ES2271605T3 - Derivados de pared celular a partir de biomasa y preparacion de los mismos. - Google Patents
Derivados de pared celular a partir de biomasa y preparacion de los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2271605T3 ES2271605T3 ES03739480T ES03739480T ES2271605T3 ES 2271605 T3 ES2271605 T3 ES 2271605T3 ES 03739480 T ES03739480 T ES 03739480T ES 03739480 T ES03739480 T ES 03739480T ES 2271605 T3 ES2271605 T3 ES 2271605T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- chitin
- fraction
- alkali
- chitosan
- insoluble
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
- A61K8/9728—Fungi, e.g. yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
Abstract
Método para aislar derivados de pared celular a partir de biomasa fúngica o de levaduras, que comprende las etapas subsiguientes de: a) poner en contacto dicha biomasa con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende dichos derivados de pared celular, b) poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una suspensión de la fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dichos derivados de pared celular, y c) poner en contacto dicha suspensión acidificada de fracción insoluble en álcali con enzimas beta-glucanasas mediante lo cual se obtienen dichos derivados de pared celular, caracterizado porque dichos derivadosde pared celular aislados y obtenidos en la etapa c) son polímeros de quitina o copolímeros de quitina-glucanoricos en quitina.
Description
Derivados de pared celular a partir de biomasa y
preparación de los mismos.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un método para aislar derivados de pared celular a partir
de biomasa fúngica o de levaduras. En otro aspecto, la invención se
refiere a un método para preparar quitosano a partir de quitina. La
invención se refiere además a polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano y polímeros de quitosano que pueden
obtenerse mediante los métodos según la invención. Además, la
invención se refiere al uso de polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano o polímeros de quitosano que pueden
obtenerse mediante los métodos según la invención en aplicaciones
farmacéuticas, médicas, agrícolas, nutracéuticas, alimenticias,
textiles, cosméticas, industriales y/o medioambientales.
Los polisacáridos naturales tales como almidón,
celulosa o quitina son de gran importancia tecnológica, ya que
están fácilmente disponibles en grandes cantidades, y ya que
presentan características únicas que no se encuentran a menudo en
polímeros sintéticos. Por ejemplo, las paredes celulares de los
hongos están organizadas mediante una red de polisacáridos,
proteínas, lípidos, siendo la mayor parte de las cadenas de
polisacárido, \beta-glucanos y quitina.
La quitina es un polímero de alto peso molecular
natural que se encuentra ampliamente en la naturaleza, de hecho el
segundo biopolímero principal tras la celulosa. La quitina es un
polisacárido cuya estructura es similar a la de la celulosa. Es el
principal componente de la cutícula de insectos y crustáceos, y
también forma parte de las paredes celulares de algunos hongos y
otros microorganismos. El quitosano se produce a nivel industrial
mediante la modificación química de quitina, y se encuentra de
manera natural en unos cuantos microorganismos. La quitina es el
polímero lineal de
N-acetil-(D)-glucosamina unida a
través de un enlace osídico \beta(1,4), que puede
representarse mediante la fórmula I. El quitosano es el polímero al
azar de N-acetil-(D)-glucosamina y
(D)-glucosamina, que puede representarse mediante la
fórmula II. La quitina y el quitosano son parte de la familia de
polímeros de glucosaminoglucanos.
Similar a la celulosa, la quitina es un
polisacárido fibroso que tiene propiedades químicas y biológicas
adicionales, útil en muchas aplicaciones industriales y médicas. No
obstante, la quitina es más difícil de extraer, dado que
normalmente se encuentra en su estructura natural en la que se
asocia estrechamente con otras sustancias.
El quitosano puede prepararse mediante la
hidrólisis parcial de los grupos acetilo de las unidades de
N-acetil-glucosamina, de modo que
el polímero se vuelve soluble en una disolución diluida de la
mayoría de los ácidos. El quitosano puede derivarse de un polímero
extraído de la biomasa, quitina. Está definido por dos
características moleculares, el peso molecular promedio y el grado
de acetilación, que es la proporción de unidades de glucosamina
acetiladas a lo largo de la estructura principal del polímero.
Fórmula I:
quitina
\vskip1.000000\baselineskip
Fórmula II:
quitosano
La producción industrial de quitina y quitosano
se aprovecha generalmente de residuos de conchas de crustáceos, por
ejemplo conchas de cangrejos y cáscaras de gambas. Dos etapas,
descalcificación mediante tratamiento ácido y desproteinización
mediante tratamiento alcalino, permiten el aislamiento de la
quitina, seguido por una etapa de desacetilación utilizando una
disolución alcalina concentrada caliente. Sin embargo, la quitina
producida a partir de biomasa de crustáceos a menudo contiene altos
niveles de minerales, principalmente carbonato de calcio, cuya
cantidad puede llegar a ser de hasta el 90% del peso seco de la
quitina. Por tanto, la calidad de la quitina y el quitosano a
menudo no es reproducible y depende de la variación estacional y de
la especie de crustáceo. El método de desacetilación es uno de
degradación, y a menudo el quitosano es de peso molecular y grado
de acetilación muy variables, lo que hace más difícil el desarrollo
del producto por parte de los usuarios. Además, resultan altos
costes de producción del requerimiento de una enorme energía
calorífica, y de grandes cantidades de hidróxido de sodio, así como
el amplio tratamiento ácido requerido por la separación de quitina
del carbonato de calcio, cuya cantidad puede llegar a ser de hasta
el 90% del peso seco de la quitina.
Sin embargo, sí que existen fuentes alternativas
de quitina y quitosano, como por ejemplo hongos cuyas paredes
celulares pueden contener hasta el 40% del peso seco de la pared. El
micelio fúngico es una red compleja de filamentos compuestos por
células. Las paredes celulares del micelio se componen de
hemicelulosa, quitina y \beta-glucanos. Pueden
seleccionarse hongos que contienen cantidades suficientes de quitina
y hacerse crecer específicamente para la extracción de quitina.
Además, los subproductos de procesos industriales de fermentación,
tales como la biomasa recogida tras la fermentación de hongos o
levaduras, también contienen quitina asociada con otros
biopolímeros, principalmente glucanos, mananos, proteínas y lípidos.
Estos subproductos de la fermentación se queman generalmente justo
tras la separación del medio de cultivo, porque su almacenamiento
no es relevante económicamente.
Para que se utilicen quitina y quitosano en
tantas aplicaciones como sea posible, su calidad debe ser uniforme
y pura. La producción de quitosano a partir de una quitina pura, que
estaría disponible en grandes cantidades de manera reproducible y
contendría bajas cantidades de impurezas inorgánicas y proteicas
sería, por tanto, un avance sustancial en este campo.
El estado de la técnica referente a las fuentes
de quitina y quitosano alternativas a las de los crustáceos no es
muy amplio. Unas cuantas patentes y solicitudes de patente se
refieren al micelio fúngico como fuente industrial potencial de
quitina, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. número 4.960.413,
número 6.255.085, número 4.195.175, número 4.368.322, número
4.806.474, número 5.232.842, número 6.333.399, y las solicitudes de
patente WO 01/68714, GB-A-458.839,
GB-A-2.026.516,
GB-A-2.259.709,
DE-A-2.923.802 y
RU-C-2.043.995. La mayoría de estos
documentos describen métodos para preparar quitosano o
quitosano-glucano a partir de micelio fúngico.
Además, los métodos describen la transformación directa de quitina
contenida en las paredes celulares fúngicas, sin ninguna etapa
intermedia para el aislamiento y la purificación de quitina. Por
tanto, los métodos descritos en estas patentes y solicitudes de
patente no permiten el aislamiento de quitina pura como una fuente
de quitosano puro. En estos métodos, se emplean disoluciones
alcalinas altamente concentradas y condiciones estrictas de
temperatura y duración, que aportan de nuevo altos riegos de
contaminación. Además, estos procedimientos agresivos producen
probablemente quitosano y derivados de
quitina de muy bajo peso molecular, y no pueden usarse para la producción de quitosano de peso molecular superior.
quitina de muy bajo peso molecular, y no pueden usarse para la producción de quitosano de peso molecular superior.
Otros artículos describen los estudios
fundamentales de la estructura de pared celular de algunas especies
de hongos, por ejemplo, Hartland et al. (1994) Yeast
10, 1591-1599; Hong et al. (1994)
Yeast, 10, 1083-1092; Heam et al.
(1994) Microbiology 140, 789-795; Fontaine
et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275,
27594-27607. Estos estudios concluyen
sistemáticamente que las paredes celulares se componen
principalmente de quitina y beta-glucanos, y que
los dos tipos de cadenas poliméricas están estrechamente asociadas,
probablemente a través de enlaces covalentes en la mayoría de los
hongos. Algunos de estos estudios mencionan el uso de enzimas
específicas para degradar selectivamente los componentes de las
paredes celulares, concretamente glucanasas y quitinasas, con el
fin de identificar adicionalmente azúcares residuales para poder
estimar la composición de polisacáridos inicial. En general, es un
objeto de la presente invención proporcionar un método mejorado
para el aislamiento de derivados de pared celular a partir de
biomasa fúngica y de levaduras. En particular, es un objeto de la
presente invención proporcionar un método para aislar polímeros de
quitina o polímeros de quitina-glucano. Es otro
objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar
quitosano.
Otro objeto de la invención es aislar polímeros
de quitina y preparar quitosano tras un rápido proceso que no
requiere un alto consumo de energía ni productos químicos que serían
perjudiciales para el medio ambiente.
Otro aspecto de la invención es proporcionar un
método para aislar polímeros de quitina pura y preparar polímeros
de quitosano de origen no animal, que son adecuados para
aplicaciones en diversos campos.
La presente invención también tiene como
objetivo proporcionar polímeros de quitina que tienen un alto grado
de pureza. Además, es otro objeto de la presente invención
proporcionar copolímeros de quitina-glucano en los
que puede ajustarse la cantidad de quitina y
beta-glucano. La presente invención tiene como
objetivo además proporcionar quitosano que tiene un alto grado de
pureza y un grado de acetilación y un peso molecular
controlables.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un método para aislar derivados de pared celular a partir
de biomasa fúngica y de levaduras, que comprende las etapas
subsiguientes de:
- a)
- poner en contacto dicha biomasa con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende dichos derivados de pared celular,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una suspensión de la fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dichos derivados de pared celular, y
- c)
- poner en contacto dicha suspensión acidificada de la fracción insoluble en álcali con enzimas \beta-glucanasas mediante lo cual se obtienen dichos derivados de pared celular.
La biomasa fúngica o de levaduras tratada en el
presente método según la invención se compone de células fúngicas o
de levaduras, de las que las paredes celulares contienen quitina.
Alternativamente, dicha biomasa también puede ser un producto
secundario de un proceso de cultivo industrial en el que se usa un
cultivo fúngico o de levaduras.
La invención proporciona un método que evita los
principales inconvenientes de los métodos existentes. Más
particularmente, la invención proporciona un método de aislamiento
de quitina con ventajas económicas y medioambientales sobre los
métodos y las fuentes existentes. Más particularmente, la invención
describe un método que permite separar quitina de
\beta-glucanos de manera controlada, sin
degradación o transformación de las cadenas de quitina.
En una realización preferida, la invención se
refiere a un método en el que dichos derivados de pared celular
obtenidos en la etapa c) son polímeros de quitina o copolímeros de
quitina-glucano ricos en quitina. Más en
particular, la invención se refiere a un método para el aislamiento
de quitina a partir de biomasa fúngica o de levaduras con el fin de
obtener polímeros de quitina, esencialmente libres de otros
polisacáridos como \beta-glucanos.
El término "polímeros de quitina" se
refiere a polímeros de quitina que contienen más del 80% de quitina
y menos del 20% de beta-glucano, y preferiblemente
más del 90% de quitina e incluso más preferido más del 95% de
quitina. En una realización, se proporcionan polímeros de quitina en
los que dichos polímeros de quitina comprenden más del 80% de
quitina.
El término "copolímeros de
quitina-glucano ricos en quitina" se refiere a
polímeros, que comprenden polímeros de quitina así como polímeros
de glucano en ciertas cantidades relativas, pero que tienen una
cantidad relativa superior de quitina que de glucano. El método
según la invención permite ajustar específicamente las cantidades
de quitina y glucano en estos copolímeros de
quitina-glucano. La cantidad de quitina en los
copolímeros puede ajustarse controlando las condiciones de la etapa
de hidrólisis enzimática en el presente método. La invención
proporciona así un método para obtener copolímeros que comprenden
quitina con una pureza controlable. El término "polímeros que
comprenden quitina con una pureza controlable" se refiere a un
producto polimérico en el que puede ajustarse la cantidad de
quitina de manera controlable por medio de enzimas glucanasas. En
una realización preferida, puede ajustarse la cantidad de quitina
en dichos copolímeros de quitina-glucano ricos en
quitina'' y es preferiblemente superior al 75% e incluso más
preferiblemente superior al 80%.
En otra realización preferida, la invención se
refiere a un método en el que dichos derivados de pared celular
obtenidos en una etapa a) o b) son copolímeros de
quitina-glucano, a partir de los cuales las
cantidades relativas de quitina con respecto a glucano dependen de
la biomasa usada. El término "copolímeros de
quitina-glucano" tal como se utiliza en el
presente documento se refiere a copolímeros obtenidos tras la
extracción de biomasa fúngica o de levaduras pero antes de la
reacción enzimática por medio de enzimas glucanasas. La cantidad de
quitina en dichos copolímeros de quitina-glucano
está definida por el microorganismo del que se extrae. En una
realización preferida, se utiliza el micelio de Aspergillus
niger en el método según la invención, y los copolímeros de
quitina-glucano extraídos del micelio de
Aspergillus niger comprenden entre el 30 y el 50% (p/p) de
quitina y entre el 50 y el 70% de beta-glucano.
Los términos "quitina" y "polímeros de
quitina" se usan en el presente documento como sinónimos.
Adicionalmente, los términos "quitosano" y "polímeros de
quitosano" se usan en el presente documento como sinónimos.
En un segundo aspecto, la presente invención se
refiere a un método para preparar quitosano a partir de quitina que
comprende las etapas subsiguientes de:
- a)
- poner en contacto dicha biomasa con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende quitina parcialmente desacetilada,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dicha quitina parcialmente desacetilada, y
- c)
- poner en contacto dicha fracción acidificada con una quitina desacetilasa, mediante lo cual se obtiene quitosano.
En este aspecto, la invención proporciona un
método para preparar quitosano, mediante el cual quitosano de alto
peso molecular, con grado de acetilación controlado, mediante una
reacción de desacetilación enzimática de quitina con una enzima
quitina desacetilasa. En este aspecto, la invención también
proporciona un método para preparar quitosano mediante el cual
puede obtenerse un quitosano de peso molecular bajo y medio con un
grado de acetilación controlable.
El término "peso molecular bajo y medio" se
refiere a un peso molecular promedio inferior a 100 kDa, según se
mide mediante viscosimetría capilar de Ubbelohde. El término "alto
peso molecular" se refiere a un peso molecular promedio superior
a 100 kDa, según se mide mediante viscosimetría capilar de
Ubbelohde.
El término "quitosano que tiene un grado de
acetilación controlado" se refiere a un producto en el que el
grado de acetilación, es decir, la proporción de unidades de
N-acetil-glucosamina, puede
ajustarse de manera controlable.
En una realización preferida, la invención se
refiere a un método en el que dicha quitina es quitina fúngica o de
levaduras que puede obtenerse mediante el método para aislar
derivados de pared celular a partir de biomasa fúngica o de
levaduras según la presente invención. Dado que esta fuente de
quitina comprende un grado de pureza muy alto, la invención permite
preparar quitosano, que también produce un alto grado de pureza.
Adicionalmente, este método también proporciona quitosano que tiene
un grado de acetilación ajustable, puesto que puede ajustarse el
grado de acetilación controlando las condiciones de la
desacetilación enzimática en el presente método.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para preparar quitosano a partir de quitina fúngica o de
levaduras, que comprende las etapas subsiguientes de:
- a)
- poner en contacto dicha quitina con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, mediante lo cual se obtienen una fracción insoluble en ácido y una fracción soluble en ácido y mediante lo cual se desecha dicha fracción insoluble en ácido y se conserva dicha fracción soluble en ácido que comprende quitosano.
En este aspecto, la invención proporciona un
método para preparar quitosano, que produce un peso molecular bajo
y medio. Este método comprende una reacción de hidrólisis alcalina
de quitina obtenida a partir de biomasa fúngica o de levaduras. El
término "peso molecular bajo y medio" se refiere a un peso
molecular promedio inferior a 100 kDa, según se definió
anteriormente.
En otro aspecto, la invención se refiere a
polímeros de quitina que pueden obtenerse mediante el método según
la presente invención.
Adicionalmente, la invención se refiere a
copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina que
pueden obtenerse mediante el método según la presente
invención.
La invención se refiere además a polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante el método según la presente
invención.
La invención se refiere además en otro aspecto a
un material compuesto que comprende polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina o
polímeros de quitosano que pueden obtenerse mediante el método
según la presente invención.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano ricos en quitina o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante el método según la presente
invención en aplicaciones médicas, farmacéuticas, agrícolas,
nutracéuticas, alimenticias, textiles, cosméticas, industriales y/o
medioambientales.
Los expertos en la técnica reconocerán
inmediatamente los muchos otros efectos y ventajas de los presentes
métodos y las numerosas posibilidades para usos finales de la
presente invención a partir de la descripción detallada y los
ejemplos facilitados a continuación.
La figura 1 representa el espectro de
^{13}C-RMN de estado sólido de la fracción
insoluble en álcali que comprende un polímero de
quitina-glucano purificado obtenido tras la
digestión alcalina de biomasa fúngica según la primera etapa del
método para aislar derivados de pared celular de la presente
invención. La razón de quitina-glucano es de 41:59
(p/p).
La figura 2 representa un estudio de dispersión
de rayos X de la fracción insoluble en álcali tras la digestión
alcalina de biomasa fúngica según la primera etapa del método para
aislar derivados de pared celular de la presente invención, cuya
razón de quitina-glucano era de 38:62 \pm 3
(p/p).
La figura 3 representa un estudio de dispersión
de rayos X de la fracción insoluble en álcali tras la digestión
alcalina de biomasa fúngica según la primera etapa del método para
aislar derivados de pared celular de la presente invención, cuya
razón de quitina-glucano era de 85:15 \pm 8
(p/p).
La invención describe en un primer aspecto un
método para aislar derivados de pared celular a partir de biomasa
fúngica o de levaduras, que comprende las etapas descritas
anteriormente.
En una realización preferida, la invención se
refiere a un método caracterizado porque dichos derivados de pared
celular son polímeros de quitina. El término "polímeros" tal
como se utiliza en el presente documento se refiere a sustancias de
alto peso molecular que son mezclas de cadenas compuestas por la
repetición de uno o varios tipos de unidades monoméricas.
Generalmente, los polímeros se componen de al menos tres unidades
monoméricas. La unidad monomérica es la unidad de repetición que
constituye las cadenas poliméricas. El término "polímeros de
quitina" se refiere a un polímero compuesto por al menos tres
unidades de repetición monoméricas de
\beta(1,4)-N-acetil-(D)-glucosamina,
y preferiblemente más de 10, e incluso más preferiblemente más de
20 unidades monoméricas. Los polímeros de quitina son cadenas de
unidades de
\beta(1,4)-N-acetil-(D)-glucosamina
monoméricas unidas a través de un enlace osídico
\beta(1,4) covalente.
La presente invención proporciona un método, que
permite extraer la quitina contenida en el micelio de hongos y
levaduras. La técnica anterior ha mostrado repetidamente que en las
paredes celulares de la mayoría de levaduras y hongos, la quitina
está asociada con otros polímeros a través de enlaces covalentes,
por ejemplo con polisacáridos del tipo
\beta-glucano, formando así una estructura de
fibrillas típica. Éste es el motivo por el cual la quitina es
difícil de extraer a partir de la biomasa fúngica y de levaduras y
de recoger en forma pura. Con el fin de obtener cadenas de quitina,
las cadenas de quitina han de separarse de las otras cadenas
poliméricas, preferiblemente mediante un método no degradante. La
presente invención describe un método que permite separar quitina
de otros polímeros, que comprenden principalmente
\beta-glucanos, sin degradación de las cadenas de
quitina.
La quitina puede obtenerse a partir de biomasa
no animal, en particular a partir de las paredes celulares del
micelio fúngico o levaduras de varios grupos, incluyendo
Zygomycetes, Basidiomycetes, Ascomycetes y Deuteromycetes
y/o mezclas de los mismos, y preferiblemente Ascomycetes.
Aspergillus y levaduras como Saccharomyces pertenecen a
este último grupo. En una realización preferida, la invención se
refiere a un método caracterizado porque dicha biomasa se
selecciona del grupo que comprende, pero no se limita a hongos
filamentosos y levaduras tales como especies de Aspergillus,
Penicillium, Trichoderma, Saccharomyces y
Schizosaccharomyces, y setas comestibles tales como especies
de Agaricus, Pleurotus, Boletus y Lentinula, y/o
mezclas de las mismas. Una característica común de estos hongos y
levaduras es la presencia de quitina en sus paredes celulares. En
una realización incluso más preferida, dicha biomasa se obtiene de
Aspergillus niger.
En otra realización, el método se caracteriza
porque dicha biomasa es un producto secundario que puede obtenerse
en un proceso de cultivo en el que se utiliza un cultivo fúngico o
de levaduras. Puede recogerse el micelio fúngico en cultivos
fúngicos modificados mediante ingeniería para la producción
industrial de compuestos como, por ejemplo, ácido cítrico, enzimas
y antibióticos. La quitina puede extraerse de las paredes celulares
de estos productos secundarios de cultivo. En una realización
preferida, dicho método se caracteriza porque dicha biomasa es un
producto secundario de un proceso de cultivo en el que se utiliza un
cultivo de Aspergillus niger para obtener ácido cítrico.
El método según la invención comprende poner en
contacto dicha biomasa con una disolución básica, mediante lo cual
se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble
en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en
álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que
comprende dichos derivados de pared celular. La disolución alcalina
utilizada para digerir la biomasa fúngica o de levaduras es una
disolución acuosa de un álcali como hidróxido de sodio, hidróxido de
potasio, hidróxido de amonio, y preferiblemente hidróxido de sodio
o potasio. En una realización preferida, dicha disolución básica
comprende una concentración inferior al 10% (p/v). La concentración
de álcali está preferiblemente oscilando entre el 0,1 y el 15%
(p/v) y más preferiblemente es inferior al 10%. La reacción se
realiza a una temperatura que oscila preferiblemente entre 5 y
120ºC, y más preferiblemente a una temperatura inferior a 60ºC. La
biomasa se hace reaccionar en suspensión en la disolución alcalina
a una concentración que oscila preferiblemente entre el 1 y el 15%
(peso seco, p/v), y más preferiblemente entre el 3 y el 12%. La
reacción se realiza preferiblemente durante de 4 a 48 horas, y más
preferiblemente durante menos de 30 horas. Esta primera etapa de
extracción permite eliminar compuestos solubles en álcali,
incluyendo pigmentos, proteínas, algunos lípidos y algunos
polisacáridos.
En otra realización preferida, la biomasa puede
tratarse en una primera disolución alcalina, filtrarse y tratarse
de nuevo en una segunda disolución alcalina. Pueden usarse aditivos
en la suspensión alcalina para mejorar la extracción del producto
insoluble en álcali. Tales aditivos pueden comprender, pero no se
limitan a, disolventes orgánicos tales como ciclohexano, acetato de
etilo, metanol o etanol; agentes antiespumantes tales como Structol;
agentes tensioactivos tales como dodecilsulfato de sodio,
poli(alcohol vinílico), Tween o poloxámeros; o preparaciones
de enzimas que contienen carboxilesterasa, éster carboxílico
hidrolasa o triacilglicerol lipasa (todas sinónimas para EC
3.1.1.3).
Para el aislamiento del producto insoluble en
álcali de las paredes celulares de la biomasa, que es un copolímero
de quitina-glucano en muchas biomasas fúngicas y de
levaduras, se sigue la primera etapa mediante etapas de lavado
repetido con agua, seguido por filtración y secado. Para el
aislamiento de los polímeros de quitina, se sigue la primera etapa
mediante lavado repetido con agua, seguido por las etapas
adicionales en el método descrito a continuación.
Una segunda etapa en el método según la
invención comprende poner en contacto dicha fracción insoluble en
álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción
insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en
contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una
suspensión de la fracción insoluble en álcali acidificada que
comprende dichos derivados de pared celular.
Tras una última etapa de filtración como se
explicó anteriormente, el producto insoluble en álcali se suspende
en agua con el fin de obtener una concentración preferiblemente
entre el 1 y el 8% (p/v), y más preferiblemente entre el 1 y el 5%.
Entonces, se ajusta el pH de la suspensión acuosa del producto
insoluble en álcali para que sea inferior a 7,0 mediante la adición
de una disolución ácida. La disolución ácida es preferiblemente una
disolución acuosa de un ácido, por ejemplo ácido clorhídrico,
acético, fórmico, láctico, glutámico, aspártico o glicólico, y
preferiblemente ácido acético. Esta etapa se realiza preferiblemente
a una temperatura de entre 5 y 60ºC, más preferiblemente inferior a
30ºC.
Una tercera etapa en el método según la
invención comprende poner en contacto fracción insoluble en álcali
acidificada con enzimas \beta-glucanasas, mediante
lo cual se obtienen dichos derivados de pared celular. En una
realización más preferida, el método se caracteriza porque las
enzimas \beta-glucanasas se seleccionan del grupo
que comprende las enzimas
endo-\beta(1,3)-glucanasa,
exo-\beta(1,3)-glucanasa,
\beta(1,3)(1,4)-glucanasa,
\beta(1,6)-glucanasa, o una mezcla de las
mismas. Incluso más preferido, se añade una mezcla de enzimas a la
suspensión de la fracción insoluble en álcali acidificada, con el
fin de hidrolizar las cadenas de \beta-glucano
que están asociadas con la quitina. Pueden encontrarse fácilmente
actividades enzimáticas \beta-glucanasa en la
preparación comercial de \beta-glucanasas
suministrada por varias compañías. La reacción de hidrólisis se
realiza preferiblemente a una temperatura de entre 5 y 60ºC, y más
preferiblemente inferior a 40ºC. La duración de la reacción es
preferiblemente inferior a 5 días.
Las preparaciones preferidas contienen
principalmente actividades \beta-glucanasa, y
preferiblemente baja o ninguna actividad quitinasa. Pueden usarse
preparaciones de enzimas disponibles comercialmente, extraerse de
microorganismos como, por ejemplo, Bacillus subtilis,
Arthrobacter luteus, Penicillium emersonii, Penicillium
funicolosum, Humicola insolens, Aspergillus niger, Trichoderma
harzanium, Trichoderma longibrachiatum. Dichas preparaciones
están disponibles de compañías como NovoZymes, Erbsloh, Roche o
Lyven. Con el fin de hidrolizar las cadenas de
\beta-glucanos de los polisacáridos extraídos de
las paredes celulares del micelio fúngico, las preparaciones
enzimáticas preferidas son aquellas que contienen las siguientes
actividades \beta-glucanasa:
endo-\beta(1,3-1,4)-glucanasa
(EC 3.2.1.6);
endo-\beta(1,3)-glucanasa
(EC 3.2.1.39);
exo-\beta(1,6)-glucanasa
(EC 3.2.1.58);
endo-\beta(1,3)-glucanasa
(EC 3.2.1.75); y/o \beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21,
\beta-D-glucósido
glucohidrolasa). En el ejemplo 3, facilitado más adelante, se
ilustran varias preparaciones enzimáticas comerciales para su uso
en el método según la invención.
En una realización preferida, la invención se
refiere a un método caracterizado porque dichos derivados de pared
celular son polímeros ricos en quitina (es decir, polímeros de
quitina o copolímeros de quitina-glucano ricos en
quitina). La fracción insoluble obtenida en el método contiene
principalmente cadenas macromoleculares de quitina, unidas con una
cierta cantidad de cadenas oligoméricas o macromoleculares
residuales de \beta-glucano. La razón de quitina
con respecto a glucano puede ajustarse fácilmente controlando las
condiciones de la reacción, principalmente mediante la preparación
de \beta-glucanasa empleada y mediante la duración
de la reacción. En una realización más preferida, la invención se
refiere a un método caracterizado porque la cantidad relativa de
quitina puede ajustarse y es preferiblemente superior al 80%, y más
preferiblemente superior al 90% e incuso más preferiblemente
superior al 95%. La cantidad relativa de quitina puede medirse
mediante ^{13}C-RMN de estado sólido. Dicha
fracción insoluble rica en quitina también puede contener proteínas,
lípidos e hidratos de carbono residuales.
Opcionalmente, en una etapa adicional del
presente método, se añade una segunda disolución alcalina al final
de la reacción de hidrólisis, por ejemplo, una disolución de
hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio y
preferiblemente hidróxido de sodio o potasio. Esta etapa adicional
se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de entre 20 y
80ºC, y más preferiblemente inferior a 70ºC, preferiblemente durante
una duración de 30 minutos a 3 horas, y más preferiblemente
inferior a 2 horas. Este segundo tratamiento alcalino permite que
se complete la separación de quitina y
\beta-glucano, aislándose así la quitina.
Para la producción de polímeros de quitina, el
procedimiento se continúa preferiblemente con etapas de lavado
repetido, seguido por una etapa de secado.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a polímeros de quitina que pueden obtenerse mediante el
método según la presente invención. Existen varias ventajas con
respecto al método descrito en la invención. El método permite
extraer quitina pura, parcial o totalmente separada de las cadenas
de \beta-glucano. Por el contrario, otros métodos
producen directamente productos de quitosano,
quitina-glucano o
quitosano-glucano.
En una realización preferida, los polímeros de
quitina contienen más del 80% de quitina, y preferiblemente más del
90% de quitina e incluso más preferido, más del 95% de quitina.
Además, la quitina obtenida según la presente
invención a partir de biomasa fúngica o de levaduras, comprende
valores inferiores del índice de cristalinidad que los polímeros de
quitina que se obtienen a partir de las conchas de crustáceos. En
una realización preferida, el índice de cristalinidad de los
polímeros de quitina es inferior al 80%, y más preferiblemente,
inferior al 70% e incluso más preferido inferior al 65%, en la que
la quitina se obtiene a partir de una biomasa de Aspergillus
niger. El índice de cristalinidad puede calcularse mediante el
método de Struszczyk et al. (J. Appl. Polym. Sci.,
1987, 33:177-189).
En otra realización, la invención se refiere a
copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina que
pueden obtenerse mediante el método según la presente invención. En
una realización preferida, dichos copolímeros de
quitina-glucano ricos en quitina tienen una cantidad
que puede ajustarse de quitina, que es preferiblemente superior al
80%.
Aún en otra realización, la invención se refiere
a copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina
que pueden obtenerse según el presente método, en particular, antes
de la etapa de hidrólisis enzimática. En una realización preferida,
en la que se obtiene quitina a partir de una biomasa de
Aspergillus niger, dichos copolímeros de
quitina-glucano obtenidos antes de la etapa de
hidrólisis enzimática contienen una cantidad de quitina
preferiblemente comprendida entre el 30 y el 50%.
Además, el presente método no incluye la
degradación de las cadenas de quitina, a diferencia de otros
métodos, que hacen uso de disoluciones alcalinas concentradas. El
presente método de extracción no requiere el uso de tensioactivos
agresivos ni compuestos ácidos. El método produce quitina a partir
de una fuente renovable, por ejemplo, una biomasa de hongos o
levaduras, que es una fuente alternativa valiosa para las conchas de
crustáceos. Además, las disoluciones alcalinas utilizadas en el
método pueden recircularse en el transcurso del procedimiento de
extracción.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a métodos para preparar quitosano. La presente invención
describe el método para preparar quitosano que tiene un peso
molecular superior mediante un primer procedimiento, y quitosano
que tiene un peso molecular inferior mediante un segundo
procedimiento.
En un procedimiento, la invención se refiere a
un método para preparar quitosano a partir de quitina que comprende
las etapas subsiguientes de
- a)
- poner en contacto dicha quitina con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende quitina parcialmente desacetilada,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una suspensión de fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dicha quitina parcialmente desacetilada, y
- c)
- poner en contacto dicha suspensión acidificada de fracción insoluble en álcali con una enzima quitina desacetilasa, mediante lo cual se obtiene quitosano.
La fuente de quitina para preparar quitosano en
este método puede comprender quitina de origen de crustáceos o
quitina de origen fúngico o de levaduras. En una realización
preferida, la fuente de quitina utilizada es quitina fúngica o
quitina de levaduras que puede obtenerse mediante el método descrito
anteriormente según esta invención.
Según este método para preparar quitosano, se
trata la quitina en una disolución concentrada de álcali de modo
que las cadenas de quitina pueden hincharse y que se fomenta el
acceso adicional de quitina desacetilasa al sustrato de quitina.
Las disoluciones alcalinas preferidas son disoluciones de hidróxido
de sodio o potasio, utilizadas en cantidades tales que la razón en
peso de álcali con respecto a quitina está oscilando entre 5 y 25,
preferiblemente entre 10 y 25. Para evitar que se degraden las
cadenas de quitina, y para fomentar la formación de un hidrogel de
quitina hinchado, la concentración de álcali es preferiblemente tan
alta como sea posible. En una realización preferida, dicha
disolución de álcali comprende una concentración superior al 40%
(p/v). La reacción tiene lugar a una temperatura de 50 a 120ºC. En
una realización preferida, la etapa a) se realiza a una temperatura
comprendida entre 50 y 120ºC, y más preferida entre 80ºC y 120ºC. En
otra realización preferida, la etapa a) se realiza durante un
periodo comprendido entre 30 y 180 minutos, y preferiblemente entre
30 y 120 minutos. La fracción insoluble en álcali obtenida en la
etapa a) se suspende y luego se diluye, se filtra y lava
extensamente con agua.
Preferiblemente, la disolución alcalina
utilizada se recoge tras la primera etapa, se concentra y recircula
y reutiliza en el método de aislamiento de quitina de la presente
invención, descrito anteriormente.
Luego, se pone en contacto la fracción insoluble
en agua suspendida obtenida con una disolución ácida, mediante lo
cual se obtiene una fracción acidificada que comprende quitina
parcialmente desacetilada. Se ajusta el pH de la suspensión a un
valor preferiblemente inferior a 7,0, y más preferiblemente inferior
a 4,8, mediante la adición de un ácido, por ejemplo ácido
clorhídrico, acético, fórmico, glutámico, ftálico y preferiblemente
ácido fórmico. Esta etapa tiene lugar a temperatura ambiente.
Posteriormente, dicha fracción acidificada
obtenida se pone en contacto con una quitina desacetilasa.
Preferiblemente, se utiliza una quitina desacetilasa recombinante
que se produce por una levadura Pichia pastoris que se ha
transformado con un vector de expresión que lleva una secuencia de
ADN que codifica para la quitina desacetilasa de Mucor rouxii. La
razón de quitina desacetilasa recombinante (rCDA) con respecto a
quitina está oscilando preferiblemente entre 0,5 y 10 mg/g de
quitina y más preferiblemente entre 0,5 y 5 mg/g. La reacción de
hidrólisis por la desacetilasa se realiza preferiblemente a una
temperatura de 15 a 50ºC, más preferiblemente de entre 20 y 40ºC,
durante una duración inferior a 120 horas, hasta que se alcanza la
proporción deseada de unidades de glucosamina acetiladas
residuales.
Es importante observar que esta etapa enzimática
se realiza en condiciones ácidas. Preferiblemente, el valor de pH
durante la etapa enzimática es inferior a 5,0, e incluso más
preferiblemente entre 3,5 y 4,5. De manera inesperada, a estos
valores bajos de pH, se obtiene una buena desacetilación enzimática,
aunque el valor de pH óptimo de la enzima desacetilasa recombinante
está comprendido entre 5,0 y 5,5. En los valores bajos de pH, la
enzima sigue siendo activa y la reacción de desacetilación
enzimática puede llevarse a cabo ventajosamente en tiempos más
cortos. Por tanto, se utiliza la enzima CDA en condiciones de
reacción que no corresponden a las condiciones óptimas para la
estabilidad y la actividad de la enzima CDA recombinante. De hecho,
aunque la enzima CDA es activa en las condiciones óptimas de 60ºC y
un pH preferiblemente inferior a 5,0, y más preferiblemente
comprendido entre 4,0 y 5,0, la presente etapa se realiza en
diferentes condiciones, sin ser perjudicial para la actividad de la
enzima.
En una realización adicional, el método según la
invención comprende una etapa adicional que comprende precipitar
dicho quitosano obtenido. Por tanto, la suspensión se filtra para
eliminar las cadenas de quitina no desacetiladas, y se ajusta el pH
a un valor superior a 7,0 con la adición de un álcali como hidróxido
de sodio, potasio o amonio. Entonces se filtra el compuesto
precipitado, se lava y o bien se seca para producir quitosano en la
forma amino o bien se vuelve a solubilizar en disolución ácida y se
liofiliza. Por ejemplo, el compuesto precipitado puede
solubilizarse en ácido clorhídrico, acético, cítrico, fórmico,
láctico, glutámico, aspártico, glicólico, benzoico, sórbico
(2,4-hexadienoico), oxálico, málico, tartárico,
ascórbico, láurico o palmítico, o cualquier otro ácido mineral u
orgánico, o cualquier otro poliácido como, por ejemplo, ácido
hialurónico o poli(ácido acrílico).
Este método enzimático permite recuperar
quitosano de peso molecular alto a partir de quitina de origen
fúngico o de crustáceos, y también controlar el grado de
acetilación final en el valor deseado, eligiendo cuidadosamente las
condiciones de la reacción con quitina desacetilasa, por ejemplo, el
pH o la duración de la reacción.
En otra realización preferida de la presente
invención, también puede usarse la quitina desacetilasa recombinante
de Mucor rouxii expresada en Pichia pastoris (rCDA) para
extender la desacetilación del quitosano, ya sea de origen fúngico
o de crustáceos, sin pérdida de peso molecular.
Por ejemplo, puede hacer reaccionar un quitosano
cuyo peso molecular viscosimétrico es de 500.000 Da y su grado de
acetilación es del 19% molar con rCDA en una disolución en ácido
fórmico (1 N) a una concentración de polímero de 0,5 g/l a pH 3,8,
durante 6 horas, a temperatura ambiente. El pH de la disolución se
aumenta entonces preferiblemente por encima de 7,0 mediante la
adición de un álcali como hidróxido de sodio, potasio o amonio para
fomentar la precipitación de quitosano, que se retira
preferiblemente mediante filtración, y posteriormente se lava y se
seca. En este ejemplo, el grado de acetilación final que comprende
el 10% molar y el peso molecular no
cambiaron.
cambiaron.
El método de desacetilación enzimática según la
invención para preparar quitosano permite ventajosamente producir
quitosano altamente desacetilado, sin pérdida de peso molecular ni
pérdida de material, y sin necesidad de fraccionamiento de las
cadenas poliméricas. Puesto que el método para producir la quitina
desacetilasa recombinante es un método destinado para lotes de
fermentación de gran volumen, las cantidades de quitina y quitosano
que pueden transformarse enzimáticamente son adecuadas para la
producción industrial y el uso del quitosano altamente desacetilado
resultante de manera muy rentable y segura desde el punto de vista
medioambiental.
En un segundo procedimiento, la invención se
refiere a un método para preparar quitosano a partir de quitina
fúngica o de levaduras, que comprende las etapas subsiguientes
de:
- a)
- poner en contacto dicha quitina con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, mediante lo cual se obtienen una fracción insoluble en ácido y una fracción soluble en ácido y mediante lo cual se desecha dicha fracción insoluble en ácido y se conserva dicha fracción soluble en ácido que comprende quitosano.
En una realización preferida, la fuente de
quitina utilizada es quitina fúngica o quitina de levaduras que
puede obtenerse mediante el método descrito anteriormente según esta
invención.
\newpage
El método para preparar quitosano de peso
molecular consiste en una reacción alcalina fuerte a alta
temperatura. Se añade un álcali como hidróxido de potasio, litio o
amonio, y preferiblemente hidróxido de sodio o potasio, a la
suspensión de quitina, de tal manera que la razón en peso de álcali
con respecto a la masa de quitina seca esté oscilando
preferiblemente entre 1 y 20 (p/p) y más preferiblemente entre 1 y
15 (p/p). Puede usarse un aditivo para minimizar la degradación de
las cadenas de quitina, por ejemplo también puede añadirse
borohidruro de sodio, tiofenol y disolventes orgánicos tales como
metanol, etanol.
Preferiblemente, la disolución alcalina
utilizada se recoge tras la primera etapa, se concentra y recircular
y reutiliza en el método de aislamiento de quitina de la presente
invención descrito anteriormente.
Posteriormente, se separa y suspende la fracción
insoluble en álcali obtenida. En una realización preferida, dicha
etapa se realiza a una temperatura superior a 80ºC. Preferiblemente,
la suspensión se pone a una temperatura que oscila entre 80 y
140ºC, más preferiblemente entre 100 y 120ºC, y la reacción
preferiblemente tiene lugar durante una duración que oscila entre
30 y 300 minutos, más preferiblemente inferior a 240 min.
La fracción insoluble en álcali se retira por
filtración y se lava con agua. Entonces, se solubiliza en una
disolución ácida diluida, por ejemplo ácido clorhídrico, acético,
fórmico y preferiblemente ácido acético a una concentración de 0,1
a 1 N. La fracción insoluble en ácido se elimina por filtración.
En una realización adicional, el método
comprende una etapa adicional en la que se precipita el quitosano de
dicha fracción soluble en ácido poniendo en contacto dicha fracción
con una disolución básica. El pH de la fracción soluble en ácido se
eleva preferiblemente por encima de 8,0 con una disolución de álcali
como de una disolución concentración de hidróxido de sodio o amonio.
El compuesto que precipita se filtra, se lava repetidamente con agua
y se seca. El compuesto obtenido es quitosano en la forma amino. En
un ejemplo, puede obtenerse un quitosano con un grado de acetilación
del 14% molar y un peso molecular viscosimétrico de 20 kDa (según se
determina mediante viscosimetría capilar).
En una realización adicional, también pueden
obtenerse sales de quitosano a partir de la fracción soluble en
ácido. Por tanto, se precipita la fracción soluble en ácido mediante
la adición de una disolución de álcali como hidróxido de sodio o
amonio. El compuesto que precipita se filtra, se lava repetidamente
con agua y luego se solubiliza en una disolución ácida y después se
liofiliza a partir de esta disolución ácida. El compuesto que
precipita puede solubilizarse en ácido clorhídrico, acético,
cítrico, fórmico, láctico, glutámico, aspártico, glicólico,
benzoico, sórbico (2,4-hexadienoico), oxálico,
málico, tartárico, ascórbico, láurico o palmítico, o cualquier otro
ácido mineral u orgánico, o cualquier otro poliácido como, por
ejemplo, ácido hialurónico o poli(ácido acrílico).
En otra realización, la invención se refiere a
polímeros de quitosano que pueden obtenerse mediante el método
según la presente invención.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a polímeros de quitosano que tienen un peso
molecular ajustable. Dependiendo del procedimiento y de las
condiciones de la reacción de desacetilación, puede obtenerse un
quitosano que tiene un peso molecular bajo, medio o alto.
Preferiblemente, dicho quitosano tiene un peso molecular
comprendido entre 10 y 1000 kDa, según se determina mediante
viscosimetría capilar de Ubbelohde.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a polímeros de quitosano que tienen un grado
de desacetilación ajustable. Dependiendo del procedimiento y de las
condiciones de la reacción de desacetilación, puede ajustarse el
grado de acetilación, en un intervalo comprendido preferiblemente
entre el 0 y el 40% molar.
La presente invención proporciona polímeros de
quitina y copolímeros de quitina-glucano ricos en
quitina de origen no animal que pueden obtenerse mediante un método
según la presente invención.
Los copolímeros de
quitina-glucano de la presente invención, es decir,
obtenidos antes de la etapa de hidrólisis enzimática según el
presente método, comprenden una parte de cadenas de
beta-glucano, estando definida la estructura y
composición de los copolímeros por el microorganismo del que se
extraen. En una realización preferida, se extraen los copolímeros
de quitina-glucano a partir del micelio de
Aspergillus niger, y comprenden principalmente cadenas de
quitina y beta-(1,3)(1,4) y beta-(1,3)-glucano.
Según la invención, la cantidad de quitina y glucano en tales
polímeros es ajustable adicionalmente, dependiendo de condiciones
particulares aplicadas durante la hidrólisis enzimática, con el fin
de obtener copolímeros de quitina-glucano ricos en
quitina.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) que pueden
obtenerse mediante un método según la presente invención
proporcionan propiedades interesantes, que los hacen adecuados para
usarse en toda clase de aplicaciones. Las características ventajosas
principales de estos productos incluyen sus propiedades de
cicatrización de heridas y si actividad quelante.
También puede obtenerse mediante un método según
la presente invención quitosano no animal. Ventajosamente,
partiendo de quitina muy pura, puede obtenerse quitosano muy puro.
Además, un procedimiento de desacetilación enzimática controlable
permite obtener quitosano de alto peso molecular y al mismo tiempo
un grado de desacetilación ajustable (bajo). También, debido a la
disponibilidad ilimitada relativa de biomasa fúngica o de levaduras,
pueden prepararse grandes volúmenes de quitosano, de manera
reproducible y ajustable. Ventajosamente, tal producción no está
sometida a variación estacional como es el caso cuando se utiliza
una fuente de quitosano de
crustáceos.
crustáceos.
Se encuentran varios problemas cuando se utiliza
quitosano procedente de una fuente animal en diferentes
aplicaciones. Por ejemplo, en aplicaciones nutricionales tal
quitosano no es adecuado para los vegetarianos, puede producir
alergias a los productos de crustáceos y requiere que los productos
alimenticios se etiqueten en consecuencia. En la aplicación
cosmética, tal quitosano puede producir alergia y existe una
tendencia de utilizar productos no animales. Por tanto, el
quitosano no animal que puede obtenerse mediante un método según la
presente invención proporciona una solución para estas
cuestiones.
Algunas de las propiedades interesantes del
quitosano que puede obtenerse mediante un método según la presente
invención incluyen carga catiónica, biodegradabilidad, ausencia de
toxicidad, quelación, cicatrización de heridas, humectación.
Adicionalmente, el quitosano de la presente invención no induce
reacciones alérgicas y puede proporcionar una actividad antifúngica
y antimicrobiana.
Los productos de quitina y quitosano que pueden
obtenerse según la presente invención pueden usarse en múltiples
formas, dependiendo de su aplicación en varios sistemas. Por
ejemplo, los polímeros de quitosano pueden usarse en la forma de
una sal de amonio, como una disolución diluida en diferentes ácidos
minerales u orgánicos tales como, pero no limitados a, ácido
clorhídrico, acético, cítrico, fórmico, láctico, glutámico,
aspártico, glicólico, benzoico, sórbico
(2,4-hexadienoico), oxálico, málico, tartárico,
ascórbico, láurico o palmítico, o cualquier otro ácido mineral u
orgánico, o cualquier otro poliácido como, por ejemplo, ácido
hialurónico o poli(ácido acrílico). La concentración de quitosano
en tal disolución se selecciona preferiblemente en función de la
viscosidad requerida. Por tanto, según la invención también pueden
obtenerse disoluciones que tienen diferentes grados de viscosidad
que comprenden productos de quitina o quitosano, según la presente
invención.
Los productos de quitosano que pueden obtenerse
según la presente invención también pueden usarse en la forma de un
hidrogel. Tal hidrogel puede prepararse utilizando métodos conocidos
en la técnica, por ejemplo, pero no limitados a, mediante la
preparación de una disolución concentrada, mediante la formación de
un complejo con (macro)moléculas aniónicas tales como
alginato, heparina, goma xantana o pectina, mediante reticulación
química, o mediante la formación de enlaces covalentes entre los
grupos amino del quitosano y otras (macro)moléculas. Los
productos también pueden usarse en la forma de un hidrogel
termorreversible.
Los productos de quitina y quitosano que pueden
obtenerse según la presente invención pueden usarse además en la
forma de una película. Por ejemplo, el quitosano preparado según un
método de la invención que tiene un alto peso molecular, puede
tener propiedades mejoradas de formación de películas y, por tanto,
puede proporcionar películas más estables. También pueden
prepararse sustratos o membranas de múltiples capas que comprenden
quitosano en asociación con otros polímeros.
Además, los productos de quitina y quitosano que
pueden obtenerse según la presente invención pueden usarse además
para fabricarse como películas porosas o un objeto poroso, de los
que los tamaños de poro son controlables aplicando métodos
conocidos por una persona experta en la técnica.
En otra realización, los productos de quitina y
quitosano que pueden obtenerse según la presente invención pueden
proporcionarse en la forma de micro, mili o nanopartículas, que
pueden obtenerse mediante técnicas conocidas por una persona
experta en la técnica (véase, por ejemplo, Polimeryc Biomaterials, S
Dimitriu ED, Marcel Dekker, 2002, cap. 1). Los productos de
quitosano que pueden obtenerse según la presente invención y
proporcionados en la forma de partículas pueden tener múltiples
posibilidades de aplicación incluyendo la encapsulación de
sustancias, microorganismos o moléculas activas tales como semillas,
células, pigmentos, aromas, sustancias olorosas, fármacos, vacunas,
agentes bioactivos (antibacterianos o antifúngicos), enzimas. La
encapsulación en partículas de quitosano hace posible inmovilizar,
proteger, transportar o liberar las sustancias activas de manera
controlada.
Los copolímeros de
quitina-glucano de la presente invención son
esencialmente no solubles en ningún disolvente, aunque son
hidrófilos, y por tanto, son adecuados para usarse en la forma de
polvo, fibras o en una forma liofilizada.
En otra realización de la presente invención, se
proporciona un material compuesto que comprende polímeros de
quitina, copolímeros de quitina-glucano (ricos en
quitina) o polímeros de quitosano que pueden obtenerse mediante un
método según la presente invención. Los polímeros de quitina o
polímeros de quitosano de origen fúngico de la presente invención
pueden usarse en una mezcla con una o más de otras sustancias. Por
ejemplo, puede mezclarse con otros polímeros, pudiéndose utilizar
la mezcla en una de las formas tal como se mencionó anteriormente,
con el fin de conferir nuevas propiedades o propiedades
sinérgicas.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante un método según la presente
invención pueden mezclarse con moléculas de baja masa molecular. En
combinación con otras sustancias, los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
polímeros de quitosano que pueden obtenerse mediante un método según
la presente invención son también adecuados como agentes
complejantes, si la sustancia presenta una carga negativa, o
adecuados como matriz para la liberación controlada de un fármaco o
principio activo o adecuado como matriz para un componente cosmético
tal como un pigmento, un aroma o una sustancia olorosa.
Los polímeros de quitosano que pueden obtenerse
mediante un método según la presente invención también pueden
mezclarse con una vacuna, en la que son adecuados como adyuvante.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano pueden mezclarse también adicionalmente con una sustancia
inorgánica, por ejemplo cerámicas, preferiblemente fosfatos de
calcio, mediante lo cual puede crearse una matriz que es adecuada
para soportar la regeneración de tejido tal como un cartílago o
huesos.
Otra realización de la presente invención se
refiere a polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante un método según la presente
invención. Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante un método según la presente
invención son polímeros que pueden modificarse químicamente para
obtener derivados, según técnicas conocidas por una persona experta
en la técnica. La modificación química puede, por ejemplo, llevarse
a cabo en uno o más grupos funcionales de las unidades de
D-glucosa,
N-acetil-D-glucosamina
o D-glucosamina, por ejemplo, en el átomo de
oxígeno en la posición 6, o en el átomo de nitrógeno en alfa al
carbono situado en la posición 1 en la
-acetil-D-glucosamina y
D-glucosamina.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante los métodos según la
invención pueden aplicarse en diversos productos y sistemas,
preferiblemente como en aplicaciones médicas, farmacéuticas,
agrícolas, nutracéuticas, alimenticias, textiles, cosméticas,
industriales y/o medioambientales.
En una realización preferida, los polímeros de
quitosano según la presente invención pueden usarse como excipiente
en la preparación de un medicamento. Pueden usarse en aplicaciones
veterinarias así como médicas en seres humanos. La invención
también se refiere a una composición farmacéutica que comprende
polímeros de quitosano según la presente invención. Para permitir
el uso de quitosano en formas farmacéuticas, se requieren una
distribución de peso molecular y un grado de acetilación
controlados y reproducibles, y niveles bajos y reproducibles de
impurezas de los compuestos. Según los métodos de la presente
invención, pueden obtenerse compuestos con tales
características.
características.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano no son antigénicos y son perfectamente biocompatibles.
Además, son biodegradables mediante hidrólisis enzimática, por
ejemplo en presencia de lizozimas. Debido a su naturaleza
antitrombogénica y hemostática, pueden usarse en todos los campos
de la medicina. Por tanto, los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante los métodos según la
invención pueden aplicarse en sistemas de cicatrización de heridas.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse mediante los métodos según la
invención también pueden usarse para prevenir la formación de
fragmentos de fibrina en las heridas, y prevenir la formación de
cicatrices, y soportar la regeneración celular. Los polímeros de
quitina, copolímeros de quitina-glucano (ricos en
quitina) o polímeros de quitosano pueden usarse en sistemas de
modificación mediante ingeniería de tejidos, trasplante celular y
encapsulación celular. Dado que los productos pueden ser películas
permeables al aire, pueden soportar la regeneración celular
mientras protegen los tejidos de ataques microbianos. También pueden
usarse para formar suturas, vendajes y preferiblemente para formar
suturas y vendajes degradables. Los polímeros de quitosano que
pueden obtenerse mediante los métodos según la invención son
adecuados además para fabricar piel artificial y en sistemas para
la reconstrucción de tejidos y órganos y/o el trasplante de células.
Por ejemplo, los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano pueden usarse en sistemas para la reparación ósea en
ortopedia y ortodoncia, para la reparación de la piel, la córnea, la
retina, el cartílago o para la reconstrucción de órganos como el
páncreas, estómago y sistemas nerviosos.
Los polímeros de quitosano según la presente
invención son adecuados también para su uso en lentes de contacto,
composiciones de prevención de la sequedad de los ojos, como lágrima
artificial en la forma de un hidrogel tópico, como un vehículo
tópico para fármacos oculares, como sistemas de material particulado
o hidrogel para la administración local dentro del ojo, en
dispositivos para reparar el desprendimiento de retina y la
degeneración macular y en adyuvantes quirúrgicos para cirugía.
Debido a sus buenas propiedades de bioadhesión,
los polímeros de quitosano según la presente invención pueden
aplicarse como adyuvante quirúrgico antiadhesivo, por ejemplo para
prevenir la adhesión entre tejidos durante la cirugía. También
pueden aplicarse como adyuvante para vacunas gracias a una buena
mucoadhesión.
Los polímeros de quitosano que pueden obtenerse
según la presente invención pueden aplicarse además como soporte
para el transporte y la liberación retardada de compuestos activos
en plantas, animales y seres humanos. Con respecto a las formas de
administración oral de los productos farmacéuticos, es
particularmente adecuado usar polímeros de quitosano cuando los
productos encapsulados deben llegar sin transformación al intestino,
dado que los productos no se digieren por el estómago. El quitosano
puede formularse como partículas, que proporciona incluso más
oportunidades para las aplicaciones de liberación controlada, oral y
parenteral. El quitosano puede aumentar la eficacia de vehículos
orales mediante modificación química y unión de fármacos u otras
moléculas biofuncionales. Dado que los polímeros de quitosano
tienen buenas propiedades de formación de geles y películas, pueden
servir para fabricar membranas transdérmicas. Sus propiedades
mucoadhesivas se desean para un buen contacto con la capa externa
de la piel. El quitosano también puede ser útil para preparar
sistemas de administración de fármacos innovadores para vías de
administración locales y sistémicas, como las vías vaginal, bucal y
parenteral.
Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano que pueden obtenerse según la presente invención pueden
usarse como un excipiente en la formación de comprimidos, la
granulación de polvos, la preparación de geles y películas, la
preparación de emulsiones, y también como agente humectante y de
recubrimiento. También pueden aprovecharse algunas propiedades más
originales del quitosano en sistemas de administración de fármacos
orales, como su capacidad para proporcionar una liberación
controlada del fármaco como una matriz, su bioadhesividad, sus
propiedades de formación de películas, su capacidad para formar
complejos con fármacos aniónicos y polímeros aniónicos. Por tanto,
pueden usarse en sistemas farmacológicos para aumentar la
solubilidad de fármacos escasamente solubles en agua, para formar
hidrogeles para aumentar la absorción de fármacos a través de
tejidos mucosos, para potenciar la respuesta inmunológica de
vacunas.
En otra realización, los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
polímeros de quitosano que pueden obtenerse según la presente
invención pueden aplicarse además en sistemas agrícolas y
agroquímicos. Pueden aplicarse como recubrimiento conservante y
biofungicida cuando se aplican sobre fruta fresca, verduras y
cultivos, o como fertilizantes, aumentando así el número de
microorganismos del suelo útiles y disminuyendo los nocivos. Las
semillas vegetales pueden empaparse con disoluciones acuosas de
quitosano para prevenir infecciones microbianas y aumentar la
producción vegetal. Los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano según la presente invención pueden usarse además en
disolución, polvo o recubrimiento de semillas. En bajas cantidades,
aproximadamente unos cuantos miligramos por metro cúbico de agua,
los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano pueden usarse para desencadenar mecanismos de defensa de
la planta frente a infecciones y ataques parasitarios. Además de
las propiedades antifúngicas, los polímeros de quitina, copolímeros
de quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros
de quitosano pueden aplicarse para reforzar la raíz de las plantas y
engrosar el tallo de las plantas. Los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
polímeros de quitosano según la presente invención también pueden
usarse para estimular la síntesis de agentes protectores por una
planta. Además, pueden usarse para acelerar la germinación y el
crecimiento de las plantas. En el sector agroalimentario, pueden
usarse para el recubrimiento de semillas, abono o pesticidas.
Debido a sus propiedades de formación de
películas, los polímeros de quitosano de la invención pueden
utilizarse como aditivos en pesticidas para proporcionar un mejor
contacto y una mejor penetración del pesticida. Además, la
asociación del pesticida con una pequeña cantidad de quitina o
quitosano de la presente invención puede ser adecuada para
disminuir la cantidad de pesticida usado.
En otra realización, los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
polímeros de quitosano que pueden obtenerse según la presente
invención son además particularmente adecuados para su uso en
aplicaciones nutracéuticas y alimenticias. Los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
pueden utilizarse como complementos alimenticios. En particular, los
polímeros de quitosano pueden aplicarse como ingrediente
alimentario en dietética. Como los polímeros de quitosano no se
digieren por el cuerpo humano, son adecuados para comportarse como
una fibra, que es un elemento importante en la dieta. Como los
polímeros de quitosano portan cargas eléctricas, pueden complejar
lípidos cargados negativamente y son adecuados para captar líquidos
en el tubo digestivo. Adicionalmente, los polímeros de quitosano
pueden aplicarse en productos nutracéuticos para obtener efectos
hipocolesterolémicos.
Adicionalmente, los polímeros de quitosano según
la presente invención pueden utilizarse como aditivos alimentarios
naturales para obtener actividad antimicrobiana y antifúngica frente
a una amplia gama de hongos, levaduras y bacterias trasmitidos por
los alimentos. Adicionalmente, pueden utilizarse como adyuvante para
conservantes alimentarios convencionales, como agentes
antipardeamiento, como componente para películas comestibles
permeables a los gases adecuadas para el almacenamiento de
frutas/verduras, como agentes espesante, estabilizante o
emulsionante, como agentes tixotrópicos o como potenciador del sabor
natural. Adicionalmente, los polímeros de quitosano según la
presente invención pueden usarse en procesos alimentarios, en los
que pueden aplicarse, por ejemplo, como agentes antiespumantes,
como espesante o estabilizador. Debido a sus capacidades coagulantes
y floculantes, los polímeros de quitosano también pueden aplicarse
en el proceso de clarificación de bebidas como el vino, cerveza y
zumos de frutas. En el presente documento, pueden precipitar
compuestos responsables de la turbidez de estas bebidas.
En otro aspecto de la industria alimentaria, los
polímeros de quitosano también pueden usarse para preparar
películas comestibles y recubrimientos para prolongar la vida útil
de almacenamiento de alimentos frescos o procesados. Los polímeros
de quitosano fúngico pueden aplicarse directamente sobre frutas y
verduras, lo que permite prolongar la vida útil de almacenamiento,
un mejor control de la descomposición de frutas/verduras y un
retraso de la maduración. Los polímeros de quitosano son adecuados
como agente antipardeamiento en frutas y verduras. Pueden usarse
como una alternativa ventajosa al sulfito, el inhibidor del
pardeamiento más eficaz disponible actualmente, aunque se sospecha
que provoca efectos adversos para la salud.
En otro aspecto, las actividades antimicrobianas
y antifúngicas de los polímeros de quitosano según la presente
invención pueden aprovecharse en la industria alimentaria, para la
conservación de carne, crustáceos (ostras), frutas, verduras y
productos terminados, o bien solos o bien en combinación sinérgica
con conservantes convencionales como, por ejemplo, sulfito o
benzoato de sodio. Cuando se asocian con otros conservantes, puede
usarse para minimizar la concentración de conservante necesaria
para un efecto de inhibición.
En otra realización, los polímeros de quitina,
copolímeros de quitina-glucano (ricos en quitina) o
polímeros de quitosano que pueden obtenerse según la presente
invención son utilizables además en aplicaciones textiles. Los
polímeros de quitosano pueden aplicarse, por ejemplo, sobre fibras
textiles en la forma de una película mediante la impregnación de
dichas fibras o un tejido con una disolución. Al realizar eso,
pueden cambiarse las propiedades de las fibras o materiales
textiles, por ejemplo mediante la aplicación de quitina o quitosano,
tales fibras o materiales textiles pueden adoptar una naturaleza
antibacteriana. Los materiales textiles médicos también pueden
impregnarse mediante polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano según la presente invención y ser adecuados en sistemas
para el tratamiento de heridas.
En aplicaciones cosméticas, los polímeros de
quitina, copolímeros de quitina-glucano (ricos en
quitina) o polímeros de quitosano que pueden obtenerse según la
presente invención son utilizables en composiciones adecuadas para
el cuidado de la piel, tales como cremas, y para el cabello, tales
como aerosoles, champús y acondicionadores, en composiciones de
maquillaje o en pastas de dientes. Son aplicables además en
composiciones anti-UV, en la preparación de
desodorantes, en composiciones para la higiene bucal y en
composiciones para la encapsulación de pigmentos. El origen no
animal de la quitina o el quitosano obtenidos según el método
descrito en la invención hace posible eliminar los riesgos de
alergias.
En aplicaciones medioambientales, los polímeros
de quitina, copolímeros de quitina-glucano (ricos en
quitina) o polímeros de quitosano que pueden obtenerse según la
presente invención pueden aplicarse como agentes quelantes, por
ejemplo como agentes de complejación de metales pesados. Los
polímeros de quitina, copolímeros de quitina-glucano
(ricos en quitina) o polímeros de quitosano pueden aplicarse para
atrapar metales pesados y en técnicas de purificación de agua, o
pueden aplicarse en un sistema de agua potable para separar los
compuestos orgánicos y los metales pesados. También pueden
aplicarse para tratar agua precipitando ciertos residuos y
capturando contaminantes como DDT y policlorobencenos.
Adicionalmente, también pueden usarse en aplicaciones en las que
son adecuados para fijar radicales.
Además, los polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano según la presente invención pueden usarse en el proceso
de fabricación del papel. En este proceso, pueden sustituir a
algunos sustituyentes de amino tales como goma o polisacáridos
polisintéticos y son adecuados para reducir el uso de aditivos
químicos y proporcionar producciones mejoradas. El papel producido
usando polímeros de quitina, copolímeros de
quitina-glucano (ricos en quitina) o polímeros de
quitosano según la presente invención puede tener una superficie
más lisa y muestra mejor resistencia a la humedad. Además, los
polímeros de quitina, copolímeros de quitina-glucano
(ricos en quitina) o polímeros de quitosano según la presente
invención pueden aplicarse también para la producción de papel
higiénico, papel para embalaje y cartón.
Este ejemplo ilustra la primera etapa en el
método para aislar derivados de pared celular a partir de biomasa
fúngica según la presente invención. Se obtuvo la biomasa como
producto secundario de un proceso de cultivo para preparar ácido
cítrico usando Aspergillus niger.
En este ejemplo, se recogieron 995 g de la
biomasa que contenía un 71% de agua y se incubaron en una reacción
que contenía 2 litros de agua y 93 g de gránulos de hidróxido de
sodio a temperatura ambiente, para alcanzar una concentración de la
biomasa final del 3,4% (p/v). En este ejemplo, la concentración
final de NaOH comprendió el 10,6% (p/v) y la razón de NaOH con
respecto a la biomasa (peso seco) fue del 32%. Tras 26 horas, se
filtró la mezcla para recoger la fracción insoluble de la biomasa
residual, que se lavó repetidamente hasta que se obtuvo un pH
neutro. En este ejemplo, la masa seca de la fracción insoluble fue
de 145 g. el análisis de esta fracción mediante
^{13}C-RMN en fase sólida reveló que
principalmente se obtuvo una mezcla de polímeros de quitina y
glucano. En este ejemplo, la razón de quitina con respecto a
glucano, según se calculó a partir del espectro de
^{13}C-RMN de estado sólido, fue de 52:48 \pm 15
(p/p).
El contenido de quitina en la fracción insoluble
se determinó mediante el análisis de la
N-acetil-glucosamina liberada tras
la hidrólisis de la fracción insoluble con enzimas quitinasas y
quitobiasas, según el método de Jeuniaux ("Chitine et
chitinolyse: un chapitre de biologie moléculaire" 1963,
Masson, París, 181) y Reissig et al. (J. Biol. Chem.,
1955, 217:959). También se determinó el contenido de quitina a
partir del análisis de resonancia magnética nuclear de carbono 13 en
fase sólida (^{13}C-RMN) de la fracción insoluble
en álcali obtenida tras la digestión alcalina de la biomasa. La
figura 1 representa el espectro de ^{13}C-RMN de
la fracción insoluble en álcali que comprende principalmente un
polímero de quitina-glucano purificado. Tras la
deconvolución e integración de las señales de los átomos de carbono
de las unidades de
N-acetil-(D)-glucosamina y
(D)-glucosa, se calculó que la razón en peso de
quitina:glucano era de 41:59 (p/p).
Este ejemplo también ilustra la primera etapa en
el método para aislar derivados de pared celular a partir de
biomasa fúngica según la presente invención. Se obtuvo la biomasa
como producto secundario de un proceso de cultivo para preparar
ácido cítrico usando Aspergillus niger.
En este ejemplo, se trató el micelio de
Aspergillus niger según diferentes condiciones. Los ensayos
nº 1 a 4 se realizaron en un reactor de 10 L, y los ensayos nº 5 a 6
en un reactor prototipo de 30 L. Los ensayos 1 a 5 se realizaron en
una etapa, mientras que los ensayos 4' y 6 se realizaron en dos
etapas. En el ensayo nº 4', se trató la biomasa con una primera
disolución de NaOH (3,4%), luego se filtró y se trató de nuevo con
una segunda disolución de NaOH (2,8%). En el ensayo nº 6, se separó
la biomasa en dos fracciones colocadas sucesivamente en el reactor
junto con una baja cantidad de NaOH seguido por una cantidad
superior de NaOH. Se muestran los resultados en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Un procedimiento de extracción aplicado a la
fracción insoluble en álcali recogida en el ensayo nº 4, según se
describe por Folch et al. (1957, J Biol Chem
224:497-509), mostró una cantidad de compuestos
lipófilos del 6% del peso seco inicial.
Un estudio de dispersión de rayos X (Siemens
D5000, Cu-K_{\alpha}, \lambda = 0,15406 nm,
2\theta = 1,5 a 30º, rendija de 1 mm, T = 25ºC) de la fracción
insoluble en álcali recogida en el ensayo nº 4', cuya razón de
quitina-glucano era de 37:63 (p/p), mostró una gran
banda de dispersión a 2\theta = 20º (figura 2), lo que indica una
estructura semicristalina. El índice de cristalinidad puede
calcularse tal como propusieron Yinhai et al. (Chem.
Mag. 2002, 4:27) o Struszczyk et al. (J. Appl. Polym.
Sci., 1987, 33:177-189), como una indicación de
la proporción de regiones cristalinas con respecto a amorfas en el
compuesto. Según el cálculo de Struszczyk, el índice de
cristalinidad (CrI, "crystalline index") de este compuesto
insoluble en álcali de quitina-glucano fue del 64%,
un valor mucho menor que el encontrado para una muestra de quitina
extraída de cáscaras de gambas y analizada mediante dispersión de
rayos X en las mismas condiciones
(CrI = 87%).
(CrI = 87%).
Este ejemplo ilustra un procedimiento preferido
para probar varias preparaciones comerciales de
\beta-glucanasas para su uso en un método según la
presente invención. Puede cuantificarse la actividad
\beta-glucanasa a partir de curvas patrón
establecidas con enzimas \beta-glucanasas de
referencia puras que se hacen reaccionar con sustratos de
\beta-glucano patrones. Por ejemplo, para probar
la actividad \beta-glucanasa de EC 3.2.1.6, pueden
hacerse reaccionar liquenasa (Megazyme) o
\beta-glucanasa (Fluka) con sustrato de
\beta-glucano de cebada (Megazyme), para probar la
actividad \beta-glucanasa de EC 3.2.1.39, puede
hacerse reaccionar una enzima endo-\beta-(1,3)
(Megazyme, Fluka) con sustratos de paquimano o curdlano (Megazyme),
para probar la actividad de EC 3.2.1.58, puede hacerse reaccionar
una exo-\beta-glucanasa con
sustratos de laminarina o escleroglucano (Sigma, Megazyme) y para
probar la actividad \beta-glucanasa de EC
3.2.1.75, puede hacerse reaccionar una \beta-(1,6)glucanasa
con pustulano (Sigma). La actividad
\beta-glucanasa (en U, unidad) se define como la
cantidad de enzima necesaria para liberar 1 \mumol de glucosa por
minuto, a 37ºC tras incubación con el sustrato patrón, al pH
recomendado.
La cantidad de proteína contenida en la
preparación comercial de enzimas puede determinarse mediante el
método BCA (ácido bicinconínico) que se basa en la reducción de
iones Cu(II) por proteínas, en condiciones alcalinas. Los
iones Cu(I) pueden formar un complejo con BCA, cuya absorción
a 526 nm es proporcional a la concentración de proteína (PK Smith
et al. (1985) Anal. Biochem. 150, 76). La actividad
\beta-glucanasa específica (en U/mg) mostrada por
las preparaciones comerciales es la razón de la actividad enzimática
y la masa de proteína contenida en la preparación.
Se probaron preferiblemente las preparaciones
enzimáticas que contienen una o varias de las actividades
\beta-glucanasa enumeradas a continuación (véase
la tabla 2). En el procedimiento de prueba, se investigaron
preferiblemente combinaciones de enzimas seleccionadas para
determinar su capacidad para hidrolizar las cadenas de
\beta-glucano de la fracción insoluble en álcali
del micelio digerido de Aspergillus niger.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de preparación | Actividad de 3.2.1.6 | Actividad de 3.2.1.39 | Actividad de 3.2.1.58 |
| (U/mg de proteína) | (U/mg de proteína) | (U/mg de proteína) | |
| 1 | 33 | 0 | 0 |
| 2 | 37 | 0 | 0 |
| 3 | 19 | 0 | 0 |
| 4 | 0 | 20 | 0 |
| 5 | 0 | 22 | 28 |
| 6 | 54 | 0 | 0 |
| 7 | 0 | 17 | 8 |
| 8 | 22 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de hidrólisis con
\beta-glucanasa se realiza preferiblemente en la
suspensión de la fracción insoluble en álcali, que se obtiene tras
el tratamiento alcalino de la biomasa según la presente invención,
a un pH comprendido preferiblemente entre 4,0 y 7,0, y más
preferiblemente entre 4,5 y 6,8. Se añade a la suspensión una
mezcla de preparaciones de \beta-glucanasa, por
ejemplo una mezcla de enzimas
endo-\beta(1,3),
exo-\beta(1,3) y
endo-\beta-(1,3)(1,4)-glucanasa.
Para hidrolizar las cadenas de \beta-glucano de la
quitina-glucano extraído de la biomasa de
Aspergillus niger, la proporción de
\beta-glucanasas, expresado en unidad de
actividad por masa de biomasa digerida seca, oscila preferiblemente
entre 5 y 1500 U/g, y más preferiblemente entre 20 y 500 U/g. La
concentración de biomasa digerida oscila preferiblemente entre el
0,5 y el 15% (p/v), y más preferiblemente entre el 2 y el 8% (p/v).
La temperatura de reacción preferida es inferior a 40ºC. La
duración de la reacción de hidrólisis oscila entre 1 y 8 días,
preferiblemente inferior a 5 días.
Este ejemplo ilustra el aislamiento de derivados
de pared celular a partir de biomasa fúngica según un método de la
presente invención. Se obtuvo la biomasa como producto secundario de
un proceso de cultivo para preparar ácido cítrico usando
Aspergillus niger.
En este ejemplo, se pusieron 3,3 kg de la
biomasa, que contenía un 71% de agua, 7,2 litros de agua y 320 g de
gránulos de NaOH en un reactor a temperatura ambiente. Tras 26
horas, se filtró la mezcla para recoger la fracción insoluble de la
biomasa residual, que se lavó tres veces. Se recogió la fracción
insoluble en álcali y se suspendió en 4 litros de agua. Se ajustó
el pH de la suspensión en 5,5 mediante la adición de ácido acético
glacial. A la suspensión acidificada, se añadieron 13,2 g de la
preparación de \beta-glucanasa nº 5 (véase la
tabla 2) y 8,25 ml de la preparación de
\beta-glucanasa nº 6 (véase la tabla 2). Se llevó
a cabo la reacción a 37ºC durante 4 días. Entonces, se filtró la
suspensión y se lavó la fracción insoluble con agua y se liofilizó,
para producir una masa del 34% de la quitina-glucano
inicial. Para este ejemplo, el espectro de
^{13}C-RMN de estado sólido del compuesto reveló
la presencia de quitina y polímeros de
\beta-glucano residuales, con una razón de
quitina:glucano de 94:6 \pm 14 (p/p).
Este ejemplo ilustra la reacción de hidrólisis
con \beta-glucanasa realizada en un método para
aislar derivados de pared celular a partir de biomasa fúngica según
la presente invención.
En este ejemplo, la reacción de hidrólisis con
\beta-glucanasa se realizó en diferentes
condiciones, con cantidades variables de las preparaciones
comerciales de beta-glucanasa nº 2, 5 y 6 (véase la
tabla 2), y durante una duración de 5 días. El compuesto de partida
que iba a hidrolizarse era un conjugado de
quitina-glucano liofilizado extraído del micelio de
Aspergillus niger según un método tal como se describió
anteriormente, cuya razón de quitina con respecto a glucano fue o
bien de 32:68 (ensayo nº 1) o bien de 38:62 (ensayos nº 2 a 7). Se
muestran los resultados en la
tabla 3.
tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El estudio de dispersión de rayos X (Siemens
D5000, Cu-K_{\alpha}, \lambda = 0,15406 nm,
2\theta = 1,5 a 30º, rendija de 1 mm, T = 25ºC) de la fracción
insoluble en álcali rica en quitina del ensayo nº 2, cuya razón de
quitina-glucano era de 85:15 \pm 8 (p/p), mostró
una gran banda de dispersión a 2\theta = 20º (figura 3). En este
ejemplo, el índice de cristalinidad del compuesto calculado según
Struszczyk et al. (J. Appl. Polym. Sci., 1987, 33,
177-189) era del 67%, mientras que es del 87% para
la quitina extraída de cáscaras de gambas.
Este ejemplo ilustra la preparación de quitosano
a partir de quitina obtenida tras la hidrólisis con
\beta-glucanasa de una fracción de
quitina-glucano de micelio de Aspergillus
niger.
Se pusieron 4 g de la fracción insoluble
obtenida mediante la hidrólisis con beta-glucanasa
en el ejemplo 4, 40 g de NaOH y 40 ml de agua a 120ºC durante 1
hora. Se suspendió la suspensión obtenida en 200 ml de agua y se
añadió ácido acético para alcanzar un pH de 3,5. Tras 12 horas, se
filtró la suspensión y se recogió el filtrado. En este ejemplo, se
ajustó el pH del filtrado a 9,5 mediante la adición de hidróxido de
amonio para fomentar la precipitación de quitosano. Tras
centrifugación, lavado y liofilización, se obtuvo 1 g de la
fracción soluble en ácido. En este ejemplo, el espectro de
^{13}C-RMN de estado sólido reveló que la
fracción soluble en ácido era quitosano puro, sin cadenas de
\beta-glucano residuales. La proporción de
N-acetil-D-glucosamina
era del 14% molar y el peso molecular viscosimétrico era de
aproximadamente 20.000 Da, según se midió mediante viscosimetría
capilar de Ubbelohde.
Este ejemplo ilustra la preparación de cloruro
de quitosano a partir de quitina obtenida tras la hidrólisis con
beta-glucanasa de una fracción de
quitina-glucano de micelio de Aspergillus
niger.
En este ejemplo, se pusieron 60 g de una
fracción insoluble rica en quitina obtenida mediante la hidrólisis
con \beta-glucanasa tal como, por ejemplo, en el
ejemplo 4, 300 g de NaOH, 6 g de borohidruro de sodio y 300 ml de
agua a 120ºC durante 1 hora. Entonces, se centrifugó la suspensión
obtenida, se filtró y se lavó hasta tener baja conductividad. Se
suspendió la fracción insoluble en 200 ml de ácido acético 0,5 M.
Tras 12 horas, se filtró la disolución, y se recogió el filtrado.
En este ejemplo, se ajustó el pH del filtrado a 9,5 mediante la
adición de hidróxido de amonio para fomentar la precipitación de
quitosano. Tras centrifugación y lavado, se solubilizó la fracción
soluble en ácido en 28 ml de HCl 1 N a pH 3,6. Entonces se liofilizó
la disolución, produciendo 6 g de quitosano en la forma de cloruro
de amonio. La proporción de
N-acetil-glucosamina es del 17%
molar y el peso molecular viscosimétrico es de aproximadamente
20.000 Da.
En este ejemplo, se trató quitina comercial
procedente de cáscaras de gambas en diferentes condiciones con el
fin de producir quitosano. En primer lugar, se trató con una
disolución alcalina fuerte de NaOH a concentración y razón de
NaOH:quitina variables, con el fin de transformar la quitina en una
forma de gel y de inducir la desacetilación parcial de
N-acetil-glucosamina en unidades de
glucosamina. Luego, se filtró la quitina parcialmente desacetilada,
se lavó y se resuspendió en una disolución de ftalato de sodio (10
mM) a pH 5,5, para producir una concentración de quitina del 5%
(p/v). Posteriormente, se añadió una enzima quitina desacetilasa
recombinante (rCDA), para alcanzar una razón de rCDA:quitina de
5:1000, y se puso la suspensión a 37ºC durante 5 días. Para estimar
el grado de acetilación fomentado por rCDA, se evaluó el ácido
acético liberado. Se filtró la suspensión, y se lavó la fracción
insoluble en álcali con agua y se secó. Entonces se solubilizó en
una disolución de ácido acético, se filtró y luego se elevó el pH
mediante la adición de hidróxido de amonio para fomentar la
precipitación de cadenas de quitosano. Luego, se lavó el precipitado
y se secó. Se representan los resultados de los ensayos en la tabla
4.
En este ejemplo, la eficacia de la enzima rCDA,
tal como se muestra por la diferencia en el GA antes y después de
la reacción con rCDA (D_{GA}) dependió del tratamiento con álcali
previo, principalmente de la concentración de NaOH y la
temperatura. Tal como se observa en los ensayos nº 5 a 8 de este
ejemplo, la quitina está preferiblemente en una forma gelificada
cuando la concentración de álcali es superior al 50% (p/p) y está
preferiblemente predesacetilada suficientemente, con el fin de que
la rCDA catalice la reacción de desacetilación.
Este ejemplo ilustra la preparación de quitosano
que tiene un alto peso molecular y un bajo grado de acetilación
mediante la desacetilación enzimática de quitosano. Se hicieron
reaccionar varias muestras de quitosano caracterizadas por su peso
molecular viscosimétrico (Mv_{0}) y grado de acetilación
(GA_{0}) iniciales con la quitina desacetilasa recombinante
(rCDA), con el fin de que disminuyera el grado de acetilación hasta
un valor inferior (GA_{F}). En esta serie de ensayos, el medio de
reacción fue o bien una disolución no tamponada de ácido
clorhídrico 1 N (ensayos nº 1 a 4) o bien ácido fórmico 1 N (ensayos
nº 5 a 10) o bien una disolución tamponada de ácido fórmico 1 N con
ftalato de sodio (nº 10) o glutamato (nº 11) a pH variable. En este
ejemplo, la razón de rCDA con respecto a quitosano era o bien de
1:1000 (nº 4) o bien de 5:1000.
Entonces se recuperó el quitosano según se
describe en los ejemplos facilitados anteriormente, mediante
precipitación a pH superior a 7,0. Se representan los resultados de
los ensayos en la tabla 5. Para todas las muestras, no cambió el
peso molecular viscosimétrico final.
Puede usarse el quitosano obtenido según un
método de la presente invención para la preparación de películas u
objetos porosos, cuyo tamaño de los poros se controla.
Por ejemplo, pueden mezclarse partículas de
tamaño calibrado que consisten en moléculas solubles en agua (por
ejemplo, cloruro de sodio) con quitosano en una disolución ácida.
Entonces, esta matriz de quitosano se solidifica mediante
evaporación del disolvente o liofilización. Las partículas se
eliminan mediante lavado para generar los poros.
\newpage
También pueden prepararse matrices porosas que
comprenden quitosano por medio de separación de fases de
polímero/disolvente del tipo líquido-sólido o
líquido-líquido, que se induce térmicamente. Por
ejemplo, se disuelve quitosano en un disolvente tal como un ácido
orgánico concentrado o diluido, por ejemplo ácido acético o ácido
fórmico, y posteriormente se congela a una temperatura inferior a la
temperatura de solidificación del disolvente (punto de congelación)
y luego se liofiliza. Se generan los poros en el lugar de los
cristales de disolvente, cristales que se forman en el momento de
la congelación mediante un mecanismo de transición desde la fase
líquida hasta la sólida. También puede inducirse una transición de
fase líquida a líquida disolviendo el quitosano en una mezcla de
disolventes de un disolvente y un no disolvente (pudiéndose ambos
liofilizar). El disolvente puede ser un ácido orgánico concentrado
tal como ácido acético o fórmico. El tamaño y la distribución de los
poros depende del mecanismo de transición de la fase de
polímero/disolvente.
Claims (17)
1. Método para aislar derivados de pared
celular a partir de biomasa fúngica o de levaduras, que comprende
las etapas subsiguientes de:
- a)
- poner en contacto dicha biomasa con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende dichos derivados de pared celular,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una suspensión de la fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dichos derivados de pared celular, y
- c)
- poner en contacto dicha suspensión acidificada de fracción insoluble en álcali con enzimas \beta-glucanasas mediante lo cual se obtienen dichos derivados de pared celular, caracterizado porque dichos derivados de pared celular aislados y obtenidos en la etapa c) son polímeros de quitina o copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cantidad de quitina en los
copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina es
ajustable y preferiblemente superior al 80%.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque dichos derivados de pared celular
obtenidos en la etapa a) o b) son copolímeros de
quitina-glucano, de los que las cantidades relativas
de quitina y glucano dependen de la biomasa usada.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha disolución
básica comprende una concentración inferior al 10% (p/v).
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha biomasa se
selecciona del grupo que comprende Zygomycetes, Basidiomycetes,
Ascomycetes y Deuteromycetes y/o mezclas de los
mismos.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha biomasa es
un producto secundario que puede obtenerse en el procedimiento de
cultivo en el que se utiliza un cultivo fúngico o de levaduras.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las enzimas
\beta-glucanasas se seleccionan del grupo que
comprende las enzimas
endo-\beta-(1,3)-glucanasa,
exo-\beta-(1,3)-glucanasa,
\beta-(1,3)(1,4)-glucanasa,
\beta-(1,6)-glucanasa o cualquier mezcla de las
mismas.
8. Método para preparar quitosano a partir
de quitina, que comprende las etapas subsiguientes de:
- a)
- poner en contacto dicha quitina con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali que comprende quitina parcialmente desacetilada,
- b)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, con el fin de obtener una suspensión de fracción insoluble en álcali acidificada que comprende dicha quitina parcialmente desacetilada, y
- c)
- poner en contacto dicha suspensión acidificada de fracción insoluble en álcali con una enzima quitina desacetilasa, mediante lo cual se obtiene quitosano.
9. Método según la reivindicación 8, en el
que se proporciona una etapa adicional que comprende precipitar
dicho quitosano obtenido.
10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el
que dicha quitina es quitina fúngica o quitina de levaduras que
puede obtenerse mediante el método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha disolución básica comprende
una concentración superior al 40% (p/v).
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la razón de
disolución básica con respecto a la masa de quitina está
comprendida entre 5 y 25 (p/p).
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que la etapa a) se realiza a una
temperatura comprendida entre 50 y 120ºC.
14. Método para preparar quitosano a partir de
quitina fúngica o de levaduras, que comprende las etapas
subsiguientes de:
- a)
- aislar polímeros de quitina o copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina a partir de biomasa fúngica o de levaduras según el método de la reivindicación 1,
- b)
- poner en contacto dichos polímeros de quitina o copolímeros de quitina-glucano ricos en quitina aislados con una disolución básica, mediante lo cual se obtienen una fracción soluble en álcali y una fracción insoluble en álcali y mediante lo cual se desecha dicha fracción soluble en álcali y se conserva dicha fracción insoluble en álcali,
- c)
- poner en contacto dicha fracción insoluble en álcali con una disolución ácida, suspendiendo dicha fracción insoluble en álcali y poniendo dicha fracción suspendida en contacto con dicha disolución ácida, mediante lo cual se obtienen una fracción insoluble en ácido y una fracción soluble en ácido y mediante lo cual se desecha dicha fracción insoluble en ácido y se conserva dicha fracción soluble en ácido que comprende quitosano.
15. Método para preparar quitosano según la
reivindicación 14, en el que se proporciona una etapa adicional que
comprende precipitar el quitosano a partir de dicha fracción soluble
en ácido poniendo en contacto dicha fracción con una disolución
básica.
16. Método según la reivindicación 14 ó 15,
caracterizado porque la razón de disolución básica con
respecto a la masa de quitina está comprendida entre 1 y 20
(p/p).
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque la fracción
insoluble en álcali se suspende a una temperatura de entre 80º y
140ºC.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE2002/0093A BE1014638A6 (fr) | 2002-02-12 | 2002-02-12 | Methode de preparation de derives de la paroi cellulaire a partir de biomasse. |
| BE2002/0093 | 2002-02-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2271605T3 true ES2271605T3 (es) | 2007-04-16 |
Family
ID=27671625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03739480T Expired - Lifetime ES2271605T3 (es) | 2002-02-12 | 2003-02-12 | Derivados de pared celular a partir de biomasa y preparacion de los mismos. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7556946B2 (es) |
| EP (1) | EP1483299B1 (es) |
| JP (1) | JP2005529191A (es) |
| CN (1) | CN1642986A (es) |
| AT (1) | ATE336516T1 (es) |
| AU (1) | AU2003215555B2 (es) |
| BE (1) | BE1014638A6 (es) |
| CA (1) | CA2475258C (es) |
| DE (1) | DE60307603T2 (es) |
| DK (1) | DK1483299T3 (es) |
| ES (1) | ES2271605T3 (es) |
| WO (1) | WO2003068824A1 (es) |
Families Citing this family (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8222232B2 (en) * | 2001-02-16 | 2012-07-17 | Cargill, Incorporated | Glucosamine and N-acetylglucosamine compositions and methods of making the same fungal biomass |
| US7816514B2 (en) | 2001-02-16 | 2010-10-19 | Cargill, Incorporated | Glucosamine and method of making glucosamine from microbial biomass |
| US7923437B2 (en) * | 2001-02-16 | 2011-04-12 | Cargill, Incorporated | Water soluble β-glucan, glucosamine, and N-acetylglucosamine compositions and methods for making the same |
| NO20014256D0 (no) | 2001-09-03 | 2001-09-03 | Bjoern Kristiansen | Fremstilling av immunstimulerende forbindelse |
| FR2900054B1 (fr) * | 2006-04-21 | 2012-09-28 | Kitozyme Sa | Utilisation de polysaccharides d'origine fongique comme composition pharmaceutique ou complements alimentaires pour la sante humaine et animale |
| FR2887750B1 (fr) * | 2005-07-04 | 2008-07-04 | Kitozyme Sa | Utilisation d'extrait de biomasse fongique comme auxiliaire technologique pour le traitement de liquides alimentaires |
| KR100674672B1 (ko) * | 2002-10-08 | 2007-01-29 | 가부시끼가이샤 리코무 | 키토산 함유 다당, 그 제조방법 및 용도 |
| EP1756362A4 (en) * | 2004-06-01 | 2009-07-01 | Fpinnovations | ADDITIVE FOR MANUFACTURING PAPER |
| US7514085B2 (en) * | 2004-07-16 | 2009-04-07 | Medimush A/S | Immune modulating compounds from fungi |
| JP4979924B2 (ja) * | 2004-11-16 | 2012-07-18 | アサヒグループホールディングス株式会社 | 酵母水溶性多糖類の製造方法 |
| CZ299903B6 (cs) * | 2006-01-17 | 2008-12-29 | Výzkumný ústav potravinárský Praha, v.v.i. | Zpusob izolace polysacharidového komplexu bunecných sten z plísnových mycelií chemickou hydrolýzou |
| JP5185519B2 (ja) * | 2006-09-19 | 2013-04-17 | 東洋精糖株式会社 | 高分散性キトサンおよびその製造方法 |
| FR2908771B1 (fr) * | 2006-11-20 | 2011-07-29 | Kitozyme Sa | Chitine-glucane d'extrait fongique de granulometrie fine |
| MY157759A (en) | 2006-11-28 | 2016-07-15 | Univ Namur | Composition comprising oligogalacturonans and polycationic saccharides |
| EA018285B1 (ru) * | 2007-08-31 | 2013-06-28 | Китозим Са | Протез для стимулирования восстановления in vivo полого органа или части полого органа |
| CZ303471B6 (cs) * | 2007-10-03 | 2012-10-03 | Contipro Biotech S.R.O. | Prípravek pro hojení ran a prevenci adheze bandáže na ránu obsahující chitosan-glukan |
| FR2927254B1 (fr) * | 2008-02-12 | 2010-03-26 | Lesaffre & Cie | Utilisation de substances actives naturelles dans des compositions cosmetiques ou therapeutiques |
| DE102009040624B3 (de) * | 2009-09-08 | 2011-02-03 | Bruno Gruber | Verwendung von getrockneten Wasserkefirkörnern |
| CN102782147B (zh) * | 2010-02-01 | 2015-04-08 | Fp创新研究中心 | 真菌改性壳聚糖粘合剂和从该粘合剂制得的木材复合物 |
| US8298810B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-10-30 | Ford Global Technologies, Llc | Mycelium structure with self-attaching coverstock and method |
| US8298809B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-10-30 | Ford Global Technologies, Llc | Method of making a hardened elongate structure from mycelium |
| US8227233B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-07-24 | Ford Global Technologies, Llc | Method of making foamed mycelium structure |
| US8227224B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-07-24 | Ford Global Technologies, Llc | Method of making molded part comprising mycelium coupled to mechanical device |
| US8227225B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-07-24 | Ford Global Technologies, Llc | Plasticized mycelium composite and method |
| US8283153B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-10-09 | Ford Global Technologies, Llc | Mycelium structures containing nanocomposite materials and method |
| US8313939B2 (en) | 2010-06-09 | 2012-11-20 | Ford Global Technologies, Inc. | Injection molded mycelium and method |
| FR2961512B1 (fr) | 2010-06-18 | 2013-09-20 | Kitozyme Sa | Chitosane sous forme de poudre |
| US20120329135A1 (en) | 2011-06-23 | 2012-12-27 | Agrinos AS | Process for Making Chitin Derivatives |
| FR2981075A1 (fr) | 2011-10-11 | 2013-04-12 | Kitozyme | Procede de preparation de glucans a partir d'aspergillus niger |
| TWI652992B (zh) * | 2011-10-31 | 2019-03-11 | 興人生命科學股份有限公司 | 酵母來源之調味料、酵母蛋白質組成物之製造方法、及酵母來源之調味料之製造方法 |
| BR112014023611B1 (pt) * | 2012-03-23 | 2021-08-31 | Pharma73, S.A. | Pó biocomposto, método de preparação de um pó biocomposto e utilização do referido pó biocomposto |
| KR101952991B1 (ko) | 2012-06-25 | 2019-02-27 | 에스.에이. 댐 | 맥주 생산으로부터 생성되는 바이오매스로부터 얻은 지방 결합제 |
| CN102977158B (zh) * | 2012-12-03 | 2015-01-28 | 江苏赛奥生化有限公司 | 用截短侧耳素废菌体制备氨基葡萄糖盐酸盐的方法 |
| EP3569262A1 (en) | 2013-03-14 | 2019-11-20 | Tricol Biomedical, Inc. | Biocompatible and bioabsorbable derivatized chitosan compositions |
| US9249235B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-02 | Johannes van Leeuwen | Processes for isolating chitin and chitosan from fungal biomass |
| CN103239762B (zh) * | 2013-05-23 | 2014-09-17 | 中国海洋大学 | 一种甲壳素膜及其在眼科治疗中的应用 |
| CO6700143A1 (es) * | 2013-06-07 | 2013-06-28 | Univ Del Valle | Complejos quitina-glucano y proceso para la preparación de los mismos a partir de biomateriales ricos en quitina |
| SG10201810255YA (en) | 2014-05-21 | 2018-12-28 | Pharma73 S A | Chitin-glucan complex, its preparation, and uses |
| FR3024362A1 (fr) | 2014-08-01 | 2016-02-05 | Synolyne Pharma Sa | Composition thermogelifiable sterilisee |
| FR3029422B1 (fr) | 2014-12-05 | 2017-01-13 | Synolyne Pharma | Microbille d'hydrogel |
| JP2016185126A (ja) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | 株式会社サラダコスモ | イソフラボノイド高度含有スプラウト及びその生産方法 |
| GB201508658D0 (en) * | 2015-05-20 | 2015-07-01 | Lambson Ltd | Capsules |
| FR3038838B1 (fr) | 2015-07-13 | 2017-08-18 | Synolyne Pharma | Chitosane pour melange avec un fluide coagulable |
| ITUA20161937A1 (it) | 2016-03-23 | 2017-09-23 | S I I T S R L Servizio Int Imballaggi Termosaldanti | Preparazione per il controllo del peso corporeo a base di chitosano e cellulosa |
| FR3057438B1 (fr) * | 2016-10-14 | 2020-10-02 | Univ Limoges | Procede d'elicitation d'une plante au moyen d'extraits de champignons macroscopiques comestibles |
| GB201708113D0 (en) | 2017-05-20 | 2017-07-05 | Mat X Ltd | Materials |
| US20200245667A1 (en) * | 2017-09-13 | 2020-08-06 | Evolve Biosystems, Inc. | Oligosaccharide compositions and their use during transitional phases of the mammalian gut microbiome |
| FR3074043B1 (fr) | 2017-11-28 | 2020-11-13 | Kiomed Pharma | Chitosane a charge anionique |
| FR3074044B1 (fr) | 2017-11-28 | 2019-11-01 | Kiomed Pharma | Carboxyalkyl chitosane |
| WO2019242847A1 (en) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Process for the preparation of a non-random chitosan polymer |
| GB2579182B (en) | 2018-11-21 | 2021-01-20 | Mat X Limited | Binder materials |
| FR3096260B1 (fr) | 2019-05-24 | 2022-05-27 | Kiomed Pharma | Chitosane et ses applications |
| WO2021046073A1 (en) | 2019-09-05 | 2021-03-11 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Feed composition |
| CN110699344B (zh) * | 2019-10-24 | 2022-03-18 | 山东理工大学 | 一种柠檬酸发酵尾渣的综合利用工艺 |
| GB201918327D0 (en) | 2019-12-12 | 2020-01-29 | Univ Leuven Kath | Extraction process |
| FR3116534B1 (fr) | 2020-11-23 | 2023-12-22 | Kiomed Pharma | Billes à base de chitosane, préparation, compositions et applications |
| BE1030387B1 (fr) | 2022-03-24 | 2023-10-24 | Kitozyme S A | Procédé de production de chitosane à partir de mycélium fongique |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4034121A (en) * | 1971-09-07 | 1977-07-05 | Ralston Purina Company | Foods with microcrystalline chitin |
| US4424346A (en) * | 1981-06-04 | 1984-01-03 | Canadian Patents And Development Ltd. | Derivatives of chitins, chitosans and other polysaccharides |
| DE3527482A1 (de) * | 1984-07-31 | 1986-02-06 | Fuji Spinning Co., Ltd., Tokio/Tokyo | Verfahren zum herstellen von koernigem poroesen chitosan |
| US4810646A (en) | 1984-11-28 | 1989-03-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Glucan compositions and process for preparation thereof |
| US4806474A (en) * | 1985-06-10 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Preparation of mycelial chitosan and glucan fractions from microbial biomass |
| GB8601109D0 (en) | 1986-01-17 | 1986-02-19 | Bass Plc | Adhesive substances |
| JPS63225602A (ja) * | 1987-03-13 | 1988-09-20 | Nitta Zerachin Kk | 易溶性キトサン |
| GB8824971D0 (en) * | 1988-10-25 | 1988-11-30 | Roberts G A F | Method for production of chitosan |
| DE69130217T2 (de) * | 1990-04-06 | 1999-06-02 | Univ Florida | Flüssigphasenimmundiagnostisches analysenverfahren |
| GB9022560D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | G B Biotechnology Limited | Processing of waste |
| JPH05199892A (ja) | 1991-09-11 | 1993-08-10 | Shin Etsu Chem Co Ltd | キトサンの製造方法 |
| US5219749A (en) | 1991-10-09 | 1993-06-15 | Institute For Molecular Biology & Biotechnology/Forth | Process for isolating and preparing purified chitin deacetylase |
| JPH05184378A (ja) | 1991-11-13 | 1993-07-27 | Shin Etsu Chem Co Ltd | キトサンの製造方法 |
| KR970008132B1 (ko) * | 1993-02-08 | 1997-05-21 | 전동원 | 생체 임상의학용 키틴 및 키토산 제조방법 |
| NO300692B1 (no) * | 1994-04-29 | 1997-07-07 | Biotec Mackzymal As | Solubilisert forgrenet ß-1,3-glukan og anvendelse derav samt anvendelse av usolubilisert forgrenet ß-1,3-glukan |
| AU4830896A (en) * | 1995-02-13 | 1996-09-04 | Abion Beteiligungs- Und Verwaltungsgesellschaft Mbh | Process for producing chitosan-glucan complexes, compounds producible therefrom and their use |
| JP2664049B2 (ja) * | 1995-04-21 | 1997-10-15 | 農林水産省食品総合研究所長 | 新規キチン脱アセチル化酵素および本酵素を用いた糖のｎ−脱アセチル化法 |
| DE19636702A1 (de) | 1996-09-10 | 1998-03-12 | Mueller Johann Dipl Holzw | Mittel zum Behandeln von Holz |
| US5739015A (en) | 1997-03-10 | 1998-04-14 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Biotransformation of chitin to chitosan |
| JP3368323B2 (ja) | 1997-05-14 | 2003-01-20 | 独立行政法人農業生物資源研究所 | キチンビーズ、キトサンビーズ、これらビーズの製造方法及びこれらビーズからなる担体並びに微胞子虫胞子の製造法 |
| JP2000140509A (ja) * | 1998-11-16 | 2000-05-23 | Kansai Kako Kk | 新規な凝集剤とそれを用いる汚泥処理方法 |
| JP2000262811A (ja) * | 1999-03-23 | 2000-09-26 | Kansai Kako Kk | 複合凝集剤とそれを用いる汚泥処理方法 |
| US6255085B1 (en) * | 1999-07-08 | 2001-07-03 | Food Industry Research & Development Institute | Production of chitosan and chitin |
| JP2001129310A (ja) * | 1999-11-08 | 2001-05-15 | Kansai Kako Kk | 凝集剤及び汚泥処理方法 |
| DE19960632A1 (de) | 1999-12-16 | 2001-07-05 | Cognis Deutschland Gmbh | Kosmetische Mittel enthaltend natürliche Chitosane |
| CA2313836C (en) | 2000-03-15 | 2009-06-09 | Cargill, Incorporated | Chitosan and method of preparing chitosan |
| EP1149596A1 (en) | 2000-04-25 | 2001-10-31 | The Procter & Gamble Company | Absorbent articles comprising a cationic polysaccharide and silicate |
| DE10060632A1 (de) * | 2000-12-06 | 2002-07-04 | Gerald Fellner | Fahrzeugtür |
| EP1247819A1 (en) * | 2001-04-04 | 2002-10-09 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co. Ltd. | Purified chitins and production process thereof |
| NO20015986D0 (no) | 2001-08-02 | 2001-12-06 | Einar J Mustaparta | Produktet chitosan, samt fremstillingsmetode og anvendelse av chitosan |
| JP2003128704A (ja) | 2001-10-24 | 2003-05-08 | Matsumoto Shika Univ | キチン・キトサンの低分子化方法及び骨伝導物の製造方法 |
| GB0126923D0 (en) * | 2001-11-09 | 2002-01-02 | Procter & Gamble | Chitosan compositions |
| PT1455802E (pt) | 2001-12-14 | 2008-11-03 | Dnp Canada Inc | Oligossacáridos de quitosano e suas utilizações |
| US20030143388A1 (en) * | 2001-12-31 | 2003-07-31 | Reeves William G. | Regenerated carbohydrate foam composition |
| AU2003221828A1 (en) * | 2002-04-02 | 2003-10-27 | Cargill, Inc. | Chitosan production |
-
2002
- 2002-02-12 BE BE2002/0093A patent/BE1014638A6/fr not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-12 CN CNA038059479A patent/CN1642986A/zh active Pending
- 2003-02-12 DK DK03739480T patent/DK1483299T3/da active
- 2003-02-12 CA CA2475258A patent/CA2475258C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-12 AT AT03739480T patent/ATE336516T1/de active
- 2003-02-12 WO PCT/EP2003/001375 patent/WO2003068824A1/en active IP Right Grant
- 2003-02-12 EP EP03739480A patent/EP1483299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-12 AU AU2003215555A patent/AU2003215555B2/en not_active Expired
- 2003-02-12 ES ES03739480T patent/ES2271605T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-12 DE DE60307603T patent/DE60307603T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-12 US US10/504,046 patent/US7556946B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-02-12 JP JP2003567950A patent/JP2005529191A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1483299B1 (en) | 2006-08-16 |
| CN1642986A (zh) | 2005-07-20 |
| US7556946B2 (en) | 2009-07-07 |
| DE60307603T2 (de) | 2007-09-13 |
| US20050130273A1 (en) | 2005-06-16 |
| CA2475258A1 (en) | 2003-08-21 |
| AU2003215555A1 (en) | 2003-09-04 |
| BE1014638A6 (fr) | 2004-02-03 |
| DE60307603D1 (de) | 2006-09-28 |
| CA2475258C (en) | 2011-10-04 |
| EP1483299A1 (en) | 2004-12-08 |
| WO2003068824A1 (en) | 2003-08-21 |
| AU2003215555B2 (en) | 2008-10-02 |
| JP2005529191A (ja) | 2005-09-29 |
| DK1483299T3 (da) | 2006-12-27 |
| ATE336516T1 (de) | 2006-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2271605T3 (es) | Derivados de pared celular a partir de biomasa y preparacion de los mismos. | |
| Huq et al. | Sources, production and commercial applications of fungal chitosan: A review | |
| Bakshi et al. | Chitosan as an environment friendly biomaterial–a review on recent modifications and applications | |
| Rafique et al. | Chitosan functionalized poly (vinyl alcohol) for prospects biomedical and industrial applications: A review | |
| Jayakumar et al. | Novel carboxymethyl derivatives of chitin and chitosan materials and their biomedical applications | |
| US8735571B2 (en) | Composition, preparation, and use of dense chitosan membrane materials | |
| Ahmed et al. | Chitosan: a natural antimicrobial agent-a review | |
| Peniche et al. | Chitin and chitosan: major sources, properties and applications | |
| JP3993633B2 (ja) | ポリ−β−１→４−Ｎ−アセチルグルコサミン | |
| JPH0776241B2 (ja) | アミノ多糖類及びそれらの誘導体の酸による非晶出化方法 | |
| JP2015511214A (ja) | 高密度キトサン膜物質の組成物、調製および使用 | |
| Oyatogun et al. | Chitin, chitosan, marine to market | |
| Mukherjee et al. | Food industry applications of Tara gum and its modified forms | |
| Lim et al. | Biomedical-grade chitosan in wound management and its biocompatibility in vitro | |
| Qavami et al. | Overview on Chitosan as a valuable ingredient and biostimulant in pharmaceutical industries and agricultural products | |
| Saravanan et al. | A review on extraction of polysaccharides from crustacean wastes and their environmental applications | |
| Bosquez-Molina et al. | New bioactive biomaterials based on chitosan | |
| Hassan et al. | Development of biodegradable poly (vinyl alcohol)/chitosan cross linked membranes for antibacterial wound dressing applications. | |
| Jahangeer et al. | Applications and perspectives of chitosan as functional biopolymer; an extended review | |
| Akbar et al. | Sodium alginate: an overview | |
| Raizaday et al. | Chitosan and its derivatives as a potential nanobiomaterial: Drug delivery and biomedical application | |
| Sudha et al. | Introduction to marine biopolymers | |
| Ebinesar et al. | Fungal chitosan: the importance and beneficiation of this biopolymer in industrial and agricultural process | |
| Demetzos et al. | Functional Materials in Biomedical Applications | |
| KR20170068008A (ko) | 화장료용유용성분또는자외선차단물질이함유된키토산마이크로스피어및그를함유하는화장료조성물 |