wein, Bier und Fruchtsäften Anwendung finden. Hierbei können sie Verbindungen ausfällen, die für die Trübung dieser Getränke verantwortlich sind.
  • In einem weiteren Aspekt der Lebensmittelindustrie können Chitosanpolymere darüber hinaus dazu verwendet werden, essbare Filme und Beschichtungen zur Verlängerung der Lagerfähigkeit von frischen oder verarbeiteten Lebensmitteln herzustellen. Chitosanpolymere, die aus Pilzen stammen, können auf Obst und Gemüse aufgebracht werden, wodurch es möglich wird, die Lagerfähigkeit zu verlängern, das Verderben des Obsts/Gemüses besser unter Kontrolle zu haben und die Reifung zu verzögern. Chitosanpolymer sind als Antibräunungsmittel zur Anwendung auf Obst und Gemüse geeignet. Sie können als vorteilhafte Alternative zu Sulfit verwendet werden, welches gegenwärtig den wirksamsten verfügbaren Bräunungshemmer darstellt, der aber unter dem Verdacht steht, Gesundheitsschäden zu verursachen.
  • In einem weiteren Aspekt können die antimikrobiellen und gegen Pilze gerichteten Wirkungen der Chitosanpolymere gemäß der Erfindung in der Lebensmittelindustrie zur Konservierung von Fleisch, Krustentieren (Austern), Obst, Gemüse und fertig verarbeiteten Produkten genutzt werden, und zwar entweder allein oder in synergetischer Kombination mit herkömmlichen Konservierungsstoffen wie zum Beispiel Sulfit oder Natriumbenzoat. In Verbindung mit weiteren Konservierungsstoffen kann es dazu verwendet werden, die Konzentration des Konservierungsstoffes, die für eine Hemmwirkung erforderlich ist, so gering wie möglich zu halten.
  • In einer weiteren Ausführungsform können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, darüber hinaus in Textilanwendungen verwendet werden. Chitosanpolymer können beispielsweise in Form eines Films auf Textilfasern aufgebracht werden, indem die Fasern oder ein Gewebe mit einer Lösung imprägniert wird. Auf diese Weise können die Eigenschaften der Fasern oder Textilien verändert werden, wobei solche Fasern oder Textilien z.B. durch Anwendung von Chitin oder Chitosan antibakterielle Eigenschaften annehmen können. Auch medizinische Textilien können mit Chitinpolymeren, (chitinreichen) Chitin-Glucan-Copolymeren oder Chitosanpolymeren gemäß der vorliegenden Erfindung imprägniert werden und in Systemen zur Behandlung von Wunden einsetzbar sein.
  • In kosmetischen Anwendungen können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, in Zusammensetzungen verwendet werden, welche zur Hautpflege geeignet sind, wie etwa in Cremes, und welche für das Haar bestimmt sind, wie etwa in Sprays, Shampoos und nach dem Shampoo anzuwendende Mittel, sowie in Schminkzusammensetzungen oder in Zahncrèmes. Sie sind weiterhin in UV-Schutz-Zusammensetzungen, bei der Herstellung von Deodoranten, in Zusammensetzungen für die Mundhygiene und in Zusammensetzungen zur Verkapselung von Pigmenten anwendbar. Die nicht-tierische Herkunft des Chitins oder Chitosans, das gemäß dem in der Erfindung beschriebenen Verfahren erhalten wurde, ermöglich es, ein Allergierisiko auszuschließen.
  • Im Umweltsektor können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, als Chelatbildungsmittel, z.B. als Komplexierungsmittel für Schwermetalle Anwendung finden. Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere können beim Zurückhalten von Schwermetallen sowie in Wasserreinigungstechniken oder in Trinkwassersystemen Anwendung finden, um organische Verbindungen und Schwermetalle abzutrennen. Sie können weiterhin in der Wasseraufbereitung Anwendung finden, indem sie bestimmte Abfallstoffe ausfällen und Verunreinigungen wie DDT oder polychlorierte Benzole abfangen. Zusätzlich dazu können sie in Anwendungen zum Einsatz kommen, wo sie dazu geeignet sind, Radikale abzufangen.
  • Darüber hinaus können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung im Herstellungsverfahren von Papier verwendet werden. In diesem Verfahren können sie einige Aminosubstituenten wie etwa Gummistoffe oder polysynthetische Polysaccharide ersetzen, und sie sind dazu geeignet, den Einsatz chemischer Zusatzstoffe zu verringern und für einen verbesserten Ausstoß zu sorgen. Papier, das unter Verwendung der Chitinpolymere, (chitinreichen) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, kann eine glattere Oberfläche haben und widerstandsfähiger gegen Feuchtigkeit sein. Darüber hinaus können Chitinpolymere, (chitinreiche) Chitin-Glucan-Copolymere oder Chitosanpolymere gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung von Toilettenpapier, Packpapier and Pappe Anwendung finden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 Alkalische Verdauung von Aspergillus niger Myzel
  • Dieses Beispiel erläutert den ersten Schritt im Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus Pilzbiomasse gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Biomasse wurde als Nebenprodukt eines Kulturverfahrens zur Herstellung von Zitronensäure unter Verwendung von Aspergillus niger erhalten.
  • In diesem Beispiel wurden 995 g Biomasse mit einem Wassergehalt von 71 % aufgefangen und mit 2 Litern Wasser und 93 g Natriumhydroxidpellets bei Raumtemperatur umgesetzt, wobei schließlich eine Biomassekonzentration von 3,4 % (w/v) erzielt wurde. In diesem Beispiel wies das Endprodukt eine NaOH-Konzentration von 10,6 % (w/v) auf, und das Mengenverhältnis von NaOH zu Biomasse (Trockengewicht) betrug 32 %. Nach 26 Stunden wurde die Mischung filtriert, um die unlösliche Fraktion der verbleibenden Biomasse zu entnehmen, welche anschließend wiederholt gewaschen wurde, bis ein neutraler pH-wert erreicht war. In diesem Beispiel betrug die Trockenmasse der unlöslichen Fraktion 145 g. Die Untersuchung dieser Fraktion mittels Festphasen-13C-NMR zeigte, dass hauptsächlich eine Mischung aus Chitin- und Glucanpolymeren erhalten wurde. In diesem Beispiel betrug das Mengenverhältnis von Chitin zu Glucan 52:48 ± 15 (w/w), wobei die Berechnung auf der Grundlage des Festphasen-13C-NMR-Spektrums erfolgte.
  • Der Chitingehalt in der unlöslichen Fraktion wurde bestimmt, indem das N-Acetyl-Glucosamin, welches nach Hydrolyse der unlöslichen Fraktion mit den Enzymen Chitinase und Chitobiase gemäß dem Verfahren von Jeuniaux ("Chitine et chitinolyse : un chapitre de biologie moleculaire" 1963, Masson, Paris, 181) und Reissig et al. (J. Biol. Chem., 1955, 217:959) freigesetzt wurde, gemessen wurde. Der Chitingehalt wurde ebenfalls auf Grundlage der magnetischen Kernresonanzanalyse von Kohlenstoff-13 in Festphase (13C-NMR) der alkaliunlöslichen Fraktion, die nach der alkalischen Verdauung von Biomasse erhalten wurde, bestimmt. 1 zeigt das 13C-NMR-Spektrum der alkaliunlöslichen Fraktion, welche hauptsächlich ein aufgereinigtes Chitin-Glucan-Polymer umfasst. Nach der Dekonvolution und Integration der Signale der Kohlenstoffatome von N-Acetyl-(D)-Glucosamin und von den (D)-Glucose-Einheiten gab die Berechnung ein Chitin:Glucan-Gewichtsverhältnis von 41:59 (w/w).
  • Beispiel 2 Alkalische Verdauung des Myzels von Aspergillus niger
  • Dieses Beispiel erläutert den ersten Schritt im Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus Pilzbiomasse gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Biomasse wurde als Nebenprodukt eines Kulturverfahrens zur Herstellung von Zitronensäure unter Verwendung von Aspergillus niger erhalten.
  • In diesem Beispiel wurde das Myzel von Aspergillus niger gemäß unterschiedlichen Bedingungen behandelt. Die Ansätze Nr. 1 bis 4 wurden in einem 10-L-Reaktor durchgeführt, und die Ansätze Nr. 5 bis 6 wurden in einem 30-L-Prototyp-Reaktor durchgeführt. Die Ansätze 1 bis 5 wurden einem einzigen Schritt durchgeführt, während die Ansätze 4' und 6 in zwei Schritten durchgeführt wurden. Im Ansatz 4' wurde die Biomasse mit einer ersten NaOH-Lösung (3,4 %) behandelt, dann filtriert und erneut mit einer zweiten NaOH-Lösung (2,8 %) behandelt. Im Ansatz Nr. 6 wurde die Biomasse in zwei Fraktionen geteilt, die nacheinander mit einer geringen Menge an NaOH in den Reaktor gegeben wurden, worauf eine größere Menge an NaOH folgte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
  • Tabelle 1
    Figure 00450001
  • Ein Extraktionsverfahren, welches von Folch et al. (1957, J Biol Chem 224: 497-509) beschrieben wurde und welchem die alkaliunlösliche Fraktion aus dem Ansatz Nr. 4 unterzogen wurde, zeigte, dass die Menge an lipophilen Verbindungen 6 % der ursprünglichen Trockenmasse betrug.
  • Eine Röntgenstreu-Untersuchung (Siemens D5000, Cu-Ka, ? = 0,15406 nm, 2? = 1,5 bei 30°, Spalt 1 mm, T 25 °C) der alkaliunlöslichen Fraktion aus Ansatz Nr. 4', dessen Chitin-Glucan-Mengenverhältnis 37:63 (w/w) betrug, zeigte eine breite Streubande bei 2? = 20° (2), was auf eine halbkristalline Struktur schließen lässt. Der Kristallinitätsindex kann nach dem Verfahren berechnet werden, das von Yinhai et al. (Chem. Mag. 2002, 4:27) oder Struszczyk et al. (J. Appl. Polym. Sci., 1987, 33: 177-189) vorgeschlagen wurde und Auskunft über den Anteil der kristallinen Bereiche gegenüber den amorphen Bereichen in der Verbindung gibt. Gemäß dem Berechnungsverfahren von Struszczyk beträgt der Kristallinitätsindex (Crl) dieser alkaliunlöslichen Chitin-Glucan-Verbindung 64 %, ein wesentlich niedrigerer Wert als derjenige, der für eine Chitinprobe aus Garnelenpanzern bestimmt wurde, welche unter den gleichen Bedingungen mittels des Röntgenstreuverfahrens untersucht wurde (Crl = 87 %).
  • Beispiel 3 Enzymatische β-Glucanase-Zubereitungen
  • Dieses Beispiel erläutert ein bevorzugtes Verfahren zum Testen verschiedener gewerblicher Zubereitungen aus β-Glucanasen im Hinblick auf eine Verwendung im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Die β-Glucanase-Aktivität anhand von Standardkurven quantitativ bestimmt werden, welche mit reinen β-Glucanase-Referenzenzymen, die mit β-Glucan-Standardsubstraten umgesetzt werden, erstellt wurden. Um beispielsweise die Aktivität der β-Glucanase EC 3.2.1.6 zu testen, können Lichenase (Megazyme) oder β-Glucanase (Fluka) mit Gersten β-Glucansubstrat (Megazyme) umgesetzt werden, zum Testen der Aktivität der β-Glucanase EC 3.2.1.39 kann ein endo-β-(1,3)-Enzym (Megazyme, Fluka) mit Pachyman- oder Curdlansubstraten (Megazyme) umgesetzt werden, zum Testen der Aktivität von EC 3.2.1.58 kann eine exo-β-Glucanase (Megazyme) mit Laminarin- oder Schleroglucansubstraten (Sigma, Megazyme) umgesetzt werden, und zum Testen der Aktivität der β-Glucanase EC 3.2.1.75 kann eine β-(1,6)-Glucanase mit Pustulan (Sigma) umgesetzt werden. Die β-Glucanase-Aktivität (in U, Einheiten) ist als Menge des Enzyms definiert, die benötigt wird, um bei 37°C und beim empfohlenen pH-Wert, nach Umsetzung mit dem Standardsubstrat, 1 μmol Glucose pro Minuten freizusetzen.
  • Die Proteinmenge, die in den gewerblichen Enzymzubereitungen enthalten ist, kann mit Hilfe des BCA-Verfahrens (Bicinchoninsäure) bestimmt werden, wobei dieses Verfahren auf der Reduktion von Cu(II)-Ionen zu Cu(I)-Ionen durch Proteine unter alkalischen Bedingungen beruht. Cu(I)-Ionen können einen Komplex mit BCA bilden, dessen Absorption bei 526 nm proportional zur Proteinkonzentration ist (PK Smith et al. (1985) Anal. Biochem. 150, 76). Die spezifische β-Glucanase-Aktivität (in U/mg) der gewerblichen Zubereitungen ist das Verhältnis der enzymatischen Aktivität zur Masse an Protein, die in der Zubereitung enthalten ist.
  • Enzymatische Zubereitungen, die eine oder mehrere der oben aufgeführten β-Glucanase-Aktivitäten enthalten, wurden vorzugsweise getestet (siehe Tabelle 2). Im Testverfahren wurden die Kombinationen ausgewählter Enzyme vorzugsweise auf ihre Fähigkeit getestet, die β-Glucanketten der alkaliunlöslichen Fraktion des verdauten Aspergillus niger Myzels zu hydrolysieren.
  • Tabelle 2 β-Glucanase-Aktivitäten in gewerblichen Enzymzubereitungen (in U pro mg Protein in der Zubereitung)
    Figure 00470001
  • Die β-Glucanase-Hydrolysereaktion wird vorzugsweise in der Suspension der alkaliunlöslichen Fraktion durchgeführt, welche nach der Alkalibehandlung der Biomasse gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und zwar bei einem pH-Wert, der vorzugsweise zwischen 4,0 und 7,0 liegt, insbesondere zwischen 4,5 und 6,8. Eine Mischung von β-Glucanase-Zubereitungen, zum Beispiel eine Mischung aus endo-β-(1,3-, exo-β-(1,3)- und endo-β-(1,3)(1,4)-Glucanase-Enzymen, wird der Suspension zugesetzt. Um die β-Glucanketten des Chitin-Glucans, welches aus der Aspergillus niger Biomasse extrahiert wurde, zu hydrolysieren, bewegt sich der Gehalt an β-Glucanasen, ausgedrückt in Aktivitätseinheiten pro Trockenmasse der verdauten Biomasse, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 1.500 U/g und insbesondere im Bereich von 20 bis 500 U/g. Die Konzentration der verdauten Biomasse beträgt vorzugsweise zwischen 0,5 und 15 % (w/v) und insbesondere zwischen 2 und 8 % (w/v). Die bevorzugte Reaktionstemperatur liegt bei weniger als 40 °C. Die Dauer der Hydrolysereaktion beträgt zwischen 1 und 8 Tagen, vorzugsweise beträgt sie weniger als 5 Tage.
  • Beispiel 4 Isolierung von Zellwandderivaten aus Aspergillus niger Biomasse gemäß der Erfindung
  • Dieses Beispiel erläutert die Isolierung von Zellwandderivaten aus Pilzbiomasse gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Biomasse wurde als Nebenprodukt eines Kulturverfahrens zur Herstellung von Zitronensäure unter Verwendung von Aspergillus niger erhalten.
  • In diesem Beispiel wurde ein Reaktor bei Raumtemperatur mit 3,3 kg Biomasse mit einem Wassergehalt von 71 %, 7,2 Litern Wasser und 320 g NaOH-Pellets beschickt. Nach 26 Stunden wurde die Mischung filtriert, um die unlösliche Fraktion der verbleibenden Biomasse zu entnehmen, welche anschließend dreimal gewaschen wurde. Die alkaliunlösliche Fraktion wurde entnommen und in 4 Litern Wasser in Suspension gebracht. Durch Zugabe von Eisessig wurde der pH-Wert der Suspension auf 5,5 eingestellt. Zu der angesäuerten Suspension wurden 13,2 g der β-Glucanase-Zubereitung Nr. 5 (siehe Tabelle 2) und 8,25 ml der beta-Glucanase-Zubereitung Nr. 6 (siehe Tabelle 2) hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 37 °C 4 Tage lang durchgeführt. Anschließend wurde die Suspension filtriert, und die unlösliche Fraktion wurde in Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, wobei die erhaltene Masse 34 % des ursprünglichen Chitin-Glucans entsprach.
  • Für dieses Beispiel zeigte das Festphasen-13C-NMR-Spektrum der Verbindung, dass Chitin sowie eine Restmenge an β-Glucan vorhanden waren, wobei das Chitin: Glucan-Mengenverhältnis 94:6 ± 14 (w/w) betrug.
  • Beispiel 5 beta-Glucanase-Hydrolyse einer Chitin-Glucan-Fraktion der Aspergillus niger Biomasse
  • Dieses Beispiel erläutert die β-Glucanase-Hydrolysereaktion, die im Rahmen eines Verfahrens zur Isolierung von Zellwandderivaten aus Pilzbiomasse gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.
  • In diesem Beispiel wurde die β-Glucanase-Hydrolysereaktion unter verschiedenen Bedingungen mit unterschiedlichen Mengen der gewerblichen beta-Glucanase-Zubereitungen Nr. 2, 5 und 6 (siehe Tabelle 2) durchgeführt, und zwar über eine Dauer von 5 Tagen. Bei der zu hydrolysierenden Ausgangsverbindung handelte es sich um ein gefriergetrocknetes Chitin-Glucan-Gemisch, welches aus dem Myzel von Aspergillus niger gemäß einem oben beschriebenen Verfahren extrahiert wurde, wobei das Mengenverhältnis von Chitin zu Glucan entweder 32:68 (Ansatz Nr. 1) oder 38:62 (Ansätze Nr. 2 bis 7) betrug. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Table 3
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Die Röntgenstreu-Untersuchung (Siemens D5000, Cu-Ka, ? = 0,15406 nm, 2? = 1,5 bei 30°, Spalt 1 mm, T = 25 °C) der chitinreichen alkaliunlöslichen Fraktion aus Ansatz Nr. 2, dessen Chitin-Glucan-Mengenverhältnis 85:15 ± 8 (w/w) betrug, zeigte eine breite Streubande bei 2? = 20° (3). In diesem Beispiel betrug der Kristallinitätsindex der Verbindung, der gemäß Struszczyk et al. (J. Appl. Polym. Sci. (1987)33, 177-189) berechnet wurde, 67 %, während der für Chitin, das aus Garnelenpanzern extrahiert wurde, bei 87 % liegt.
  • Beispiel 6 Herstellung von Chitosan aus Chitin, das aus Pilzen stammt
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Chitosan aus Chitin, welches nach β-Glucanase-Hydrolyse einer Chitin: Glucan-Fraktion aus Aspergillus niger Myzel erhalten wurde.
  • 4 g der unlöslichen Fraktion, die durch die beta-Glucanase-Hydrolyse in Beispiel 4 erhalten wurde, 40 g NaOH und 40 ml Wasser wurden 1 Stunde lang bei einer Temperatur von 120 °C gehalten. Die erhaltene Suspension wurde in 200 ml Wasser in Suspension gebracht, und Essigsäure wurde hinzugefügt, um einem pH-Wert von 3,5 zu erreichen. Nach 12 Stunden wurde die Lösung filtriert und das filtriert wurde aufgefangen. In diesem Beispiel wurde der pH-Wert des Filtrats durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf 9,5 eingestellt, um die Fällung von Chitosan zu fördern. Nachdem zentrifugiert, gewaschen und gefriergetrocknet wurde, wurde 1 g der säurelöslichen Fraktion erhalten. In diesem Beispiel zeigte das Festphasen-13C-NMR-Spektrum der Verbindung, dass die säurelösliche Fraktion aus reinem Chitosan bestand, ohne verbleibende β-Glucanketten. Der Anteil des N-Acetyl-D-glucosamin betrug 14 mol%, und das viskosimetrische Molekulargewicht lag bei ungefähr 20.000 Da, gemessen mittels Ubbelohde Kapillarviskosimetrie.
  • Beispiel 7 Herstellung von Chitosanchlorid aus Chitin, das aus Pilzen stammt
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Chitosanchlorid aus Chitin, welches nach beta-Glucanase-Hydrolyse einer Chitin-Glucan-Fraktion aus Aspergillus niger Myzel erhalten wurde.
  • In diesem Beispiel wurden 60 g einer chitinreichen unlöslichen Fraktion, die durch die β-Glucanase-Hydrolyse wie z.B. in Beispiel 4 erhalten wurde, 300 g NaOH, 6 g Natriumborhydrid und 300 g Wasser 1 Stunde lang bei 120 °C gehalten. Die erhaltene Suspension wurde anschließend zentrifugiert, filtriert und bis zu einer geringen Leitfähigkeit gewaschen. Die unlösliche Fraktion wurde in 200 ml Essigsäure (0,5 M) in Suspension gebracht. Nach 12 Stunden wurde die Lösung filtriert und das Filtrat wurde aufgefangen. In diesem Beispiel wurde der pH-Wert des Filtrats durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf 9,5 eingestellt, um die Fällung von Chitosan zu fördern. Nach dem Zentrifugieren und Waschen wurde die säurelösliche Fraktion in 28 ml HCl 1N bei 3,6 solubilisiert. Die Lösung wurde dann gefriergetrocknet, wobei 6 g Chitosan in der Ammoniumchloridform erhalten wurden. Der Anteil an N-Acetyl-Glucosamin betrug 17 mol% und das viskosimetrische Molekulargewicht lag bei ungefähr 20.000 Da.
  • Beispiel 8 Herstellung von Chitosan mit hohem Molekulargewicht und niedrigem Acetylierungsgrad durch enzymatische Deacetylierung von Chitin
  • In diesem Beispiel wurde gewerbliches Chitin aus Garnelenpanzern unter verschiedenen Bedingungen behandelt, um Chitosan zu gewinnen. Zuerst wurde es mit einer starken alkalischen NaOH-Lösung mit verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen NaOH:Chitin-Mengenverhältnissen behandelt, um das Chitin in die Gelform zu überführen und eine teilweise Deacetylierung des N-Acetyl-Glucosamins in den Glucosamin-Einheiten zu bewirken. Anschließend wurde das teilweise deacetylierte Chitin filtriert, gewaschen und in einer von Natriumphthalat (10 mM) bei einem pH-Wert von 5,5 wieder in Suspension gebracht, um eine Chitinkonzentration von 5 (w/v) zu erzielen. Anschließend wurde ein rekombinantes Chitin-Deacetylase-Enzym (rCDA) hinzugefügt, wobei das rCDA:Chitin-Mengenverhältnis 5:1.000 betrug, woraufhin die Suspension 5 Tage lang bei 37 °C gehalten wurde. Um das Ausmaß der Deacetylierung, die durch rCDA bewirkt wurde, abzuschätzen, wurde die freigesetzte Essigsäure bestimmt. Die Suspension wurde filtriert, und die alkaliunlösliche Fraktion wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Sie wurde anschließend in einer Essigsäurelösung solubilisiert und filtriert, woraufhin der pH-Wert durch Zugabe von Ammoniumhydroxid erhöht wurde, um die Fällung der Chitosanketten zu fördern. Anschließend wurde der Niederschlag gewaschen und getrocknet. Die Ergebnisse der Ansätze sind in Tabelle 4 dargestellt.
  • Tabelle 4
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • In diesem Beispiel hing die Wirksamkeit des rCDA-Enzyms von der vorherigen Alkalibehandlung, hauptsächlich von der NaOH-Konzentration und der Temperatur, ab, wie der Unterschied der DA-Werte vor und nach der Reaktion mit rCDA (DDA) zeigt. Wie in den Ansätzen Nr. 5 bis 8 dieses Beispiels beobachtet wurde, tritt das Chitin vorzugsweise in der gelierten Form auf, wenn die Alkalikonzentration bei mehr als 50 % liegt, und es ist vorzugsweise ausreichend vor-deacetyliert, um es der rCDA zu ermöglichen, die Deacetylierungsreaktion au katalysieren.
  • Beispiel 9 Herstellung von Chitosan mit hohem Molekulargewicht durch enzymatische Deacetylierung von Chitosan
  • Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von Chitosan mit hohem Molekulargewicht und einem niedrige Acetylierungsgrad durch enzymatische Deacetylierung von Chitosan. Verschiedenartige Chitosanproben, die durch ihr ursprüngliches viskosimetrisches Molekulargewicht (Mv0) und ihren Acetylierungsgrad (DA0) gekennzeichnet sind, wurden mit der rekombinanten Chitin-Deacetylase (rCDA) umgesetzt, um den Acetylierungsgrad auf einen niedrigeren Wert (DAF) abzusenken. In einer Reihe von Ansätzen wurden als Reaktionsmedium entweder eine nicht gepufferte Lösung von Salzsäure 1 N (Ansätze Nr. 1 bis 4) oder Ameisensäure 1 N (Ansätze Nr. 5 bis 10) oder eine gepufferte Ameisensäurelösung 1 N mit Natriumphthalat (Nr. 10 oder -glutamat (Nr. 11) verwendet, wobei der pH-Wert variierte. In diesem Beispiel betrug das Mengenverhältnis von rCDA zu Chitosan entweder 1:1.000 (Nr. 4) oder 5:1.000.
  • Anschließend wurde Chitosan wie in den obigen Beispielen beschrieben durch Fällung bei pH-Werten über 7,0 gewonnen. Die Ergebnisse der Ansätze sind in Tabelle 5 dargestellt. Bei sämtlichen Proben blieb das viskosimetrische Molekulargewicht am Ende unverändert.
  • Tabelle 5
    Figure 00540001
  • Beispiel 10 Herstellung eines poröses Trägermaterials, das Chitosan umfasst
  • Chitosan, das gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, kann zur Herstellung von Filmen oder porösen Gegenständen verwendet werden, wobei deren Porengröße festlegbar ist.
  • Zum Beispiel können Partikel von festgelegter Größe, die aus wasserlöslichen Molekülen (z.B. aus Natriumchlorid) bestehen, mit Chitosan in einer Säurelösung gemischt werden. Anschließend wird diese Chitosanmatrix durch Lösemittelverdampfung oder Gefriertrocknung in den festen Zustand überführt. Die Partikel werden durch Waschen entfernt, um die Poren zu erzeugen.
  • Poröse Matrices, die Chitosan umfassen, können auch hergestellt werden, indem eine Polymer/Lösemittel-Phasentrennung des Typs flüssig zu fest oder flüssig zu flüssig durchgeführt wird, wobei das auslösende Moment die Temperatur ist. Zum Beispiel wird Chitosan in einem Lösemittel wie etwa einer konzentrierten oder verdünnten organischen Säure, beispielsweise in Essigsäure oder Ameisensäure, gelöst und anschließend gefroren, wobei die Temperatur unterhalb der Erstarrungstemperatur des Lösemittels (Schmelzpunkt) liegt, und dann gefriergetrocknet. Die Poren entstehen anstelle der Lösemittelkristalle, wobei diese Kristalle sich zum Zeitpunkt des Erstarrens durch einen Phasenübergang von flüssig zu fest bilden. Eine Phasenübergang von flüssig zu flüssig kann ebenfalls ausgelöst werden, indem Chitosan in einer Lösemittelmischung eines Lösemittels und eines nicht lösenden Mittels gelöst wird (welche beide gefriergetrocknet werden können). Bei dem Lösemittel kann es sich um eine konzentrierte organische Säure wie etwa Essigsäure oder Ameisensäure handeln. Die Größe und die Verteilung der Poren hängen vom Übergangsmechanismus aus der Polymer/Lösemittelphase ab.

Claims (17)

  1. Verfahren zur Isolierung von Zellwandderivaten aus Pilz- oder Hefe-Biomasse, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) In-Kontakt-Bringen der Biomasse mit einer basischen Lösung, wofurch eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten wird und wodurch die alkalilösliche Fraktion verworfen wird und die alkaliunlösliche Fraktion, welche die Zellwandderivate umfasst, zurückbehalten wird, b) In-Kontakt-Bringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung, indem die alkaliunlösliche Fraktion suspendiert und die suspendierte Fraktion mit der sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine Suspension angesäuerter alkaliunlöslicher Fraktion zu erhalten, welche die Zellwandderivate umfasst, und c) In-Kontakt-Bringen der angesäuerten Suspension der alkaliunlöslichen Fraktion mit β-Glukanase-Enzymen, wodurch die Zellwandderivate erhalten warden, dadurch gekennzichnet, dass die isolierten und in Schritt d) Erhaltenen Zellwandderivate Chitinpolymere oder chitinreiche Chitin-Glukan Kopolymere sind.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Chitin in den chitinreichen Chitin-Glukan-Kopolymeren einstellbar und vorzugsweise höher als 80% ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) oder b) erhaltenen Zellwandderivate Chitin-Glukan-Kopolymere sind, deren relative Mengen an Chitin und Glukan von der verwendeten Biomasse abhängen.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Lösung eine Konzentration von weniger als 10% (w/v) umfasst.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse ausgewählt wird aus Zygomyceten, Basidiomyceten, Ascomyceten und Deuteromyceten und/oder Gemischen davon.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse ein Nebenprodukt ist, das in einem Kultivierungsverfahren erhältlich ist, wobei eine Pilz- oder Hefe-Kultur verwendet wird.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die β-Glukanase-Enzyme aus gewählt warden aus Endo-β-(1,3)-Glukanase-, Exo-β-(1,3)-Glukanase-, β-(1,3)(1,4)-Glukanase-, β-(1,6)-Tlukanase-Enzymen oder jedem Gemiqch davon.
  8. Verfahren zur Zubereitung von Chitosan aus Chitin, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst a) In-Kontakt-Bringen des Chitins mit einer basischen Lösung, wodurch eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten wird und wodurch die alkalilösliche Fraktion verworfen wird und die alkaliunlösliche Fraktion, die teilweise deacetyliertes Chitin umfasst, zurückbehalten wird, b) In-Kontakt-Bringen der alkaliunlösliche Fraktion mit einer sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, um eine Suspension angesäuerter alkaliunlöslicher Fraktion zu erhalten, die teilweise deacetyliertes Chitin umfasst, und c) In-Kontadt-Bringen der angesäuerten Suspension der alkaliunlöslichen Fraktion mit einem Chitin-Deacetylase-Enzym, wodurch Chitosan erhalten wird.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei ein weiterer Schritt bereitgestellt wird, der die Präzpitation des erhaltenen Chitosnas umfasst.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Chitin Pilz- oder Hefe-Chitin ist, das durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die basische Lösung eine Konzentration von mehr als 40% (w/v) umfasst.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von basischer Lösung zu der Chitinmasse zwischen 5 und 25 (w/w) beträgt.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei Schritt a) bei einer Temperatur zwischen 50 und 120°C ausgeführt wird.
  14. Verfahren zur Zubereitung von Chitosan aus Pilz- oder Hefe-Chitin, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Isolieren von Chitinpolymeren oder chitinreichen Chitin-Glukan-Kopolymeren aus Pils- oder Hefe-Biomasse gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1, b) In-Kontakt-Bringen der isolierten Chitinpolymere oder chitinreichen Chitin-Glukan-Kopolymere mit einer basischen Lôsung, wodurch eine alkalilösliche Fraktion und eine alkaliunlösliche Fraktion erhalten wird und wodurch die alkalilösliche Fraktion verworfen und die alkaliunlösliche Fraktion zurückbehalten wird, c) In-Kontakt-Bringen der alkaliunlöslichen Fraktion mit einer sauren Lösung in Kontakt gebracht wird, wodurch eine säureunlösliche Fraktion und eine säurelösliche Fraktion erhalten wird und wodurch die säureunlösliche Fraktion verworfen und die säurelösliche Fraktion, die Chitosan umfasst, zurückbehalten wird.
  15. Vefahren zur Zubereitung von Chitosan gemäß Anspruch 14, wobei ein weiterer Schritt bereitgestellt wird, der die Präzipitation von Chitosan aus der säurelöslichen Fraktion umfasst, indem die Fraktion mit einer basischen Lösung in Kontakt gebracht wird.
  16. Verfahren zur Zubereitung von Chitosan gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von basischer Lösung zu der Chitinmasse zwischen 1 und 20 (w/w) beträgt.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die alkaliunlösliche Fraktion bei einer Temperatur zwischen 80° und 140°C suspendiert wird.
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